JP6243737B2 - Ｅ−カドヘリンの可溶性細胞外ドメインを標的とする組成物および癌治療のための関連方法 - Google Patents

Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１０年１０月２７日出願の、米国特許仮出願第６１／４０７，３６７号の優先日の優先権を主張する。この先願仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府支援の研究に関する陳述
本発明は、Ｇｒａｎｔ Ｎｏｓ．ＣＡ１３３９１０およびＥＳ０１５８３２のもと、米国国立衛生研究所により授与された政府の支援によりなされた。米国連邦政府は本発明においてある一定の権利を有する。

技術分野
本発明の組成物および方法は、細胞−細胞接着タンパク質Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインを標的とすることに関する。本組成物は、Ｅ−カドヘリン細胞外ドメインの抗体ならびに抗原性断片など、癌を処置する治療および予防法において使用することができる結合物質を含む。

Ｅ−カドヘリンは、上皮細胞−細胞接着の維持を助ける、一体化膜貫通糖タンパク質である。Ｅ−カドヘリン機能（全長）の欠失の結果、細胞の脱分化、増殖および皮膚癌、肺癌、胃癌、腸癌および乳癌における侵襲性が高くなることが明らかになっている（Ｂｒｏｕｘｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（１６）：７６５４−７６６４（２００７）；Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３（２）：３３３−３３９（１９９８）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２０１：９７−１０６（２００３））。さらに、乳癌患者からの生検標本におけるＥ−カドヘリン染色の欠失は、予後不良および転移が起こるまでの時間が短いことと関連付けられている（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：１２８１−１２８６（２００２））。

全長タンパク質は、ＥＣ１−ＥＣ５と呼ばれる５個のサブドメインからなる細胞外ドメイン、１個の膜貫通領域および細胞質ドメインから構成される（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５（２）：１０１４−１０２１（２００５）参照）。細胞膜表面から最も遠いＥＣ１サブドメインは、カドヘリン発現細胞（Ｅ−、Ｎ−、Ｐ−およびＲ−カドヘリン発現細胞を含む。）で見られるヒスチジン−アラニン−バリン（ＨＡＶ）トリプレットを含有し、このサブドメインは、Ｅ−カドヘリンが介在する細胞−細胞接触を促進するために必須であると考えられている（Ｂｅａｖｏｎ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３６：１６０７−１６２０（２０００））。

全長Ｅ−カドヘリンは、膜貫通ドメイン付近に様々なプロテアーゼに対する切断部位を含有し、その部位での切断によって、可溶性Ｅ−カドヘリン（ｓＥｃａｄ）と呼ばれる〜８０−８４ｋＤａの可溶性Ｎ末端ペプチドが生じる。正常な未刺激上皮細胞においては低レベルで、乳癌、皮膚癌、肺癌、前立腺癌、胃癌および結直腸癌などの上皮由来腫瘍がある患者においては高レベルで、ｓＥｃａｄの切断が構成的に起こる（Ｂａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４８：１７９−１８０（１９９５）；Ｂａｒａｎｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．３８４（１）：６−１１（２００９）；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ４８：８０８−８１１（２００１）；Ｃｈａｒａｌａｂｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｏｎｃｏｌ．２８（１）：８３−８５（２００６）；Ｋｕｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：６４４７−６４５２（２００３）；Ｓｈｉｒａｈａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．１３：３０−３６（１９９６）；Ｖｅｌｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７：１８５７−１８６３（１９９８））。ｓＥｃａｄの切断はまた、アポトーシス誘導後、正常な非癌性のイヌ腎臓細胞で増加することも報告されている（Ｓｔｅｉｎｈｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６：４９７２−４９８０（２００１）。

ｓＥｃａｄレベルは癌患者の尿または血清中で上昇し、正常細胞でアポトーシスが起こると上昇するが、この切断タンパク質の生物学的活性はよく分かっていない。多くの研究から、ｓＥｃａｄが正常な上皮細胞−細胞接着を妨害し、上皮細胞の散乱を誘導し、腫瘍細胞増殖、移動および浸潤を促進することが明らかになっている（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１０８（２）：３６１−３６９（２００８）；Ｍａｒｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２６）：９１８２−９１８７（２００５）；Ｍａｒａｍｂａｕｄ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２１．（８）：１９４８−１９５６（２００２）；Ｎａｊｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２６）：１８３９３−１８４０１（２００８）；Ｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：１１１−１１８（２００１）；Ｒｙｎｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８３：１５９−１６５（２００２）；およびＳｙｍｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（５）：２０３０−２０３９（２００７））。これらの生物学的機能を調節するシグナル伝達経路は今も尚明らかとなっていない。ＳＫＢｒ３乳癌細胞株を使用した研究から、精製細胞外融合タンパク質（Ｆｃ−ｓＥｃａｄ）を外から添加することによってｓＥｃａｄ−ＨＥＲ２複合体が誘導され、それにより細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）が活性化されることが分かった（Ｎａｊｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２６）：１８３９３−１８４０１（２００８））。ヒトＥＧＦ受容体は、多くの上皮腫瘍において過剰発現されるかまたは制御不能となる受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢまたはＨＥＲファミリーに属する（ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＢａｓｅｌｇａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０−６５６５（２０００）；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２６：２６３−２７４（２００８））。この受容体ファミリーは、ＥＲＫなどの下流シグナル伝達分子を活性化し、次に細胞増殖、移動、浸潤および血管形成を含む一連の癌細胞挙動を活性化する（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃｅｌｌ １００：５７−７０（２０００）；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：１４７−１５４（２０００））。したがって、多くの抗ＥＧＦ療法が開発されてきた。これらは、低分子チロシンキナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体および癌ワクチンを含む（Ｆｕｋｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：２９２ａ Ａｂｓ１１８８（２００２）；Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３５：３２７−３３６（２００３）；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：７１−８１（１９９７）；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３４４：７８３−７９２（２００１）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：２８９−２９４（２００２））。これらの治療ストラテジーは、一部の腫瘍のみが、規定の成熟段階において特異的な受容体／抗原を発現し、ある一定の組織構造およびステージの腫瘍全てが標的受容体／抗原を過剰発現するわけではない（乳癌の２０％から５０％のみがＥＧＦ受容体を過剰発現する。）という点において、限定的である。したがって、これらのタイプの薬物に対する奏効率は低いままである（ＭｅｎｄｅｌｓｏｎおよびＢａｓｅｌｇａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０−６５６５（２０００）；Ｏｒｔｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １７（１）：７−１５（２０１０））。さらに、最初はこれらの薬物に反応性がある腫瘍が抵抗性を獲得する（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：３９０８−３９１４（２００６）；Ｏｒｔｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １７（１）：７−１５（２０１０）；およびＲｉｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２：８３９−８４４（２００６））。

本発明は、部分的に、Ｅ−カドヘリンのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上内のエピトープを標的とした結果、相当程度（例えば、何らかの臨床的に有害な程度）、上皮由来腫瘍細胞を死滅させるが、正常な健常上皮細胞または、内皮細胞および線維芽細胞を含む非上皮細胞は死滅させないという、発明者らの発見に基づく。したがって、本発明の組成物は、Ｅ−カドヘリンのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上およびその生物学的に活性のある変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチド；このようなポリペプチドを発現させるための発現ベクターおよび細胞；およびＥＣ２−ＥＣ５サブドメインを標的とする作用物質（例えば抗体）を含む。本発明の方法は、Ｅ−カドヘリンのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは生物学的に活性のあるその変異体を同定し、作製する方法；これらのポリペプチドを標的とする抗体などの作用物質を作製する方法；および、上皮癌を治療するかまたはそれらの発生もしくは再発リスクを低下させるために、このような作用物質を投与するかまたはインビボでそれらの産生を誘導する方法を含む。読み易くするために、発明者らは、一々生物学的に活性のある変異体に言及しないが、天然のＥ−カドヘリンのＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４，およびＥＣ５サブドメインの１以上で見られるアミノ酸配列を有するポリペプチドが本明細書中に記載のように作製され、使用され得る場合、そのポリペプチドの生物学的に活性のある変異体も作製され、使用され得ることを理解されたい。

抗Ｅ−カドヘリン抗体が投与される方法は、用量特異的療法を包含し、これらの療法は、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌および皮膚癌ならびに他の上皮癌および外胚葉由来の組織（例えば、中枢神経系、眼のレンズ、脳神経節および知覚神経節および神経、および頭部の結合組織）の癌を選択的に対象とするかまたはこれらに対して細胞毒性であり得る。他の細胞毒性療法（例えば、化学療法、ホルモン療法、放射線療法および抗体を利用した治療法（例えば、モノクローナル抗ＥＧＦ抗体療法））と結びつけて、本明細書中に記載の治療および予防法を遂行することができる。

したがって、ある態様において、本発明は、とりわけ、可溶性Ｅ−カドヘリン（ｓＥｃａｄ）の第二、第三、第四または第五のサブドメイン（それぞれＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４およびＥＣ５）の１以上を特異的に標的とするが、ｓＥｃａｄの第一のサブドメイン（ＥＣ１）は標的としない作用物質の治療的有効量を、患者に投与することによる、癌を有する患者を治療する方法を特色とする。本薬剤は、ＥＣ４および／またはＥＣ５を特異的に標的とし得る。１個のサブドメイン（例えばＥＣ４またはＥＣ５）が標的とされる場合、本作用物質は、そのドメインに限定されるアミノ酸残基に結合し得る。本作用物質は、ｓＥｃａｄのＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４またはＥＣ５サブドメインの１以上中のアミノ酸残基を含むがｓＥｃａｄのＥＣ１サブドメイン中のものは含まないエピトープに特異的に結合する、抗体またはその断片もしくは他の変異体などの、タンパク質骨格であり得る。

本作用物質が抗体である場合、抗体は、ヒト化、キメラ、マウスまたはヒト抗体であり得る。本作用物質または抗体は１本鎖抗体でもあり得、本作用物質または抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体でもあり得る（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスの免疫グロブリン）。本作用物質の正確な性質にかかわらず、本作用物質は、検出可能に標識され得る（例えば、蛍光または化学発光タグ）。

生物細胞への影響に関して、本作用物質は、何らかの顕著なまたは相当な程度、悪性のＥ−カドヘリン発現細胞を死滅させるが、非悪性の細胞を死滅させないものとして特徴付けられ得る。プログラムされた細胞死、増殖停止、アノイキス、壊死、オートファジーまたは、細胞死をもたらす別の状態を誘導することによって、死滅が達成され得る。

細胞毒性量の賦形剤または他の「不活性」成分を含まない製剤処方または製剤として本発明の薬剤を製剤化することができる。より具体的には、経口投与、静脈内投与、鼻腔もしくは吸入投与（例えば吹送）、筋肉内投与、腹腔内投与、経粘膜投与（例えば、直腸または膣の内側の粘膜組織への投与用に製剤化）または経皮投与による患者への送達のために、医薬組成物または医薬的に許容可能な組成物を製剤化することができる。発明者らは、下記でさらに投与量を論じるが、本作用物質が、約１μｇ／ｍＬから約４００μｇ／ｍＬの本作用物質（例えば、約４μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬの本作用物質）を含有する製剤処方で送達され得ることをここで述べる。投与量はまた、患者への投与時に、患者の活性医薬品の血清レベルが約１から１０ｍｇ／ｋｇ（例えば約１から５ｍｇ／ｋｇ）となるようなものであり得る。細胞培養において使用される場合、投与量は、培地に添加したときに、活性医薬品が細胞培養液に対して約１から５００μｇ／ｍＬ（例えば、約１から４００μｇ／ｍＬ）存在するようなものであり得る。当技術分野で認められるように、投与量は、様々な調合において変動し得、本製剤処方または製剤内の投与量は、（例えば、製造者により供給される）製剤中の添加物の有無または相対量に依存して変動し得る。したがって、本発明の方法は、本作用物質が、（ａ）患者への投与時に、本作用物質の血清レベルが約１から１０ｍｇ／ｋｇ（例えば約１から５ｍｇ／ｋｇ）となるか、または（ｂ）細胞培養への添加時に、本作用物質の濃度が、細胞培養液に対して約１から５００μｇ／ｍＬ（１から４００μｇ／ｍＬ）となる、製剤処方で送達されるものを包含する。

