JP6253529B2 - 疲労抑制剤の探索方法 - Google Patents
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Description
本発明は、疲労抑制剤を探索する方法に関する。
現代社会においては、過重労働やストレスなどから疲労が蔓延している。例えば、１９９９年、日本で行われた疲労の実態調査（厚生省研究班 班長：大阪大学 木谷照夫）の結果では、名古屋地区の一般地域住民４，０００名（有効回答数３，０１５）のうち、５９．１％の人が疲労を自覚しており、３５．８％の人では半年以上続く慢性的な疲労が認められていることが明らかになっている（非特許文献１）。
このような状況から、抗疲労素材の開発が望まれ、近年、新緑の緑葉が放散する「緑の香り」が、拘束ストレスに起因してＦｏｓ様タンパク質を発現したラットにおいて、Ｆｏｓ様タンパク質の発現を抑制すること（非特許文献２）、更にはトランス−２−ヘキセナールとシス−３−ヘキセノールの混合物（以下、「トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物」と称する）の香りが疲労回復効果を持つことが報告されている（特許文献１）。
このような状況から、抗疲労素材の開発が望まれ、近年、新緑の緑葉が放散する「緑の香り」が、拘束ストレスに起因してＦｏｓ様タンパク質を発現したラットにおいて、Ｆｏｓ様タンパク質の発現を抑制すること（非特許文献２）、更にはトランス−２−ヘキセナールとシス−３−ヘキセノールの混合物（以下、「トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物」と称する）の香りが疲労回復効果を持つことが報告されている（特許文献１）。
疲労は、精神あるいは身体に負荷を与えた際に作業効率（パフォーマンス）が一過性に低下した状態と定義できる。そのため、抗疲労素材の開発においては、主観的な疲労評価である疲労のVAS （Visual Analogue Scale）評価だけでなく、作業負荷によるパフォーマンス（作業効率）評価を行うことが推奨されている（非特許文献３）。
したがって、これらの評価は、被験者に一定の疲労を負荷した後、その効果を評価する必要があるため、一度に多くの素材を評価することはできないという課題があった。
したがって、これらの評価は、被験者に一定の疲労を負荷した後、その効果を評価する必要があるため、一度に多くの素材を評価することはできないという課題があった。
木谷照夫．疲労の実態調査と健康づくりのための疲労回復法に関する研究（厚生省）．平成11年度研究業績報告．2000.
第７６回日本生理学会講演要旨、第２５８頁、１９９９年
本疲労学会 抗疲労臨床評価ガイドライン
本発明は、疲労抑制剤又はその候補物質を効率良く探索する方法を提供する。
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。近年、嗅覚受容体を培養細胞で機能的に発現させ、受容体の活動を個別に観察する手法が開発され（Katada et al, Biochem Biophys Res Commun 2003, 305:964-969）、特定の嗅覚受容体を発現する培養細胞を用いて当該嗅覚受容体のリガンドを探索する方法が知られている（国際公開第２００６／００２１６１号、国際公開第２００８／００８２２４号）。
本発明者は、上記の疲労回復効果を有するトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功し、その中から選ばれた特定の嗅覚受容体の応答を指標とすることにより、疲労抑制剤又はその候補物質を評価・選択できることを見出した。
本発明者は、上記の疲労回復効果を有するトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに応答する嗅覚受容体を新たに同定することに成功し、その中から選ばれた特定の嗅覚受容体の応答を指標とすることにより、疲労抑制剤又はその候補物質を評価・選択できることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の工程ａ）〜ｃ）を含む疲労抑制剤又はその候補物質の探索方法に係るものである。
ａ）ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６からなる嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加する工程
ｂ）当該試験物質に対する当該受容体ポリペプチドの応答を測定する工程
ｃ）測定された応答に基づいて、当該応答を増強する試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する工程
ａ）ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６からなる嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加する工程
ｂ）当該試験物質に対する当該受容体ポリペプチドの応答を測定する工程
ｃ）測定された応答に基づいて、当該応答を増強する試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する工程
本発明によれば、疲労抑制剤又はその候補物質を簡易且つ効率よく探索することができる。
本発明において、「疲労」とは、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えた際にみられる一時的な身体的及び精神的パフォーマンスの低下現象を意味し、ここで、パフォーマンスの低下は、身体的及び精神的作業能力の質的あるいは量的な低下を示す。そして、「疲労抑制」は、上記疲労を減弱させる作用や疲労を回復させる作用を意味する。
また、本発明の「疲労」には、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）や過労死も含まれる。
慢性疲労症候群は、原因不明の慢性的な疲労感のために健全な社会生活が送れなくなるという病態として知られ（日本内科学会雑誌、８１：５７３−５８２（１９９２））、その基本的な症状として、例えば、原因不明の激しい全身倦怠感、微熱、頭痛、リンパ節腫脹、筋肉痛、脱力感、思考力又は集中力に関する障害、抑うつ症状、及び睡眠障害などが挙げられる。
過労死とは、重度の過労状態にあり、身体的活力を保つことができないにも拘らず、疲労を十分に感じることができなくなり、その結果、脳血管疾患や心疾患を発症して永久的労働不能や死亡に至った状態を意味する。
したがって、本発明の疲労抑制剤は、斯かる慢性疲労症候群の各症状を緩和し、正常な状態に移行させること、更にはそれにより過労死を予防することを包含する。
また、本発明の「疲労」には、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）や過労死も含まれる。
