JP6243110B2 - レーザー走査顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザー光の走査によって測定対象物の表面形状のプロファイルや測定対象物である細胞等の表面状態の計測および観察を高速に行うレーザー走査顕微鏡装置に関するものである。

微少なものを高精度に測定したり観察したりするものとして、光ヘテロダイン干渉法がよく知られている。これは、周波数の異なる２つのレーザー光を干渉させて、その差の周波数のビート信号を作成し、このビート信号の位相変化を検出することで、被測定物を測定や観察するものである。

そして、下記特許文献１の特開昭５９−２１４７０６号公報には、音響光学素子を用いて異なる波長からなる２つのビームを隣接して発生させ、これら２ビーム間の位相変化を検出し、その位相変化を累積して表面プロファイルを得る方法が開示されている。しかし、この特許文献１の技術では、ビームプロファイル内の情報を引き出すことはできず、面内であるビームプロファイル内の分解能を高くすることは出来なかった。

他方、従来よりＤＰＣ(Differential Phase Contrast)法と呼ばれる手法が知られている。これは、最初Dekkers and de Langにより電子顕微鏡に適用された技術であり、その後、Sheppard and Wilson等により光学的顕微鏡への拡張がなされた技術である。すなわち、このＤＰＣ法は、被測定物である対象物に照射された電磁波に対してファーフィールドであって、この電磁波の照射軸に対して対称に配置されたディテクタ同士の差動信号を検出することにより、対象物のプロファイル情報を得るものである。

この一方、本発明者たちは、音響光学素子等を用いることで、相互にわずかに異なる周波数を有しつつ相互にわずかな照射位置ずれを生じさせた２つのビームを走査させ、ファーフィールドに配置した複数の受光素子で得たこれら２ビーム間の位相変化からの差動出力をヘテロダイン検波する方式を案出している。つまり、この手法は、ＤＰＣ法とヘテロダイン法を融合させたような手法を用いたものともいえ、この手法により対象物の表面プロファイルを得るものであった。

これらＤＰＣ法を用いた手法や、ＤＰＣ法とヘテロダイン法を融合させた手法は、一走査にて３次元プロファイル情報を取得できるので、非常に高速な処理ができ、透明な細胞やプランクトンを生きたまましかも染色等の手段を用いることなく観察でき、またナノ粒子等の観察も可能であり、非常に有益な計測、観察手段といえる。

特開昭５９−２１４７０６号公報

しかしながら、プランクトンや細胞などは自発的に３次元的に移動するし、ナノ粒子等の計測においてもブラウン運動等で計測、観察したい測定対象物とされる対象物が動いてしまい十分な計測や観察はできなかった。さらにこれに伴って、対象物の細部の動きを特に拡大して見ることは、従来の手法であっても困難を極めていた。

本発明は上記背景に鑑みてなされたもので、移動する対象物でも計測や観察を可能とし、さらには移動する対象物の細部の動きを拡大して観察することをも可能とするレーザー走査顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成させるために、本発明は、レーザー光を出射するレーザー光源と、
レーザー光を２次元走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、３次元的に移動し得る対称物を有した試料に対してレーザー光を出射する対物レンズと、
レーザー光の光軸に対して対称に２分割された分割受光素子を有し、試料からの反射光あるいは透過光を受光する際に０次回折光と±１次回折光との干渉情報に変換される試料の屈折率分布や凸凹の情報を、これら分割受光素子間の差出力に反映して受光する受光素子と、
前記分割受光素子からの出力差の情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置とされるものである。

さらに、本発明は、レーザー光を出射するレーザー光源と、
該レーザー光を相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ、相互に異なる方向に出射する光変調器と、
２つの光を２次元走査する走査光学素子と、
瞳位置を有し、３次元的に移動し得る対称物を有した試料に対して２つの光を出射する対物レンズと、
前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器で相互に異なる方向に出射された各々の光を試料上で近接させる瞳伝達レンズ系と、
試料からの反射光あるいは透過光を受光し光電変換してビート信号を発生する受光素子と、
前記受光素子のビート信号に基づいて得られた２つの光同士の位相差およびビート信号自体の振幅を検出する信号比較器と、
前記信号比較器で検出された位相差による位相情報と振幅による強度情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置とされるものである。

また、本発明においては、前記光変調器からの光を一部分離すると共に前記試料からの反射光を反射するビームスプリッターを有し、
前記受光素子が、
前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第１の受光素子と、
前記ビームスプリッターで反射した前記試料からの反射光を受光する第２の受光素子と、
を含み、
第１の受光素子で受光した変調信号と第２の受光素子で受光した出力信号とのビート信号を信号比較器で作成するものが好適である。
同じく、前記光変調器からの光を一部分離するビームスプリッターを有し、
前記受光素子が、
前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第１の受光素子と、
前記試料からの透過光を受光する第２の受光素子と、
を含み、
第１の受光素子で受光した変調信号と第２の受光素子で受光した出力信号とのビート信号を信号比較器で作成するものが好適である。