ｓＥｃａｄ標的化物質が投与される本発明の方法の何れかにおいて、本方法は、患者からの生体試料を提供し（例えば、標的化物質を投与する前および／または標的化物質を投与した後のいくつかの時点）、その試料がレベル上昇したｓＥｃａｄまたは癌に対する別の予測バイオマーカーを含むか否かを判定する工程を含み得る。この生体試料は、例えば、尿、唾液、脳脊髄液、血液または生検試料であり得る。このような工程が本作用物質を投与する前に行われる場合、ｓＥｃａｄのレベル上昇は患者が本治療に対する適した候補であることを示し得る。このような工程が、本作用物質の投与後、１回以上行われる場合、ｓＥｃａｄレベル低下は、患者がその治療に良好に反応していることを示し得る。

本発明の方法の何れかにおいて、第二の癌治療薬も投与し得る。例えば、化学療法剤、放射線治療、抗体による治療（すなわち、癌の治療において有用であり、ｓＥｃａｄ以外の標的に特異的に結合する抗体）または手術による介入を行い得る。

治療に敏感に反応する患者としては、上皮化組織内の癌を有する者が挙げられる。この癌は、消化管（例えば、口腔、咽喉、食道、胃、腸、直腸または肛門）、中枢神経系、***、皮膚（例えば、扁平上皮癌またはメラノーマ）、生殖系（例えば、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、外陰もしくは***癌、前立腺癌、精巣腫瘍または***の癌）、肺または泌尿器の癌であり得る。

本方法は、治療用または予防用であり得る。したがって、別の態様において、本方法は、対象が癌を発現する可能性を低下させる方法を特色とする。これらの方法は、治療的有効量の、（ａ）ｓＥｃａｄのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上からのアミノ酸配列を含むがＥＣ１サブドメインを除く抗原性ポリペプチドまたは抗原的に活性のあるその断片もしくは他の変異体または、（ｂ）抗原性ポリペプチドまたは抗原的に活性のあるその断片もしくは他の変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを対象に投与することによって行い得る。本抗原性ポリペプチドは、ＥＣ４内に限定されるか、ＥＣ５内に限定されるか、またはＥＣ４およびＥＣ５の両方からの配列を包含するアミノ酸配列を含み得る。本抗原性ポリペプチドは、ｓＥｃａｄに特異的に結合するが対象において非悪性の細胞により発現されるＥ−カドヘリンには結合しない抗体の産生を誘導し得る。これらの方法で使用される抗原性ポリペプチドおよび発現ベクターは、上述の製剤と同じであるかまたは類似であるように製剤化され得る。例えば、これらは、経口投与、静脈内投与（経口投与が好ましいものであり得る）、鼻腔もしくは吸入投与（例えば吹送）、筋肉内投与、腹腔内投与、経粘膜投与または経皮投与により送達され得る。対象が直面するリスクは、本明細書中に記載の何らかのタイプの癌を発現するリスクであり得る。リスクは、集団における一般発生率に基づく平均的リスクであり得るか、または、癌の遺伝的素因もしくは癌の早期発症によるリスク上昇であり得る。例えば、上皮化組織内の癌、消化管（例えば、口腔、咽喉、食道、胃、腸、直腸または肛門）、中枢神経系、***、皮膚（例えば、扁平上皮癌またはメラノーマ）、生殖系（例えば、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、外陰もしくは***癌、前立腺癌、精巣腫瘍または***の癌）、肺または泌尿器の癌の発症または再発のリスクを低下させるために、抗原性ポリペプチドまたはそれらをコードするベクターを対象に投与することができる。

本発明の方法は、薬品(医薬)の調製に関連して表現できる。したがって、本発明は、薬品の調製における本明細書中に記載の作用物質および組成物の使用を包含する。ある実施形態において、本作用物質および組成物の使用は、癌（本明細書中に記載のタイプの癌を含む）の治療のための薬品の調製に及ぶ。

本発明の組成物は、治療的有効量の、（ａ）ｓＥｃａｄのＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４またはＥＣ５サブドメインの１以上中のアミノ酸残基を含むが、ｓＥｃａｄのＥＣ１サブドメイン中のものは含まないエピトープに特異的に結合する抗体；（ｂ）ｓＥｃａｄのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上からのアミノ酸配列を含むが、ＥＣ１サブドメインのアミノ酸配列を除外する抗原性ポリペプチドまたは抗原的に活性のあるその断片もしくは他の変異体；または（ｃ）抗原性ポリペプチドまたは抗原的に活性のあるその断片もしくは他の変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでなる、医薬的に許容可能な組成物を含む。

さらに別の態様において、本発明は、ｓＥｃａｄ中のエピトープを同定するための方法を特色とする。これらの方法は、とりわけ、（ａ）ｓＥｃａｄまたはその断片もしくは他の変異体を含むポリペプチドを提供し；（ｂ）動物にこのポリペプチドを投与し；（ｃ）このポリペプチドに反応して動物により産生される抗体を単離し；（ｄ）そこから産生された抗体またはモノクローナル抗体に癌性細胞を曝露することによって行われ得る。癌性細胞の死滅は、本ポリペプチドが、癌治療、予防またはイメージングにおいて作用物質として標的化され得るかまたは使用し得るｓＥｃａｄのエピトープを含むことを意味する。本発明の他の態様におけるように、本ポリペプチドは、ｓＥｃａｄのＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４またはＥＣ５サブドメインの１以上からのアミノ酸配列を含み得るが、ｓＥｃａｄのＥＣ１サブドメインからのアミノ酸は除外する。例えば、本ポリペプチドは、ＥＣ４および／またはＥＣ５（例えば、ＥＣ４に限定されるアミノ酸配列またはＥＣ５に限定されるアミノ酸配列）の１以上からのアミノ酸配列を含み得る。

癌治療を開発する際の最大の難関の１つは、癌性細胞と正常な健常組織とを区別し得る治療剤を発見することにある。現在利用可能な化学療法剤の多くは、非選択的に細胞毒性であり、治療指標が狭く、その結果、患者を衰弱させ、全体的な患者死亡率を上昇させる全身的な薬物毒性がもたらされる。したがって、新しい癌療法の非常に望まれる特性は、正常な健常細胞および組織に悪影響を与えることなく癌細胞を選択的に標的とする能力である。本発明の組成物はシグナル伝達経路の何らかの特定の点において細胞に影響を与えるものに限定されるものではないが、発明者らの期待は、本発明の治療組成物が、ＨＥＲ２受容体の上流で作用し、ＨＥＲ２標的療法よりも多岐にわたる下流標的を捕捉することである。

添付の図面および下記の記載において、本発明の１以上の実施形態の詳細を述べる。本記載および図面ならびに特許請求の範囲から、本発明の他の特性、目的および長所が明らかとなろう。

図１Ａは、ヒトＥ−カドヘリン（配列番号：１）のアミノ酸配列を示し、細胞外サブドメインＥＣ２−ＥＣ５は下線を交互に付す（ＥＣ２およびＥＣ４は、二重線を付し、ＥＣ３およびＥＣ５は１本線を付す。）ことによって示す。図１Ｂは、図示されるようなｓＥｃａｄを有する野生型ヒトＥ−カドヘリンの概略図である。可溶性断片の長さは変動し得、４番目または５番目の細胞外ドメインにおいて、または、他の場合では膜貫通ドメインにおいて終結し得る（例えばＮｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４（１）：１１１−１１８，２０００による研究を参照）。 図２Ａは、実施例５に記載のような、食塩水またはα−ｓＥｃａｄで処置後、ある時間にわたる、マウスにおける触診可能な腫瘍数を示す線グラフである。図２Ｂにおいて、左側は、食塩水処置マウスで見ることができる腫瘍とα−ｓＥｃａｄ処置マウスで見ることができる腫瘍を示す写真のパネルである（実施例５に記載のとおり）。未処置（食塩水）および処置（α−ｓＥｃａｄ）マウスからの組織の組織学的標本として、手術により摘出した腫瘍も示す。図２Ｃは、未処置（食塩水）および処置（ａ−ｓＥｃａｄ）マウスにおける腫瘍重量（ｇ）および体積（ｃｍ^３）の相違を説明する、一対の棒グラフである。

下記でさらに述べるように、発明者らは、上皮癌細胞および非癌性細胞の両方のパネルにおいて、Ｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１９：８４−９３（２００９））、Ｆｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（４１）：４３０６１−４３０６９（２００４））およびＧａｌａｚ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０５（１）：８６−９６（２００５））により使用されたＤＥＣＭＡ−１抗体を含む、Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインを標的とする様々な市販のモノクローナルおよびポリクローナル抗体の有効性を試験した。発明者らがこれらの実験を繰り返した際、発明者らは、４０μｇ／ｍＬという低い濃度でこの抗体を適用することによって、驚くべきことに、癌細胞（すなわち、ＭＣＦ−７、ＳＣＣ１２ｂ、ＳＣＣ１３、ＣＲＬ−１５５５、ＰＡＭ２１２、ＳＰ３０８およびＫＬＮ２０５細胞）ならびに対照として使用した非癌性細胞（すなわち、ヒト***上皮細胞およびＰＨＫおよびＰＭＫ細胞）の両方において細胞死が誘導されることが分かった。さらに、同じ濃度（４０μｇ／ｍＬ）で対照ＩｇＧアイソタイプ抗体によってこれらの癌および非癌性細胞を処理した場合も、両タイプの細胞において同じレベルの細胞死を誘導した。これらのデータから、抗体の適用後の細胞死の非特異的な誘導が示唆される。発明者らの研究室において、Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインＥＣ２−ＥＣ５を標的とする抗体の希釈度のより高い溶液を適用することによって（１０から２０μｇ／ｍＬの低用量）、癌細胞でのみ、明らかにアポトーシスによって細胞死が誘導された。発明者らは、非癌性細胞において有害な効果は全く認めなかった。さらに、１０から２０μｇ／ｍＬの濃度で非癌性細胞へ対照ＩｇＧアイソタイプを適用した場合、一般的に、細胞生存能への検出可能な影響はなかった。これらの１０から２０μｇ／ｍＬの濃度は、Ｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１９：８４−９３（２００９））、Ｆｏｕｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（４１）：４３０６１−４３０６９（２００４））およびＧａｌａｚ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０５（１）：８６−９６（２００５））により使用された濃度よりも約２０から５０倍低い。したがって、発明者らが期待するのは、低用量の製剤（例えば、先行研究でＥｓｐａｄａらにより示唆されたものよりも低い用量）として、本製剤処方および調合物を製造し、使用することができるということである。

上述のように、Ｅ−カドヘリンのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインに対する１０から２０μｇ／ｍＬの抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の外部からの添加によって、ヒトおよびマウス腫瘍細胞株の代表的パネルを選択的に死滅させた。発明者らはまた、このような抗体が、ＨＴ２９ヒト結腸細胞株、ＮＣＩ−Ｈ２９２ヒト肺細胞株およびＫＬＮ２０５マウス肺癌細胞株に対して細胞毒性を有することを示すデータも有している。さらに、発明者らは、正常ヒト***上皮細胞、正常ヒトおよびマウス角化細胞、マウス３Ｔ３線維芽細胞およびヒト内皮細胞を含む非癌性細胞では、低濃度で上記のサブドメインを標的とする抗体を用いた発明者らの分析において影響がないままであることを明らかにした。上皮由来腫瘍細胞において、Ｅ−カドヘリンのＥＣ２−ＥＣ５細胞外ドメインの標的とする様々な組み合わせが細胞死を誘導するが、その分子経路はまだ明らかになっていない。しかし、発明者らは、癌細胞の死滅が、プロアポトーシス性のマーカーｐ５３を上方制御することを明らかにし、ＥＣ２−ＥＣ５ Ｅ−カドヘリンドメインに対する抗体処理後、ＭＣＦ−７乳癌、マウスＳＣＣおよびマウスＫＬＮ２０５肺癌細胞株において、この上方制御を観察した。

