JP6237194B2 - 染色方法 - Google Patents
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Description
特に組織標本に関しては、標本の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの2つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)が標準的に用いられ(非特許文献1、特許文献1〜2参照)、ヘマトキシリン染色(H染色)により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、エオジン染色(E染色)により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される。病理医は、染色された組織標本の顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化などの形態学的な情報、染色情報、をもとに診断を行っている。
免疫染色では、たとえば蛍光染色法(蛍光標識法)が用いられる。蛍光染色法は、蛍光色素などの蛍光粒子で修飾した抗体を用いて、対象となる抗原を染色し観察することで抗原量を測る手法である。
かかる場合、細胞の形態観察と蛍光粒子の観察との両方を行いたいため、ある程度エオジンが発光する励起波長で蛍光粒子を励起させている。その際に、輝度の低い蛍光粒子(たとえばQ-dotなど)では、E染色により蛍光が埋もれてしまい輝点の観測が不可能となるため、E染色に埋もれない輝度を有する蛍光粒子を選択することが必要となってくる。現在用いられている蛍光粒子では、輝度がその粒子の体積に比例することから、HE染色時においてある程度大きな粒径を有する粒子が必要となっており、実際には粒径が150nm程度の粒子が用いられている。
たとえば、図5に示すとおり、蛍光粒子12とビオチン14とを直接結合した標識体10を作製し、標識体10を用いて、抗原20に1次抗体30とアビジン42で修飾した2次抗体40とを結合したものを免疫染色する方法では、蛍光粒子12が150nm程度の粒径を有しているため、蛍光粒子12同士の立体障害によって抗原20と結合できない蛍光粒子12が存在し、すべての抗原20を認識できなくなってしまう。
このような問題に対し、粒径の小さい蛍光粒子12のみを用いれば、抗原20間の距離が狭くても蛍光粒子12が認識可能となり、H染色のみの観察条件では輝点数が増加する。しかしながら、粒径の小さい蛍光粒子12では輝度自体が低いため、蛍光免疫染色とHE染色とを共に行うと、エオジンの蛍光より蛍光粒子12の蛍光のほうが弱く、輝点が確認できず、蛍光免疫染色による定量性が低下する。
蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光粒子であって平均粒径の異なる2種以上の前記蛍光粒子を、標識剤として用いる病理切片の染色方法において、
前記病理切片に対して、第1の平均粒径であり且つ第1の蛍光色を発する第1の蛍光粒子を用いて特定の抗原を免疫染色する工程と、
前記病理切片に対して、平均粒径が前記第1の蛍光粒子の前記第1の平均粒径より小さい第2の平均粒径であり且つ前記第1の蛍光色と異なる第2の蛍光色を発する第2の蛍光粒子を用いて前記特定の抗原を免疫染色する工程と、
を有することを特徴とする染色方法が提供される。
特に(1)、(2)の病理切片を免疫染色する工程では、互いに平均粒径の異なる蛍光粒子を標識剤として使用するようになっている。そして蛍光染色後の病理切片に対しては、励起光を照射してこれら蛍光粒子を蛍光発光させ、その病理切片から生体物質(抗原)を検出するようになっている。
他方、(1)、(2)の免疫染色する工程と(3)の形態観察染色する工程とでは、好ましくは(1)、(2)の免疫染色する工程の処理を先に実行し、その後に(3)の形態観察染色する工程の処理を実行するのがよいが、その順序(先後)は入れ替わってもよい。
(i)染色方法
免疫染色では蛍光染色法が好適に用いられる。
蛍光染色法は抗原を蛍光粒子で染色する方法である。
染色の際には、蛍光粒子と1次抗体を直接結合した標識体を作製し、抗原を染色する方法(1次抗体法)、蛍光粒子と2次抗体を直接結合した標識体を作製し、抗原に1次抗体を結合したものを染色する方法(2次抗体法)、蛍光粒子とビオチンとを直接結合した標識体を作製し、抗原に1次抗体とアビジンで修飾した2次抗体とを結合したものを染色する方法(ビオチン−アビジン法、図5参照)などを用いることができる。
1次抗体は特に限定されず、免疫染色を行おうとする対象(抗原)によって変わる。たとえばHER2抗原の免疫染色を行う場合には、抗HER2抗体を用いる。
「抗原」は膜タンパク質や細胞質内のタンパク質などが好適な対象である。
2次抗体も特に限定されず、1次抗体によって変わる。たとえば抗マウス・ラビット・牛・ヤギ・羊・犬・チキンが挙げられる。
蛍光粒子と抗体やビオチンの結合は既存の如何なる方法を用いても構わない。たとえば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化などを用いることができる。