他方、本発明に係わる信号比較器が、前記光変調器に印加された変調信号と前記受光素子の出力信号とのビート信号を作成することで、該ビート信号に基づいて得られた２つの光同士の位相差とビート信号自体の振幅を検出することが好適である。また、本発明に係わる光変調器は、前記レーザー光源から出射されたレーザー光を入射させる音響光学素子と該音響光学素子にキャリア交流信号（ｆｃ）と正弦波信号（ｆｍ）を印加する信号発生器とを含むことが好適である。さらに、本発明に係わる走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーの１次元走査素子、２つの１次元走査デバイスと瞳伝達レンズ系よりなる２次元走査光学系、あるいは、１次元または２次元のマイクロミラーデバイスとされることが好適である。

一方、本発明に係わる受光素子は、前記光変調器で異なる方向に出射された光の分離
方向に垂直な方向に少なくとも２分割された分割受光素子とされることが好適である。
また、本発明に係わる受光素子の出力は、前記受光素子の２分割以上された分割受光素
子のすべての分割受光素子の和信号、または２分割以上された分割受光素子の対応する
位置にある分割受光素子同士の差信号より取得することが好適である。

さらに、本発明は、搭載台に前記試料が載せられたレーザー走査顕微鏡装置であって、
前記対象物の存在する対象領域を特定する第１の過程と、
該対象領域の強度情報を２値化して重心検出を行う第２の過程と、
前記強度情報のヒストグラムのばらつき程度を評価する第３の過程と、
該ばらつきの大きい方向を特定する第４の過程と、
よりなる各過程を有し、
搭載台を移動することで、第２の過程から算出された重心位置に前記試料内の対象物を動かし、
第４の過程により対物レンズをばらつきの大きい方向に動かすことが好適である。
また、本発明は、前記第４の過程において、対物レンズを微小振動させてばらつきの大きい方向に対物レンズを動かすことが好適である。

この他、本発明は、赤外光を出射する近赤外レーザー光源と、
該近赤外レーザー光源からの赤外光を平行光とするコリメーターレンズと、
前記瞳伝達レンズ系と前記対物レンズとの間の光軸上に配し、かつ赤外光を反射して
試料側に送る副ビームスプリッターと、
を含むことが好適である。
また、本発明に係わる赤外カットフィルターが、前記受光素子と赤外光の導入光路と
の間に配置されたことが好適である。

請求項に係る発明の作用を以下に説明する。
ＤＰＣ法および、ＤＰＣ法とヘテロダイン法の融合方法によれば、１走査で３次元プロファイル情報を取得できるので、その情報をもとにして以下の演算がおこなわれる。
具体的には、３次元的に移動し得る対称物を有した試料からの画像を経時的に連続して取得して画像データを各フレーム毎に得ると共に、この対象物の演算領域を特定し、対象物の観察から得られた情報の差動信号を２値化して、重心座標Ｘ、Ｙの検出を行う。
Ｘ＝Σxnnx/Σnx
Ｙ＝Σynny/Σny
ここで、xn,ynは、２値化された画素に対応するｘ座標、ｙ座標であり、nx,nyは、ｘ，y座標を占める画素の個数である。
この演算により算出した重心座標Ｘ、Ｙに基づき、対物レンズや試料を載せている移動ステージのｘ、ｙ値を変化させて対象物を光軸に対して移動させ、視野の中心に対象物が常時位置するように制御する。

一方、細胞やプランクトンなどの対象物は３次元的に移動するので、上記２次元的なトラキングに加え、対物レンズまたは移動ステージをフォーカス方向（Ｚ軸方向）にも移動させないとぼやけた画像となる。
この際、対象物から検出された信号強度のコントラストのヒストグラムを重心座標Ｘ、Ｙのデータに基づき作成した場合、ばらつきの大きいものほど合焦点となる。特に、ヘテロダイン検波を用いた方法では、位相情報がプロファイルの傾きの方向を表しているので、合焦点付近では±９０度程度の角度の値になる。例えば、信号強度のコントラストのヒストグラムは合焦点状態に対して鋭敏であり、これを使用するものの、位相情報を補足確認手段として使うこともできる。

以上の演算結果により対象物の合焦点位置の移動方向が分かるので、現フレーム情報と前フレーム情報との比較により、フォーカス移動方向を決められる。その移動方向に対物レンズを動かすか移動ステージを上下動することにより、合焦点状態を維持することができる。

他方、上記のＤＰＣ法および、ＤＰＣ法とヘテロダイン法との融合方法において、走査光学系と対物レンズ間にビームスプリッターを介して信号検出用レーザーの波長とは異なる赤外線領域の波長の光を同軸上に入射させることが考えられる。つまり、この赤外線領域の波長の光を別の光学系にて合成して対象物に照射し、この赤外領域の光にてレーザートラップを行い、対象物を固定する。

