JP6239568B2 - 乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、食品、薬剤 - Google Patents
乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、食品、薬剤 Download PDFInfo
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Description
グリセロール 陰性
D−アラビノース 陰性
L−アラビノース 陽性
リボース 陽性
D−キシロース 陰性
ガラクトース 陽性
グルコース 陽性
フルクトース 陽性
マンノース 陽性
ラムノース 陰性
イノシトール 陰性
D−マンニトール 陽性
ソルビトール 陽性
N−アセチルグルコサミン 陽性
アミグダリン 陽性
アルブチン 陽性
エスクリン 陽性
サリシン 陽性
セロビオース 陽性
マルトース 陽性
ラクトース 陽性
メリビオース 陰性
スクロース 陽性
トレハロース 陽性
ラフィノース 陰性
ゲンチオビオース 陽性
細胞形態:桿菌
大きさ:0.5×1.0〜2.0μm
胞子形成:−
運動性:−
カタラーゼ:−
オキシダーゼ:−
37℃での生育:+
45℃での生育:−
グラム染色性:陽性
コロニーの色:乳白色
コロニーの形:円形
グリセロール 陰性
D−アラビノース 陰性
L−アラビノース 陽性
リボース 陽性
D−キシロース 陰性
ガラクトース 陽性
グルコース 陽性
フルクトース 陽性
マンノース 陽性
ラムノース 陰性
イノシトール 陰性
D−マンニトール 陽性
ソルビトール 陽性
N−アセチルグルコサミン 陽性
アミグダリン 陽性
アルブチン 陽性
エスクリン 陽性
サリシン 陽性
セロビオース 陽性
マルトース 陽性
ラクトース 陽性
メリビオース 陰性
スクロース 陽性
トレハロース 陽性
ラフィノース 陰性
ゲンチオビオース 陽性
本実施形態では、以下に説明する方法、条件による試験によって、乳酸菌PIC−NBN22株および既知のラクトバチルス・プランタラム(比較例 受託番号NBRC3074、NBRC3075、NBRC12006、NBRC14712、NBRC14713、NBRC15891、NBRC101977、NBRC101978)の胃酸耐性を評価した。
<ATPアーゼ活性>
以下に説明するプロトコルに従って、乳酸菌PIC−NBN22株および既知のラクトバチルス・プランタラム(比較例 受託番号NBRC3074、NBRC3075、NBRC12006、NBRC14711、NBRC14712、NBRC14713、NBRC101973、NBRC101974、NBRC101977、NBRC101978、NBRC15891)のATPアーゼ活性を評価した。
(a)各ラクトバチルス・プランタラムをMRS液体培地に培養し、遠心分離により菌体を回収する。
(b)菌体0.1gに対し、25mMTris−HCl・5mMMgCl2・buffer(pH8.0)を0.1ml、アルミナを0.25g、プロテアーゼインヒビターを4.5μl加え、乳鉢ですりつぶす。
(c)0.9mlの25mMTris−HCl・5mMMgCl2・buffer(pH8.0)を加え、乳鉢内の菌体をよく懸濁させて1000g×10分、4℃で遠心分離する。
(d)上清を再度3000g×10分、4℃で遠心分離する。上清を粗ATPアーゼとする。
5mM・ATPNa/5mM・MgCl2を含む50mM・Tris−HCl・buffer(pH7)1000μlと粗ATPアーゼ200μlとを37℃で10分間に亘って反応させ、その後、氷冷した0.1N・HCl:600μlを10000g×10分間遠心分離し、上清:1.6mlと発色液4.4mlとを18℃で10分間に亘って反応させ、660nm吸光度測定を行った。発色液は、5N硫酸:10ml、2.5%モリブデン酸アンモニウム:10ml、3%硫酸水素Na−1%パラメチルアミノフェノール硫酸:10ml、水:40mlの水溶液とした。
乳酸菌PIC−NBN22株は、野菜をペーストに加工したものを発酵させ、複雑な香気成分を付与することができる。また、これをあらゆる漬物(浅漬け、古漬け、ぬか漬け、キムチ)に添加することで、発酵様香気を持った漬物を製造することができる。
(2%(w/v)ブドウ糖+1%(w/v)酵母エキス水溶液(滅菌済))に、乳酸菌PIC−NBN22株のグリセロールストック品から釣菌したものを添加し、30℃の温度環境で、20時間培養してスターターを作成した。
白菜ペースト10.0g、上白糖4.0g、酵母エキス0.2g、ブドウ糖2.0g、スターター2.0g、水181.8mlを混合したものを、30℃の温度環境で、70時間発酵させた。また比較例のために、0℃の温度環境で保存し、発酵させていないものを用意した。
下記の条件でガスクロマトグラフィー(GC)を行った。
GC:ヒューレット・パッカード社製HP6890Series GC System