慢性疲労症候群は、原因不明の慢性的な疲労感のために健全な社会生活が送れなくなるという病態として知られ（日本内科学会雑誌、８１：５７３−５８２（１９９２））、その基本的な症状として、例えば、原因不明の激しい全身倦怠感、微熱、頭痛、リンパ節腫脹、筋肉痛、脱力感、思考力又は集中力に関する障害、抑うつ症状、及び睡眠障害などが挙げられる。
過労死とは、重度の過労状態にあり、身体的活力を保つことができないにも拘らず、疲労を十分に感じることができなくなり、その結果、脳血管疾患や心疾患を発症して永久的労働不能や死亡に至った状態を意味する。
したがって、本発明の疲労抑制剤は、斯かる慢性疲労症候群の各症状を緩和し、正常な状態に移行させること、更にはそれにより過労死を予防することを包含する。
本発明において、「嗅覚受容体ポリペプチド」とは、嗅覚受容体又はそれと同等の機能を有するポリペプチドをいい、嗅覚受容体と同等の機能を有するポリペプチドとは、嗅覚受容体と同様に、細胞膜上に発現することができ、匂い分子の結合によって活性化するポリペプチドをいう（Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，５：２６３−２７８）。
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本発明の疲労抑制剤又はその候補物質の探索方法は、ａ）ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６からなる嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加する工程、ｂ）当該試験物質に対する当該受容体ポリペプチドの応答を測定する工程、ｃ）測定された応答に基づいて、当該応答を増強する試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する工程、を含む。
本発明の方法においてＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６は、いずれもヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体である。
ＯＲ１Ａ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２８９５４７６２２として登録されている。ＯＲ１Ａ１は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ２Ｊ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０７５８８２４５として登録されている。ＯＲ２Ｊ３は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ２Ｗ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１６９２３４７８８として登録されている。ＯＲ２Ｗ１は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ５Ｋ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１１５２７０９５４として登録されている。ＯＲ５Ｋ１は、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ５Ｐ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２３５９２２２９として登録されている。ＯＲ５Ｐ３は、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ１０Ａ６は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２２１８８３５として登録されている。ＯＲ１０Ａ６は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
図１に示すように、当該ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６を含む嗅覚受容体ポリペプチドは、疲労回復効果を有することが知られているトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに対して応答を示すことが明らかにされた。
よって、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の６種の嗅覚受容体と機能的に等価なポリペプチドは、嗅覚受容体ポリペプチドとして当該６種の嗅覚受容体と同様に本発明の方法に使用することができる。斯かる嗅覚受容体ポリペプチドとしては、例えば、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の各アミノ酸に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物に対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、シス−３−ヘキセノールとトランス−２−ヘキセナールの混合比率は、特に限定されないが、等モル混合物であるのが好ましい。
ＯＲ１Ａ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２８９５４７６２２として登録されている。ＯＲ１Ａ１は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ２Ｊ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０７５８８２４５として登録されている。ＯＲ２Ｊ３は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ２Ｗ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１６９２３４７８８として登録されている。ＯＲ２Ｗ１は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ５Ｋ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１１５２７０９５４として登録されている。ＯＲ５Ｋ１は、配列番号７で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ５Ｐ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：２３５９２２２９として登録されている。ＯＲ５Ｐ３は、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ＯＲ１０Ａ６は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５２２１８８３５として登録されている。ＯＲ１０Ａ６は、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