ここで、赤外領域の光と使用しているレーザー波長の光との分離は、ＤＰＣ法においては、色フィルターを用いる。但し、ＤＰＣ法とヘテロダイン法との融合方法においては、この赤外領域の光は変調を受けず、検出信号には全く影響を与えることがないことから、色フィルター等を用いる必要性はない。従って、このように赤外線領域の波長の光を用いることで、画像処理に要する時間が不要となるので、より高速な走査が可能となる。

以上より、本発明のレーザー走査顕微鏡装置によれば、このように生きたままの細胞やナノ粒子をトラッキングし、観察、計測できるので、微細な状態変化などの情報をリアルタイムに取得できるなど、細胞等を不活性化して計測する電子顕微鏡にはない大きな特徴を有することになる。また、生物の微細な構造や動きなどをマイクロマシンに適用させる手法が提案され、実行されつつあるが、このような生物の微細な構造や動きなどの応用にも極めて有効な観察手段となる。

上記のように、ＤＰＣ法や、ＤＰＣ法とヘテロダイン法とを融合した方法を用いれば、微弱な信号でも１走査で３次元プロファイル情報や屈折率分布情報を高精度に取得できるものの、動いている細胞や微小物体等では動きを抑制できないので、これらの対象物ではその観察、計測能力を十分に発揮することが困難であった。

しかしながら、本発明のレーザー走査顕微鏡装置によれば、２次元走査系と受光素子により取得した信号データを変換したデータとを用いて対象物を画像化し、画像処理することで位置情報と合焦点情報を取得することが可能となる。

これに伴って、これらの情報に基づき対象物を載せている移動ステージや対物レンズの位置を制御することで、動いている細胞や微生物等の移動する対象物でも高速な計測、観察を可能とし、さらには移動する対象物の細部の動きを拡大して観察可能として、レーザー走査顕微鏡装置の観察、計測能力を十分に発揮できるようになる。また、上記光学系に赤外レーザー光によるレーザートラップ光学系を併用することにより、画像処理に要する時間を省けるので、より高速な走査が可能となる。

本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例１に係るＤＰＣ法における透過光学系のブロック図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例１に係るＤＰＣ法における反射光学系のブロック図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例１に係るＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系のブロック図である。 図３の対物レンズおよび測定対象物周辺部分を拡大して示す図である。 実施例１に係るＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系による試料上の照射領域を表す説明図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例１に係るＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた反射光学系のブロック図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例２に係るＤＰＣ法における透過光学系のブロック図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例２に係るＤＰＣ法における反射光学系のブロック図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例２に係るＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系のブロック図である。 本発明のレーザー走査顕微鏡装置の実施例２に係るＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた反射光学系のブロック図である。 本発明に適用されるプレパラートの概略図である。

以下に、本発明に係るレーザー走査顕微鏡装置の実施例１及び実施例２を各図面に基づき、詳細に説明する。

以下、上記光学系を具体的に適用して効果のあるＤＰＣ法の光学系および、ＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた光学系について述べる。ここで、本実施例に係るレーザー走査顕微鏡装置では、得られた差出力等の信号と走査信号とに基づいて対象物を画像化し、この画像信号により画像処理的な手法を用いて試料内で移動し得る対象物のトラッキングを行うものであり、以下に具体的に述べる。

図１はＤＰＣ法における透過光学系のブロック図を示し、このブロック図に基づき以下に詳述する。この図１に示すように、レーザー光源１からの光束はコリメーターレンズ２により平行光とされ、２次元走査デバイス６に入射される。この２次元走査デバイス６は光を面上に２次元走査するデバイスであり、例えばＭＥＭＳ、ガルバノミラー、レゾナントミラー等により構成されるものである。

コリメーターレンズ２からの平行光束は、２次元走査デバイス６の瞳位置を対物レンズ１１の瞳位置に伝達する瞳伝達レンズ系１０を経て、対物レンズ１１に入射された後、試料Ｓに収束される。試料Ｓに収束された光は透過光となり、受光素子９に入射される。そして、この受光素子９は、光電変換された各々のビート信号を作成する光電変換部（図示せず）を有した構造とされている。この受光素子９はデータ処理制御部１４に接続されていて、受光素子９から送られる受光に関する情報に基づき、データ処理制御部１４にてデータ処理されている。このとき、受光素子９は、試料Ｓから実質上ファーフィールドとなる位置に配置され、光軸Ｌに対して対称に２分割された分割受光素子９Ａ、９Ｂとされている。

この結果、光軸Ｌ上の平行光束が試料Ｓの屈折率分布や凸凹により０次回折光と±１次回折光とに分離され、分離されたこれらの光が干渉しつつ、受光素子９に受光される。これに伴い、試料Ｓの屈折率分布や凸凹の情報が、０次回折光と±１次回折光との干渉情報に変換される。このとき、光軸Ｌに対して対称な２つの分割受光素子９Ａ、９Ｂ間の差出力に試料Ｓの上記情報が反映されて、データ処理制御部１４に送られる。

