JP6257529B2 - Influenza C virus and vaccine - Google Patents
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Description
参照による組み入れ
本出願は、米国特許出願13/385,004(2012年1月27日出願、この出願の開示は引用により本明細書に含まれる)の優先権を主張する。
本発明はインフルエンザCウイルスおよびインフルエンザCウイルスワクチンに関する。
This application incorporates by reference, U.S.
The present invention relates to influenza C virus and influenza C virus vaccine.
インフルエンザCは、ほとんどの個体が小児のときに感染するのでヒトのありふれた病原体である。インフルエンザCは、感冒に類似する軽度の呼吸器症状を引き起こす。中国でブタから単離されたインフルエンザCに関して1つの報告が存在する(Yuanji and Desselberger 1984, J. Gen. Virol. 65:1857-72)。さらにまた前記研究は、ブタインフルエンザCウイルスはブタに感染しブタの間で伝播され得ることを示した。いくつかの他の論文がインフルエンザCと反応する抗体をブタで同定し、ブタがインフルエンザCの保菌動物であるか又はヒトがこのウイルスを極めて通常的にブタに広めることを示唆した(Kimura et al. 1997, Virus Res. 48:71-9;Yamaoka et al. 1991, J Gen Virol. 72:711-714;Brown et al. 1995, Epidemiol. Infect. 114:511-20;Ohwada et al. 1987, Microbiol Immunol. 31:1173-80)。 Influenza C is a common human pathogen because most individuals are infected when they are children. Influenza C causes mild respiratory symptoms similar to the common cold. There is one report on influenza C isolated from pigs in China (Yuanji and Desselberger 1984, J. Gen. Virol. 65: 1857-72). Furthermore, the study showed that swine influenza C virus can infect pigs and be transmitted between pigs. Several other papers identified antibodies that react with influenza C in pigs, suggesting that pigs are influenza C carriers or that humans spread the virus very commonly in pigs (Kimura et al 1997, Virus Res. 48: 71-9; Yamaoka et al. 1991, J Gen Virol. 72: 711-714; Brown et al. 1995, Epidemiol. Infect. 114: 511-20; Ohwada et al. 1987, Microbiol Immunol. 31: 1173-80).
インフルエンザCはこれまで1つの論文でしか報告されなかったように、ブタで発見されるのは稀なことである。単離され特徴が明らかにされたウイルスは、インフルエンザCの極めて稀な変種である。公知インフルエンザCウイルスとこのウイルスとの全体的なパーセント相同性はわずかに約65%であり、このウイルスが、これまでに記載されたことがない完全に新規な系列のウイルスであること、さらにこれまでに記載されたウイルスとは希薄な関係を有するだけであることを示している。この低レベルの相同性は、典型的なヒトインフルエンザCウイルスに対して作製されたワクチンはC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に対して防御作用をもたないであろうということを示唆している。“ユニバーサル”インフルエンザCプライマーセットもまたこのウイルスを検出できなかったという知見もまた、このウイルスの新規性を物語っている。さらにまた、ヒト及びブタでの抗体力価の検出は、当該ウイルスのブタ及びフェレットでの複製能力と同様に、このウイルスがブタ及びヒトで症状を引き起こすことができることを示唆する。我々は、ブタの感染を防ぐワクチンを作製できること及び学術論文もまたこのワクチンがヒトを防御し得ることを支持するであろうということ示す。 Influenza C is rarely found in pigs, as it has been reported in only one article so far. The isolated and characterized virus is a very rare variant of influenza C. The overall percent homology between the known influenza C virus and this virus is only about 65%, indicating that this virus is a completely new family of viruses that have not been described before. It shows that it has only a rare relationship with the viruses described so far. This low level of homology suggests that a vaccine made against a typical human influenza C virus will not have a protective effect against C / pig / Oklahoma / 1334/2011. Yes. The finding that the “universal” influenza C primer set also failed to detect the virus also demonstrates the novelty of the virus. Furthermore, detection of antibody titers in humans and pigs suggests that the virus can cause symptoms in pigs and humans, as well as the ability of the virus to replicate in pigs and ferrets. We show that a vaccine can be made that prevents infection of pigs and that academic papers will also support that this vaccine can protect humans.
ある特徴では、本発明は、以前に特徴が明らかにされたいずれのインフルエンザCウイルスとも低い相同性しかもたない新規なインフルエンザCウイルスである。チャレンジ実験は、前記ウイルスはブタに感染しブタの間で伝播され得ることを示す。さらにまた、インフルエンザCは一般的にヒトの病源体と考えられ、血清学的実験を実施して、ブタ及びヒトの両方でこのウイルスに対する抗体の発生に注目した。ブタの約10%及びヒトの30%がこのウイルルスに対する抗体を有する。さらに補足的な実験データは、このウイルスがフェレット(ヒトの感染実験の代用動物)に感染し伝播され得ることを示す。
第二の特徴では、本発明は、この新規なインフルエンザCウイルスに対するワクチンである。
第三の特徴では、本発明は、この新規なインフルエンザCウイルスの部分ゲノムである。
別の特徴では、本発明は、この新規なインフルエンザCウイルスを動物で検出する方法である。
In one aspect, the present invention is a novel influenza C virus that has low homology with any of the previously characterized influenza C viruses. Challenge experiments show that the virus can infect pigs and can be transmitted between pigs. Furthermore, influenza C is generally considered a human pathogen and serological experiments were conducted to focus on the development of antibodies against this virus in both pigs and humans. About 10% of pigs and 30% of humans have antibodies against this virus. Further supplemental experimental data indicate that this virus can infect and propagate ferrets (a surrogate animal for human infection experiments).
In a second aspect, the present invention is a vaccine against this novel influenza C virus.
In a third aspect, the present invention is a partial genome of this novel influenza C virus.
In another aspect, the present invention is a method for detecting this novel influenza C virus in animals.
ウイルスの単離
ニューポート・ラボラトリーズ(Newport Laboratories)に付託したサンプルは、インフルエンザ様の病気の徴候を示すブタから得た鼻の拭き取り検体であった。サンプルはリアルタイム逆転写PCRではインフルエンザAについて陰性であった。前記サンプルのアリコットをコンフルエントなブタ精巣(ST)細胞単層に適用し、存在する一切のウイルスの増殖を試みた。5日後に細胞傷害作用が明瞭で、このブタ精巣細胞でウイルスが増殖したことを示した。細胞培養上清サンプルをQPCRによってインフルエンザAについて分析し、陰性であった。シチメンチョウ赤血球を血球凝集させる能力について細胞培養上清を分析した(血球凝集アッセイ)。血球凝集アッセイは以下のプロトコルにしたがって実施した(実験#1)。
実験#1
1.0序
ブタインフルエンザウイルスを定量する
2.0材料
−容器
−96ウェルマイクロタイターV底プレート
−マルチチャンネルピペッター及びチップ(100−200μL)
−100−1000μLピペット
−10−100μLピペッター
−ピペットチップ
−身体防御用装備(PPE:実験衣、防護メガネ、手袋)
−バイオセーフティーキャビネット
−カバープレート/蓋
−タイマー
−50mLファルコンチューブ
−遠心分離機
3.0試薬/媒体
−Lampireのシチメンチョウ赤血球(TRBC)
−1xDPBS
4.0媒体処方
シチメンチョウ赤血球溶液(0.5%)
−TRBCはアルスバー溶液で到着。50mLの円錐チューブで2000rpm、10分間遠心分離する。上清を吸引して廃棄する。
−最初の血液と等体積の1xDPBSを添加して、前記RBCを洗浄する。逆さまにしてさらに穏やかに震盪する。遠心分離し上清を廃棄する。さらに2回繰り返す。集積細胞を4℃で保存する。
−50mLの1xDPBSを50mLチューブに加える。250μLの1xPBSを取り出す。250μLのシチメンチョウ集積RBCを加える。穏やかに混合する。プレート当たり5mLが必要である。稀釈細胞を4℃で保存する。
5.0手順
準備
−8サンプルについて1枚の96ウェルプレートに横方向に走らせる。試験するべきサンプルを基準に何枚のプレートが必要かを計算し、適切なペーパーワークに書き入れる。
−代替設定:12サンプルについて1枚の96ウェルプレートに縦方向に走らせることができる。
試験手順
−プレートの全ウェルを50μLのDPBSで満たす。
−サンプル#1の50μLをウェルのA1に、サンプル#2をB1に入れ、以下同様である。
−プレートの各試験セットと一緒に陰性コントロール(単にDPBS)を最後のプレートで試験する。
−列1から始めて列12まで50μLを用いてプレートを稀釈し(陰性コントロールの行は除く)、残りの50μLは廃棄する。
−プレートを稀釈した後で、全ウェルを50μLの0.5%TRBCで満たす(前記TRBCはチューブを逆さまにして血球を混合し、攪拌しない)。プレートを軽く叩き、覆いをして室温で2時間までインキュベートする。
−代替設定:12サンプルを縦方向に走らせるために、サンプル#1の50μLをウェルA1に、サンプル#2をA2に入れる。
−行Aから始めて行Hまで50μLを用いてプレートを稀釈し(陰性コントロールの列は除く)、残りの50μLは廃棄する。
−プレートを稀釈した後で、全ウェルを50μLの0.5%TRBCで満たす(前記TRBCはチューブを逆さまにして血球を混合し、攪拌しない)。プレートを軽く叩き、覆いをして室温で2時間までインキュベートする。
6.0判読
−プレートを30−45°傾けて読み取る。読み取りに際して、完全な涙滴形態(teardrop)のない最後のウェルが終末点である。対応するペーパーワークに印をつける。
−HA力価を対応するペーパーワークに列挙する。
−陰性コントロール行(又は列)は完全な涙滴形態で、血球凝集を示さないはずである。
この未同定ウイルスは1280の力価でcrbcを血球凝集させる能力を有していた。多くのウイルスが、細胞(赤血球を含む)にウイルスを結合させることができるヘマグルチニンタンパク質をコードする遺伝子を含む。インフルエンザウイルスは赤血球を凝集させる能力を有する。
Isolation of the virus The sample submitted to Newport Laboratories was a nasal wipe obtained from a pig showing signs of influenza-like illness. The sample was negative for influenza A by real-time reverse transcription PCR. An aliquot of the sample was applied to a confluent porcine testis (ST) cell monolayer to attempt to propagate any virus present. After 5 days, the cytotoxic effect was clear, indicating that the virus grew in these porcine testis cells. Cell culture supernatant samples were analyzed for influenza A by QPCR and were negative. Cell culture supernatants were analyzed for the ability to hemagglutinate turkey erythrocytes (hemagglutination assay). The hemagglutination assay was performed according to the following protocol (Experiment # 1).