上述のように、本発明の組成物は、ｓＥｃａｄのＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４およびＥＣ５の１以上（ＥＣ１ではない）を特異的に標的とする作用物質を含む。これらの作用物質は、続いてｓＥｃａｄを阻害し得るか、または、腫瘍細胞微小環境において、細胞生存受容体などの別の標的に結合するか、これを阻害するかまたは封鎖し得る。本組成物は、何らかの特定の機構によりその効果を発揮するものに限定されるものではないが、発明者らの作業仮説では、本発明の作用物質は、癌細胞に有益であるｓＥｃａｄのシグナル提供能を妨害するということである。例えば、発明者らは、癌細胞が、微小環境にｓＥｃａｄを分泌し、それが、その微小環境で、正常な細胞−細胞接触を模倣する機能的骨格を提供するという仮説を立てた。したがって、実際にまたは効果的に腫瘍微小環境からｓＥｃａｄを除去することによって、腫瘍細胞が接着し、生存し続ける能力が撹乱される。他の例において、本発明の作用物質は、別の細胞標的（例えばＨＥＲ−２）と相互作用するｓＥｃａｄ上のエピトープへの結合によってｓＥｃａｄ活性を阻害し得、それにより、細胞生存、細胞増殖，細胞移動および／または浸潤に関与する下流のシグナル伝達事象を変化させる。あるいは、またはさらに、作用物質は、ｓＥｃａｄシグナル伝達に必要である特異的なエピトープに結合し得ないが、代わりに、破壊のためにそれを封鎖、タグ付加または標的とするようにｓＥｃａｄに結合し得、それによって腫瘍微小環境でのその濃度が低下し、細胞−細胞相互作用の模倣または細胞受容体への結合にそれが利用できなくなる。例えば、本作用物質および組成物は、例えばＥ−カドヘリンへの結合および切断部位の遮断または、さもなくばｓＥｃａｄ放出の遮断または阻害により、切断されるｓＥｃａｄを減少させ得る。したがって、本明細書中に記載のように、組成物または作用物質は、ＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上を特異的に標的とし得、特異的なエピトープを遮断するかまたは実際にｓＥｃａｄレベルを低下させることによって、ｓＥｃａｄがシグナルの１以上を提供するのを効果的に阻止する。

読み易くするために、発明者らは、ｓＥｃａｄのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上におけるものであってｓＥｃａｄの第一のサブドメイン（ＥＣ１）のものではないアミノ酸残基を特異的に標的とする作用物質を、より簡単に、標的物質と呼ぶ。本発明の標的物質は、ｓＥｃａｄのＥＣ２−ＥＣ５サブドメインの１以上におけるアミノ酸残基に特異的に結合する（しかし、ｓＥｃａｄのＥＣ１には結合しない。）、改変フィブロネクチンドメインまたは免疫グロブリンまたはその断片もしくは他の変異体などのタンパク質骨格であり得る。この作用物質がタンパク質（例えば、タンパク質骨格または抗原性ポリペプチド）であるか、またはこれらを含む場合、発明者らは、この作用物質をタンパク質に基づく治療剤と呼び得る。発明者らは、より長いアミノ酸ポリマーを指すのに「タンパク質」という用語を使用する傾向があり、より短い配列または、より大きい分子もしくは複合体内のアミノ酸残基の鎖を指すのに、「ポリペプチド」という用語を使用する傾向がある。しかし、両用語とも、翻訳後修飾（例えば、アミド化、リン酸化またはグリコシル化）とは無関係に、２以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体または他のペプチド模倣物全体を述べるものとする。ペプチド結合または例えばエステルもしくはエーテル結合などの他の結合によって、サブユニットアミノ酸残基を連結することができる。「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語は、天然および／または非天然または合成アミノ酸を指し、これは、Ｄ−またはＬ−型の光学異性体であり得る。

抗ｓＥｃａｄ抗体は、様々な構造が可能であり、実質的に免疫グロブリン遺伝子によりコードされる１以上のポリペプチドからなるタンパク質を包含し得る。インタクト抗体、抗体マルチマーまたは抗体の機能的な抗原−結合領域を含むその抗体断片もしくは他の変異体を含め、多様な抗体構造の何れか１つを使用することができる。発明者らは、「抗体」と同意語として「免疫グロブリン」という用語を使用し得る。抗体は、元来、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体の起源にかかわらず、適切な抗体としては、インタクト抗体、例えば、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を有するＩｇＧ四量体、１本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト抗体ならびに抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖおよびこのような断片由来の組み換え抗体、例えば、キャメルボディ（ｃａｍｅｌｂｏｄｉｅｓ）、ミクロ抗体、ダイアボディおよび二特異性抗体が挙げられる。

インタクト抗体は、抗原−結合可変領域（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）ならびに軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）および重鎖定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含むものである。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。当技術分野で周知であるように、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）が散在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分けられる。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は定められている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、１９９１ ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照）。抗体のＣＤＲは通常、ネイティブ免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に規定するアミノ酸配列を含む。

抗ｓＥｃａｄ抗体は、何らかのクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４））由来であり得、免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはデルタタイプであり得る。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２）、ガンマ（ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。

免疫グロブリンまたは抗体の「抗原−結合部分」という用語は、一般的に、標的、この場合は、ｓＥｃａｄの第二から第五のサブドメインの１以上内または１以上間の（例えば、第四と第五のサブドメイン内またはこれらの間の）アミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する免疫グロブリンの一部分を指す。したがって、免疫グロブリンの抗原−結合部分は、１以上の免疫グロブリン鎖が全長ではないが、細胞標的に特異的に結合する分子である。抗原−結合部分または断片の例としては：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２個のＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）抗体のシングルアームのＶＬＣおよびＶＨＣドメインからなるＦｖ断片および（ｖ）例えば可変領域の抗原結合部分に特異的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離ＣＤＲが挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬＣおよびＶＨＣは、組み換え法を用いて、それらをＶＬＣおよびＶＨＣ領域が対になって一価分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照）を形成する１本のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーによって、連結することができる。このようなｓｃＦｖは、本発明の標的物質であり得、抗体の「抗原結合部分」という用語によって包含される。

「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、強固な共有結合された状態の１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３個の超可変領域が相互作用して、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上で抗原−結合部位が定められる。６個の超可変領域が抗原−結合特異性を付与する一方、結合部位全体よりも親和性は低いものの、１個の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個の超可変領域のみを含むＦｖの半分）さえも抗原を認識し、これに結合する能力を有する。安定性を向上させるために、ＶＨ−ＶＬドメインを（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３などのフレキシブルペプチドリンカーにより結合して、１本鎖ＦｖまたはｓｃＦＶ抗体断片を形成させ得るし、または、フレームワーク領域において２個のシステイン残基を導入することによって、ジスルフィド結合を形成させるように改変して、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）を得ることもできる。

別掲のとおり、他の有用な抗体型としては、ダイアボディ、ミニボディおよび二特異性抗体が挙げられる。ダイアボディは、短いペプチドリンカー（約５アミノ酸以下）により共有結合されるｓｃＦｖのホモ二量体である。短かすぎて同じ鎖の２個のドメイン間で対形成できないリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対形成させ、２個の抗原−結合部位を生成させることができる（例えば、ダイアボディに関するさらなる情報については、ＥＰ４０４，０９７およびＷＯ９３／１１１６１を参照）。本組成物および方法において有用なダイアボディ変異体、（ｄｓＦｖ）_２または直鎖状抗体は、抗原結合領域の対を形成する縦に並んだＦｄセグメントの対（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１）を含む（例えば、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：１０５７（１９９５）を参照）。有用なミニボディは、ＳＣＦＶ−Ｃ_Ｈ３融合タンパク質のホモ二量体である。ミニボディ変異体、Ｆｌｅｘミニボディにおいて、ｓｃＦｖをＩｇＧ１のヒンジ領域に融合させ、次にこれを１０アミノ酸リンカーによりＣＨ_３領域に連結させる。

２個の異なるエピトープを認識する二特異性抗体もまた、一方のアームが本明細書中に記載のようなｓＥｃａｄに特異的に結合する限り、使用することができる。様々な異なる二特異性抗体型が開発されてきた。例えば、有用な二特異性抗体は、クアドローマ、すなわち、各Ｈ−Ｌ対が異なる抗体由来であるインタクト抗体であり得る。通常、クアドローマは、２個の異なるＢ細胞ハイブリドーマを融合させ、その後、その融合細胞（ｃａｌｌｓ）をスクリーニングして、両セットのクローン型免疫グロブリン遺伝子の発現を維持するものを選択することにより作製される。あるいは、二特異性抗体は、組み換え抗体であり得る。二特異性抗体に対する代表的な型としては、異なる特異性の２本の１本鎖がペプチドリンカーを介して連結されるタンデムｓｃＦｖ、ダイアボディおよび１本鎖ダイアボディが挙げられるが、これらに限定されない。

抗体の断片は、全長抗体の所望の特異性および／または癌細胞の生存、増殖または転移を阻害するのに十分な特異性を保持する限り、本発明が提供する方法での使用に適切である。したがって、本明細書中に記載のような抗ｓＥｃａｄ抗体の断片は、列挙されるサブドメインへのインタクト抗体の結合能を保持し得る。これらの抗体部分は、当業者にとって公知の従来の技術を用いて得ることができ、インタクト抗体が抗癌剤としてスクリーニングされる場合と同じようにして有用性についてスクリーニングすることができる。

抗体断片を調製するための方法は当技術分野で周知であり、生化学的方法（例えばインタクト抗体のタンパク質分解性消化（その後、化学的架橋が行われ得る））および所望の断片の合成を行うために免疫グロブリン配列が遺伝子改変される、組み換えＤＮＡに基づく方法の両方を包含する。代表的な生化学的方法は、米国特許第５，８５５，８６６号；同第５，８７７，２８９号；同第５，９６５，１３２号；同第６，０９３，３９９号；同第６，２６１，５３５号；および同第６，００４，５５５号に記載されている。連続するポリペプチドを作製するために、キメラまたはヒト化鎖をコードする核酸を発現させることができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；およびＷｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号を参照のこと。また、ＣＤＲグラフト抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５−１４６０（１９９２）を、１本鎖抗体についてはＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ（米国特許第４，９４６，７７８号）およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８））も参照のこと。

非特異的なチオールプロテアーゼであるパパインによる免疫グロブリン全体のタンパク質分解によって、抗体断片を得ることができる。パパイン消化によって、それぞれが１個の抗原−結合部位を有する「Ｆａｂ断片」と呼ばれる、２個の同一である抗原−結合断片が得られ、残りは「Ｆｃ断片」である。「様々な分画」をプロテインＡ−セファロースまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。ウサギおよびヒト起源のＩｇＧからＦ（ａｂ’）_２断片を調製する通常の手順は、酵素ペプシンによる限定的なタンパク質分解である。インタクト抗体のペプシン処理によって、２個の抗原連結部位を有するＦ（ａｂ’）_２断片が得られ、これは、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元来、それらの間でヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングは公知である。

例えばｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五のサブドメインに（またはこれらのサブドメインの２以上におけるアミノ酸残基を含むエピトープに）特異的に結合させることによってｓＥｃａｄを標的とする標的物質（例えば抗体またはその抗原−結合断片もしくは他の変異体）を作製する方法も本発明の範囲内にある。例えば、免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列を変更するためにＰＣＲ突然変異誘発法を用いて（例えば、ヒト化免疫グロブリンを作製するために使用される方法を用いて；例えば、Ｋａｎｕｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；およびＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ、Ｇｅｎｅ １０１：２９７−３０２（１９９１）を参照）可変領域を構築することができる。これらまたは他の適切な方法を用いて、変異体を容易に作製することもできる。例えば、ある実施形態において、クローン化可変領域を突然変異誘発させることができ、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択することができる（例えばファージライブラリから；例えば、Ｋｒｅｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５１４，５４８号；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／０６２１３を参照）。

本明細書中に記載のような細胞標的を特異的に認識する免疫グロブリンを作製または単離する他の適切な方法としては、例えば、ヒト抗体の全レパートリーを生成することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫付与に依存する方法が挙げられる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５４５，８０６号；およびＳｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５４５，８０７号を参照）。

当技術分野で周知であるように、モノクローナル抗体は、抗体産生細胞の単一クローンにより産生される同一抗原特異性の均質な抗体であり、ポリクローナル抗体は一般に、同じ抗原上の様々なエピトープを認識し、抗体産生細胞の複数のクローンにより産生される。各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナルという修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））により記載されたハイブリドーマ法によってまたは組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１））およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリからも単離され得る。

本明細書中のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、すなわち、一般に、特定の種由来であるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同の重鎖および／または軽鎖の一部分を有する抗体を含み、一方で、この鎖の残りの部分は、所望の生物学的活性を示す限り、別の種由来であるかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片の対応する配列と同一もしくは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。目的のキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、旧世界ザル、新世界ザル、原猿）由来の可変ドメイン抗原−結合配列およびヒト定常領域配列を含む、霊長類化抗体が挙げられる。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するための様々な方法が当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第４，１９６，２６５号に記載の方法を参照。最も標準的なモノクローナル抗体作製技術は、一般的に、通常、ポリクローナル抗体を調製するためのものと同じ系列に沿って開始される（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））。通常、抗体産生細胞を刺激するするために、選択された免疫原で適切な動物に免疫付与することができる。マウスおよびラットなどのげっ歯類は代表的な動物であるが、ウサギ、ヒツジ、カエルおよびニワトリを使用することもできる。マウスは特に有用であり得る（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスは日常的に使用され、一般的に、より高い割合の安定融合が得られる。）。