他方、この試料Ｓは、光軸Ｌに対して直交し、かつ相互に直交するＸ軸方向やＹ軸方向に沿ってモータ等により移動可能とされている移動ステージ１２に搭載されている。また、対物レンズ１１も光軸Ｌに沿ってモータ等により上下動可能になっている。これら移動ステージ１２及び対物レンズ１１はそれぞれデータ処理制御部１４に接続されていて、このデータ処理制御部１４のデータ処理及び、データ処理制御部１４からの２次元走査デバイス６に送り出される走査情報に基づき、データ処理制御部１４はこれらの情報を画像やデータの形とすることができる。これに伴い、データ処理制御部１４が試料Ｓ内の対象物に対してこのレーザー走査顕微鏡装置の視点に追従させて合致可能としている。

これに対して、図２はＤＰＣ法における反射光学系のブロック図であり、図１に示す透過光学系と異なるのは、コリメーターレンズ２と２次元走査デバイス６との間に配置されたビームスプリッター７により光束の一部を取り出し、この光束を少なくとも２分割された分割受光素子９Ａ、９Ｂからなる受光素子９がそれぞれ受光することにより、これらの差出力を検出することである。この際、試料Ｓからの反射平行光は、実質上ファーフィールド情報であることになる。

次に、図３および図６に、発明者たちが提案するＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた光学系のブロック図を示し、これを以下に説明する。ここで、図３はこれらの方法を組み合わせた透過光学系のブロック図を示し、図６はこれらの方法を組み合わせた反射光学系のブロック図を示す。
これらの光学系が図１および図２に示す光学系と異なるのは、音響光学素子３によりきわめて接近した２つの光束を作成し、拡大率を適正にすることで、図４の実線で示すビームＬＡおよび点線で示すビームＬＢのように、非常に接近して相互に同一径とされる２つのビームとされて、試料Ｓに照射することができる。

具体的には、この図３に示すように、レーザー光が出射されるレーザー光源１と、ＡＯＤドライバー４が接続されて動作が制御される光変調器である音響光学素子（ＡＯＤ）３との間に、コリメーターレンズ２が配置されている。また、この音響光学素子３に対して、２群のレンズからなる瞳伝達拡大レンズ系５、入力されたレーザー光を分離して出射するビームスプリッター７、入力されたレーザー光を２次元走査する２次元走査デバイス６が順に並んで配置されている。
さらに、このビームスプリッター７に隣り合って、２群のレンズからなる瞳伝達レンズ系１０が位置し、この隣に対物レンズ１１が試料Ｓと対向して配置されている。つまり、これら部材がレーザー光の光路とされる光軸Ｌに沿って並んでいることになる。

他方、光軸Ｌが通過する方向に対して直交する方向であってビームスプリッター７の右隣の位置には、光センサである受光素子８が配置されている。また、試料Ｓの背面側である下側には、同じく光センサである受光素子９が配置されている。そして、これら受光素子８、９は、それぞれ光軸Ｌに対して対称に２分割された分割受光素子８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂにより構成されていている。なお、これら受光素子８、９は、光電変換された各々のビート信号を作成する光電変換部（図示せず）を有した構造とされている。

さらに、これら受光素子８、９が、これら受光素子８、９からの信号を比較する信号比較器１３にそれぞれ接続され、音響光学素子３に印加された変調信号自体と受光素子９が作成する出力信号であるビート信号とから、この信号比較器１３が、該ビート信号に基づいて得られた２つの光同士の位相差とビート信号自体の振幅を検出する。また、この信号比較器１３は、最終的にデータを処理して試料Ｓのプロフィル等を得るデータ処理制御部１４に繋がっている。

以上に伴い、キャリア周波数ｆｃと変調周波数ｆｍの２つのＤＳＢ変調された信号を外部からＡＯＤドライバー４を経て、音響光学素子３に入力することで、きわめて接近したこれら２つの光束を作成することができる。これらきわめて接近した２方向に出射された光束は、音響光学素子３の実質的な瞳位置を２次元走査デバイス６の瞳位置に伝達する瞳伝達レンズ系５、光を面上に走査する２次元走査デバイス６および、２次元走査デバイス６の瞳位置を対物レンズ１１の瞳に伝達するための瞳伝達レンズ系１０を経て、対物レンズ１１に入射される。

前述と同様に、この試料Ｓは、光軸Ｌに対して直交し、かつ相互に直交するＸ軸方向やＹ軸方向に沿ってモータ等により移動可能とされている移動ステージ１２に搭載されている。また、対物レンズ１１も光軸Ｌに沿ってモータ等により上下動可能になっている。これら移動ステージ１２及び対物レンズ１１はそれぞれデータ処理制御部１４に接続されていて、このデータ処理制御部１４のデータ処理に基づき、試料Ｓ内の対象物Ｓ１に対してこのレーザー走査顕微鏡装置の視点に追従させて合致可能になっている。