免疫染色では、まず、標識剤として蛍光粒子を使用する。
本実施形態にかかる「蛍光粒子」とは、蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光色素内包樹脂粒子である。
蛍光色素としては、たとえば、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(インビトロジェン社製)系色素分子、Texas Red系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、ローダミン系色素分子、オキサジン系色素分子、芳香環系色素分子、カルボピロニン系色素分子などを挙げることができる。
具体的には、5−カルボキシ−ローダミン、6−カルボキシ−ローダミン、5,6−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン 6G、テトラメチルローダミン、X−ローダミン、及びAlexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL,BODIPY TMR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665(以上インビトロジェン社製)、Cy5、Cy5.5、1,3−Bis[4−(dimethylamino)−2−hydroxyphenyl]−2,4−dihydroxycyclobutenediylium dihydroxide, bis、1,3−Bis[4−(dimethylamino)phenyl]−2,4−dihydroxycyclobutenediylium dihydroxide, bis、2−(4−(Diethylamino)−2−hydroxyphenyl)−4−(4−(diethyliminio)−2−hydroxycyclohexa−2,5−dienylidene)−3−oxocyclobut−1−enolate、2−(4−(Dibutylamino)−2−hydroxyphenyl)−4−(4−(dibutyliminio)−2−hydroxycyclohexa−2,5−dienylidene)−3−oxocyclobut−1−enolate、2−(8−Hydroxy−1,1,7,7−tetramethyl−1,2,3,5,6,7−hexahydropyrido[3,2,1−ij]quinolin−9−yl)−4−(8−hydroxy−1,1,7,7−tetramethyl−2,3,6,7−tetrahydro−1H−pyrido[3,2,1−ij]quinolinium−9(5H)−ylidene)−3−oxocyclobut−1−enolate、1−Butyl−2−[5−(1−butyl−1,3−dihydro−3,3−dimethyl−2H−indol−2−ylidene)−penta−1,3−dienyl]−3,3−dimethyl−3eiti−indolium hexafluorophosphate、1−Butyl−2−[5−(1−butyl−3,3−dimethyl−1,3−dihydro−indol−2−ylidene)−3−chloro−penta−1,3−dienyl]−3,3−dimethyl−3H−indolium hexafluorophosphate、3−Ethyl−2−[5−(3−ethyl−3H−benzothiazol−2−ylidene)−penta−1,3−dienyl]−benzothiazol−3−ium iodide、N, N-Di-(2, 6-diisopropylphenyl)-1, 6, 7, 12-(4-tert.butyl-phenoxy)-perylen-3, 4, 9, 10-tetracarbonacid diimide、N,N-Bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3,4:9,10-tetracarboxdiimide、N,N'-Bis(2,6-diisopropylphenyl)perylene-3,4:9,10-bis(dicarbimide)、Benzenesulfonic acid, 4,4',4'',4'''-[[2,9-bis[2,6-bis(1-methylethyl)phenyl]-1,2,3,8,9,10-hexahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra[2,1,9-def:6,5,10-d'e'f']diisoquinoline-5,6,12,13-tetrayl]tetrakis(oxy)]tetrakis-、Benzeneethanaminium, 4,4',4'',4'''-[[2,9-bis[2,6-bis(1-