Experiment # 1
1.0 Introduction Quantifying swine influenza virus
2.0 Materials-Container-96 well microtiter V bottom plate-Multichannel pipetter and tip (100-200μL)
−100−1000μL pipette−10−100μL pipetter−Pipette tip−Physical defense equipment (PPE: experimental clothing, protective glasses, gloves)
-Biosafety cabinet-Cover plate / lid-Timer-50mL falcon tube-Centrifuge
3.0 Reagent / Medium-Lampire's turkey red blood cells (TRBC)
-1xDPBS
4.0 Medium Formula Turkey Red Blood Cell Solution (0.5%)
-TRBC arrived with Alsbar solution. Centrifuge in a 50 mL conical tube at 2000 rpm for 10 minutes. Aspirate supernatant and discard.
-Wash the RBC by adding an equal volume of 1x DPBS to the initial blood. Shake upside down and gently. Centrifuge and discard the supernatant. Repeat two more times. Store the accumulated cells at 4 ° C.
Add 50 mL of 1 × DPBS to the 50 mL tube. Remove 250 μL of 1 × PBS. Add 250 μL turkey-integrated RBC. Mix gently. 5mL per plate is required. Store diluted cells at 4 ° C.
5.0 Procedure Preparation-Run 8 samples laterally in one 96-well plate. Calculate how many plates are needed based on the sample to be tested and fill in the appropriate paperwork.
-Alternative setting: 12 samples can be run vertically in one 96 well plate.
Test Procedure-Fill all wells of the plate with 50 μL of DPBS.
-Place 50 μL of sample # 1 in well A1,
Test the negative control (simply DPBS) with each test set on the plate on the last plate.
-Dilute the plate with 50 μL starting from column 1 to column 12 (except for the negative control row) and discard the remaining 50 μL.
After diluting the plate, fill all wells with 50 μL of 0.5% TRBC (the TRBC mixes the blood cells upside down and does not agitate). Tap the plate, cover and incubate at room temperature for up to 2 hours.
-Alternative setting: To run 12 samples vertically, place 50 μL of sample # 1 in well A1 and
Dilute the plate with 50 μL starting from row A to row H (excluding the negative control column) and discard the remaining 50 μL.
After diluting the plate, fill all wells with 50 μL of 0.5% TRBC (the TRBC mixes the blood cells upside down and does not agitate). Tap the plate, cover and incubate at room temperature for up to 2 hours.
6.0 interpretation
-Tilt the plate 30-45 ° and read. Upon reading, the last well without a complete teardrop is the endpoint. Mark the corresponding paperwork.
-List HA titers in the corresponding paperwork.
-The negative control row (or column) should be completely teardrop-shaped and show no hemagglutination.
This unidentified virus had the ability to hemagglutinate crbc with a titer of 1280. Many viruses contain a gene encoding a hemagglutinin protein that can bind the virus to cells (including red blood cells). Influenza viruses have the ability to agglutinate red blood cells.
実験#2
電子顕微鏡検査のために、未知のウイルスを感染させたST細胞のフラスコをミネソタ大学獣医診断学研究室(University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory)に送った。ウイルスの画像はオルトミクソウイルス科(family Orthomyxoviridae)と一致した(図1)。この科はインフルエンザA、B、C及びトゴトウイルスから成る。
実験#3
インフルエンザA、B又はCのいずれかを特異的に検出するように設計したプライマーを用いてPCRを試みた(表1)。全てのPCR反応が陰性であった。さらにまた、ノイラミニダーゼの基質メチルウンベリフェリルN-アセチルノイラミン酸を用いて、ノイラミニダーゼ活性アッセイを実施した。このウイルスはノイラミニダーゼ活性をもたなかった(インフルエンザA及びBはともにノイラミニダーゼを有する)。次に、4-ニトロフェニルアセテート(Sigma Aldrich N8130)を用いて、エステラーゼ活性アッセイを実施した。このウイルスはエステラーゼ活性を示した。赤血球を血球凝集させる能力及びエステラーゼ活性を有することは、インフルエンザC及びコロナウイルス科のいくつかのメンバーの特徴である。ヘマグルチニンエステラーゼ活性を及び電子顕微鏡検査を基準にして、このウイルスは予備的にインフルエンザCと同定したが、ただしPCRではインフルエンザCについては陰性であった。
For electron microscopy, ST cell flasks infected with an unknown virus were sent to the University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory. The virus image was consistent with the family Orthomyxoviridae (Figure 1). This family consists of influenza A, B, C and Togotovirus.
Experiment # 3
PCR was attempted using primers designed to specifically detect either influenza A, B or C (Table 1). All PCR reactions were negative. Furthermore, a neuraminidase activity assay was performed using the neuraminidase substrate methylumbelliferyl N-acetylneuraminic acid. This virus had no neuraminidase activity (both influenza A and B have neuraminidase). Next, esterase activity assays were performed using 4-nitrophenyl acetate (Sigma Aldrich N8130). This virus showed esterase activity. The ability to hemagglutinate red blood cells and the esterase activity are characteristic of several members of the influenza C and coronaviridae families. Based on hemagglutinin esterase activity and electron microscopy, the virus was preliminarily identified as influenza C, but PCR was negative for influenza C.