GCサンプラ:ヒューレット・パッカード社製HP7694 Headspace Sampler
インテグレータ:ヒューレット・パッカード社製HP6890Series Integrator
カラム:アジレント社製DB−WAX 125−7032 30m×0.53mm 1.00μm
カラム温度:40℃〜230℃
昇温条件:40℃で5分保温後に10℃/minで昇温、その後230℃で5分保温
キャリアガス:He
キャリアガス流速:50cm/sec
検出器:水素炎イオン化型検出器(FID)
以下に説明するプロトコルに従って、PIC−NBN22株および既知のラクトバチルス・プランタラム(比較例 受託番号NBRC3074、NBRC3075、NBRC12006、NBRC14711、NBRC14712、NBRC14713、NBRC101973、NBRC101974、NBRC101977、NBRC101978、NBRC15891)の漬物製造における発酵性を評価した。
ブドウ糖1gと酵母エキス1gと水48mlとを攪拌し、オートクレーブ後、各菌のコロニーを接種し、30℃で20時間培養後、発酵前液に添加するまで5℃で冷蔵庫に保存した。
白菜ペースト5gとブドウ糖0.5gと酵母エキス0.5gと大豆ペプチド0.1gと水42.4mlとを攪拌し、オートクレーブ後、5℃で冷蔵保存した。白菜ペーストは、芯を除いた白菜をミキサーでペースト化したものを耐熱袋によって包装し、95℃で30分加熱後、流水で20分冷却し、冷蔵保存したものである。
発酵前液(オートクレーブ後)に各スターターを1.5ml添加し、30℃で培養した。培養24時間目のサンプルについてヘッドスペースをGCで分析し、香気成分の組成を調べた。
下記の条件でガスクロマトグラフィー(GC)を行った。
GC:ヒューレット・パッカード社製HP6890Series GC System
GCサンプラ:ヒューレット・パッカード社製HP7694 Headspace Sampler
インテグレータ:ヒューレット・パッカード社製HP6890Series Integrator
カラム:アジレント社製DB−WAX 125−7032 30m×0.53mm 1.00μm
カラム温度:40℃〜230℃
昇温条件:40℃で5分保温後に10℃/minで昇温、その後230℃で5分保温
キャリアガス:He
キャリアガス流速:50cm/sec
検出器:水素炎イオン化型検出器(FID)
以下に説明するプロトコルに従って、PIC−NBN22株および既知のラクトバチルス・プランタラム(比較例 受託番号NBRC3074、NBRC3075、NBRC12006、NBRC14711、NBRC14712、NBRC14713、NBRC101973、NBRC101974、NBRC101977、NBRC101978、NBRC15891)の漬物製造環境下における発酵適性を評価した。
ブドウ糖1gと酵母エキス1gと水48mlとを攪拌し、オートクレーブ後、各菌のコロニーを接種し、30℃で20時間培養後、発酵前液に添加するまで5℃で冷蔵庫に保存した。また、添加量を算出するために培養液の濁度を吸光度620nmにて測定した。
白菜ペースト5gとブドウ糖0.5gと酵母エキス0.5gと大豆ペプチド0.1gと水42.4mlとを攪拌し、オートクレーブ後、5℃で冷蔵保存した。白菜ペーストは、芯を除いた白菜をミキサーでペースト化したものを耐熱袋によって包装し、95℃で30分加熱後、流水で20分冷却し、冷蔵保存したものである。発酵前液は、1株につき2つ作成し、一方はpH5.5、もう一方は塩酸でpH4.5に調整した。
スターターの添加菌数が一定となるよう、最も濁度の低かったスターター添加量を1.5mlとしてその他のスターター添加量を算出し、2種の発酵前液に添加した。発酵液全体量を合わせるため、スターター添加後に蒸留水を発酵前液に添加した。そして、20℃で42時間培養後にサンプリングした。各発酵液を4倍に希釈し、分光光度計で吸光度620nmにて濁度を測定し、乳酸菌の増殖率を測定した。
20℃での温度環境での発酵42時間後におけるpH5.5およびpH4.5の発酵液の濁度を測定し、増加率を算出した。その結果を図4および表4(A)、(B)に示す。なお、表4(A)はpH4.5の発酵液の濁度増加率を、表4(B)はpH5.5の発酵液の濁度増加率を、各々示している。
(1)乳酸菌菌体からの脂肪酸抽出手順
(a)下記ラクトバチルス・プランタラムを4.0%NaCl含有pH4.5調整済みのMRS液体培地に培養し、遠心分離により菌体を回収する。
(c)菌体1gに酸化アルミニウム1gを加え、乳鉢ですりつぶす。
(d)生理食塩水を1ml加え、テフロン(登録商標)製遠沈管に移し替える。
(e)5mlメタノールを加える。
(f)2.5mlクロロホルムを加える。
(g)2分間激しく振とうし、10分間室温で静置する。
(h)2.5mlクロロホルムを加えて30秒間激しく振とうする。
(i)2.5ml生理食塩水を加えて30秒間激しく振とうする。
(j)3000rpm、5分間遠心分離する。