methylethyl)phenyl]-1,2,3,8,9,10-hexahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra[2,1,9-def:6,5,10-d'e'f']diisoquinoline-5,6,12,13-tetrayl]tetrakis(oxy)]tetrakis[N,N,N-trimethyl-、ROX (X-Rhodamine,Rhodamine Red X)、DY-590、5-ROX、Spectrum Red、PYRROMETHENE650、Texas Red、BODIPY TR、DyLight 594、AlexaFluor 594、HiLyte594、HiLyteFluor TR、Cresyl violet、ATTO590、MFP590、DY-610、ATTO610、DY-615、Oxazine170、ATTO620、C-Phycocyanin、AlexaFluor 633、Phycocyanin、ATTO633、DY-630、DY-632、DY-633、MFP631、DyLight633、NorthernLights637、DY-631、DY-634、Nile Blue、APC(Allophycocyanin)、APC-XL、EVOblue30、SRfluor 680-CarboxylateLD700 PERCHLORATE、ATTO 655などを挙げることができる。
これら蛍光色素は、単独で用いられてもよいし、複数種が混合され用いられてもよい。
蛍光色素の内包には、原料であるモノマーに蛍光色素の分子を結合させて粒子を合成する方法、樹脂に蛍光色素を吸着させて導入する方法など、樹脂中への蛍光色素の導入はいかなる方法を用いても構わない。
次に、免疫染色では、互いに平均粒径の異なる2種以上の蛍光粒子を用いる。「平均粒径」とは、走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数(本実施形態では1000個)の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径の算術平均である。
これら蛍光粒子間では、いずれも蛍光色素内包樹脂粒子が使用され、蛍光色素は異なっていてもよいし同じでもよく、内包用の樹脂も異なっていてもよいし同じでもよい。
平均粒径の小さい蛍光粒子(小径蛍光粒子)としては、好ましくはCy5をポリメラミン中に内包したCy5色素内包ポリメラミン粒子や、Cy5をポリスチレン中に内包したCy5色素内包ポリスチレン粒子が使用され、より好ましくはCy5色素内包ポリメラミン粒子が使用される。大径蛍光粒子の平均粒径との関係から、小径蛍光粒子の平均粒径(上限値)は、好ましくは80nm以下である。汎用顕微鏡において、HE染色時に輝点としてカウントできる必要があるという観点から、小径蛍光粒子の平均粒径(下限値)は、好ましくは20nm以上である。
HE染色に用いられるエオジンは顕微鏡観察条件によっては蛍光を放つ。エオジン吸収波長は多くの蛍光標識体の励起波長と重複するため、HE染色に用いたエオジンの発光が蛍光標識体の観察を妨害しうるという課題がある。
エオジンの蛍光スペクトル(励起波長520nm)と励起スペクトル(蛍光波長540nm)を、図2に示す。励起スペクトルより、エオジンは350nm未満の波長域および450nmを超えかつ550nm未満の波長域で効率よく励起されることがわかる。
従って、本実施形態にかかる蛍光粒子は、この波長域を回避した350〜450nmの波長域かまたは550nm以上の長波長域の光で励起される必要がある。
好ましくは、大径蛍光粒子の蛍光色素については580nm付近の波長の光で励起する蛍光色素を使用し、小径蛍光粒子の蛍光色素については600nm以上の波長の光で励起する蛍光色素を使用する。
形態観察染色のうち、特に組織標本に関しては、標本の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの2つの色素を用いるHE染色が標準的に用いられているが、これに限定されるものではない。他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色(Pap染色)等がある。
また、HE染色では、H染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、E染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色されるが、これに限定されるものではない。ヘマトキシリン類縁体やヘマトキシリンと同様の吸収波長を持つ色素により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、エオジン類縁体やエオジンと類似の吸収波長を持つ色素により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色されてもよい。
したがって、HE染色における視認性を維持したまま、抗原数が多く蛍光粒子の立体障害が問題となってくるような病理切片においても、より多くの抗原を認識可能となり、結果として蛍光免疫染色と形態観察染色とを共に行う場合であっても、蛍光免疫染色による抗原の定量性を向上させることができる。