免疫付与後、ＭＡｂ作製および不死の骨髄腫細胞の細胞、一般的には免疫付与した動物と同種のうち１つとの融合で使用するために、所望の抗体を産生する可能性のある体細胞、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を選択することができる。ハイブリドーマ作製融合手順の使用に適した骨髄腫細胞株は一般に非抗体産生であり、融合効率が高く、酵素欠損があるので、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）だけの増殖を支持するある一定の選択培地中では増殖できなくなっている。当業者にとって公知であるように、多くの骨髄腫細胞の何れか１つを使用することができる。例えば、免疫付与動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌを使用することができ、ラットの場合は、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０または上記で列挙したマウス細胞株のうち１つを使用することができる。Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６は全て、ヒト細胞融合に関して有用であり得る。

この培養から、特異的なハイブリドーマの選択を可能にするハイブリドーマ集団が提供され、続いて連続希釈を行い、抗体産生のために無期限に増殖可能な個別の抗体産生株へのクローニングを行うことができる。

モノクローナル抗体を作製するための方法には、精製段階が含まれ得る。例えば、通常、ろ過、遠心および様々なクロマトグラフィー法、例えばＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィーなど（これらは全て当業者にとって周知の技術である）を使用して、抗体をさらに精製することができる。これらの精製技術はそれぞれ、混合物の他の成分から所望の抗体を分離するための分画化を含む。抗体調製に特に適した分析法としては、例えば、プロテインＡ−セファロースおよび／またはプロテインＧ−セファロースクロマトグラフィーが挙げられる。

本発明の抗ｓＥｃａｄ抗体は、ヒトまたは非ヒト起源からのＣＤＲを含み得る。「ヒト化」抗体は通常、ヒト定常および／または可変領域ドメインまたは特異的な改変を有する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは他の種からのキメラまたは変異モノクローナル抗体である。いわゆる「ヒト化」抗体を作製するための技術は当業者にとって周知である。

免疫グロブリンのフレームワークは、ヒト、ヒト化または非ヒト（例えばヒトでの抗原性を低下させるように改変されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えばコンセンサス配列）であり得る。ヒト化免疫グロブリンは、ヒト生殖細胞系列配列およびＣＤＲに対応するフレームワーク残基が、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えおよび体細胞突然変異から生じるものである。しかし、ヒト化免疫グロブリンはまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列においてコードされないアミノ酸残基（例えば、エクスビボでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により導入される突然変異）も含み得る。ヒト可変遺伝子のインビボ体細胞突然変異の結果、フレームワーク残基の突然変異が起こることが明らかになっている（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５３７（２００１）を参照）。このような抗体は、フレームワーク突然変異にもかかわらず、その起源からして、「ヒト」と呼ばれる。マウス抗体可変ドメインはまた、フレームワーク残基において体細胞突然変異も含有する（Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１５９（１９９６）を参照）。それゆえに、ヒトＩｇ遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスは、それらが、平均で４．５個のフレームワーク突然変異を保持するけれども、一般的に「完全ヒト」と呼ばれる免疫グロブリンを産生する（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６（１９９７））。したがって、一般に認められた語法から、生殖細胞系列配列に基づくが、例えばインビボ体細胞突然変異プロセスにより導入されたフレームワーク突然変異を保持する抗体可変ドメイン遺伝子は、「ヒト」と呼ばれることが示される。

ヒト化抗体は、例えば（１）ヒトフレームワークおよび定常領域上へ非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植するか（当技術分野でヒト化と呼ばれるプロセス）または、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれらにヒト様の表面を提供すること（当技術分野でベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）と呼ばれるプロセス）を含め、当技術分野で公知の様々な方法により改変され得る。ヒト化抗体は、ヒト化およびベニア化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体の両方を含み得る。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が一部または完全に不活性化されているマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することができる。抗原投与時、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再編成、アセンブリー，および抗体レパートリーを含め、全ての点でヒトにおいて見られるのと非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号，および次の科学出版物：Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１））に記載されている。

キメラおよびヒト化抗体に加えて、完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウス由来（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号；同第６，０９１，００１号；および同第６，１１４，５９８号を参照）またはヒト免疫グロブリン遺伝子のファージディスプレイライブラリ由来（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）を参照）であり得る。いくつかの実施形態において、当技術分野で公知の標準的方法を使用して、ｓｃＦｖ−ファージディスプレイライブラリによって、抗体を作製し、同定し得る。

抗原結合親和性、そのエフェクター機能またはその薬物動態を調節するために、抗ｓＥｃａｄ抗体を改変し得る。特に、ＣＤＲおよび、親和性がより高い、および／または特異性がより高い抗体を同定するためにスクリーニングされた産生物において、ランダム突然変異を行い得る。このような突然変異誘発および選択は、抗体の技術分野において日常的に実施されている。このような置換変異体を作製するための一つの便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。

例えば本明細書中で提供される抗体とともにＣＤＲシャッフリングおよび移植技術を使用することができる。ＣＤＲシャッフリングは、ＣＤＲ配列を特異的なフレームワーク領域に挿入する（Ｊｉｒｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２１５：４７１（１９８８））。ＣＤＲ移植技術によって、１つのマスターフレームワークへのＣＤＲ配列のランダムな組み合わせが可能となる（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：２７９（１９９９）；およびＳｏｄｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２（２０００））。このような技術を用いて、例えば抗ｓＥｃａｄ抗体のＣＤＲ配列に対して突然変異を生じさせ、複数の異なる配列を生成させることができ、これを骨格配列に組み込み、所望の特徴、例えばより高い親和性などについて、得られた抗体変異体をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、当技術分野で公知であるように、Ｔ細胞エピトープの存在について、抗ｓＥｃａｄ抗体の配列を調べることができる。次に、Ｔ細胞エピトープを除去するために、すなわち抗体を「脱免疫化」するために、下線を付した配列を変化させることができる。

例えばファージミド技術を用いた組み換え技術によって、一連の抗体をコードする組み換え遺伝子から所望の特異性を有する抗体を調製することが可能となる。ある種の組み換え技術は、免疫付与した動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ Ｊ．Ｍｅｄ．５３：１７５（１９８６）；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３（１９９１）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４５７（１９９２））。このような方法に関して、免疫付与した動物の脾臓から単離されるＲＮＡからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリを調製することができ、抗原を発現する細胞および対照細胞を用いてパンニングすることによって、適切な抗体を発現するファージミドを選択することができる。従来のハイブリドーマ技術を凌ぐこのアプローチの長所には、１回でおよそ１０^４倍という多くの抗体を作製し、スクリーニングすることができること、およびＨおよびＬ鎖の組み合わせにより新しい特異性を生成させることができることであり、これは、さらに、生成される適切な抗体の割合を上昇させることができる。

細菌における多様な抗体分子の大きなレパートリーを作製するための一つの方法は、ベクターとしてバクテリオファージラムダを利用する（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９））。ラムダベクターを用いた抗体の作製は、個別の出発ベクターへ、ＤＮＡ配列の重鎖および軽鎖集団をクローニングすることを含む。続いて、ベクターを無作為に組み合わせて、抗体断片を形成させるように、重鎖および軽鎖の同時発現を方向付ける単一ベクターを形成させることができる。糸状ファージディスプレイのための一般的な技術が記載されている（米国特許第５，６５８，７２７号）。最も一般的な意味において、本方法は、単一ベクター系を用いて、抗体遺伝子レパートリーから、予め選択されたリガンド−結合特異性を同時クローニングおよびスクリーニングするための系を提供する。予め選択されたリガンド−結合能に関してライブラリの単離メンバーをスクリーニングすることによって、発現された抗体分子の結合能と便利な手段との相関関係を用いて、ライブラリからそのメンバーをコードする遺伝子を単離することが可能となる。ファージミドライブラリをスクリーニングするためのさらなる方法が記載されている（米国特許第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）。

全体的または部分的な合成抗体組み合わせ部位またはパラトープの大規模ライブラリの作製およびスクリーニングのための一つの方法は、Ｍ１３、ｆｌまたはｆｄなどの糸状ファージ由来のディスプレイベクターを利用する（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，６９８，４２６号）。「ファージミド」と呼ばれる糸状ファージディスプレイベクターは、多様で新規の免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなライブラリを産み出す。この技術は、糸状ファージ複製のアセンブリ段階中、遺伝子産物および遺伝子をつなぐための手段として、糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメインを使用し、コンビナトリアルライブラリから抗体をクローニングおよび発現させるために使用されている（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３（１９９１）；およびＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８（１９９１））。標準的な親和性単離手順によって、ノイラミニダーゼ分子に結合する特異的なＦａｂ断片に関して、表面発現ライブラリをスクリーニングする。ファージ集団の増幅後に、ポリペプチドをコードする核酸の配列決定を行うことによって、選択したＦａｂ断片の特徴を調べることができる。

抗体の多様なライブラリを作製し、所望の結合特性についてスクリーニングするための一つの方法が記載されている（米国特許第５，６６７，９８８号および同第５，７５９，８１７号）。この方法は、免疫グロブリン可変重鎖および軽鎖可変ドメインのＣＤＲ領域へ縮重を組み込むために、変性オリゴヌクレオチドおよびプライマー伸長反応を用いて、ファージミドライブラリの形態で、ヘテロ二量体免疫グロブリン分子のライブラリを調製すること、およびファージミド表面で突然変異誘発ポリペプチドを提示することを含む。その後、予め選択された抗原への結合能について、提示タンパク質をスクリーニングする。抗体の多様なライブラリを作製し、所望の結合特異性についてスクリーニングするためのこの方法のさらなる変法が記載されている（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，７０２，８９２号）。この方法においては、重鎖配列のみを使用し、ＣＤＲＩまたはＣＤＲＩＩＩ超可変領域の何れかをコードする全てのヌクレオチド位置で重鎖配列を無作為化し、何ら生物学的プロセスに依存せずに、ＣＤＲにおける遺伝的多様性を作り出すことができる。

上記で開示されたコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリに加えて、一つの分子クローニングアプローチは、ヒト抗体ライブラリを含有するトランスジェニックマウスから抗体を調製することである。このような技術が記載されている（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，５４５，８０７号）。単一アイソタイプ、より具体的にはＢ細胞成熟に必須であるアイソタイプ、例えばＩｇＭおよび場合によりＩｇＤなどのヒト抗体を作製するために、このようなトランスジェニック動物を使用することができる。ヒト抗体を作製するための別の方法は、Ｂ細胞発生に必要とされるアイソタイプから他のアイソタイプへの変換が可能なトランスジェニック動物について記載する、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，７７０，４２９号に記載されている。

グリコシル化を減少させるかまたはなくすために、抗ｓＥｃａｄグロブリンを改変し得る。グリコシル化を欠く免疫グロブリンは、全くグリコシル化されていないか、完全にはグリコシル化されていないか、または非定型的にグリコシル化されている（すなわち、突然変異体に対するグリコシル化パターンが、対応する野生型免疫グロブリンのグリコシル化パターンとは異なる）免疫グロブリンであり得る。ＩｇＧポリペプチドは、グリコシル化を減弱させる１以上（例えば、１、２または３以上）の突然変異、すなわち、結果としてＩｇＧ ＣＨ２ドメインがグリコシル化を欠くかまたは完全にはグリコシル化されていないかまたは非定型的にグリコシル化されている突然変異を含む。ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２９７でのアスパラギン残基の突然変異は、このような突然変異の例である。例えばフソース（ｆｕｓｏｓｅ）部分をＮ結合型グリカンから削除することによって、オリゴ糖構造を改変することもできる。

インビボでの抗体の安定性およびまたは溶解性を向上させるために、非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールに複合化することによって、抗体を修飾することもできる。抗ｓＥｃａｄ抗体がｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインへの選択的結合能を保持する限り、どのようなＰＥＧ化方法でも使用することができる。

得られるポリペプチドが、標的、すなわち、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインに対して特異的である少なくとも１つの結合領域を含む限り、多岐にわたる抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは骨格を使用することができる。このようなフレームワークまたは骨格は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要イディオタイプを含み（本明細書中の他所で開示されるものなど）、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダで同定されたものなどの１本重鎖抗体はこの点で特に興味深い。