表1:ウイルス検出のためにリアルタイム逆転写PCRで用いたプライマー及びプローブ(IABkQ=アイオワブラックホールクェンチャー)
Table 1: Primers and probes used in real-time reverse transcription PCR for virus detection (IABkQ = Iowa Black Hole Quencher)
実験#4−ゲノム配列決定
ウイルスを細胞培養で増やして、2560の血球凝集(HA)力価を有する細胞培養採集物200mLを生成した。細胞培養液を0.2ミクロンフィルターでろ過して細胞残屑を除去した。続いて前記液を110,000xgで3時間遠心分離してウイルスをペレットにした。続いてこのウイルスを1mLのリン酸緩衝食塩水に再懸濁し、DNase(New England Biolabs M0303S)及びRNase(New England Biolabs M0243S)を用い37℃で1時間消化した。前記ウイルス溶液を続いて静かに35mLの25%シュクロース溶液の最上部に重層し、110,000xgで3時間遠心分離してウイルスをペレットにした。キアゲン(商標)ウイルスRNAミニキット(Qiagen, Inc., 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia, CA 91355)を製造業者の指示にしたがって用いて、ウイルスRNAを前記ウイルスペレットから抽出した。簡単に記せば、担体RNAを含む700μLの緩衝液AVLに前記ウイルスペレットを再懸濁し、10分間室温でインキュベートした。次に、560μLのエタノールを前記サンプルに添加し、続いてこのサンプルをQIAampTMミニカラムに6000xgの遠心分離によってロードした。次にこのカラムをそれぞれ500μLの緩衝液AW1及びAW2で連続して洗浄し、14,000xgで2分間遠心分離して乾燥させ、その後60μLの水で溶出させた。続いてプロメガ(Promega)逆転写キット(Promega Corp., 2800 Woods Hollow Rd., Madison WI 53711; www.promega.com)を同封のランダムプライマーとともに用いて、前記ウイルスRNAからcDNAを逆転写した。GoScriptTM逆転写系が便利なキットであり、前記は、PCR増幅用調製物中に、逆転写酵素及び第一鎖cDNAの効率的な合成のために設計された最適化試薬セットを含んでいる。GoScriptTM逆転写系の成分を用いて、全RNA、ポリ(A)+mRNA又は合成転写物RNAのいずれかで開始してRNA鋳型を逆転写することができる。
次にこのcDNAをRNaseH(New England Biolabs M0297S)で37℃、1時間消化して、RNA-cDNAハイブリッドからRNAを除去した。DNAポリメラーゼのクレノウフラグメント(New England Biolabs M0210S)を用いて、前記一本鎖cDNAを二本鎖にした。
BioRuptor(商標)ソニケーションシステム(Diagenode Inc. North America, 376 Lafayette Rd., Suite 102, Sparta, NJ 07871)を用いて、前記二本鎖cDNAを超音波処理して、前記ウイルスcDNAをフラグメントにした。次に、ライフテクノロジーズ(Life TechnologiesTM)イオンプラスフラグメントライブラリーキットプロトコル(www.lifetechnologies.com)にしたがい、前記フラグメント化cDNAを用いてcDNAライブラリーを以下のように構築した:50マクロリットルのフラグメント化cDNAを108マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、40マイクロリットルの5x末端修復緩衝液、及び2マイクロリットルの末端修復酵素と混合した。この反応物を室温で20分インキュベートした。インキュベーションの後で、360マイクロリットルのAgencourt(商標)Ampure(商標)ビーズを前記サンプルに添加し、続いて前記を回転装置に8−10rpmで10分置いた。このサンプルをパルススピンし、DynaMagTM-2マグネットラックに置いた。溶液が清澄になった後、上清を取り出し廃棄した。続いてこの後のプロトコルを用いてサンプルを2回洗浄した。サンプルをマグネットから移動させずに、500マイクロリットルの新しく作成した70%エタノールを前記サンプルに添加した。前記サンプルを含むチューブをマグネット上で2回回転させてビーズを周辺に移動させた。溶液が清澄になった後、エタノールを除去した。この洗浄手順を反復した。第二の70%エタノール洗浄及び上清の除去に続いて、前記サンプルチューブをパルススピンし、前記マグネットラックに戻した。残留エタノールを吸引し、サンプルを室温でほぼ5分間乾燥させた。50マイクロリットルの1xTE(10mMトリス塩酸、1mMのEDTA(pH8.0))をcDNAに添加し、撹拌し、パルススピンし、さらにマグネットラックに戻した。溶液が清澄になった後、溶出cDNAを含む上清を新しい1.5mLのLoBindチューブ(商標)に移した。
Experiment # 4-Genome Sequencing Virus was expanded in cell culture to produce 200 mL of cell culture collection with a hemagglutination (HA) titer of 2560. Cell culture fluid was filtered through a 0.2 micron filter to remove cell debris. Subsequently, the solution was centrifuged at 110,000 × g for 3 hours to pellet the virus. Subsequently, the virus was resuspended in 1 mL of phosphate buffered saline and digested with DNase (New England Biolabs M0303S) and RNase (New England Biolabs M0243S) at 37 ° C. for 1 hour. The virus solution was then gently layered on top of 35 mL of 25% sucrose solution and centrifuged at 110,000 × g for 3 hours to pellet the virus. Viral RNA was extracted from the viral pellet using a Qiagen ™ viral RNA mini kit (Qiagen, Inc., 27220
Next, this cDNA was digested with RNaseH (New England Biolabs M0297S) at 37 ° C. for 1 hour to remove RNA from the RNA-cDNA hybrid. The single-stranded cDNA was made double-stranded using a Klenow fragment of DNA polymerase (New England Biolabs M0210S).
The viral cDNA was fragmented using a BioRuptor ™ sonication system (Diagenode Inc. North America, 376 Lafayette Rd., Suite 102, Sparta, NJ 07871). . Next, according to the Life Technologies ™ ion plus fragment library kit protocol (www.lifetechnologies.com), a cDNA library was constructed using the fragmented cDNA as follows: 50 macroliter fragments The cDNA was mixed with 108 microliters of nuclease-free water, 40 microliters of 5x end repair buffer, and 2 microliters of end repair enzyme. The reaction was incubated at room temperature for 20 minutes. After incubation, 360 microliters of Agencourt ™ Ampure ™ beads were added to the sample, which was then placed on a rotator at 8-10 rpm for 10 minutes. This sample was pulse spun and placed in a DynaMag ™ -2 magnet rack. After the solution became clear, the supernatant was removed and discarded. Subsequently, the sample was washed twice using the subsequent protocol. Without removing the sample from the magnet, 500 microliters of freshly made 70% ethanol was added to the sample. The tube containing the sample was rotated twice on the magnet to move the beads to the periphery. After the solution became clear, the ethanol was removed. This washing procedure was repeated. Following a second 70% ethanol wash and removal of the supernatant, the sample tube was pulse spun and returned to the magnet rack. Residual ethanol was aspirated and the sample was allowed to dry at room temperature for approximately 5 minutes. 50 microliters of 1 × TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) was added to the cDNA, stirred, pulse spun, and returned to the magnet rack. After the solution was clarified, the supernatant containing the eluted cDNA was transferred to a new 1.5 mL LoBind tube ™.
20マイクロリットルの10xリガーゼ緩衝液、77マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、50マイクロリットルのアダプター(Adapter)及び3マイクロリットルのDNAリガーゼを50マイクロリットルのcDNAとともに混合した。前記混合物を室温で30分インキュベートした。溶液が清澄になった後、上清を取り出し廃棄した。続いてこの後のプロトコルを用いてサンプルを2回洗浄した:サンプルをマグネットから移動させずに、500マイクロリットルの新しく作成した70%エタノールを前記サンプルに添加した。前記サンプルを含むチューブをマグネット上で2回回転させてビーズを周辺に移動させた。溶液が清澄になった後、エタノールを除去した。この洗浄手順を反復した。第二の70%エタノール洗浄及び上清の除去に続いて、前記サンプルチューブをパルススピンし、前記マグネットラックに戻した。残留エタノールを吸引し、サンプルを室温でほぼ5分間乾燥させた。30マイクロリットルの1xTEをcDNAに添加し、ボルテックスで撹拌し、パルススピンし、さらにマグネットラックに戻した。溶液が清澄になった後、溶出cDNAを含む上清を新しい1.5mLのLoBindチューブ(商標)に移した。
30マイクロリットルのcDNAの全てを2%アガロースゲルにロードし、110Vで80分間ゲル電気泳動に付した。ゲル電気泳動の後、180−210塩基対のために前記サンプルをサイズ選別した。QIAquick(商標)PCR精製キット(Qiagen, Inc., 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia, CA 91355; www.qiagen.com)を製造業者の指示にしたがって用いて、サイズ選別cDNAライブラリーをゲル精製した。前記ゲルから切り出したcDNAフラグメントを秤量し、ゲル1体積につき3体積の緩衝液QGを添加した。ゲルスライスが完全に溶解するまで、前記混合物を回転装置上にて室温でインキュベートした。ゲルスライスが完全に溶解したら直ちに、前記溶液をQIAquick(商標)スピンカラム(Qiagen, Inc., 27220 Turnberry Lane Suite 200 Valencia, CA 91355; www.quiagen.com)に適用し、2mLのコレクションチューブを提供し、最大速度(ほぼ16,000rcf)で1分遠心分離した。フロースルーを廃棄し、QIAquick(商標)カラムを同じチューブに戻した。750マイクロリットルの緩衝液PEを前記カラムに添加し最大速度(ほぼ16,000rcf)で前記を1分間遠心分離することによって、cDNAを含むカラムを洗浄した。フロースルーを廃棄し、QIAquick(商標)カラムを同じチューブに戻し、さらに最大速度で4分遠心分離した。続いて、前記QIAquick(商標)カラムを清浄な1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに入れた。40マイクロリットルの緩衝液EBをQIAquick(商標)カラムメンブレンに添加し、数分間室温でインキュベートし、その後前記カラムを1分間遠心分離してcDNAを溶出させた。
ライフテクノロジーズ(商標)イオンプラスフラグメントライブラリーキット(www.lifetechnologies.com)プロトコルにしたがい、溶出させたサイズ選別cDNAライブラリーをニックトランスレーションして増幅させた。40マイクロリットルのサイズ選別cDNAを200マイクロリットルのPlatinum(商標)PCR SuperMix High Fidelity及び10マイクロリットルのライブラリーアンプリフィケーションプライマーミックスと混合した。125マクロリットルのアリコットを2本のPCRチューブの各々に移し、以下のパラメーターにしたがってサーモサイクラーを稼働させた:
20 microliters of 10 × ligase buffer, 77 microliters of nuclease-free water, 50 microliters of adapter (Adapter) and 3 microliters of DNA ligase were mixed with 50 microliters of cDNA. The mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. After the solution became clear, the supernatant was removed and discarded. The sample was then washed twice using the following protocol: 500 microliters of freshly made 70% ethanol was added to the sample without removing the sample from the magnet. The tube containing the sample was rotated twice on the magnet to move the beads to the periphery. After the solution became clear, the ethanol was removed. This washing procedure was repeated. Following a second 70% ethanol wash and removal of the supernatant, the sample tube was pulse spun and returned to the magnet rack. Residual ethanol was aspirated and the sample was allowed to dry at room temperature for approximately 5 minutes. 30 microliters of 1 × TE was added to the cDNA, vortexed, pulse spun, and returned to the magnet rack. After the solution was clarified, the supernatant containing the eluted cDNA was transferred to a new 1.5 mL LoBind tube ™.