図１に示すように、当該ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６を含む嗅覚受容体ポリペプチドは、疲労回復効果を有することが知られているトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに対して応答を示すことが明らかにされた。
よって、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の６種の嗅覚受容体と機能的に等価なポリペプチドは、嗅覚受容体ポリペプチドとして当該６種の嗅覚受容体と同様に本発明の方法に使用することができる。斯かる嗅覚受容体ポリペプチドとしては、例えば、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の各アミノ酸に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物に対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。
ここで、シス−３−ヘキセノールとトランス−２−ヘキセナールの混合比率は、特に限定されないが、等モル混合物であるのが好ましい。
本発明の方法において、嗅覚受容体ポリペプチドは、受容体の機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、嗅覚受容体ポリペプチドは、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然に嗅覚受容体ポリペプチドを発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体ポリペプチドを担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、当該嗅覚受容体ポリペプチドを有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体ポリペプチドの範囲に含まれる。
好ましい態様においては、嗅細胞等の天然に嗅覚受容体ポリペプチドを発現する細胞、又は嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
好適には、嗅覚受容体ポリペプチドの細胞膜発現を促進するために、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに、ＲＴＰ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を細胞に導入する。好ましくは、ＲＴＰ１Ｓをコードする遺伝子を、当該嗅覚受容体ポリペプチドをコードする遺伝子とともに細胞に導入する。ＲＴＰ１Ｓの例としては、ヒトＲＴＰ１Ｓが挙げられる。ヒトＲＴＰ１Ｓは、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：５０２３４９１７として登録されており、配列番号１３で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、ヒトＲＴＰ１Ｓの代わりに、ヒトＲＴＰ１Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＲＴＰ１Ｓと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。
また、ヒトＲＴＰ１Ｓの代わりに、ヒトＲＴＰ１Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＲＴＰ１Ｓと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。
本発明の方法に使用される試験物質は、疲労抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
試験物質を添加した後、嗅覚受容体ポリペプチドの応答が測定される。
測定は、嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法等によって行えばよい。また嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Touhara K. Neurochem Int. 2007 51. 132-139.）。従って、例えば試験物質添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が挙げられる。
測定は、嗅覚受容体の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法等によって行えばよい。また嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Touhara K. Neurochem Int. 2007 51. 132-139.）。従って、例えば試験物質添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が挙げられる。
次いで、測定された上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に基づいて、当該受容体ポリペプチドに応答する試験物質が同定される。試験物質の同定は、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、試験物質を添加しない該嗅覚受容体ポリペプチドの応答と比較することによって行うことができる。また、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドを発現しない細胞の応答と比較することによって行うこともできる。また、試験物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、試験物質を添加する前の該嗅覚受容体ポリペプチドの応答と比較することによっても行うことができる。また、試験物質と対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を、対照物質を添加した該嗅覚受容体ポリペプチドの応答と比較することによっても行うことができる。
例えば、上記嗅覚受容体ポリペプチドの応答に対して試験物質が及ぼす作用は、試験物質添加群と非添加群との間、該嗅覚受容体ポリペプチド発現群と非発現群との間、試験物質添加前後、又は試験物質および対照物質群と対照物質群との間で、該嗅覚受容体ポリペプチドの応答を比較することによって評価することができる。試験物質添加により、該嗅覚受容体ポリペプチドの応答が活性化される場合、当該試験物質を、該嗅覚受容体ポリペプチドを活性化又は応答を増強する物質として同定することができる。尚、対照物質としては、例えばトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物が挙げられる。