ｓＥｃａｄ抗体のＣＤＲが移植され得る非免疫グロブリン骨格を用いて、非免疫グロブリンベースの抗体を作製することができる。フレームワークまたは骨格が、標的に対する特異的な結合領域を含む限り、当業者にとって公知のどのような非免疫グロブリンフレームワークや骨格でも使用し得る。免疫グロブリン様分子は、免疫グロブリンとある特定の構造特性（例えばβ−シート二次構造）を共有するタンパク質を含む。非免疫グロブリンフレームワークまたは骨格の例としては、アドネクチン（フィブロネクチン）、アンキリン、ドメイン抗体およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、リポカリン、小モジュール免疫薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ、Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡおよびアフィリン（γ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗ｓＥｃａｄ抗体は、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメイン上のエピトープに特異的に結合する（しかし、ＥＣ１のエピトープには結合しない）。エピトープは、パラトープによって特異的に結合される標的上の抗原性決定基、すなわち、抗体の結合部位を指す。エピトープ性決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、一般に特異的な三次元構造特性ならびに特異的な荷電特性を有する。エピトープは通常、約４から約１０個の連続アミノ酸（連続的エピトープ）または、特定の構造を規定する一連の非連続アミノ酸であり得る（例えばコンフォメーションエピトープ）。したがって、エピトープは、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０および少なくとも１２個のこのようなアミノ酸から構成され得る。アミノ酸の空間コンフォメーションを決定する方法は当技術分野で公知であり、例えばｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。

抗体が結合し得る他の可能性あるエピトープを予測する方法は当技術分野で周知であり、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ分析（ＫｙｔｅおよびＤｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２））、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ分析（ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８（１９８１）；ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４８３−４８９（１９８３）；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８８：１−１８（１９８６））．Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析（ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１−１８６（１９８８））およびＥｍｉｎｉ分析（Ｅｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４０：１３−２０（１９８５））が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、理論的細胞外ドメインを決定することによって、可能性あるエピトープが同定される。このような予測を行うために、ＴＭｐｒｅｄ（ＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７４：１６６（１９９３）を参照）またはＴＭＨＭＭ（Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０５（３）：５６７−５８０（２００１））などの分析アルゴリズムを使用することができる。シグナルペプチドの存在を予測するために、およびそれらのペプチドがどこで全長タンパク質から切断されるかを予測するために、ＳｉｇｎａｌＰ ３．０（Ｂｅｄｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（４）：７８３−７９５（２００４））などの他のアルゴリズムを使用することができる。細胞の外側のタンパク質部分は抗体相互作用の標的ととして機能し得る。

本発明の組成物は、（１）結合活性の閾値レベルを示す、および／または（２）公知の関連ポリペプチド分子と顕著には交差反応しない抗体を含む。当業者は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２（１９４９））によって、抗体の結合親和性を容易に決定することができる。

いくつかの実施形態において、本抗ｓＥｃａｄ抗体は、それらの標的エピトープまたは模倣デコイと、標的であるｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインに対して、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインとある程度の相同性を有すると予測される他のタンパク質よりも、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍以上、結合し得る。

いくつかの実施形態において、抗ｓＥｃａｄ抗体は、１０^−４Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下の高い親和性でまたはサブナノモルの親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭまたはさらにそれ未満）で結合する。いくつかの実施形態において、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインに対する抗体の結合親和性は、少なくとも１ｘ１０^６Ｋａである。いくつかの実施形態において、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインに対する抗体の結合親和性は、少なくとも５ｘ１０^６Ｋａ、少なくとも１ｘ１０^７Ｋａ、少なくとも２ｘ１０^７Ｋａ、少なくとも１ｘ１０^８Ｋａ、またはそれ以上である。抗体はまた、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインに対する結合親和性の点でも記載または特定され得る。いくつかの実施形態において、結合親和性は、Ｋｄが、５ｘ１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５ｘ１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５ｘ１０^−３Ｍ、１０^−４Ｍ、５ｘ１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５ｘ１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５ｘ１０^−７Ｍ、１０^−７Ｍ、５ｘ１０^−８Ｍ、１０^−８Ｍ、５ｘ１０^−９Ｍ、５ｘ１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５ｘ１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５ｘ１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５ｘ１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５ｘ１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５ｘ１０^−１５Ｍ未満または１０^−１５Ｍ以下であるものを含む。

いくつかの実施形態において、本抗体は、既知の関連ポリペプチド分子に結合せず、例えば、ｓＥｃａｄポリペプチドの第二、第三、第四または第五サブドメインに結合するが、既知の関連ポリペプチドには結合しない。ｓＥｃａｄポリペプチドの第二、第三、第四または第五サブドメインに特異的に結合する抗体集団を単離するために、既知の関連ポリペプチドへの抗体をスクリーニングし得る。例えば、ｓＥｃａｄポリペプチドの第二、第三、第四または第五サブドメインに特異的な抗体は、適切な緩衝液条件下で不溶性マトリックスに接着させられたｓＥｃａｄポリペプチドの第二、第三、第四または第五サブドメイン関連タンパク質（ｓＥｃａｄポリペプチドの第二、第三、第四または第五サブドメインを除く。）を含むカラムを通過していく。このようなスクリーニングによって、密接に関連のあるポリペプチドと非交差反応性であるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の単離が可能となる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｏ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ（ｅｄｓ．），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５）。特異的な抗体のスクリーニングおよび単離は当技術分野で周知である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ（ｅｄｓ．），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３；Ｇｅｔｚｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１−９８（１９８８）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，１９９６；Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６７−１０１，１９８４を参照）。このようなアッセイの代表例としては、同時免疫電気泳動（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウエスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイおよびサンドイッチアッセイが挙げられる。

悪性ｅ−カドヘリン発現細胞を選択的に死滅させる特定の抗体の能力は、例えば本明細書中の実施例で開示される方法を用いて評価することができる。

抗ｓＥｃａｄ抗体は、タグを含み得、このタグはまた、レポーターまたはマーカー（例えば検出可能なマーカー）とも呼ばれ得る。検出可能なマーカーは、タグ付加ペプチドの発現または活性の定性的および／または定量的評価を可能とする抗ｓＥｃａｄ抗体または、生物学的に活性なその断片に共有結合される何らかの分子であり得る。活性は、生物学的活性、物理化学的活性またはそれらの組み合わせを含み得る。標識される抗体が生物学的活性を保持する限り、検出可能なマーカーの形態および位置は多様であり得る。多くの様々なマーカーを使用し得、特定のマーカーの選択は、所望の適用に依存する。例えば、生体試料、例えば、尿、唾液、脳脊髄液、血液または生検試料中のｓＥｃａｄのレベルを評価するために、または、ｓＥｃａｄペプチド療法に対する臨床反応を評価するために、標識化抗ｓＥｃａｄ抗体を使用し得る。

適切なマーカーとしては、例えば、酵素、光親和性リガンド、放射性同位体および蛍光または化学発光化合物が挙げられる。検出可能なマーカーをペプチドに導入する方法は当技術分野で周知である。合成中または合成後にマーカーを付加することができる。形質転換細胞を増殖させる培地への標識前駆体（例えば放射性標識アミノ酸）の添加によって、組み換え抗ｓＥｃａｄ抗体または生物学的に活性なその変異体を標識することもできる。いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーの組み込みを促進するために、ペプチドの類似体または変異体を使用することができる。例えば、いずれかのＮ末端フェニルアラニン残基を、^１２５Ｉで容易に標識され得る非常に類似した芳香族アミノ酸、例えばチロシンで置換することができる。いくつかの実施形態において、効果的な標識をサポートするさらなる官能基を抗ｓＥｃａｄ抗体の断片または生物学的に活性のあるその変異体に付加することができる。例えば、ネイティブ構造のＮ−末端に３−トリブチルスズベンゾイル基を付加し得、続いてトリブチルスズ基を^１２５Ｉで置換することにより、放射性標識ヨードベンゾイル基が生成される。

抗体または抗体様の治療剤それ自体を投与する代わりに、本方法はまた、インビボでの抗ｓＥｃａｄ抗体の産生を誘発するタンパク質を投与することによっても遂行することができる。したがって、本発明の組成物は、ＥＣ２−ＥＣ５サブドメインにおけるＥ−カドヘリンの細胞外ドメインの抗原性断片を含む（図１Ａおよび図１Ｂを参照）。免疫原性融合タンパク質を作製するために、これらのポリペプチドを異種ポリペプチドに融合させ得る。例えば、米国特許第７，２６２，２７０号に記載のように、インフルエンザウイルスＨＡ２ヘマグルチニンタンパク質の断片にｓＥｃａｄポリペプチドを融合させることができる。

Ｅ−カドヘリンの発現を阻害するために使用することができる核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは、ＲＮＡ干渉に介在するオリゴヌクレオチド）も本発明の範囲内である。インビボまたはエクスビボで（例えば細胞または組織培養において）ｓＥｃａｄの抗原性断片を発現させるために、核酸コンストラクトを使用することもできる。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で同義語として使用され得、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび、核酸類似体を含有するＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含め、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。ポリヌクレオチドは、何らかの三次元構造を有し得る。核酸は、二本鎖または１本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であり得る。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびその一部、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー、ならびに核酸類似体が挙げられる。本発明の内容において、核酸は、例えば、抗体、突然変異抗体もしくはその断片またはｓＥｃａｄもしくはその断片をコードし得る。

「単離」核酸は、例えば天然のＤＮＡ分子またはそれらの断片であり得るが、ただし、天然のゲノムにおいて通常はそのＤＮＡ分子のすぐ隣で見出される少なくとも１つの核酸配列が除去されているかまたは存在しないものとする。したがって、単離核酸としては、他の配列と独立に個別の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成核酸またはｃＤＮＡまたは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されるゲノムＤＮＡ断片）が挙げられるが、これらに限定されない。単離核酸はまた、ベクター、自己複製プラスミド、ウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ分子も指す。さらに、単離核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子など、改変核酸を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリまたはゲノムＤＮＡ制限消化を含有するゲルスライス片内の多くの（例えば数十または数百から数百万）その他の核酸の中に存在する核酸は単離核酸ではない。

標準的技術によって、単離核酸分子を作製することができる。例えば、本明細書中に記載のポリペプチド（即ち改変タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含め、本明細書中に記載のヌクレオチド配列を含有する単離核酸を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。トータルゲノムＤＮＡまたはトータル細胞性ＲＮＡからの配列を含め、ＤＮＡならびにＲＮＡから特異的な配列を増幅させるために、ＰＣＲを使用することができる。例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に様々なＰＣＲ法が記載されている。一般的に、増幅させようとする鋳型の逆鎖と配列が同一であるかまたは類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、関心のある領域の末端またはそれ以上からの配列情報を使用する。部位特異的なヌクレオチド配列修飾を鋳型核酸に導入し得る様々なＰＣＲストラテジーも使用可能である（必要に応じて、例えば改変タンパク質、例えば抗体、突然変異抗体もしくはそれらの断片または融合タンパク質もしくはそれらの断片を作製する場合）。１つの核酸分子として（例えば、自動化ＤＮＡ合成を用いて、３’から５’方向でホスホールアミダイト技術を用いて）または一連のオリゴヌクレオチドとしての何れかで、単離核酸を化学的に合成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされる際に２本鎖が形成されるように、所望の配列を含有する長いオリゴヌクレオチド（例えば＞５０−１００ヌクレオチド）の１以上の対を、各対が相補性のある短いセグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を含有するように、合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長させ、オリゴヌクレオチド１対あたり１つの２本鎖核酸分子を得て、次に、これをベクターにライゲーションすることができる。本発明の単離核酸は、例えば改変タンパク質コードＤＮＡの天然部分の突然変異誘発によって得ることもできる。

本明細書中に記載の核酸およびポリペプチド（例えばｓＥｃａｄの抗原性断片）は、「外来性」と呼ばれ得る。「外来性」という用語は、核酸またはポリペプチドが、組み換え核酸コンストラクトの一部であるかもしくはこれによりコードされているか、またはその天然の環境にはないことを示す。例えば、外来性核酸は、別の種に導入される１つの種からの配列、すなわち異種核酸であり得る。一般に、組み換え核酸コンストラクトを介して他の種にこのような外来性核酸を導入する。外来性核酸は、生物に対してネイティブである、およびその生物の細胞に再導入されている配列でもあり得る。ネイティブ配列を含む外来性核酸は、外来性核酸に連結される非天然配列、例えば組み換え核酸コンストラクトにおいてネイティブ配列に隣接する非ネイティブ制御配列の存在により、天然の配列とは区別され得ることが多い。さらに、安定的に形質転換された外来性核酸は一般に、ネイティブ配列が見出される位置以外の位置に組み込まれる。

