JP6231857B2 - Ophthalmic combination that enhances the effect of drugs with binding affinity for albumin in aqueous humor - Google Patents
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Description
本発明は、眼房水中アルブミンに結合親和性を有する薬剤の効果を増強する眼科用組み合わせ剤に関する。 The present invention relates to an ophthalmic combination that enhances the effect of a drug having binding affinity for albumin in aqueous humor.
生体内における薬理効果の強弱は、標的組織への遊離型薬物の移行量に大きく依存する。その主要な調節因子のひとつが血漿蛋白質である。吸収された薬物は循環血中に移行したのち、様々な血漿蛋白質と結合する。これまでに、血漿蛋白質と薬物との結合を阻害して遊離型薬物濃度を高めることにより、薬物の効果を増強することが報告されている（特許文献１）。 The strength of the pharmacological effect in vivo is largely dependent on the amount of free drug transferred to the target tissue. One of its main regulators is plasma protein. Absorbed drugs move into the circulation and then bind to various plasma proteins. So far, it has been reported that the effect of a drug is enhanced by inhibiting the binding between a plasma protein and a drug to increase the free drug concentration (Patent Document 1).
眼房水においてもアルブミンなどの蛋白質が存在することが報告されている。眼房水中アルブミンと結合した薬物は、眼内で効果を発現することもできずシュレム管より全身の血液中に排出される。また、アルブミン量は疾患の重症度や個体差により大きく変化することが予測されるため、患者個々での薬剤の効果に大きな差が出る可能性がある。しかしながら、眼房水中アルブミンと点眼薬物との結合を調べた報告は皆無である。 It has been reported that proteins such as albumin are also present in aqueous humor. The drug combined with albumin in the aqueous humor cannot express an effect in the eye and is discharged from the Schlemm's canal into the whole body blood. In addition, since the amount of albumin is predicted to vary greatly depending on the severity of the disease and individual differences, there may be a large difference in the effect of the drug in each patient. However, there has been no report examining the binding between ocular albumin and eye drops.
本発明は、眼内に投与される薬剤の効果を高める方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the method of improving the effect of the chemical | medical agent administered intraocularly.
本発明は、以下を提供する：
１．眼房水中アルブミンに結合親和性を有する第一の薬剤、および
第一の薬剤と同じ眼房水中アルブミンの結合部位に結合親和性を有する第二の薬剤
をそれぞれ別個の製剤中に含む眼科用組み合わせ剤であって、
第一の薬剤の投与前に第二の薬剤が投与される、組み合わせ剤。
２．第一の薬剤が、ジクロフェナクである、前記１記載の組み合わせ剤。
３．第一の薬剤が、イソプロピルウノプロストンである、前記１記載の組み合わせ剤。
４．第二の薬剤が、中鎖脂肪酸、フルルビプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、6-メトキシ-2-ナフタレン酢酸、カルプロフェン、スプロフェン、およびイブプロフェンから選択される、前記１〜３のいずれか記載の組み合わせ剤。
５．中鎖脂肪酸が、カプリル酸およびカプリン酸から選択される、前記４記載の組み合わせ剤。
６．体液中のアルブミンの薬物に対する結合性を調べる方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）対象とするアルブミンを、第一のサイトプローブと接触させる工程、
（２）第一のサイトプローブと接触させたアルブミンを、第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる第二のサイトプローブと接触させる工程、および
（３）第一のサイトプローブの遊離濃度を測定する工程。
７．体液中のアルブミンの薬物に対する結合性を調べる方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）対象とするアルブミンを、以下のサイトプローブとそれぞれ接触させる工程：
（ａ）第一のサイトプローブ、および
（ｂ）第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる血清アルブミンに対する結合定数を有する第二のサイトプローブ、
（２）第一のサイトプローブとの結合性を、第二のサイトプローブとの結合性と比較する工程。
８．第一のサイトプローブ、および
第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる第二のサイトプローブ
を含む、前記６記載の方法を実施するためのキット。
９．第一のサイトプローブ、および
第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる血清アルブミンに対する結合定数を有する第二のサイトプローブ
を含む、前記７記載の方法を実施するためのキット。
１０．サイトプローブがサイトIプローブおよびサイトIIプローブから選択される、前記８または９記載のキット。
The present invention provides the following:
1. A first drug having binding affinity for albumin in aqueous humor and a second drug having binding affinity at the same binding site of albumin in aqueous humor as the first drug in separate formulations An agent,
A combination wherein a second drug is administered prior to administration of the first drug.