All 30 microliters of cDNA was loaded onto a 2% agarose gel and subjected to gel electrophoresis at 110 V for 80 minutes. After gel electrophoresis, the sample was sized for 180-210 base pairs. The size-selected cDNA library was gel purified using the QIAquick ™ PCR purification kit (Qiagen, Inc., 27220
The eluted size-selected cDNA library was nick-translated and amplified according to the Life Technologies ™ Ion Plus Fragment Library Kit (www.lifetechnologies.com) protocol. 40 microliters of size-selected cDNA was mixed with 200 microliters of Platinum ™ PCR SuperMix High Fidelity and 10 microliters of library amplification primer mix. A 125 macroliter aliquot was transferred to each of the two PCR tubes and the thermocycler was run according to the following parameters:
表2:PCRサーモサイクラーパラメーター
Table 2: PCR thermocycler parameters
サンプルを新しい1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブにプールし、375マイクロリットルのAgencourt Ampure(商標)ビーズを前記サンプルに添加し、前記を回転装置上にて室温で10分インキュベートして精製した。このサンプルをパルススピンし、DynaMag(商標)-2マグネットラックに置いた。溶液が清澄になった後、上清を取り出し廃棄した。続いてこの後のプロトコルを用いてサンプルを2回洗浄した。サンプルをマグネットから移動させずに、500マイクロリットルの新しく作成した70%エタノールを前記サンプルに添加した。前記サンプルを含むチューブをマグネット上で2回回転させてビーズを周辺に移動させた。溶液が清澄になった後、エタノールを除去した。この洗浄手順を反復した。第二の70%エタノール洗浄及び上清の除去に続いて、前記サンプルチューブをパルススピンし、前記マグネットラックに戻した。残留エタノールを吸引し、サンプルを室温でほぼ5分間乾燥させた。50マイクロリットルの1xTEをcDNAに添加し、ボルテックスで撹拌し、パルススピンし、さらにマグネットラックに戻した。溶液が清澄になった後、溶出cDNAを含む上清を新しい1.5mLのLoBindチューブに移した。
cDNAの量は、イオンライブラリー定量キット(www.lifetechnologies.com)を製造業者のプロトコルにしたがって用いて定量した。以下の表にしたがって、大腸菌(E. coli)DH10Bコントロールライブラリーから5つの連続10倍希釈を調製した。
Samples were pooled in a new 1.5 ml microcentrifuge tube and 375 microliters of Agencourt Ampure ™ beads were added to the sample, which was purified by incubating on a rotator for 10 minutes at room temperature. This sample was pulse spun and placed in a DynaMag ™ -2 magnet rack. After the solution became clear, the supernatant was removed and discarded. Subsequently, the sample was washed twice using the subsequent protocol. Without removing the sample from the magnet, 500 microliters of freshly made 70% ethanol was added to the sample. The tube containing the sample was rotated twice on the magnet to move the beads to the periphery. After the solution became clear, the ethanol was removed. This washing procedure was repeated. Following a second 70% ethanol wash and removal of the supernatant, the sample tube was pulse spun and returned to the magnet rack. Residual ethanol was aspirated and the sample was allowed to dry at room temperature for approximately 5 minutes. 50 microliters of 1 × TE was added to the cDNA, vortexed, pulse spun, and returned to the magnet rack. After the solution was clarified, the supernatant containing the eluted cDNA was transferred to a new 1.5 mL LoBind tube.
The amount of cDNA was quantified using an ion library quantification kit (www.lifetechnologies.com) according to the manufacturer's protocol. Five serial 10-fold dilutions were prepared from the E. coli DH10B control library according to the following table.
表3:大腸菌DH10Bコントロールライブラリーの希釈
ヌクレアーゼフリー水でサンプルライブラリーの1:20稀釈を先ず初めに調製した。以下の表に記載するように、1:2000及び1:20000の連続希釈をその後で調製した。
Table 3: E. coli DH10B control library dilutions
A 1:20 dilution of the sample library in nuclease-free water was first prepared. Serial dilutions of 1: 2000 and 1: 20,000 were then prepared as described in the table below.
表4:サンプルライブラリーの稀釈
各qPCR反応がトリプリケートで実施されるので、マスターミックスは、各qPCR反応につき250マイクロリットルのイオンライブラリーTaqMan(商標)qPCRミックス2x、25マイクロリットルのイオンライブラリーTaqMan(商標)定量アッセイ20x、及び100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を混合することによって調製した。各反応のために、15マイクロリットルのマスターミックスをPCRプレートのウェルに分注した。稀釈したコントロール又はサンプルライブラリーの5マイクロリットルを適切な各ウェルに添加した。鋳型無しのコントロール(NTC)として5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を用いた。ウェルに封をして、簡単に遠心分離し、以下のリアルタイムPCR条件に付した。
Table 4: Sample library dilutions
Since each qPCR reaction is performed in triplicate, the master mix is 250 microliters of ion library TaqMan ™ qPCR mix 2x, 25 microliters of ion library TaqMan ™ quantitative assay 20x for each qPCR reaction, and Prepared by mixing 100 microliters of nuclease-free water. For each reaction, 15 microliters of the master mix was dispensed into the wells of the PCR plate. Five microliters of diluted control or sample library was added to each appropriate well. As a control without template (NTC), 5 microliters of nuclease-free water was used. The wells were sealed, centrifuged briefly and subjected to the following real-time PCR conditions.