組み換えコンストラクトも本明細書中で提供され、ポリペプチド、例えば抗体、突然変異抗体もしくはそれらの断片またはｓＥｃａｄもしくはそれらの断片を発現させるために細胞を形質転換するため、使用され得る。組み換え核酸コンストラクトは、例えば、改変タンパク質、例えば抗体、突然変異抗体もしくはその断片またはｓＥｃａｄもしくはその断片を発現させるのに適切な制御領域に操作可能に連結される、本明細書中に記載のような、抗体、突然変異抗体もしくはその断片またはｓＥｃａｄもしくはそれらの断片をコードする核酸を含む。いくつかの場合において、組み換え核酸コンストラクトは、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、アンチセンス方向に、コード配列、遺伝子またはコード配列もしくは遺伝子の断片を含む核酸を含み得る。当然のことながら、多くの核酸が、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。ゲノムコードの縮重は当技術分野で周知である。多くのアミノ酸で、アミノ酸のコドンとなるヌクレオチドトリプレットが複数ある。例えば、特定の生物における最適な発現が得られるように、その生物に対する適切なコドンバイアステーブルを用いて、抗体のある一定の断片、突然変異抗体もしくはその断片または融合タンパク質もしくはその断片のコード配列におけるコドンを修正することができる。

本明細書中に記載の核酸などの核酸を含有するベクターも提供される。「ベクター」は、挿入セグメントを複製するために別のＤＮＡセグメントが挿入されるレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドなどである。発現ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクターおよび、米国特許出願第２００６／０２３９９７０号（本明細書によって参照により本明細書中に組み込まれる）に記載のような、ＨＳＶ単位複製配列粒子が含まれる。一般的に、ベクターは、的確な制御エレメントと連結される場合、複製可能である。適切なベクター骨格には、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはＰＡＣなど、当技術分野で日常的に使用されるものが含まれる。「ベクター」という用語は、クローニングおよび発現ベクターならびにウイルスベクターおよび組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、制御領域を含むベクターである。適切な発現ベクターとしては、プラスミドおよび、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルス由来のウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような会社から、非常に多くのベクターおよび発現系が市販されている。

本明細書中で提供されるベクターはまた、例えば、複製開始点、骨格付着領域（ＳＡＲ）および／またはマーカーも含み得る。マーカー遺伝子は、宿主細胞において選択可能な表現型を与え得る。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン）に対する抵抗性など、殺生物剤抵抗性を与え得る。上記のように、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するために設計されたタグ配列を含み得る。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニンまたはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列などのタグ配列は一般に、コードされたポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端の何れかを含め、ポリペプチドのあらゆる場所に挿入され得る。

ベクターは制御領域も含み得る。「制御領域」という用語は、転写または翻訳開始および速度および、転写または翻訳産物の安定性および／または可動性に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、反応エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列およびイントロンが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、転写されるべき配列の転写または翻訳に影響を与えるために、核酸の制御領域および転写されるべき配列を配置することを指す。例えば、コード配列をプロモーターの調節下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は一般に、プロモーターの１から約５０ヌクレオチド下流の間に配置される。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド程度上流または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド程度上流に配置され得る。プロモーターは一般に、少なくともコア（基礎）プロモーターを含む。プロモーターはまた、少なくとも１つの調節エレメント、例えばエンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）も含み得る。含められるべきプロモーターの選択は、いくつかの因子に依存し、その因子には、効率、選択可能性、誘導性、所望の発現レベルおよび細胞または組織選択的発現が含まれるが、これらに限定されない。コード配列に対してプロモーターおよび他の制御領域を適切に選択し、配置することによって、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的なことである。

宿主細胞も本明細書中で提供される。宿主細胞は、例えば、本発明のポリペプチドを発現する、原核生物、例えばＥ．コリ（大腸菌）などの細菌または真核生物、例えば、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞であり得る。

ｓＥｃａｄを阻害する本明細書中に記載の作用物質は、生理学的に許容可能である（すなわち、本明細書中に記載の治療および予防法において使用するのに十分に無毒性）医薬組成物中に含まれ得る。したがって、本発明は、経皮送達ｓＥｃａｄ阻害剤用の局所クリーム（日焼け止めに組み込まれる。）および持続放出パッチを含め、様々な製剤を特色とする。他の実施形態において、本医薬組成物は、含嗽液、ジェルもしくはエマルションとして、または直腸溶液、縣濁液もしくはエマルションとして製剤化され得る。当業者にとって当然のことながら、治療されている癌のタイプに基づき、具体的な製剤を選択し得る。例えば、口腔、咽喉、食道または胃の癌を治療するために、含嗽液、ジェルまたはエマルションを使用し得、直腸または結腸の癌を治療するために、直腸液、縣濁液またはエマルションを使用し得る。

患者への投与用に、本発明の治療剤（例えば、ｓＥｃａｄを阻害する、抗ｓＥｃａｄ抗体および他のタンパク質または核酸に基づく作用物質）のインビボでの安定性を向上させる材料、および／または制御的放出もしくは持続放出させる材料とともに、本発明の治療剤を製剤化することができる。したがって、本発明は、ｓＥｃａｄ特異的な作用物質が微小粒子（例えば、ポリマー性微小粒子、例えばポリラクチド−コ−グリコリド微小粒子）またはナノ粒子（例えば、リポソーム、ポリマー性炭水化物ナノ粒子、デンドリマーおよび炭素ベースのナノ粒子）とともに製剤化される送達システムを包含する。

その他の製剤には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内または肺内投与用の製剤が含まれる。別掲のとおり、持続放出インプラントを作製し、使用することもできる。

本発明の治療または予防法は、いずれも、治療前または治療の進行とともに、患者を評価する工程を含み得る。上述のように、***、皮膚、肺、前立腺、胃および結直腸癌ならびに他の上皮悪性腫瘍がある患者の尿および／または血清においてｓＥｃａｄが上昇することは、十分に裏付けられている。発明者らのデータは、ｓＥｃａｄレベルに対する先行研究と一致しており、ｓＥｃａｄが、正常上皮細胞の表面から低レベルで、およびヒト皮膚癌細胞、ヒト乳癌細胞およびマウス肺癌細胞からはるかに高レベルで切断されることを明らかにしている。したがって、本方法は、対象から得られた試料（例えば、尿または血液試料）からｓＥｃａｄレベルが決定される工程を含み得る。レベル上昇は、本明細書中に記載のような治療に対して対象が望ましい候補であることの指標であり、治療進行とともにｓＥｃａｄをモニタリングすることにより、最適な投与およびスケジュール化が容易になり、転帰を予想することができる。例えば、抵抗性の発現を検出し、無反応の患者から反応性のある患者を迅速に区別するために、モニタリングを使用することができる。抵抗性または無反応性の兆候がある場合、医師は、腫瘍がさらなる回避機構を発現する前に、代替法または補助薬剤を選択することができる。

癌に罹患しているかまたは罹患し易いヒトまたは哺乳動物に、ｓＥｃａｄの第二、第三、第四または第五サブドメインの１以上を特異的に標的とする２以上の作用物質を含む組成物を投与し得る。本抗ｓＥｃａｄ抗体は、別の治療剤、例えば細胞毒性剤、または癌化学療法剤とともに投与することもできる。２以上の治療剤の同時投与は、治療剤がそれらの治療効果を発揮している間重複している限り、同時にまたは同経路で投与される必要はない。同時投与または、異なる日または週での投与のような連続投与が企図される。

本発明の医薬組成物はまた、さらに、ｓＥｃａｄ標的物質に加えて、別の治療用抗体（または複数の抗体（例えば、ｓＥｃａｄ以外の細胞性標的（または複数の標的）を認識する抗体））も含み得る。代表的な免疫グロブリンを以下に列挙する。各免疫グロブリンは、その正しい名称およびその商標により識別される。「ＤＢ」で始まる丸括弧内の数字は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａで利用可能なＴｈｅ ＤｒｕｇＢａｎｋデータベース上の各抗体の識別子を指す。Ｔｈｅ ＤｒｕｇＢａｎｋ データベースは、ｓＥｃａｄ のｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ（ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ）上でＷｉｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：Ｄ９０１−９０６（２００８））において記載されている。有用な免疫グロブリンとしては、アブシキシマブ（レオプロ（商標））（ＤＢ０００５４）、キメラヒト−マウスモノクローナル抗体７Ｅ３のＦａｂ断片、ＥＰ０４１８３１６（Ａ１）およびＷＯ８９／１１５３８（Ａ１）に記載されている合成物；アダリムマブ（ヒュミラ（商標））（ＤＢ０００５１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に結合し、その同種受容体へのＴＮＦ−αの結合を阻止する完全ヒトモノクローナル抗体；アレムツズマブ（キャンパス（商標））（ＤＢ０００８７）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）およびＴ細胞リンパ腫の治療で使用される成熟リンパ球の表面上に存在するタンパク質であるＣＤ５２を標的とするヒト化モノクローナル抗体；バシリキシマブ（シムレクト（商標））（ＤＢ０００７４）、ＩＬ−２受容体のアルファ鎖（ＣＤ２５）に対するキメラマウス−ヒトモノクローナル抗体；ベバシズマブ（アバスチン（商標））（ＤＢ００１１２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を認識し、ブロックするヒト化モノクローナル抗体、血管形成を刺激する化学的シグナル、その合成はＰｒｅｓｔａ ｅｌ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７：４５９３−４５９９（１９９７）に記載されている；セルツキシマブ（ｃｅｒｔｕｘｉｍａｂ）（アービタックス（商標））（ＤＢ００００２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、阻害するキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体、その合成は、米国特許第６，２１７，８６６号に記載されている；セルトリズマブペゴル（シムジア（商標））、ヒト化ＴＮＦ阻害剤モノクローナル抗体のＰＥＧ化Ｆａｂ’断片；ダクリズマブ（ゼナパックス（商標））（ＤＢ００１１１）、ＩＬ−２受容体のαサブユニットに対するヒト化モノクローナル抗体；エクリズマブ（ソリリス（商標））、ヒトＣ５補体タンパク質に結合するヒト化モノクローナル抗体；エファリズマブ（ラプチバ（商標））（ＤＢ０００９５）、ＣＤ１１ａに結合するヒト化モノクローナル抗体；ゲムツズマブ（マイロターグ（商標））（ＤＢ０００５６）細胞毒性剤に連結されているＣＤ３３に対するモノクローナル抗体、そのアミノ酸配列は、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９１）およびＣａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．７３（３ Ｓｕｐｐｌ）：１０４９−１０５６（１９９４））に記載されている；イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（商標））（ＤＢ０００７８）、キレート剤チウキセタンおよび放射性同位体（イットリウム^９０またはインジウム^１１１）と組み合わせられたモノクローナルマウスＩｇＧ１抗体イブリツモマブ；インフリキシマブ（レミケード（商標））（ＤＢ０００６５）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に結合するキメラマウス−ヒトモノクローナル抗体、その合成は、米国特許第６，０１５，５５７号に記載されている；ムロモナブ−ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３（商標））、Ｔ細胞受容体−ＣＤ３複合体に結合するマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体；ナタリズマブ（チサブリ（商標））（ＤＢ００１０８）、細胞接着分子α４−インテグリンに対するヒト化モノクローナル抗体、その配列は、Ｌｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８（１）：３−１６（１９９７）に記載されている；オマリズマブ（ゾレア（商標））（ＤＢ０００４３）、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に選択的に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体；パリビズマブ（シナジス（商標））（ＤＢ００１１０）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質のＡ抗原性部位のエピトープに対するヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧ）、そのアミノ酸配列は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６（５）：１２１５−１２２４（１９９７）に記載されている；パニツムマブ（べクチビックス（商標））、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１およびヒトのＨＥＲ１としても知られている）に対して特異的な完全ヒトモノクローナル抗体；ラニビズマブ（ルセンティス（商標））、ベバシズマブ（アバスチン（商標））と同じ親マウス抗体由来である親和性成熟抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体断片；リツキシマブ（リツキサン（商標）、マブセラ（商標））（ＤＢ０００７３）、主にＢ細胞表面上で見られるタンパク質ＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体；トシツモマブ（ベキサール（商標））（ＤＢ０００８１）、^１３Ｉが共有結合している抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体；またはトラスツズマブ（ハーセプチン（商標））（ＤＢ０００７２）、ＨＥＲ２タンパク質に選択的に結合するヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。

本抗体は、承認済み抗体または市販抗体（生物学的類似物）の生物学的同等物を含み得る。生物学的類似物は、例えば、市販抗体と同じ一次アミノ酸配列を有する、現在知られている抗体であり得るが、市販抗体とは異なる細胞型または異なる生成、精製または製剤法により生成され得るものである。一般的に、あらゆる寄託物を使用することができる。