以上の結果として、対物レンズ１１で収束された光束は、図４に示す光軸Ｌを境界線Ｃとして、きわめて接近された２つのスポットとして試料Ｓを面上に走査することになる。また、これら２つのビームＬＡ、ＬＢの有する周波数は、「光の振動数＋キャリア周波数fc±変調周波数fｍ」となり、この２つのスポットは周波数ｆｃ＋ｆｍと周波数ｆｃ−ｆｍの２つの信号となるので、これらの信号をヘテロダイン検波することにより、試料Ｓの凸凹情報、屈折率分布を反映した信号が得られる。

これに伴って、中心距離Δxだけ離れた２点をそれぞれ中心とする２つのビームＬＡ、ＬＢの重なっている照射領域Ａ，Ｂのほぼ中心を図５の境界線Ｃとし、この境界線Ｃを挟んだ２つのビームＬＡ、ＬＢが試料Ｓに照射されて、対象物Ｓ１の位置が検出されることから、試料Ｓ内で移動し得る対象物Ｓ１を追従可能とすることができる。

本実施例において、具体的にヘテロダイン検波を行うには、照射された変調信号の一部をビームスプリッター７で取り出して受光素子８でレファランス信号を得て、このレファランス信号と２分割された受光素子９で検出された信号とで差動出力を求め、信号比較器１３により位相差情報および強度情報を取得し、データ処理制御部１４に送る。データ処理制御部１４では、２次元走査デバイス６に送り出される走査情報とともに取得された位相差情報や強度情報を画像やデータの形として、図示しないディスプレイに表示したり、メモリにデータとして蓄積したりする。

ただし、受光素子８は必ずしも必要ではなく、音響光学素子３に出力する信号、 すなわち音響光学素子３に印加される変調信号自体と比較してもよい。この場合、回路系や音響光学素子等による遅延が発生するが、予め補正するなどしておけば、位相差検出等に大きな影響を与えることはない。

また、試料Ｓの表面を面上に走査する極めて接近した２つのスポット光は、相互に周波数の異なる光となるが、実質上、瞳伝達レンズ系５、１０等の拡大光学系を使用することにより、高い周波数でも極めて接近させたスポットにすることができる。これにより高速な走査により高速な情報取得ができることになる。

これに対して、図６はＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた反射光学系のブロック図であり、図３に示す透過光学系と異なるのは、試料Ｓから反射して戻ってきた光束をビームスプリッター７により取り出し、この光束を２分割された分割受光素子９Ａ、９Ｂからなる受光素子９によりそれぞれ受光することで、これらの差出力を検出することである。この際、試料Ｓからの反射平行光は、実質上ファーフィールド情報であることになる。

この一方、このようにして得られた２つの光は、上記手法により分離度を非常に小さくすることができ、実質上１つのビームで走査した情報と変わらない。これに対し、一つのビームで走査し、ファーフィールドに配置した少なくとも２分割された受光素子の差動出力を得る方法が、前記したＤＰＣ法である。

つまり、ＤＰＣ法に比較すると、このような本ヘテロダイン法をさらに使用した方法では、ヘテロダイン検出することにより、位相変化および強度変化をきわめて精度よく検出できる点と、受光素子９で受光される光が非常に微弱でも検出回路系のゲインを高くすることで、高精度に検出できる点と、検出される信号は変調信号だけなので、外乱光の影響を受けることもなくなる点とを有することから、さらに高精度な検出ができることになる。

また、上記のような光学系の受光素子部分に、０次回折光と±１次回折光とに一旦分離するような光学系を用いることで、さらに空間周波数の高い情報、すなわち横分解能の大幅な向上が図れるようになる。

以上の光学系を用いて得られる信号は、微分干渉光学系のバイアスのない信号であり、対象物Ｓ１の図５のＸＹ軸で形成される平面に対する傾き等を反映して、差動出力の正負が決まる。さらに、レーザー光は、２次元走査デバイス６により２次元走査されて、試料Ｓ側に送られるが、この試料Ｓからの光を受光素子９により受光して、信号比較器１３で位相差情報および強度情報を取得してこれらがデータ処理制御部１４に送られる。そして、上記差動出力からの差動信号に基づくデータと２次元走査の際の走査情報とを合成することにより、対象物Ｓ１の画像情報をデータ処理制御部１４で得ることができる。

この画像情報を取得するときに、ＤＰＣ法では、予めバイアスを与えて差動出力をかさ上げして表示することができる。また、ＤＰＣ法とヘテロダイン法との融合方法では、強度情報と位相情報に分けられるので、傾き情報を位相情報として表記し、強度情報を差動出力信号の絶対値のように表示することができる。

このようなデータ処理により、画像情報を何種類かの情報に変換することができるが、光学的には、ジャストフォーカスの状態において試料Ｓ中の対象物Ｓ１の有する空間周波数が最大になる。したがって、ジャストフォーカスであるほど、強度のコントラス変化が大きくなる。つまり、強度のコントラストのヒストグラムは、ジャストフォーカスであるほどばらつきが大きくなるので、このばらつき具合を数値化し、フォーカス度合いの評価量とすることもできる。