表5:qPCR反応のPCR条件
鋳型の稀釈係数は以下の等式を用いて計算した:
鋳型希釈係数=[(qPCR相対量)*(サンプルライブラリーの希釈倍数)]/0.32
サンプルをそのようにして稀釈し、Ion XpressTM鋳型キットv2.0(www.lifetechnologies.com)を用いた配列決定のために調製した。エマルジョンオイル(商標)(Emulsion OilTM)を冷蔵庫から取り出して混合した。9ミリリットルのエマルジョンオイル(商標)をIKA(商標)DT-20チューブに添加した。この充填IKA(商標)チューブを使用の準備ができるまで氷上に置いた。582マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、200マイクロリットルの5xPCR試薬ミックス、100マイクロリットルの10xPCR酵素ミックス、100マイクロリットルの Ion Sphere (商標)粒子(添加前に1分間ボルテックスで撹拌)及び18マイクロリットルの稀釈サンプルライブラリーを混合することによって水性PCRミックスを作製した。前記混合物を5秒間ボルテックスで撹拌して傍らに置き、その間にエマルジョンオイルを含むIKA(商標)DT-20チューブをIKA(商標)Ultra-Turrax(商標)チューブドライブに設置し適所に固定した。IKA(商標)DT-20チューブの蓋上の粘着ラベルを取り除き、サンプルのローディング口を露出させた。IKA(商標)Ultra-Turrax(商標)上のスタートボタンを押し、前記水性PCRミックスの全体積をIKA(商標)DT-20チューブの蓋の該開口部から分配した。IKA(商標)Ultra-Turrax(商標)チューブドライブ上で5分間混合した後、前記エマルジョンを氷上に約5分間置いた。前記エマルジョンを移すために、ピペットの先端からほぼ5mmを切り取って大きな内径を有するチップを作製した。この大きな内径のチップを取り付けたエッペンドルフ(商標)リピーター(商標)ピペットを用い、前記エマルジョンを抜き出し、ほぼ90ウェルが満たされるまで、96ウェルPCRプレートの各ウェルに100マイクロリットルの増加分で分配した。前記96ウェルプレートに蓋をし、以下のPCRパラメーターにしたがってサーマルサイクラーにかけた。
Table 5: PCR conditions for qPCR reactions
The dilution factor of the mold was calculated using the following equation:
Template dilution factor = [(qPCR relative amount) * (dilution factor of sample library)] / 0.32
Samples were so diluted and prepared for sequencing using the Ion Xpress ™ template kit v2.0 (www.lifetechnologies.com). Emulsion Oil ™ (Emulsion Oil ™ ) was removed from the refrigerator and mixed. Nine milliliters of Emulsion Oil ™ was added to the IKA ™ DT-20 tube. The filled IKA ™ tube was placed on ice until ready for use. 582 microliters of nuclease-free water, 200 microliters of 5xPCR reagent mix, 100 microliters of 10xPCR enzyme mix, 100 microliters of Ion Sphere ™ particles (vortexed for 1 minute before addition) and 18 microliters of dilution An aqueous PCR mix was made by mixing the sample library. The mixture was vortexed for 5 seconds and set aside while an IKA ™ DT-20 tube containing emulsion oil was placed in an IKA ™ Ultra-Turrax ™ tube drive and fixed in place. The adhesive label on the lid of the IKA ™ DT-20 tube was removed to expose the sample loading port. The start button on the IKA ™ Ultra-Turrax ™ was pressed and the entire volume of the aqueous PCR mix was dispensed from the opening in the lid of the IKA ™ DT-20 tube. After mixing for 5 minutes on an IKA ™ Ultra-Turrax ™ tube drive, the emulsion was placed on ice for about 5 minutes. In order to transfer the emulsion, a tip having a large inner diameter was prepared by cutting approximately 5 mm from the tip of the pipette. Using an Eppendorf (TM) Repeater (TM) pipette fitted with this large inner diameter tip, the emulsion was extracted and dispensed in 100 microliter increments into each well of a 96 well PCR plate until almost 90 wells were filled . The 96-well plate was capped and subjected to a thermal cycler according to the following PCR parameters.
表6:配列決定のためのPCRパラメーター
PCRの後で、ウェルの内容物を可能なかぎりマルチチャンネルピペットを用いてマルチチャンネルピペット溶液保持部分に移した。ほぼ1.2ミリリットルのエマルジョンを6つの1.5mL微小遠心分離チューブの各々に移した。6つの微小遠心分離チューブの全てを15,500xgで2分間遠心分離してエマルジョンを収集した。遠心分離の間に、2ミリリットルのリカバリーソリューション(Recovery SolutionTM)及び6ミリリットルの1-ブタノールを混合することによって、ブレーキングソリューション(Breaking SolutionTM)を作製した。続いて、前記ブレーキングソリューションを白色の微細な乳化物質が形成されるまで約1分間ボルテックスで撹拌した。前記エマルジョンを遠心分離した後、各チューブから油の清澄な最上部分画を除去した。白色のエマルジョンを含む6つのチューブをそれぞれ1mLのブレーキングソリューションで処理し、30秒間ボルテックスで撹拌し、さらに15,500xgで2分間遠心分離した。遠心分離後、各チューブの最上部有機相を除去した。各サンプルチューブに1mLのリカバリーソリューションを加え、30秒間ボルテックスで撹拌し、続いて15,500xgで2分間遠心分離した。各チューブの上清をほぼ100マイクロリットルのみが残されるまで除去した。同じピペットチップを用いて、6つのチューブの全てのペレットを再懸濁して新しい1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに移した。もとのチューブのうち3つを200マイクロリットルの一アリコット分のリカバリーソリューションを用いてリンスした。三番目のチューブをリンスした後、1つにまとめて再懸濁したペレットを含むチューブに前記溶液を移した。この手順を残りの3つのチューブで繰り返した。
全体積が1.5mLになるまでリカバリーソリューションを前記1つにまとめたチューブに添加した。続いて、前記チューブを30秒間ボルテックスで撹拌し、さらに15,500xgで3分間遠心分離した。ほぼ100マイクロリットルだけ残すように前記上清を除去した。残留物質を再懸濁し、新しい1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに移した。100マイクロリットルのウォッシュソリューション(Wash SolutionTM)をもとのチューブに添加してリンスし、続いて前記サンプルを含む前記新しいチューブに移した。このサンプルを、1mLのウォッシュソリューション(商標)を添加し、30秒間ボルテックスで撹拌し、続いて15,500xgで3分間チューブを遠心分離することによって2回洗浄した。100マイクロリットルだけ残すように上清を除去した。この洗浄手順を繰り返した。
Table 6: PCR parameters for sequencing
After PCR, the contents of the well were transferred to the multichannel pipette solution holding part using a multichannel pipette as much as possible. Approximately 1.2 milliliters of the emulsion was transferred to each of six 1.5 mL microcentrifuge tubes. All six microcentrifuge tubes were centrifuged at 15,500 xg for 2 minutes to collect the emulsion. During the centrifugation, a breaking solution (Breaking Solution ™ ) was made by mixing 2 ml of Recovery Solution ™ and 6 ml of 1-butanol. Subsequently, the braking solution was vortexed for about 1 minute until a white fine emulsified material was formed. After centrifuging the emulsion, the clear top fraction of oil was removed from each tube. Each of the 6 tubes containing the white emulsion was treated with 1 mL of the braking solution, vortexed for 30 seconds and then centrifuged at 15,500 xg for 2 minutes. After centrifugation, the top organic phase of each tube was removed. 1 mL of recovery solution was added to each sample tube and vortexed for 30 seconds, followed by centrifugation at 15,500 × g for 2 minutes. The supernatant of each tube was removed until only approximately 100 microliters remained. Using the same pipette tip, all pellets from the 6 tubes were resuspended and transferred to a new 1.5 ml microcentrifuge tube. Three of the original tubes were rinsed with an aliquot of 200 microliters of recovery solution. After rinsing the third tube, the solution was transferred to the tube containing the single resuspended pellet. This procedure was repeated with the remaining three tubes.
Recovery solution was added to the combined tube until the total volume was 1.5 mL. Subsequently, the tube was vortexed for 30 seconds and further centrifuged at 15,500 × g for 3 minutes. The supernatant was removed so that only approximately 100 microliters remained. Residual material was resuspended and transferred to a new 1.5 ml microcentrifuge tube. 100 microliters of Wash Solution ™ was added to the original tube, rinsed, and then transferred to the new tube containing the sample. The sample was washed twice by adding 1 mL Wash Solution ™, vortexing for 30 seconds, followed by centrifuging the tube at 15,500 × g for 3 minutes. The supernatant was removed to leave only 100 microliters. This washing procedure was repeated.