蛍光粒子としてPI色素内包ポリメラミン粒子を、標識体としてストレプトアビジンが結合したPI色素内包ポリメラミン粒子を、下記のとおり作製した。
N,N’−Bis(2,6−diisopropylphenyl)−1,6,7,12−tetraphenoxyperylene−3,4:9,10−tetracarboxdiimideを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。
ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体14.4mgを水22.5mLに加えた後、ホットスターラ―上で70℃20分間加熱し、メラミン樹脂ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)0.65g(粒径150nm)を加え、さらに5分間加熱撹拌した。ギ酸100μLを加え、60℃20分間で加熱攪拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に12,000rpmで20分間かけ、上澄み除去した。この洗浄をエタノールと水で行なった。
得られた粒子0.1mgをEtOH(エタノール)1.5mL中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランLS−3150(信越化学工業社製)2μLを加えて8時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
得られた色素内包ナノ粒子を、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有したPBS(リン酸緩衝液生理的食塩水)を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl−[(N−maleomidopropionamid)−dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。この混合液を10,000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包樹脂粒子(蛍光粒子)を得た。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬社製)をN−succinimidyl S−acetylthioacetate(SATA)を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光色素内包樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の蛍光色素内包樹脂粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合PI色素内包ポリメラミン粒子A(標識体)を得た。
このような製造方法において、PI量とポリメラミン量とを一定としてポリメラミン量を増減させ、ストレプトアビジン結合PI色素内包ポリメラミン粒子のサンプルB〜Hを作製した(表1参照)。
病理切片として、あらかじめELISAで総タンパク量を測定している培養細胞を使用した。抗原はHER2を用いた。
その後、上記病理切片を、サンプルA〜Hを用いて免疫染色し、その後形態観察染色(H染色およびHE染色)を実施した。免疫染色と形態観察染色は下記のとおりに実施した。
培養細胞を脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した培養細胞スライドを10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)中で121℃、5分間オートクレーブ処理することで、抗原の不活性化処理を行った。
不活性化処理後の培養細胞スライドを、PBS緩衝液を用いて洗浄した後、湿潤箱中で1時間1%BSA含有PBS緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、1%BSA含有PBS緩衝液で0.05nMに希釈した抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5)(ベンタナ社製)を組織切片と2時間反応させた。これをPBS緩衝液で洗浄後、1%BSA含有PBS緩衝液で2μg/mLに希釈した4B5に結合するビオチン標識抗ウサギモノクロナール抗体と30分反応させた。この反応後、1%BSA含有PBS緩衝液で0.2nMに希釈した前述の蛍光色素内包樹脂粒子を組織切片と、中性のpH環境(pH6.9〜7.4)、室温の条件下で3時間反応させた。小径粒子を反応させる際には、上記反応後、培養細胞スライドをPBS緩衝液を用いて洗浄した後、1%BSA含有PBS緩衝液で0.2nMに希釈した小径粒子を用いて湿潤箱中で反応される。その後、培養細胞スライドを、PBS緩衝液を用いて洗浄した。