本医薬組成物はまた、例えば細胞機能を阻害または阻止する物質など、細胞毒性剤も含み得るかまたは細胞毒性剤と一緒に投与され得、および／または細胞の破壊を引き起こす。代表的な細胞毒性剤としては、放射性同位体（例えば、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙおよび^１８６Ｒｅ）、化学療法剤および毒素、例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素または合成毒素、またはそれらの断片が挙げられる。非細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害または阻止せず、および／または細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞傷害剤は、細胞傷害性となるように活性化され得る作用物質を含み得る。非細胞傷害剤は、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を含み得る（例えば、本明細書中で参照により組み込まれる、米国特許公開第２００３／００２８０７１号および第２００３／００３２９９５号を参照）。このような作用物質は、本明細書中で開示される抗体または他の標的作用物質と複合化、カップリング、結合またはそれに随伴され得る。

本明細書中で開示される組成物とともに、従来の抗癌剤を投与することができる。有用な薬品としては、抗血管形成剤、すなわち、生存に必要な新しい血管成長を刺激するという腫瘍の能力を阻止する薬剤である。当技術分野で公知のあらゆる抗血管形成剤を使用することができ、これには、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の機能を阻止するベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）などの薬剤が含まれる。他の例としては、ダルテパリン（フラグミン（登録商標））、スラミン、ＡＢＴ−５１０、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、レナリドマイド、ＬＹ３１７６１５（エンザスタウリン）、ダイズイソフラボン（ゲニステイン；大豆タンパク質単離物）、ＡＭＧ−７０６、抗ＶＥＧＦ抗体、ＡＺＤ２１７１、Ｂａｙ４３−９００６（トシル酸ソラフェニブ）、ＰＩ−８８、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（バタラニブ）、ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ）、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、サリドマイド、ＡＴＮ−１６１、ＥＭＤ１２１９７４（シレニグチド（Ｃｉｌｅｎｉｇｔｉｄｅ））およびセレコキシブ（セレブレックス（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。

他の有用な治療剤としては、ＤＮＡ損傷、例えば、癌細胞の細胞性ＤＮＡにおける２本鎖の破壊を促進する薬剤が挙げられる。当業者にとって公知のあらゆる形態のＤＮＡ損傷剤を使用することができる。ＤＮＡ損傷は、一般に、放射線療法および／または化学療法により生じ得る。放射線療法の例としては、外照射療法および内部照射療法（小線源療法とも呼ばれる。）が挙げられるが、これらに限定されない。外照射療法のためのエネルギー源としては、ｘ線、ガンマ線および粒子ビームが挙げられ、内部照射療法で使用されるエネルギー源としては、放射性ヨウ素（ヨウ素^１２５またはヨウ素^１３１），およびストロンチウム^８９またはリン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩またはコバルトの放射性同位体からのものが挙げられる。放射線療法を行う方法は当業者にとって周知である。

ＤＮＡ損傷性の化学療法薬の例としては、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル（リューケラン）、シスプラチン（プラチノール）、シクロホスファミド（シトキサン、ネオサール）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ）、イホスファミド（イフェックス）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（窒素マスタード、ムスタルゲン）、メルファラン（アルケラン）およびプロカルバジン（マチュレーン）が挙げられるが、これらに限定されない。

他の標準的な癌化学療法薬としては、アルキル化剤、例えばカルボプラチンおよびシスプラチン；窒素マスタードアルキル化剤；ニトロソウレアアルキル化剤、例えばカルムスチン（ＢＣＮＵ）；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート；葉酸；プリン類似体代謝拮抗剤、メルカプトプリン；ピリミジン類似体代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））；ホルモン性抗新生物薬、例えばゴセレリン、ロイプロリドおよびタモキシフェン；天然抗新生物薬、例えばアルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）、抗生物質天然抗新生物薬、例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびミトマイシンＣを含むミトマイシン類；およびビンカアルカロイド天然抗新生物薬、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン；ヒドロキシ尿素；アセグラトン、アドリアマイシン、イホスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍多糖類、抗腫瘍血小板因子、シクロホスファミド（シトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）（登録商標））、シゾフィラン、シタラビン（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、、ドラスタチン類、ドラスタチン類似体、例えばアウリスタチン、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、ミトザントロン、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン、エスペラマイシン類（例えば、米国特許第４，６７５，１８７号を参照）、ネオカルジノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチン（ウベニメクス（登録商標））、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が挙げられるが、これらに限定されない。

癌患者に対する治療剤として使用され得るさらなる薬剤としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；突然変異体および類似体を含むインターロイキン１から１８；インターフェロンまたはサイトカイン類、例えばインターフェロンα、βおよびγホルモン類、例えば黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体および、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）；成長因子、例えば形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびインスリン増殖因子（ＩＧＦ）；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；浸潤阻害因子−２（ＩＩＦ−２）、骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；サイモシンα−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；および抗血管形成因子が挙げられる。

有用な治療剤としては、プロドラッグ、例えば、親薬物と比較して、腫瘍細胞に対して細胞毒性が低いかまたは細胞毒性がなく、酵素により活性化可能であるかまたは活性のあるもしくはより活性が高い親形態に変換可能な、医薬的に活性のある物質の前駆体または誘導体型である。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４：３７５−３８２（１９８６） ａｎｄ Ｓｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ，”Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。プロドラッグとしては、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ｂ−ラクタム含有プロドラッグ、場合によっては置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合によっては置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび、より活性が高い細胞毒性のない薬物に変換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用可能なプロドラッグ型に誘導体化され得る細胞毒性薬の例としては、上述の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の反応が誘導されるか否かを調べる場合、当業者にとって公知の方法であればいずれの方法でも使用できる。反応が誘導されるか否かを調べるのに、特定の疾患状態の程度を評価する臨床方法を使用することができる。反応を評価（ｅｖｅｌｕａｔｅ）するために使用される特定の方法は、患者の障害の性質、患者の年齢および性別、投与されている他の薬物および担当医師の判断に依存する。

（実施例１）：ｓＥｃａｄの封鎖は、インビトロで悪性***上皮細胞においてアポトーシスを誘発するが、正常ヒト***上皮細胞ではアポトーシスを誘発しない。

Ｅ−カドヘリン細胞外ドメイン切断は最初に、ＭＣＦ−７乳癌細胞の培地中に可溶性の８０ｋＤａ断片を検出した、Ｗｈｅｅｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１８７−２０２（１９８７））により記載された。それ以来、このｓＥｃａｄ断片の切断は、悪性の***、皮膚、卵巣、前立腺、食道、結腸、肺および脳細胞を含め、インビトロでいくつかの異なる悪性細胞型について記載されてきた（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７（１０）：３２８９−３２９７（２００１）；Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０８（２）：３６１−３６９（２００８）；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（５０）：７０８０−７０９０（１９９９）；ＫａｎｔａｋおよびＫｒａｍｅｒ，１９９８；Ｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：１１１−１１８（２００１）；Ｒｙｎｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８３：１５９−１６５（２００２）；Ｓｙｍｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６７（５）：２０３０−２０３９（２００７））。

良性と悪性細胞との間でＥ−カドヘリンの局在化および構成的切断に違いがあるか否かを調べるために、発明者らは、Ｅ−カドヘリンを視覚化する目的で、免疫蛍光顕微鏡によって、正常ＭＣＦ−１０Ａ***上皮細胞およびＭＣＦ−７乳癌細胞を染色した。４ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）上、１０％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭ中で、コンフルエントになるまで両細胞型を増殖させた。１００％メタノール中で細胞を固定し、Ｅ−カドヘリンを免疫染色し、免疫蛍光顕微鏡（ｘ２０倍率）により調べた。ヒストンＨ１（赤）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して、核を標識した。発明者らはまた、切断されたＥ−カドヘリン細胞外ドメインについて上清（ｓｕｐｅｒｎａｎｔａｎｔｓ）もＥＬＩＳＡにより分析した。コンフルエントのＭＣＦ−１０ＡおよびＭＣＦ−７細胞から馴化培地を回収し、製造者の説明書に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってｓＥｃａｄレベルを分析した。

ヒトＥ−カドヘリンサブドメインＥＣ１（ＳＨＥ７８−７、Ｚｙｍｅｄ）に対して特異的なモノクローナル抗体への曝露後、発明者らは、細胞−細胞接触部位において、しかも最も注目すべきことに、両細胞株における細胞のクラスター内で、細胞間境界に沿って、Ｅ−カドヘリン免疫染色を観察した。対照的に、正常ＭＣＦ−１０Ａ細胞およびＭＣＦ−７癌細胞の両方の馴化培地中で、切断された可溶性Ｅ−カドヘリン細胞外ドメインが検出されたが、ＭＣＦ−７癌細胞株では顕著に上昇していた。ｓＥｃａｄレベルは、ＭＣＦ−１０ＡとＭＣＦ−７細胞との間で有意に異なった。

次に、Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインに対する抗体（ＤＥＣＭＡ；２０μｇ／ｍＬ）または免疫前血清（ＩｇＧ；２０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、コンフルエントＭＣＦ−１０Ａ細胞およびＭＣＦ−７細胞を４８時間培養し、製造者の説明書に従い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、アポトーシスについて分析した。抗ｓＥｃａｄ抗体に曝露した正常ＭＣＦ−１０Ａ細胞と未処理またはアイソタイプ対照細胞との間では、アポトーシスに関して特記すべき差はなかった。対照的に、抗ｓＥｃａｄ処理したＭＣＦ−７癌細胞では、細胞アポトーシスの顕著な増加を示し、未処理細胞ではそれは明らかではなかった。これらの知見をさらに確認するために、発明者らは、細胞質ヒストン結合ＤＮＡ断片（モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソーム）を測定するアポトーシス特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。製造者の説明書に従い、細胞質ヒストン結合ＤＮＡ断片に対するアポトーシス特異的ＥＬＩＳＡを用いて、２０μｇ／ｍＬの抗ｓＥｃａｄＡｂまたはＩｇＧの存在下または非存在下で４８時間培養したＭＣＦ−１０ＡおよびＭＣＦ−７の細胞溶解液をアポトーシスについて分析した（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ^ＰＬＵＳ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。その結果、抗ｓＥｃａｄ処理はＭＣＦ−７細胞においてアポトーシスを劇的に誘導したが、ＭＣＦ−１０Ａ細胞においては特記するような効果がなかったことが明らかになった。何れの細胞株でも壊死レベルは抗ｓＥｃａｄ処理により影響を受けなかった。まとめると、これらの結果から、切断されたＥ−カドヘリン細胞外ドメインを細胞環境から阻害または封鎖することによって、乳癌細胞においてアポトーシスが選択的に誘導され、その一方で正常な健常***上皮細胞では回避されることが示される。

ｐ５３の活性化は、腫瘍形成の抑制にとって重要な遺伝子の転写制御へと導かれ、その特異的な作用は主にアポトーシスの惹起を通じて発揮されるので（Ｆｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３（５）：１９２−１９９（２００７））、発明者らは、次に、ｐ５３がこの抗ｓＥｃａｄ−誘導性アポトーシスに関与するか否かを調べたいと考えた。ウエスタンブロッティングおよびｐ５３に対する抗体を用いて、発明者らは、ＭＣＦ−７細胞におけるこのプロアポトーシス性タンパク質の発現への抗ｓＥｃａｄの効果を調べた。簡潔に述べると、５０μｇの細胞溶解液を４−１５％勾配ゲル上で電気泳動にかけ（ＢｉｏＲａｄ）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに移し、抗ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；１：４００）を用い、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：３，０００）および増感化学発光（ＥＣ１）検出で免疫ブロッティングを行った。Ｇ３ＰＤＨ染色により等量のタンパク質を検証した。２０μｇの抗ｓＥｃａｄでの処理では、ｐ５３は２４時間から増加し始め、４８時間までに最大レベルに到達した。対照的に、未処理細胞またはアイソタイプ対照で処理した細胞はｐ５３発現を欠いた。腫瘍におけるｐ５３の存在は化学療法への良好な反応と相関し、低レベルのｐ５３は癌細胞において薬物抵抗性をもたらすので、発明者らは、腫瘍環境におけるｓＥｃａｄの阻害によって細胞毒性が促進され、現在の化学療法ストラテジーで発現する抵抗性が低下し得ると考える。