鋳型陽性イオンスフェア(商標)(Ion SphereTM)粒子の濃縮をイオンエクスプレス(商標)(Ion XpressTM)テンプレートキットv2.0プロトコル(www.lifetechnologies.com)にしたがって実施した。ダイナビーズ(商標)MyOneTMストレプトアビジンC1ビーズをボルテックスで撹拌した。10マイクロリットルのMyOneTMビーズを1.5ミリリットルの微小遠心分離チューブに移し、70マイクロリットルのウォッシュソリューション(商標)で洗浄し、ボルテックスで撹拌し、マグネット上に2分間置いた。続いて上清を廃棄した。前記MyOneTMビーズを10マイクロリットルの新しいウォッシュソリューション(商標)に再懸濁し、続いてイオンスフェア粒子(商標)(ISP)を含むサンプルチューブに移した。捕捉を行うために、100マイクロリットルのアニーリングバッファー(商標)(Annealing BufferTM)もまた前記サンプルチューブに添加した。続いて前記チューブを回転装置上に室温で10分間置いた。サンプルチューブを遠心分離し、溶液が清澄になるまでマグネット上に置いた。上清を“未結合”と標識したチューブに移した。前記ビーズを200マイクロリットルのウォッシュソリューション(商標)で2回洗浄し、混合し、さらに上清を“未結合”チューブに移す前にマグネット上に戻した。新しいメルトオフソリューション(商標)(Melt-OFF SolutionTM)を、分子グレード水中の200マイクロリットルの1M NaOH、16マイクロリットルの10%トゥイーン(商標)20、及び1.38ミリリットルの分子グレード水を混合することによって調製した。イオンスフェア粒子をダイナビーズ(商標)MyOneTMストレプトアビジンC1ビーズから溶出させるために、400マイクロリットルのメルトオフ溶液(商標)を前記サンプルチューブに添加し、混合し、続いて7分間回転装置に置いた。その後上清を取り出し、“濃縮1”と標識したチューブに入れた。前記“濃縮1”のチューブをボルテックスで撹拌し、続いて15,500xgで4分間回転させた。100マイクロリットルの上清を除いて全てを廃棄した。続いて1マイクロリットルのウォッシュソリューション(商標)を前記“濃縮1”チューブに適用し、ボルテックスで撹拌し、15,500xgで4分間回転させた。さらにもう一度、100マイクロリットルの上清を除いて全てを除去した。残留サンプルを混合し、“濃縮1”チューブを前記マグネットに戻した。数分後に上清を取り出し、前記を“濃縮2”と標識したチューブに入れた。
Concentration of template positive ion sphere ™ (Ion Sphere ™ ) particles was performed according to the Ion Express ™ (Ion Xpress ™ ) template kit v2.0 protocol (www.lifetechnologies.com). Dynabead ™ MyOne ™ Streptavidin C1 beads were vortexed. Ten microliters of MyOne ™ beads were transferred to a 1.5 milliliter microcentrifuge tube, washed with 70 microliters of Wash Solution ™, vortexed and placed on a magnet for 2 minutes. Subsequently, the supernatant was discarded. The MyOne ™ beads were resuspended in 10 microliters of a new Wash Solution ™ and subsequently transferred to a sample tube containing Ionsphere Particles ™ (ISP). To perform the capture, 100 microliters of Annealing Buffer ™ was also added to the sample tube. The tube was then placed on a rotator for 10 minutes at room temperature. The sample tube was centrifuged and placed on a magnet until the solution was clear. The supernatant was transferred to a tube labeled “unbound”. The beads were washed twice with 200 microliters of Wash Solution ™, mixed, and the supernatant was returned to the magnet before being transferred to “unbound” tubes. Mix the new Melt-OFF Solution ™ with 200 microliters of 1M NaOH in molecular grade water, 16 microliters of 10% Tween ™ 20, and 1.38 milliliters of molecular grade water. It was prepared by. To elute ion microspheres particles from the Dynabeads (TM) MyOne TM Streptavidin C1 beads, 400 microliters Merutoofu solution (R) was added to the sample tube, mixed and placed followed by 7 minutes rotary device . The supernatant was then removed and placed in a tube labeled “Concentration 1”. The “concentration 1” tube was vortexed and then spun at 15,500 × g for 4 minutes. All but 100 microliter of supernatant was discarded. Subsequently, 1 microliter of Wash Solution ™ was applied to the “Concentrated 1” tube, vortexed and spun at 15,500 × g for 4 minutes. Once again, all but 100 microliters of supernatant was removed. The remaining sample was mixed and the “concentrated 1” tube was returned to the magnet. After several minutes, the supernatant was removed and placed in a tube labeled “
ライフテクノロジーズイオン配列決定キットv2.0ユーザーマニュアル(www.lifetechnologies.com)にしたがい、DNA配列決定を実施した。“濃縮2”チューブのサンプルの50マイクロリットルを新しい0.2mL PCRチューブに移した。5マイクロリットルのコントロールイオンスフェア(商標)(Control Ion SpheresTM)及び150マイクロリットルのアニーリングバッファー(商標)を添加し、前記溶液を混合し、15,500xgで2分間遠心分離した。9マイクロリットルだけ残すように上清を除去した。5マイクロリットルのシーケンシングプライマー(商標)(Sequencing PrimerTM)を前記サンプルに添加し、一サイクル(95℃で2分、続いて37℃で2分)のためにサーマルサイクラーに置いた。続いて前記サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、1マイクロリットルのシーケンシングポリメラーゼ(商標)(Sequencing PolymeraseTM)とともに混合し、室温で5分インキュベートした。
一方、新しいチップをパッケージから取り出し、イオン(商標)遠心分離アダプター/ローターバケットに置いた。レイニン(商標)(Rainin(商標))SR-L200Fピペットチップを用いて、50マイクロリットルの100%イソプロパノールをチップの大きな口に添加し、続いて他方の口から吸引した。前記チップを2回50マイクロリットルのアニーリングバッファー(商標)で前記チップの大きい口から洗浄し、前記バッファーを他方の口から吸引した。
PGMTMシークェンサーのメインメニューの“実験”タブを押した。シークェンサーが動き出したとき、古いチップを新しいチップに交換した。バーコードスキャナーを用いて、該パッケージのチップバーコードをスキャンした。バーコードが入力された後、“チップチェック”ボタンを押した。チップチェック完了後、“次へ”のボタンを押して、チップのカリブレーションに進んだ。カリブレーションの後、チップを取り出し、イオン(商標)遠心分離アダプター/ローターバケットに戻し、50マイクロリットルのアニーリングバッファーでチップの大きい口から洗浄し、前記バッファーをチップの他方の口から吸引した。レイニン(商標)SR-L200Fチップ付きレイニン(商標)ピペット-ライト(商標)(Pipette-Lite(商標))LTS-20ピペットを用いて、7マイクロリットルのサンプルを前記チップの大きい口に配置した。続いて前記チップの他方の口に移動した液体を除去した。続いてイオンチップ(商標)(Ion ChipTM)を遠心分離器に移し、4分間回転させた。新しいレイニン(商標)SR-L200Fチップを用いて、サンプルの残りを前記チップのローディング口に配置した。異動した液体を他方の口から除去し、チップを再び4分間遠心分離した。最後の回転が終了した後、PGMスクリーン上の“次へ”のボタンを押し、前記チップをイオントーレント(Ion Torrent)PGMTMマシーンに戻してロードし、配列決定を開始させた。
DNA sequencing was performed according to the Life Technologies Ion Sequencing Kit v2.0 User Manual (www.lifetechnologies.com). 50 microliters of the sample in the “concentrated 2” tube was transferred to a new 0.2 mL PCR tube. 5 microliters of Control Ion Spheres ™ and 150 microliters of annealing buffer ™ were added, the solution was mixed and centrifuged at 15,500 × g for 2 minutes. The supernatant was removed to leave only 9 microliters. Five microliters of Sequencing Primer ™ (Sequencing Primer ™ ) was added to the sample and placed in a thermal cycler for one cycle (95 ° C for 2 minutes followed by 37 ° C for 2 minutes). The sample was then removed from the thermal cycler, mixed with 1 microliter of Sequencing Polymerase ™ and incubated at room temperature for 5 minutes.
Meanwhile, a new chip was removed from the package and placed in an Ion ™ centrifuge adapter / rotor bucket. Using a Rainin ™ SR-L200F pipette tip, 50 microliters of 100% isopropanol was added to the large mouth of the tip followed by aspiration from the other mouth. The chip was washed twice with 50 microliters of annealing buffer ™ from the large mouth of the chip and the buffer was aspirated from the other mouth.
Press the “Experiment” tab in the main menu of the PGM TM sequencer. When the sequencer started moving, the old chip was replaced with a new one. The chip barcode of the package was scanned using a barcode scanner. After entering the bar code, press the “Chip Check” button. After completing the chip check, press the “Next” button to proceed to chip calibration. After calibration, the chip was removed and returned to the ION ™ centrifuge adapter / rotor bucket, washed from the large mouth of the chip with 50 microliters of annealing buffer, and the buffer was aspirated from the other mouth of the chip. Using a Rainin ™ Pipette-Lite ™ LTS-20 pipette with a Rainin ™ SR-L200F tip, a 7 microliter sample was placed in the large mouth of the tip. Subsequently, the liquid moved to the other mouth of the chip was removed. Subsequently, Ion Chip ™ was transferred to a centrifuge and rotated for 4 minutes. Using a new Rainin ™ SR-L200F chip, the rest of the sample was placed in the loading port of the chip. The transferred liquid was removed from the other mouth and the chip was again centrifuged for 4 minutes. After the last rotation was completed, the “Next” button on the PGM screen was pressed to load the chip back into the Ion Torrent PGM ™ machine and start sequencing.