免疫染色後、形態観察染色(H染色およびHE染色)を行った。免疫染色した培養細胞スライドをマイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った(H染色)。その後、該切片を45℃の流水で3分間洗浄した。次に、1%エオジン液で5分間染色してエオジン染色を行った(HE染色)。
H染色後またはHE染色後、純エタノールに5分間漬ける操作4回行い、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに5分間漬ける操作を4回行い、透徹を行った。最後に、封入剤(「エンテランニュー」、Merck社製)を用いて組織切片を封入して観察用のサンプルスライドとした。
H染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とを下記のとおりにカウントした。
免疫染色および形態観察染色した組織切片に対して所定の励起光を照射して蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡(BX−53,オリンパス社製)により観察および撮像を行った。また、輝点計測は、ImageJ FindMaxima法により計測した(露光時間400m秒でNoiseToleranceは60)。上記励起光は、光学フィルターに通すことで、PI色素内包ポリメラミン粒子に対して575〜600nmに設定した。また、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターに通すことで、612〜682nmに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長条件は視野中心部付近の照射エネルギーが900W/cm2となるようにした。画像取得時の露光時間は画像の輝度が飽和しないように任意に設定(例えば400m秒に設定)して撮像した。
H染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とをカウントした結果を表1に示す。
表1に示すとおり、H染色時の輝点数に着目して、サンプルAからサンプルHにかけて順に確認すると、サンプルFからサンプルGにかけて当該輝点数が著しく減少している。この結果から、小径蛍光粒子を用いた抗原の定量化にあたり、蛍光粒子の平均粒径(下限値)は好ましくは20nm以上であると判断される。
他方、H染色時の輝点数とHE染色時の輝点数とに着目して、サンプルAからサンプルHにかけてサンプルごとにこれら輝点数の差を確認すると、サンプルDにおいて輝点数の差が著しく大きくなっている。この結果から、小径蛍光粒子を用いた抗原の定量化にあたり、蛍光粒子の平均粒径(上限値)は好ましくは80nm以下であると判断される。
表2〜表5に示すとおり、大径蛍光粒子または小径蛍光粒子を含むストレプトアビジン結合蛍光色素内包樹脂粒子のサンプルを作製した。
サンプル1−1、2−1、3−1、4−1では、標識体として市販(インヴィトロジェン社製)のストレプトアビジン結合Qdot655を用いた。
サンプル1−2〜1−11、2−2〜2−11、3−2〜3−11、4−2〜4−11では、[実施例1]と同様にして標識体を作製した。なお、免疫染色において1番目に使用する標識体として[実施例1]と同様にPIを使用しサンプル作製し、2番目に使用する標識体としてPIを単にCy5に変更しサンプル作製した(平均粒径はCy5量とポリメラミン量とを一定としてポリメラミン量を増減させ制御した。)。
PI色素内包ポリスチレン粒子はソープフリー乳化重合法により作製した。[実施例1]のPI蛍光色素を4−アミノスチレン(東京化成工業社製)と室温条件で1時間混合し、色素結合スチレンを作製した。アルゴンバブリングした純水中5mLにグリシジルメタクリレート(東京化成工業社製)0.18gとスチレン(和光純薬社製)0.05g、ジビニルベンゼン0.05g、上記色素結合スチレン0.005gを加えた。撹拌しながら70℃に昇温し、水溶性アゾ重合開始剤であるV−50(和光純薬社性)を0.012g加え、12時間反応した。反応液を10000Gで20分遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子を純水に分散し再度遠心分離で回収する事で精製を行なった。得られた粒子を過剰のアンモニア水に加え、粒子末端のエポキシ基をアミノ基へと変換し、末端にアミノ基を持つ色素内包ポリスチレンナノ粒子を得た。
得られた色素内包ナノ粒子を、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有したPBS(リン酸緩衝液生理的食塩水)を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl−[(N−maleomidopropionamid)−dodecaethyleneglycol]ester)を混合し、1時間反応させた。この混合液を10,000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで末端にマレイミド基が付いた蛍光色素内包樹脂粒子(蛍光粒子)を得た。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬社製)をN−succinimidyl S−acetylthioacetate(SATA)を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光色素内包樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