ここで、ＤＰＣ法および、ＤＰＣ法とヘテロダイン法の融合方法によれば、１走査で３次元プロファイル情報を取得できるので、その情報をもとにして以下のような処理が考えられる。
まず、上記した光学系によれば、３次元情報をリアルタイムに取得できるので、画像情報を構成するビデオ信号のフレーム間で動きのある物体と静止している背景とを容易に分離可能となる。たとえば、データ処理制御部１４にてフレーム間での差算を行い、変化のある画素を残し、ある大きさ以上の領域を動いている物体の領域として同定することができる。この様にして第１の過程でまず、試料Ｓ中にいくつかある領域のうちの対象物Ｓ１の存在する対象領域を選択する。

次に、上記のように対象物Ｓ１の演算領域を特定した後、データ処理制御部１４において第２の過程で対象領域の差動出力に基づき対象物Ｓ１の観察から得られた強度情報を２値化して、光軸Ｌに対して直交しかつ相互に直交するＸ軸方向やＹ軸方向における重心位置である、重心座標Ｘ、Ｙの検出を下記の簡単な演算により行う。
Ｘ＝Σxnnx/Σnx
Ｙ＝Σynny/Σny
ここで、xn,ynは、２値化された画素に対応するｘ座標、ｙ座標であり、nx,nyは、ｘ，y座標を占める画素の個数である。
この演算をフレームごとに行い、各フレームの各演算により算出した重心座標Ｘ、Ｙの値に基づき、試料Ｓを載せている搭載台である移動ステージ１２のｘ、ｙ値を変化させて対象物Ｓ１を光軸Ｌに対して移動させることができる。そして、例えば視野の中心である光軸Ｌ上に対象物Ｓ１が常時位置するように制御すれば、対象物Ｓ１を視野の中心である視点にほぼ制止している状態にできる。

一方、細胞やプランクトンなどの対象物Ｓ１は３次元的に移動するので、上記２次元的なトラキングに加え、対物レンズ１１または移動ステージ１２をフォーカス方向（図４のＺ軸方向）にも移動させないとぼやけた画像となる。このため、フレーム毎に上記したフォーカス度合いの評価パラメーターである強度情報のヒストグラムのばらつき量を取得し、データ処理制御部１４において第３の過程でこのばらつき程度を評価して、このばらつき量が大きくなる方へ対物レンズ１１または移動ステージ１２を上下動し、合焦点状態を維持するように制御する。

例えば、対象物Ｓ１から検出された信号強度のコントラストのヒストグラムを作成した場合、ばらつきの大きいものほど合焦点となる。特に、ヘテロダイン検波を用いる方法では、位相情報がプロファイルの傾きの方向を表しているので、合焦点付近では±９０度付近の角度の値になる。従って、信号強度のコントラストのヒストグラムが合焦点状態に関して鋭敏であり、これを使用するものの、位相情報を補足確認手段として使うこともできる。

このとき、このばらつきの大きい方向を特定するために、第４の過程にて対物レンズ１１を常に上下方向に微小振動させて、いわゆるウォブリング状態にしておき、上記ばらつき量が大きくなる方向に対物レンズ１１を動かすようにすることが考えられる。このような画像情報に基づく合焦状態の実現については、この他にいろいろな方法が存在するので、それらを適用してもよい。 たとえば、一つの方法としては、合焦状態ほど、はっきりした画像になるので、実質的な空間周波数が高くなる。このために受光素子の光軸から離れた受光素子上の出力自体が大きくなる。この情報を取得することで、合焦状態の程度の判断を行うことが可能となる。また、合焦状態ほど、傾き情報が大きくなるので、上記したヘテロダイン検波した強度情報が大きくなるので、合焦状態の程度の判定に使用することができる。

以上のようにして、得られた信号出力からの画像処理の手法により３次元的なトラッキングを実施すれば、比較的簡単に対象物Ｓ１を視野のほぼ中央に位置させ、かつ合焦点状態にさせることができる。このようにすれば、微生物や細胞の動きを３次元的に直接観察でき、細胞内の器官と動きとの関連や様々な情報を取得することが可能となる。

本実施例は、実施例１と異なって対象物Ｓ１を物理的にトラップすることで、観察や計測をし易くするものである。本実施例では、実施例１に示した光学系の他に、いわゆるレーザートラップを行う光学系を付加している。
ここで、図７はＤＰＣ法における透過光学系のブロック図を示し、図８はＤＰＣ法における反射光学系のブロック図を示し、図９はＤＰＣ法とヘテロダイン法とを組み合わせた透過光学系のブロック図を示し、図１０はＤＰＣ法とヘテロダイン法とを方法を組み合わせた反射光学系のブロック図を示す。これら光学系は、実施例１で説明したものとほぼ同様であり、実施例１と異なる点を以下に述べる。