配列判読物は、DNAStarソフトウェアSeqmanNexGen(商標)(DNASTAR, Inc., 3801 Regent Street, Madison, WI 53705; www.dnastar.com)を用いde novoアッセンブリーオプションでアッセンブリングした。配列アッセンブリーによって7つのコンティーグが同定され、それらコンティーグは、それらの各々に関係する10,000を超える判読物を含んでいた。これらのコンティーグを、それらが完全なオープンリーディングフレームを表すようにトリミングした。前記トリミング配列及び対応するタンパク質配列は、配列番号:4−17として本出願に含まれる。仮説的な翻訳オープンリーディングフレームのBLASTP分析によって、ヒトインフルエンザCの単離株の7つのセグメントとの相同性が明らかになり前記単離株をC/ブタ/Oklahoma/1334/2011と命名した。各セグメントのもっとも近縁なホモローグを下記に示す。非構造タンパク質(NS)をコードすると注釈が付されたセグメントはmRNAに転写され、選択的スプライシングにより下記表7のように2つの異なるタンパク質(NS1及びNS2)が得られる。陽性パーセンテージは、単離されたインフルエンザCウイルスと公開データベース中に存在する、各セグメントに対してもっとも近縁なホモローグとの間のパーセント類似性を示す。PB1はヒトインフルエンザC単離株C/Johannesburg/1/66と中等度の相同性(85%類似性)を示したが、他の全てのセグメントは、以前に配列決定されたインフルエンザCとは低い相同性を示した(他のセグメントに対する%類似性は48−71%)。C/ブタ/Oklahoma/1334/2011と以前に配列決定されたウイルスとの間のこの低い全体的類似性は、本ウイルスの固有性を示している。 Sequence interpretation was assembled with the de novo assembly option using the DNAStar software SeqmanNexGen ™ (DNASTAR, Inc., 3801 Regent Street, Madison, Wis. 53705; www.dnastar.com). Seven contigs were identified by the sequence assembly, which contained over 10,000 readings associated with each of them. These contigs were trimmed so that they represented a complete open reading frame. The trimming sequence and the corresponding protein sequence are included in the present application as SEQ ID NOs: 4-17. A BLASTP analysis of a hypothetical translational open reading frame revealed homology with seven segments of the human influenza C isolate, which was named C / pig / Oklahoma / 1334/2011. The closest homologue of each segment is shown below. Segments annotated to encode nonstructural proteins (NS) are transcribed into mRNA and alternative splicing yields two different proteins (NS1 and NS2) as shown in Table 7 below. The positive percentage indicates the percent similarity between the isolated influenza C virus and the closest homologue for each segment present in the public database. PB1 showed moderate homology (85% similarity) with human influenza C isolate C / Johannesburg / 1/66, but all other segments were lower than previously sequenced influenza C Showed homology (% similarity to other segments 48-71%). This low overall similarity between C / pig / Oklahoma / 1334/2011 and the previously sequenced virus indicates the uniqueness of the virus.
表7:BLAST相同性
Table 7: BLAST homology
蔓延性を決定するための血清学的調査
C/ブタ/Oklahoma/1334/2011をヒトインフルエンザCと低い配列相同性を有する新規なウイルスと立証したので、血清学的調査を実施して、ヒト及びブタの両方で感染発生率を決定した。多数の州からニューポートラボラトリーズに付託された、約200の任意抽出ブタ血清サンプルを、血球凝集阻害アッセイを用いてC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に対する抗体について分析した。約8%のサンプルがHIアッセイで陽性で、10−160の力価を示した。
同様に、セント・ジュード小児病院(St Jude’s Children’s Hospital;Memphis, TN)の共同研究者らは、カナダの高齢者(65−95歳)から収集したヒト血清バンクでHIアッセイを実施した。約28%のサンプルが10−80の陽性HI力価を示した。総合すれば、これらの結果は、ヒト及びブタはC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に広く曝露されていることを示している。これらの結果はまた、このウイルスがヒト及びブタに感染できることを示唆している。
ブタのワクチン免疫及びチャレンジ実験
C/ブタ/Oklahoma/1334/2011を高力価(HA=2560)に増殖させ、バイナリーエチレンイミンで不活化し、続いて10%トリゲン(Trigen)(水中油アジュバント)を添加して死滅ウイルスワクチンを作製した。C/ブタ/Oklahoma/1334/2011に対する抗体について血清学的に陰性の22匹のブタに、0日目及び14日目に2mLの不活化ウイルスワクチンの筋肉内デリバリーによりワクチン接種した。血清サンプルを0、14及び28日目に収集してHI力価について分析した。28匹のブタもまた非ワクチン接種コントロールとして含まれた。ワクチン接種ブタは28日までに血清転換を示し、平均HI力価は433を有した。非ワクチン接種ブタはHIアッセイで陰性であった。表8及び図3はそれらの結果を示す。ワクチン接種ブタは強い血清転換を示した。インフルエンザAでの大ざっぱな指針は、40を超えるHI力価は防御能力を示す。チャレンジ前のワクチン接種ブタの血清で測定した抗体は、防御抗体が存在していたことを示唆している。このデータはチャレンジ結果と一致する。
Serological investigations to determine prevalence
Since C / pig / Oklahoma / 1334/2011 was demonstrated as a novel virus with low sequence homology to human influenza C, serological studies were performed to determine the incidence of infection in both humans and pigs. Approximately 200 randomly extracted porcine serum samples submitted to Newport Laboratories from a number of states were analyzed for antibodies to C / pig / Oklahoma / 1334/2011 using a hemagglutination inhibition assay. About 8% of the samples were positive in the HI assay and showed a titer of 10-160.
Similarly, collaborators at St Jude's Children's Hospital (Memphis, TN) performed HI assays on human serum banks collected from Canadian older adults (aged 65-95). About 28% of samples showed 10-80 positive HI titers. Taken together, these results indicate that humans and pigs are widely exposed to C / pig / Oklahoma / 1334/2011. These results also suggest that this virus can infect humans and pigs.
Pig immunization and challenge experiments
C / pig / Oklahoma / 1334/2011 is grown to high titer (HA = 2560), inactivated with binary ethyleneimine, and then killed with 10% Trigen (oil-in-water adjuvant) Was made. Twenty-two pigs serologically negative for antibodies against C / pig / Oklahoma / 1334/2011 were vaccinated by intramuscular delivery of 2 mL of inactivated virus vaccine on
28日目に、11匹のワクチン接種ブタ及び11匹の非ワクチン接種ブタを、6.2log10 TCID/mLのC/ブタ/Oklahoma/1334/2011の2mLにより鼻内にチャレンジした。チャレンジ後2日目に、11匹のワクチン接種及び11匹の非ワクチン接種ブタを当該部屋に加え、接触曝露チャレンジグループとして供した。チャレンジ日からチャレンジ後14日まで1日おきに体温を測定した。表9は結果を示す On day 28, 11 vaccinated and 11 non-vaccinated pigs were challenged intranasally with 2 mL of 6.2 log10 TCID / mL C / pig / Oklahoma / 1334/2011. Two days after challenge, 11 vaccinated and 11 non-vaccinated pigs were added to the room and served as a contact exposure challenge group. Body temperature was measured every other day from the challenge date to 14 days after challenge. Table 9 shows the results
処置グループ間に相違は観察されず、インフルエンザが典型的には発熱をもたらすようには、このウイルスは発熱を引き起こさないことが示された。同様に、鼻拭き取り検体をチャレンジ日からチャレンジ14日後まで1日おきに収集した。 No difference was observed between treatment groups, indicating that the virus does not cause fever, as influenza typically produces fever. Similarly, nasal wipes were collected every other day from the challenge date to 14 days after the challenge.
ウイルスの存在をアッセイする方法
拭き取り検体からRNAを調製し、インフルエンザCの存在を逆転写リアルタイムPCR(rt-RT-PCR)によってアッセイした。C/ブタ/Oklahoma/1334/2011のゲノム配列を基にして設計した以下のプライマー及びプローブを用いた。プライマー及びプローブのヌクレオチド配列は本出願には配列番号:1−3として含まれ、ここでフォワードプライマー=5’-GCT GTT TGC AAG TTG ATG GG-3’(配列番号:1);リバースプライマー=5’-TGA AAG CAG GTA ACT CCA AGG-3’(配列番号:2)、及びプローブ=Cy5-標識-5’-TTC AGG CAA GCA CCC GTA GGA TT-3'-(配列番号:3)-IABkQである。
結果は表10及び図3に示す。“Ct”はサイクル閾値を意味する。リアルタイムPCRでは、遺伝物質(RNA又はDNA)は、以下のように多様な温度でサンプル/酵素をサイクルさせることによってポリメラーゼにより複写される。リアルタイムPCRは、生成されたDNA産物と結合する蛍光レポーターを使用する。サイクルが進行しDNA生成物が蓄積するにつれ、より多くの蛍光が生成される。いくつかの時点で、蛍光がPCRマシーンによって検出される。一定レベルの蛍光の検出は閾値と呼ばれる。この閾値レベルを超える蛍光を生成するために必要なサイクル数はCtと称される。リアルタイムPCRは、より多くのDNA/RNAがPCR開始前に存在する場合に閾値を超える蛍光の生成に必要なサイクル/ダブリング数がより小さくなるように、出発サンプル中のRNA/DNAの量を定量できる。
したがって、より低いCt値はもとのサンプル中のより高レベルのDNA/RNAに一致する。
Methods for assaying for the presence of virus RNA was prepared from wipes and assayed for the presence of influenza C by reverse transcription real-time PCR (rt-RT-PCR). The following primers and probes designed based on the genomic sequence of C / pig / Oklahoma / 1334/2011 were used. The nucleotide sequences of the primers and probes are included in this application as SEQ ID NOs: 1-3, where forward primer = 5′-GCT GTT TGC AAG TTG ATG GG-3 ′ (SEQ ID NO: 1); reverse primer = 5 '-TGA AAG CAG GTA ACT CCA AGG-3' (SEQ ID NO: 2), and probe = Cy5-labeled-5'-TTC AGG CAA GCA CCC GTA GGA TT-3'- (SEQ ID NO: 3) -IABkQ is there.