上記の蛍光色素内包樹脂粒子とストレプトアビジンとを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合PI色素内包ポリスチレン粒子(標識体)を得た。
なお、サンプル1−12〜1−14、2−12〜2−14、3−12〜3−14、4−12〜4−14でも、免疫染色において2番目に使用する標識体としてPIを単にCy5に変更しサンプル作製した(平均粒径はCy5量とポリスチレン量とを一定としてポリスチレン量を増減させ制御した。)。
[実施例1]と同様にして、免疫染色と形態観察染色とを実施し、H染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とをカウントした。
なお、免疫染色にあたっては、大径蛍光粒子(PI色素内包樹脂粒子)を反応させた後に、PBSで3回洗浄し、小径蛍光粒子(Cy5色素内包樹脂粒子)を反応させた。輝点数のカウントにあたっては、励起光は、光学フィルターに通すことで、PI、Cy5色素内包樹脂粒子それぞれに対して575〜600nm、635〜650nmに設定し、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターに通すことで、それぞれ612〜682nm、650〜700nmに設定した。
H染色後の輝点数とHE染色後の輝点数とをカウントした結果を表2〜表5に示す。
なお、表2〜表5では、サンプル1−1、2−1、3−1、4−1におけるH染色時の輝点数が、抗原の定量化にあたりより正確な値であって理想的な値をとり、合計輝点数がこの値に近いほど、抗原の定量化が向上していると判断することができる。
サンプル1−2、2−2、3−2、4−2では、先に小径蛍光粒子で免疫染色しその後に大径蛍光粒子で免疫染色しており、HE染色時において小径蛍光粒子による輝点数が少なく、抗原の定量化が向上しているとはいえない。
このような結果から、蛍光染色と形態観察染色とを共に行う場合、蛍光染色による抗原の定量性を向上させるには、先に大径蛍光粒子で免疫染色しその後に小径蛍光粒子で免疫染色することが有用であることがわかる。
さらに、サンプル1−6〜1−8、2−6〜2−8、3−6〜3−8、4−6〜4−8と、サンプル1−12〜1−14、2−12〜2−14、3−12〜3−14、4−12〜4−14との比較から、前者のサンプル群のほうがHE染色時における小径蛍光粒子による輝点数が多く、蛍光粒子の内包用の樹脂としては、ポリスチレンよりもポリメラミンのほうが好適であることがわかる。
12 蛍光粒子
14 ビオチン
20 抗原
30 1次抗体
40 2次抗体
42 アビジン
Claims (6)
- 蛍光色素を樹脂中に内包した蛍光粒子であって平均粒径の異なる2種以上の前記蛍光粒子を、標識剤として用いる病理切片の染色方法において、
前記病理切片に対して、第1の平均粒径であり且つ第1の蛍光色を発する第1の蛍光粒子を用いて特定の抗原を免疫染色する工程と、
前記病理切片に対して、平均粒径が前記第1の蛍光粒子の前記第1の平均粒径より小さい第2の平均粒径であり且つ前記第1の蛍光色と異なる第2の蛍光色を発する第2の蛍光粒子を用いて前記特定の抗原を免疫染色する工程と、
を有することを特徴とする染色方法。 - 請求項1に記載の染色方法において、
前記第1の蛍光粒子と前記第2の蛍光粒子とで平均粒径の差が40nm以上であることを特徴とする染色方法。 - 請求項1または2に記載の染色方法において、
前記第1の蛍光粒子の平均粒径が120〜200nmであることを特徴とする染色方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の染色方法において、
前記第1の蛍光粒子の平均粒径が120〜200nmであり、
前記第2の蛍光粒子の平均粒径が20〜80nmであることを特徴とする染色方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の染色方法において、
前記病理切片を、ヘマトキシリン・エオジン染色する工程をさらに有し、
前記第1の蛍光粒子として580nm付近の波長の光で励起する蛍光粒子を使用し、前記第2の蛍光粒子として600nm以上の波長の光で励起する蛍光粒子を使用することを特徴とする染色方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の染色方法において、
前記第1の蛍光粒子を用いて特定の抗原を免疫染色する工程の後に、前記第2の蛍光粒子を用いて前記特定の抗原を免疫染色する工程を行うことを特徴とする染色方法。
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