本実施例の各光学系では、レーザー光である赤外光を出射する近赤外レーザー光源１５および、この近赤外レーザー光源１５からの赤外光を平行光とするコリメーターレンズ１６を有している。さらに、このコリメーターレンズ１６を通過して平行光とされた赤外光をレーザー光源１からの信号光と共に対物レンズ１１に入射するための副ビームスプリッター１７が、瞳伝達レンズ系１０と対物レンズ１１との間に配置されている。このため、この副ビームスプリッター１７により前記した各光学系の光軸Ｌに同軸入射されたこの赤外光で対象物Ｓ１をスポット状に照射する。この結果として、周知の光圧により対象物Ｓ１を移動ステージ１２上でトラップして固定できる。

ここで、信号を得るための信号光と赤外光とを分離するために、図７および図８に示すＤＰＣ法では、赤外カットフィルターであるカラーフィルター１８が、受光素子９と赤外光の導入光路との間とされる受光素子９の手前の位置に配置されていて、信号光だけがカラーフィルター１８を通過するようにする。

この一方、図９および図１０に示すＤＰＣ法とヘテロダイン法との融合方法では、信号光が電気的に変調されるのに対して、赤外光は変調されないので、電気的なヘテロダイン検波により自動的に信号光しか検出されないことになる。このため、ＤＰＣ法とヘテロダイン法との融合方法では、カラーフィルター１８等の特別な光学素子を用いる必要性がなくなる。

以上より、本実施例によれば、赤外光でトラップできる対象物Ｓ１は、小型の細胞や液体中にあるナノ粒子とかポリマーとされる。通常は自発的に動くかブラウン運動により動いて観察しづらいものの、以上述べた手法を用いれば、簡単に対象物Ｓ１を捕捉することができる。

また、本実施例によれば、画像処理に要する時間が不要となるので、より高速な走査が可能となる。さらに、信号光と反対方向から低ＮＡの対物レンズで赤外光を導入し、信号光をＮＡの高い対物レンズで導入した場合、高い分解能で対象物Ｓ１を補足しながら観察、測定することもできる。

次に、上記各実施例における移動ステージ１２上に対象物Ｓ１を固定するためのプレパラート２１の一例を図１１に基づき説明する。
具体的には、ガラスやシリコン等の複屈折性の少ない素材を用いて、図１１に示すように先端２１Ａが球状で伸縮素材になっているプレパラート２１を採用する。このプレパラート２１を図示しないカバーガラスに吸盤のように軟かく吸着するようにしておき、対象物Ｓ１の大きさよりも大きい径と深さの異なる数種の凹凸部２２を先端２１Ａ間に設けた構造とする。

つまり、このプレパラート２１は、対象物Ｓ１を含む溶液をカバーガラスとの間に大まかに閉じ込めるような役割をする。このようにすると、対象物Ｓ１の範囲を最初からある程度制限することができるので、対象物Ｓ１を同定しやすいし、演算速度の向上や光トラップ圧の効率を向上させることができる。

尚、上記実施例のように対物レンズをＺ軸方向に移動させる替わりに、移動ステージ１２でＸＹＺの３軸方向にそれぞれ移動するようにしても良い。また、この移動ステージ１２の支持面とされるテーブルは、透過系光学で有れば当然に透明なガラス材等により形成されている。
以上、本発明に係る実施の形態を説明したが、本発明は前述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。

本発明は、レーザー光の走査によって不透明物体の表面形状の観察及び計測、透明物体の表面または内部構造の観察及び計測を高速に行うレーザー走査顕微鏡装置だけでなく、さまざまな種類の顕微鏡に好適なものである。

１ レーザー光源
２ コリメーターレンズ
３ 音響光学素子
４ ＡＯＤドライバー
５ 瞳伝達レンズ系
６ ２次元走査デバイス
７ ビームスプリッター
８、９ 受光素子
１０ 瞳伝達レンズ系
１１ 対物レンズ
１２ 移動ステージ
１３ 信号比較器
１４ データ処理制御部
１５ 近赤外レーザー光源
１６ コリメーターレンズ
１７ 副ビームスプリッター
１８ カラーフィルター
２１ プレパラート
２２ 凹凸部
Ｓ 試料
Ｓ１ 対象物

Claims (13)