(k)下層のクロロホルム層をパスツールピペットで採取し、テフロン(登録商標)製の遠沈管に移す。
(l)3000rpm、5分間遠心分離する。
(m)下層のクロロホルム層をパスツールピペットで慎重に採取し、ナスフラスコに入れる。
(n)35℃以下の湯浴で減圧乾固する。
(o)乾固物を1mlのヘキサンに溶解し、バイアル瓶に移し、硫酸マグネシウムを少量加え、1晩脱水する。
(p)脱水完了後、ヘキサン溶液を脂肪酸抽出物とした。
(a)ヘキサン溶液0.5mlに0.5mg/mlのヘプタデカン酸/ヘキサン溶液を1.0ml、ヘキサンを0.5ml加え混ぜる。
(b)2M水酸化カリウム/メタノール溶液を0.2ml加え、2分間激しく振とうさせる。
(c)上層のヘキサン層を0.5ml採取し、ヘキサンで5mlに定容したものを1μlガスクロマトグラフィーに注入する。
ガスクロマトグラフ:ジーエルサイエンス GC−4000Plus/FID
カラム:TC−2560 0.25mmI.D.×100m df=0.20μm
カラム温度:100℃で5分保温後に10℃/minで230℃まで昇温
キャリアガス:He
スプリット:50ml/min
(1)PIC−NBN乳酸菌の投与
3匹ずつ2群に群分けした6週齢のBALB/c・Cr・Slc雄性マウスの一方の群には粉末化したPIC−NBN22乳酸菌の粉末を注射用水を用いて懸濁したものを投与し、もう一方の群には対照群としてプラセボ(媒体)を投与した。投与期間は両群とも1週間で、強制経口投与し、投与液量は10ml/kgとした。
投与前と投与最終日とに糞の採取を行い、以下の要領でIgA含量の測定を行った。
(1)被験物質の調製
PIC−NBN22乳酸菌をMRS液体培地に接種し、32℃で18時間培養し、前培養液とした。新しいMRS液体培地に前培養液を1%接種し、32℃で18時間培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収し、滅菌水で2回洗浄した後、凍結乾燥処理を行った。
凍結乾燥菌体12mgを1.25mmol/Lタウロコール酸ナトリウム溶液(10mol/Lリン酸緩衝液(pH6.8))0.8mlに懸濁し、37℃で2.5時間インキュベートした。10000g、4℃で5分間遠心分離後、上清中の胆汁酸濃度を総胆汁酸テストワコー(和光純薬工業製)を用いて測定し、菌体に吸着した胆汁酸の割合を求めた。胆汁酸吸着率(%)は47.6±0.9(n=3)であった。
凍結乾燥菌体12mgをコレステロール溶液(100μg/ml60%エタノール)0.4mlに懸濁し、37℃で1時間インキュベートした。10000g、4℃で5分間遠心分離を行った。その上清0.1mlに33%KOH0.3mlおよび99.5%エタノール3mlを加え、60℃で15分間インキュベートした。冷却後、ヘキサン5mlおよび純水3mlを加え、1分間攪拌した。
(1)細菌株の培養
PIC−NBN22乳酸菌はMRS培地を用いて、30℃で嫌気的に培養した。ピロリ菌は10%非働化ウシ胎仔血清を含有するBHI培地を用いて微好気環境下で培養した。
PIC−NBN22乳酸菌前培養液を10倍に希釈し、1日間上記条件下で培養した溶液を乳酸菌培養液とした。600nm吸光度に基づき、本溶液を4×108cfu/mlとなるように調整し、共培養試験に供した。ピロリ菌前培養液を250倍に希釈し、1日間上記条件下で培養した溶液をピロリ菌培養液とした。600nm吸光度に基づき、本溶液を7×106cfu/mlとなるように調整し、共培養試験に供した。
5mlのFCS含有BHI培地に上述した乳酸菌培養液とピロリ菌培養液を添加し、微好気条件下で37℃、22時間培養した。対照群には、乳酸菌培養液を添加しないものを用意し、同様に培養した。培養前後のピロリ菌数は、ヘリコバクター寒天培地を用いて算出した。その結果を表6に示す。
5.0nmol/mg/min未満は×
トランスバクセン酸の比率:0.3%以下は○
0.3%より高いは×
漬物の製造環境下における発酵適性:20℃、pH5.5およびpH4.5環境下における42時間培養後の濁度増加率が300%以上は○
20℃、pH5.5およびpH4.5環境下における42時間培養後の濁度増加率が300%未満は×
野菜発酵時の香気成分種類の豊富さ:20種類以上は○
20種類未満は×
胃酸耐性:pH3.5での対胃酸環境生存率が260%以上かつpH3.0での対胃酸環境生存率が100%以上は○
pH3.5での対胃酸環境生存率が260%未満もしくはpH3.0での対胃酸環境生存率が100%未満は×
Claims (4)
- ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌PIC−NBN22株(受託番号NITE P−1496)。
- 請求項1に記載の乳酸菌を含む食品添加剤。
- 請求項1に記載の乳酸菌を含む食品。
- 請求項1に記載の乳酸菌を含む薬剤。
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