上記の手順で同定された試験物質は、後記実施例で示すように、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の６種の嗅覚受容体を活性化し（図２）、公知の疲労抑制剤であるトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物と同等以上の疲労抑制効果が認められる（図３）。したがって、当該試験物質は、疲労抑制剤又はその候補物質となり得る。
例えば、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照となる群と比較して好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上に高ければ、当該試験物質を、疲労抑制剤又はその候補物質として評価又は選択することができる。あるいは、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照となる群と比較して統計学的に有意に高ければ、当該試験物質を、疲労抑制剤又はその候補物質として評価又は選択することができる。
例えば、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照となる群と比較して好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上に高ければ、当該試験物質を、疲労抑制剤又はその候補物質として評価又は選択することができる。あるいは、上記の手順で測定された試験物質添加群における嗅覚受容体ポリペプチドの応答が、対照となる群と比較して統計学的に有意に高ければ、当該試験物質を、疲労抑制剤又はその候補物質として評価又は選択することができる。
斯くして、評価又は選択された試験物質は、疲労抑制剤又はその候補物質として使用することができ、また、疲労抑制剤又はその候補物質を製造するために使用することができる。疲労抑制剤の候補物質は、さらに公知の疲労評価である、パソコン作業などに対する作業能率を評価する行動試験、自律神経機能測定、唾液中コルチゾール測定等を必要に応じて行うことにより、疲労抑制剤を選択することができる。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞以下の工程ａ）〜ｃ）を含む疲労抑制剤又はその候補物質の探索方法。
ａ）ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６からなる嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加する工程
ｂ）当該試験物質に対する当該受容体ポリペプチドの応答を測定する工程
ｃ）測定された応答に基づいて、当該応答を増強する試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する工程
＜２＞前記嗅覚受容体ポリペプチドが、天然に嗅覚受容体ポリペプチドを発現する細胞上又は嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、＜１＞の方法。
＜３＞試験物質を添加しない嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程をさらに含む、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が１．１倍以上に増強されていれば、当該試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する、＜３＞の方法。
＜５＞前記受容体の応答を測定する工程が、レポータージーンアッセイによって行われる、＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜１＞以下の工程ａ）〜ｃ）を含む疲労抑制剤又はその候補物質の探索方法。
ａ）ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６からなる嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加する工程
ｂ）当該試験物質に対する当該受容体ポリペプチドの応答を測定する工程
ｃ）測定された応答に基づいて、当該応答を増強する試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する工程
＜２＞前記嗅覚受容体ポリペプチドが、天然に嗅覚受容体ポリペプチドを発現する細胞上又は嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、＜１＞の方法。
＜３＞試験物質を添加しない嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程をさらに含む、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が１．１倍以上に増強されていれば、当該試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する、＜３＞の方法。
＜５＞前記受容体の応答を測定する工程が、レポータージーンアッセイによって行われる、＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１ トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに応答する嗅覚受容体の同定
（１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ （Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔ Ｉ、Ａｓｃ Ｉサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔ Ｉ、Ａｓｃ Ｉサイトへと組換えた。
実施例１ トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに応答する嗅覚受容体の同定
（１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｅｍａｌｅ （Ｇ１５２１：Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマニュアルに従って組込み、ｐＥＮＴＲベクター上に存在するＮｏｔ Ｉ、Ａｓｃ Ｉサイトを利用して、ｐＭＥ１８Ｓベクター上のＦｌａｇ−Ｒｈｏタグ配列の下流に作成したＮｏｔ Ｉ、Ａｓｃ Ｉサイトへと組換えた。
（２）ｐＭＥ１８Ｓ−ＲＴＰ１Ｓベクターの作製
ヒトＲＴＰ１Ｓはｈｕｍａｎ ＲＴＰ１遺伝子（ＭＨＳ１０１０−９２０５８６２：Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にＥｃｏＲ Ｉ、アンチセンス側にＸｈｏ Ｉサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したｈＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号１３）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉサイトへ組込んだ。