1. レーザー光を出射するレーザー光源と、
   レーザー光を２次元走査する走査光学素子と、
   瞳位置を有し、３次元的に移動し得る対称物を有した試料に対してレーザー光を出射
   する対物レンズと、
   レーザー光の光軸に対して対称に２分割された分割受光素子を有し、試料からの反射
   光あるいは透過光を受光する際に０次回折光と±１次回折光との干渉情報に変換される
   試料の屈折率分布や凸凹の情報を、これら分割受光素子間の差出力に反映して受光する
   受光素子と、
   前記分割受光素子からの出力差の情報を取得してデータ処理すると共に、このデータ
   処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させるデータ処理制御部と、
   を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置。
2. レーザー光を出射するレーザー光源と、
   該レーザー光を相互に異なる周波数の２つの光に変調させつつ、相互に異なる方向に
   出射する光変調器と、
   ２つの光を２次元走査する走査光学素子と、
   瞳位置を有し、３次元的に移動し得る対称物を有した試料に対して２つの光を出射す
   る対物レンズと、
   前記光変調器と該対物レンズとの間に位置して、前記光変調器で相互に異なる方向に
   出射された各々の光を試料上で近接させる瞳伝達レンズ系と、
   試料からの反射光あるいは透過光を受光し光電変換してビート信号を発生する受光素
   子と、
   前記受光素子のビート信号に基づいて得られた２つの光同士の位相差およびビート信
   号自体の振幅を検出する信号比較器と、
   前記信号比較器で検出された位相差による位相情報と振幅による強度情報を取得して
   データ処理すると共に、このデータ処理に基づき前記試料内の対象物に視点を合致させ
   るデータ処理制御部と、
   を含むことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置。
3. 前記光変調器からの光を一部分離すると共に前記試料からの反射光を反射するビーム
   スプリッターを有し、
   前記受光素子が、
   前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第１の受光素子と、
   前記ビームスプリッターで反射した前記試料からの反射光を受光する第２の受光素子
   と、
   を含み、
   第１の受光素子で受光した変調信号と第２の受光素子で受光した出力信号とのビート
   信号を信号比較器で作成することを特徴とする請求項２記載のレーザー走査顕微鏡装置
   。
4. 前記光変調器からの光を一部分離するビームスプリッターを有し、
   前記受光素子が、
   前記ビームスプリッターで分離された光を受光する第１の受光素子と、
   前記試料からの透過光を受光する第２の受光素子と、
   を含み、
   第１の受光素子で受光した変調信号と第２の受光素子で受光した出力信号とのビート
   信号を信号比較器で作成することを特徴とする請求項２記載のレーザー走査顕微鏡装置
   。
5. 前記信号比較器が、
   前記光変調器に印加された変調信号と前記受光素子の出力信号とのビート信号を作成
   することで、該ビート信号に基づいて得られた２つの光同士の位相差とビート信号自体
   の振幅を検出することを特徴とする請求項２記載のレーザー走査顕微鏡装置。
6. 前記光変調器は、前記レーザー光源から出射されたレーザー光を入射させる音響光学
   素子と該音響光学素子にキャリア交流信号（ｆｃ）と正弦波信号（ｆｍ）を印加する信
   号発生器とを含むことを特徴とする請求項２から５のいずれかに記載のレーザー走査顕
   微鏡装置。
7. 前記走査光学素子は、ガルバノミラー、レゾナントミラーの１次元走査素子、２つの
   １次元走査デバイスと瞳伝達レンズ系よりなる２次元走査光学系、あるいは、１次元ま
   たは２次元のマイクロミラーデバイスとされることを特徴とする請求項１から６のいず
   れかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。
8. 前記受光素子は、前記光変調器で異なる方向に出射された光の分離方向に垂直な方向
   に少なくとも２分割された分割受光素子とされることを特徴とする請求項３から６のい
   ずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。
9. 前記受光素子の出力は、前記受光素子の２分割以上された分割受光素子のすべての分
   割受光素子の和信号、または２分割以上された分割受光素子の対応する位置にある分割
   受光素子同士の差信号より取得することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載
   のレーザー走査顕微鏡装置。
10. 搭載台に前記試料が載せられたレーザー走査顕微鏡装置であって、
    前記対象物の存在する対象領域を特定する第１の過程と、
    該対象領域の強度情報を２値化して重心検出を行う第２の過程と、
    前記強度情報のヒストグラムのばらつき程度を評価する第３の過程と、
    該ばらつきの大きい方向を特定する第４の過程と、
    を含む各過程を有し、
    搭載台を移動することで、第２の過程から算出された重心位置に前記試料内の対象物
    を動かし、
    第４の過程により対物レンズを該ばらつきの大きい方向に動かすことを特徴とする請
    求項１から９のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装置。
11. 前記第４の過程において、対物レンズを微小振動させて前記ヒストグラムのばらつき
    の大きい方向に対物レンズを動かすことを特徴とする請求項１０記載のレーザー走査顕
    微鏡装置。
12. 赤外光を出射する近赤外レーザー光源と、
    該近赤外レーザー光源からの赤外光を平行光とするコリメーターレンズと、
    前記瞳伝達レンズ系と前記対物レンズとの間の光軸上に配し、かつ赤外光を反射して
    試料側に送る副ビームスプリッターと、
    を含むことを特徴とする請求項２〜６、８のいずれかに記載のレーザー走査顕微鏡装
    置。
13. 赤外カットフィルターが、前記受光素子と赤外光の導入光路との間に配置されたこと
    を特徴とする請求項１２記載のレーザー走査顕微鏡装置。

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