（実施例２）：ヒト皮膚扁平上皮細胞癌(扁平上皮癌)細胞では、抗ｓＥｃａｄ抗体処理後アポトーシスが起きるが、正常成人ヒト角化細胞ではアポトーシスが起きない。

ｓＥｃａｄの構成的切断が、ヒト扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）と正常上皮角化細胞培養との間で異なるか否かを直接調べるために、発明者らは、正常初代ヒト皮膚角化細胞（ＰＨＫ）および２種類の異なるヒトＳＣＣ細胞株（ＳＣＣ１２ｂおよびＳＣＣ１３）においてｓＥｃａｄレベルを評価した。ＰＨＫ、ＳＣＣ１２ｂおよびＳＣＣ１３細胞を約８０％コンフルエントになるまで増殖させ、ウエスタン免疫ブロッティングにより、培養上清（ｓｕｐｅｒｎａｎｔａｎｔｓ）におけるｓＥｃａｄレベルを調べた。簡潔に述べると、各細胞株から得た６０μＬの馴化培地を４−１５％勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で電気泳動にかけ、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに移し、抗Ｅ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；１：６００）を用い、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：３，０００）および増感化学発光（ＥＣＬ）検出で免疫ブロッティングを行った。さらに、ＰＨＫ、ＳＣＣ１２ｂおよびＳＣＣ１３細胞からの馴化培地を回収し、製造者の説明書に従い、ＥＬＩＳＡによりｓＥｃａｄレベルについて分析した。発明者らは、ウエスタンブロッティングによって、両方のＳＣＣ細胞株で、ｓＥｃａｄの発現上昇を観察した。これは、ＥＬＩＳＡに基づいて、ＳＣＣ１２ｂおよびＳＣＣ１３細胞株のｓＥｃａｄレベルが、非癌性ＰＨＫ細胞よりも３倍超増加したことに対応した。

抗ｓＥｃａｄ抗体が上記のＭＣＦ−７乳癌細胞以外の上皮癌細胞においてアポトーシスを誘導し得るか否かを調べるために、発明者らは、抗ｓＥｃａｄ（２０μｇ／ｍＬ、ＤＥＣＭＡ；Ｓｉｇｍａ）または免疫前血清（ＩｇＧ；「アイソタイプ対照」）の存在下または非存在下で４８時間、ＰＨＫ（Ｄ０３３）、ＳＣＣ１２ｂおよびＳＣＣ１３細胞をコンフルエントになるまで培養し、製造者の説明書に従い、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて、アポトーシスについて細胞を分析した。

ＳＣＣ１２ｂおよびＳＣＣ１３細胞は、抗ｓＥｃａｄに曝露された場合、アポトーシスの顕著な増加を示したが、この阻止抗体で正常ＰＨＫを処理した場合には、検出可能なプロアポトーシス性の影響は示されなかった。アポトーシス特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、発明者らは、同じ用量の抗ｓＥｃａｄでＰＨＫを処理してもアポトーシスに影響がなかったことをさらに確認した。まとめると、このデータは、抗ｓＥｃａｄ処理が、２種類の異なるヒト皮膚癌細胞株で選択的にアポトーシスを誘導するが、正常初代ヒト角化細胞皮膚培養物では誘導しないことを示す。

（実施例３）：マウスＳＣＣは、抗ｓＥｃａｄ誘導性アポトーシスを起こし易い。

扁平上皮細胞癌などの疾患プロセスを効果的に調べるためには、ヒトモデルと動物モデルの両方のアプローチを使用することが賢明である。したがって、発明者らは、ＳＣＣマウス細胞株において抗ｓＥｃａｄ処理がアポトーシスを選択的に誘導するか否かを調べたいと考えた。そうであるならば、マウスモデル系を用いてインビボで、抗ｓＥｃａｄ剤の有効性および毒性のさらなる試験が可能になる。

発明者らは、最初に、ＥＬＩＳＡによって、コンフルエントの初代マウス角化細胞（ＰＭＫ）およびマウスＳＣＣ細胞株（ＰＡＭ２１２）の馴化培地におけるｓＥｃａｄのレベルを調べた。予想されるように、ＰＡＭ２１２細胞株におけるｓＥｃａｄレベルは、対照ＰＭＫ培養物よりも２倍近く高かった。ウエスタンブロッティングによってこれらのレベルを確認したが、ｓＥｃａｄの相対レベルはＰＡＭ２１２細胞株で２倍から３倍高かった。したがって、乳癌およびヒト皮膚癌細胞と同様に、Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインの構成的切断は、非癌性の健常上皮細胞よりもマウスＳＣＣにおいて統計学的に高いことが明らかである。

抗ｓＥｃａｄ処理が、マウスＳＣＣに対して選択的に細胞毒性であることを確認するために、Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインに対する抗体（２０μｇ／ｍＬ ＤＥＣＭＡ；Ｓｉｇｍａ）または免疫前血清（ＩｇＧ）の存在下または非存在下で４８時間、ＰＭＫおよびＰＡＭ２１２細胞をコンフルエントになるまで培養し、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて、アポトーシスについて分析した。発明者らは、本阻止抗体との温置後、ＳＣＣ細胞株において、ＴＵＮＥＬ−陽性細胞で顕著な上昇を観察したが、ＰＭＫ培養物では特記すべき相違はなかった。

アポトーシス特異的なＥＬＩＳＡアッセイ（ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ^ＰＬＵＳ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））によってこれらの結果を確認したが、抗ｓＥｃａｄ処理したＰＡＭ２１２細胞株においてアポトーシスが２倍を超えて上昇し、ＰＭＫ培養物において特記すべき細胞死がないことが示された。対照的に、細胞型に関係なく、試験した条件全てにおいて壊死レベルは不変であった。

発明者らは既に２０μｇ／ｍＬの抗ｓＥｃａｄ抗体へ曝露されたＭＣＦ−７細胞におけるｐ５３レベル上昇を明らかにしたので、次に、この阻止抗体または免疫前血清（ＩｇＧ）の存在下または非存在下で２４時間および４８時間培養したＰＡＭ２１２細胞において同様のｐ５３上昇があるか否かを調べた。簡潔に述べると、５０μｇの細胞溶解液を４−１５％勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で電気泳動にかけ、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに移し、抗ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；１：４００）を用い、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：３，０００）および増感化学発光（ＥＣＬ）検出により、免疫ブロッティングを行った。Ｇ３ＰＤＨ染色により等量のタンパク質を検証した。ウエスタンブロッティングにより、抗ｓＥｃａｄ処理後２４時間および４８時間までにｐ５３レベルの著しい上昇があるが、未処理またはアイソタイプＩｇＧ対照ではバンドがないことが証明された。抗ｓＥｃａｄ誘導ｐ５３発現のこのタイミングは、既に記載のＭＣＦ−７細胞株で見られたものと同じである。したがって、この抗ｓＥｃａｄ誘導性癌細胞死はｐ５３依存性経路を介するものであると思われるが、正確な下流の因子はまだ明らかになっていない。

（実施例４）：他の非癌性細胞においてｓＥｃａｄの阻止はアポトーシスを誘導しない。

抗ｓＥｃａｄ Ａｂまたは免疫前血清（ＩｇＧ）の存在下または非存在下で２４−４８時間、３Ｔ３マウス線維芽細胞およびヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養し、ＴＵＮＥＬによって、および上述のアポトーシス特異的なＥＬＩＳＡアッセイにより、アポトーシスについて分析した。本阻止抗体の存在下で、ＴＵＮＥＬアッセイを使用した３Ｔ３細胞は殆どまたは全くアポトーシス性の核を示さず、アポトーシス特異的なＥＬＩＳＡアッセイによっても、アポトーシスに変化は見られなかった。同様に、抗ｓＥｃａｄで処理したＨＵＶＥＣ細胞は、両ストラテジーを使用した結果、アポトーシスに特記すべき差は示さなかった。さらに、３Ｔ３およびＨＵＶＥＣ細胞は、本Ｅ−カドヘリン阻止抗体においてこれらの細胞を示さなかった。

（実施例５）：抗ｓＥｃａｄ ｍＡｂ療法は、インビボで、腫瘍の発症を遅延させ、腫瘍負担を防ぎ、腫瘍グレードを低下させる。

この試験において、触診可能な乳癌腫瘍の急速な発現（肺への転移を伴う侵襲性の強い腺癌へ進行する）を特徴とする処女雌ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴトランスジェニックマウスを使用した（Ｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｂｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。４８日齢で開始し、ｓＥｃａｄのＥＣ−５ドメインを標的とするモノクローナル抗体（α−ｓＥｃａｄ；ＤＥＣＭＡ−１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、２０μｇ／２００μＬ食塩水／マウス）または生理食塩水で、ｉ．ｐ．注射により、マウスを週に２回処置した。このマウスを９０日齢で屠殺した。全ての食塩水処置（対照）ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスが、５０から６０日までに触診可能な腫瘍を発現したが、処置マウスにおいては、腫瘍発症の統計学的に有意な遅延が観察された（８１から８５日；図２Ａを参照）。９０日齢のＥＣ５ ｍＡｂ処置マウスでは、組織病理学的に中程度に分化していると判定された総腫瘍は、より少なかった（構造的グレードＩＩおよび核グレードＩ；図２Ｂを参照）。対照的に、９０日食塩水処置マウスにおける腫瘍の分化度は全て低かった（構造的グレードＩＩＩおよび核グレードＩＩＩ；図２Ｃを参照）。ｍＡｂ処置マウスではまた、総腫瘍重量および体積も低下した。

要するに、これらの結果は、様々な上皮癌細胞株（***、皮膚および肺）において抗ｓＥｃａｄ抗体治療により細胞死が誘発される一方で、隣接する正常な健常上皮細胞、線維芽細胞および内皮細胞では誘導されないことを明らかに示している。発明者らは、癌細胞が、正常な細胞−細胞接触を擬似的に模倣し、機能的骨格を隣接する近隣細胞に提供するため、微小環境においてｓＥｃａｄを分泌している、ということを提案する。したがって、腫瘍微小環境からｓＥｃａｄを除去することによって、腫瘍細胞環境のこの養育能が阻害され、プログラムされた細胞死に関与するｐ５３依存性分子経路が活性化される。

本発明の多くの実施形態を記載してきた。そうではあるものの、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更が為され得ることを理解されたい。したがって、他の実施形態が次の特許請求の範囲内に含まれる。

Claims (9)

1. 可溶性Ｅ−カドヘリン（ｓＥｃａｄ）の第二、第三、第四または第五のサブドメイン（それぞれＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４およびＥＣ５）の１以上を特異的に標的とするが、ｓＥｃａｄの第一のサブドメイン（ＥＣ１）は標的としない治療的有効量の抗体またはその抗原結合断片を含む癌治療剤であって、該治療的有効量の抗体またはその抗原結合断片が腫瘍細胞を選択的に死滅させる、上記癌治療剤。
2. 前記抗体又はその抗原結合断片が、ＥＣ４および／またはＥＣ５を特異的に標的とする、請求項１に記載の癌治療剤。
3. 前記抗体が、ヒト化、キメラもしくはヒト抗体、１本鎖抗体、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体であり、または前記抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスもしくは免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）クラスのものである、請求項１に記載の癌治療剤。
4. 前記抗体又はその抗原結合断片が検出可能に標識される、請求項１に記載の癌治療剤。
5. 前記抗体又はその抗原結合断片が、悪性のＥ−カドヘリン発現細胞を死滅させるが、非悪性の細胞は死滅させない、請求項１に記載の癌治療剤。
6. 前記抗体又はその抗原結合断片が、細胞毒性量の何らかの賦形剤を含まない製剤処方で投与されるか、または前記抗体又はその抗原結合断片が、（ａ）患者への投与時に、前記抗体又はその抗原結合断片の血清レベルが約１から１０ｍｇ／ｋｇとなるか、もしくは（ｂ）細胞培養への添加時に、前記抗体又はその抗原結合断片の濃度が、細胞培養液に対して約１から５００μｇ／ｍＬとなる製剤処方で送達される、請求項１に記載の癌治療剤。
7. 前記抗体又はその抗原結合断片が、経口投与、静脈内投与、鼻腔もしくは吸入投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経粘膜投与または経皮投与により製剤処方中で送達される、請求項１に記載の癌治療剤。
8. 前記抗体又はその抗原結合断片が、患者由来の生体試料でｓＥｃａｄまたは癌に対する別の予測バイオマーカーのレベルが上昇していることが判定された場合に癌治療剤として投与されるか、または第二の癌治療と共に投与される、請求項１に記載の癌治療剤。
9. 前記癌が上皮化組織内であるか、または消化管、中枢神経系、***、皮膚、生殖系、肺または泌尿器の癌である、請求項１に記載の癌治療剤。

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