ヒトＲＴＰ１Ｓはｈｕｍａｎ ＲＴＰ１遺伝子（ＭＨＳ１０１０−９２０５８６２：Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にＥｃｏＲ Ｉ、アンチセンス側にＸｈｏ Ｉサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したｈＲＴＰ１Ｓ遺伝子（配列番号１３）をｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉサイトへ組込んだ。
（３）嗅覚受容体発現細胞の作製
ヒト嗅覚受容体396種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
ヒト嗅覚受容体396種をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞を作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
（４）トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の調製
ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ（３−ヘキセン−１−オール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎａｌ（２−ヘキセナール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を等モル（それぞれ１００μＭ）で混合し、上記混合物とした。
ｃｉｓ−３−ｈｅｘｅｎｏｌ（３−ヘキセン−１−オール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びｔｒａｎｓ−２−ｈｅｘｅｎａｌ（２−ヘキセナール：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を等モル（それぞれ１００μＭ）で混合し、上記混合物とした。
（５）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記（３）で作製した培養物から、培地をピペットマンで取り除き、ＤＭＥＭ（ナカライテスク）で調製したトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物（１００μＭずつの混合物）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で充分に発現させた。プレートを１０分間室温に放置した後、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内に蓄積したルシフェラーゼ量を測定することにより、それぞれの嗅覚受容体の応答を評価した。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。試験物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、試験物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｆｌｕｃ２Ｐ−ＣＲＥ−ｈｙｇｒｏ）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記（３）で作製した培養物から、培地をピペットマンで取り除き、ＤＭＥＭ（ナカライテスク）で調製したトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物（１００μＭずつの混合物）を含む溶液を７５μｌ添加した。細胞をＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で充分に発現させた。プレートを１０分間室温に放置した後、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内に蓄積したルシフェラーゼ量を測定することにより、それぞれの嗅覚受容体の応答を評価した。ルシフェラーゼの活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＴＭ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。試験物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、試験物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅとして算出し、応答強度の指標とした。
（６）結果
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｉ２の７種類の嗅覚受容体がトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに対して応答を示した（図１）。
このうち、ＯＲ２Ｊ３，ＯＲ２Ｗ１はシス−３−ヘキセノールの受容体であることが既に知られているが、トランス−２−ヘキセナールとの混合物でも応答性を示すかどうかは知られていない。また、その他の５種の受容体はいずれも、トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに応答することは報告されていない受容体である。
ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｉ２の７種類の嗅覚受容体がトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに対して応答を示した（図１）。
このうち、ＯＲ２Ｊ３，ＯＲ２Ｗ１はシス−３−ヘキセノールの受容体であることが既に知られているが、トランス−２−ヘキセナールとの混合物でも応答性を示すかどうかは知られていない。また、その他の５種の受容体はいずれも、トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りに応答することは報告されていない受容体である。
実施例２ 香料混合物のＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６への応答性
（１）香料混合物の調製
メチル２−ナフチルケトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ｌ−カルボン（（−）−１−メチルー４−イソプロペニルー６−シクロヘキセンー２−オン：和光純薬工業社）、メチルイソオイゲノール（１，２−ジメトキシー４−（１−プロペニル）ベンゼン：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及び酢酸フェニルエチル（２−フェニルエチル エステル：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の４種の香料化合物を等モルで混合し、香料混合物Ａとした。