The results are shown in Table 10 and FIG. “Ct” means cycle threshold. In real-time PCR, genetic material (RNA or DNA) is copied by the polymerase by cycling the sample / enzyme at various temperatures as follows. Real-time PCR uses a fluorescent reporter that binds to the generated DNA product. As the cycle progresses and the DNA product accumulates, more fluorescence is generated. At some point, fluorescence is detected by the PCR machine. The detection of a certain level of fluorescence is called the threshold. The number of cycles required to produce fluorescence above this threshold level is referred to as Ct. Real-time PCR quantifies the amount of RNA / DNA in the starting sample so that fewer cycles / doublings are required to generate fluorescence that exceeds the threshold when more DNA / RNA is present before PCR starts it can.
Thus, lower Ct values are consistent with higher levels of DNA / RNA in the original sample.
上記の図表のCt値は鼻拭き取り検体におけるウイルスRNAレベルを示す。37.1は陰性である。37.1未満の値はいずれもウイルスRNA陽性である(したがってウイルスが排出されている)。このデータはまた図3に図示されている。非ワクチン接種チャレンジグループのウイルスRNA排出数は、ワクチン接種動物と顕著に相違する。我々は前記データに関してスチューデントt-検定を実施し、直接チャレンジの非ワクチン接種動物は、他のグループよりも高いレベルでウイルスを排出した(P<0.001)。したがって、このワクチンはブタを防御した。ウイルスは、直接曝露又は接触曝露のどちらかでチャレンジ後にただ1匹のワクチン接種ブタから検出されただけであった。対照的に、非ワクチン接種ブタはチャレンジ後3日目に(直接チャレンジ)又は暴露後6日目に(接触チャレンジ)ウイルスを排出し始めた。この実験は、本ウイルスはブタに感染できブタで複製可能で、環境及び接触動物にウイルスを排出することを示している。さらにまた、相同なワクチンでワクチン免疫されたブタは感染から完全に防禦される。
フェレットのチャレンジ
典型的にはヒトインフルエンザウイルスはフェレットで良好に複製するので、インフルエンザの研究でフェレットはヒトの代用動物として一般的に用いられる。インフルエンザCは一般的にはヒトの病源体と考えられるので、C/ブタ/Oklahoma/1334/2011をフェレットのチャレンジに用いて、このウイルスがヒトの病源体であり得るか否かを決定した。3匹のフェレットの鼻内に6.0log10組織培養感染用量50/mL(TCID50/mL)を用いてチャレンジした。チャレンジ後1日目に3匹のフェレットを当該囲いに加え、接触動物として供した。さらにまた、3匹のフェレットを別個の囲いに収容して、エーロゾル曝露のみの動物として供した。表11及び図4に結果を示す。
The Ct values in the chart above indicate viral RNA levels in nasal wipes. 37.1 is negative. Any value below 37.1 is positive for viral RNA (thus the virus is being excreted). This data is also illustrated in FIG. The number of viral RNA excretion in the non-vaccinated challenge group is significantly different from vaccinated animals. We performed a student t-test on the data, and directly challenged non-vaccinated animals shed virus at a higher level than the other groups (P <0.001). Therefore, this vaccine protected pigs. Virus was only detected in one vaccinated pig after challenge with either direct exposure or contact exposure. In contrast, non-vaccinated pigs began to drain virus 3 days after challenge (direct challenge) or 6 days after exposure (contact challenge). This experiment shows that the virus can infect pigs and is replicable in pigs and excretes the virus to the environment and contact animals. Furthermore, pigs vaccinated with homologous vaccines are completely protected from infection.
Ferret Challenge Ferrets are commonly used as human surrogates in influenza research because human influenza viruses typically replicate well in ferrets. Since influenza C is generally considered a human pathogen, C / pig / Oklahoma / 1334/2011 was used for ferret challenge to determine whether this virus could be a human pathogen. Three ferrets were challenged with a 6.0 log 10 tissue culture infectious dose of 50 / mL (TCID 50 / mL) in the nose. On the first day after challenge, 3 ferrets were added to the enclosure and served as contact animals. Furthermore, three ferrets were housed in separate enclosures and served as aerosol-only animals. The results are shown in Table 11 and FIG.
表11:直接接種、直接接触又はエーロゾル接触によってC/ブタ/Oklahoma/1334/2011に感染させたフェレットの鼻拭き取り検体洗浄液で検出されたウイルスのTCID50/mL
Table 11: TCID 50 / mL of viruses detected in nasal wipes of ferrets infected with C / pigs / Oklahoma / 1334/2011 by direct inoculation, direct contact or aerosol contact
ウイルスはST細胞の滴定によって鼻拭き取り検体で検出した。ウイルスは、鼻内チャレンジ動物でチャレンジ後3日目までに、接触チャレンジフェレットで暴露後6日目までに検出された。エーロゾル曝露フェレットではウイルスは検出されなかった。このデータはC/ブタ/Oklahoma/1334/2011は、直接チャレンジ又はチャレンジ動物との接触のどちらかによって曝露フェレットに感染できることを示している。しかしながら、このウイルスはエーロゾル伝播を介しては拡散しないように思われる。このことは、C/ブタ/Oklahoma/1334/2011はおそらくヒトに感染できることを示唆する。
Virus was detected in nasal wipes by ST cell titration. Virus was detected by intranasal challenge animals by day 3 after challenge and by contact challenge ferret by
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載した方法及び材料と同様又は等価の方法及び材料を用いて本発明を実施又は試験することができるが、適切な方法及び材料が下記に記載される。本明細書に記載した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、該当する法律及び規制が容認する範囲で参照によりその全体が本明細書に含まれる。矛盾が生じる場合は、本明細書(定義を含む)が優先するであろう。
本発明は、本発明の趣旨又は本質的属性から外れることなく他の具体的な形態で実施することが可能であり、したがって、本実施態様はあらゆる点から例示的であり非制限的であると考えられ、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲を本発明の趣旨を示すために照合することが所望される。
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although the invention can be practiced or tested using methods and materials similar or equivalent to those described herein, suitable methods and materials are described below. All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are hereby incorporated by reference in their entirety to the extent permitted by applicable law and regulation. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.
The present invention can be implemented in other specific forms without departing from the spirit or essential attributes of the present invention, and thus the embodiments are illustrative and non-limiting in all respects. It is contemplated that it is desirable to refer to the appended claims rather than the foregoing description to demonstrate the spirit of the invention.
Claims (11)
(a)フォワード及びリバースプライマーを含む少なくとも1つの精製オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて該サンプル由来の少なくとも1つの核酸の1つ以上のセグメントを増幅させる工程であって、該フォワードプライマーが配列番号:1を含み、さらにリバースプライマーが配列番号:2を含み、少なくとも1つの増幅生成物を生成する、前記工程;及び
(b)該増幅生成物を検出し、それによって該サンプル中のブタインフルエンザCウイルスの存在を検出する工程。 A method for detecting the presence of swine influenza C virus according to claim 7 in at least one sample, comprising the following steps (a) and (b):
(A) amplifying one or more segments of at least one nucleic acid from the sample using at least one purified oligonucleotide primer pair comprising forward and reverse primers, wherein the forward primer is SEQ ID NO: 1 And wherein the reverse primer comprises SEQ ID NO: 2 and produces at least one amplification product; and (b) detecting the amplification product, thereby detecting swine influenza C virus in the sample Detecting the presence.
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