（２）実施例１と同様の手順でＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ発現させたＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｉ２に対して、（１）で調製した香料混合物Ａで刺激し、嗅覚受容体の応答性を評価した。
（１）香料混合物の調製
メチル２−ナフチルケトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ｌ−カルボン（（−）−１−メチルー４−イソプロペニルー６−シクロヘキセンー２−オン：和光純薬工業社）、メチルイソオイゲノール（１，２−ジメトキシー４−（１−プロペニル）ベンゼン：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及び酢酸フェニルエチル（２−フェニルエチル エステル：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の４種の香料化合物を等モルで混合し、香料混合物Ａとした。
（２）実施例１と同様の手順でＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ発現させたＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ１０Ａ６及びＯＲ５１Ｉ２に対して、（１）で調製した香料混合物Ａで刺激し、嗅覚受容体の応答性を評価した。
（３）結果
香料混合物Ａは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の受容体を強く活性化した（図２）。
香料混合物Ａは、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６の受容体を強く活性化した（図２）。
実施例３ 香料混合物の疲労抑制効果
（１）健常男性２０名に対し、１時間のストループカラーワードテストを行った。問題は、１．５秒間隔で次々と表示し、被験者にはなるべく早く正確に回答するよう指示した。パフォーマンス評価は、ストループカラーワードテストの正答率を解析することにより行った。ストループカラーワードテストを行っている間、香りなし（水）、実施例１（４）で調製したトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物（最終濃度０．２５％）、実施例２（１）で調製した香料混合物Ａ（最終濃度０．０２％）をアロマディフューザー（無印良品）にて室内に充満した。被験者を以下の３群にわけ、各香りの間は１週間のインターバルを開け、試験を実施した。
（１）健常男性２０名に対し、１時間のストループカラーワードテストを行った。問題は、１．５秒間隔で次々と表示し、被験者にはなるべく早く正確に回答するよう指示した。パフォーマンス評価は、ストループカラーワードテストの正答率を解析することにより行った。ストループカラーワードテストを行っている間、香りなし（水）、実施例１（４）で調製したトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物（最終濃度０．２５％）、実施例２（１）で調製した香料混合物Ａ（最終濃度０．０２％）をアロマディフューザー（無印良品）にて室内に充満した。被験者を以下の３群にわけ、各香りの間は１週間のインターバルを開け、試験を実施した。
第１群：香りなし→トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物→香料混合物Ａ
第２群：トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物→香料混合物Ａ→香りなし
第３群：香料混合物Ａ→香りなし→トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物
第２群：トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物→香料混合物Ａ→香りなし
第３群：香料混合物Ａ→香りなし→トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物
（２）結果
ストループカラーワードテスト開始から３０分間の正答率を香りなしの正答率を基準として解析した結果、トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りと香料混合物Ａの香りで正答率に有意な差は認められなかった。以上の結果から、香料混合物Ａが疲労抑制効果を示し、その効果はトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物と同等であることが示された（図３）。
ストループカラーワードテスト開始から３０分間の正答率を香りなしの正答率を基準として解析した結果、トランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物の香りと香料混合物Ａの香りで正答率に有意な差は認められなかった。以上の結果から、香料混合物Ａが疲労抑制効果を示し、その効果はトランス−２−ヘキセナール／シス−３−ヘキセノール混合物と同等であることが示された（図３）。
Claims (5)
- 以下の工程ａ）〜ｃ）を含む疲労抑制剤又はその候補物質の探索方法。
ａ）ＯＲ１Ａ１、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｗ１，ＯＲ５Ｋ１，ＯＲ５Ｐ３及びＯＲ１０Ａ６からなる嗅覚受容体ポリペプチドに試験物質を添加する工程
ｂ）当該試験物質に対する当該受容体ポリペプチドの応答を測定する工程
ｃ）測定された応答に基づいて、当該応答を増強する試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する工程 - 前記嗅覚受容体ポリペプチドが、天然に嗅覚受容体ポリペプチドを発現する細胞上又は嗅覚受容体ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、請求項１記載の方法。
- 試験物質を添加しない嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する工程をさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
- 前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が１．１倍以上に増強されていれば、当該試験物質を疲労抑制剤又はその候補物質として選択する、請求項３記載の方法。
- 前記受容体の応答を測定する工程が、レポータージーンアッセイによって行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
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