2. 2. The combination according to 1 above, wherein the first drug is diclofenac.
3. 2. The combination according to 1 above, wherein the first drug is isopropyl unoprostone.
4). The combination agent according to any one of the above 1 to 3, wherein the second agent is selected from medium chain fatty acids, flurbiprofen, naproxen, ketoprofen, 6-methoxy-2-naphthaleneacetic acid, carprofen, suprofen, and ibuprofen. .
5. 5. The combination according to 4 above, wherein the medium chain fatty acid is selected from caprylic acid and capric acid.
6). A method for examining the binding of albumin in a body fluid to a drug, comprising the following steps:
(1) A step of bringing the target albumin into contact with the first site probe,
(2) contacting albumin that has been contacted with the first site probe with a second site probe that has a binding affinity at the same binding site as the first site probe and is different from the first site probe; And (3) measuring the free concentration of the first site probe.
7). A method for examining the binding of albumin in a body fluid to a drug, comprising the following steps:
(1) The step of bringing the target albumin into contact with each of the following site probes:
(A) a first site probe; and (b) a second site probe having binding affinity for the same binding site as the first site probe and having a binding constant for serum albumin different from that of the first site probe. ,
(2) A step of comparing the binding property with the first site probe with the binding property with the second site probe.
8). A first site probe, and a second site probe having binding affinity at the same binding site as the first site probe and different from the first site probe kit.
9. 8. The first site probe, and the second site probe having binding affinity at the same binding site as the first site probe and having a binding constant for serum albumin different from the first site probe Kit for carrying out the method.
10. 10. The kit according to 8 or 9 above, wherein the site probe is selected from a site I probe and a site II probe.
本発明により、眼内に投与される薬剤の効果を単独で投与した場合よりも増強することができ、より効果的な眼科用組み合わせ剤を提供することが可能となる。 According to the present invention, the effect of a drug administered into the eye can be enhanced as compared with when administered alone, and a more effective ophthalmic combination can be provided.
１．眼科用組み合わせ剤
本発明は、眼房水中アルブミンに結合親和性を有する第一の薬剤、および、第一の薬剤と同じ眼房水中アルブミンの結合部位に結合親和性を有する第二の薬剤をそれぞれ別個の製剤中に含む眼科用組み合わせ剤であって、第一の薬剤の投与前に第二の薬剤が投与される組み合わせ剤に関する。眼房水中アルブミンに結合親和性を有する第一の薬剤の投与前に，共通の眼房水中アルブミンの結合部位に結合親和性を有する第二の薬剤を投与すると，第二の薬剤の眼房水中アルブミンへの結合により第一の薬剤の眼房水中アルブミンへの結合が阻害され、第一の薬剤の遊離濃度が上昇し、第一の薬剤を単独で投与した場合よりも高い効果を得ることができる。
1. The present invention relates to a first drug having binding affinity for aqueous humor albumin and a second drug having binding affinity at the same binding site of albumin in aqueous humor as the first drug. An ophthalmic combination that is contained in a separate formulation, wherein the second drug is administered prior to administration of the first drug. Prior to administration of the first drug having binding affinity for albumin in aqueous humor, if a second drug having binding affinity at the binding site of albumin in common aqueous humor is administered, The binding of albumin inhibits the binding of the first drug to albumin in the aqueous humor, increasing the free concentration of the first drug and obtaining a higher effect than when the first drug is administered alone. it can.
本明細書において、サイトプローブまたはサイト薬物とは、アルブミンの薬物結合部位に結合する薬物を意味する。眼房水中アルブミンの代表的な薬物結合部位としては、サイトIおよびサイトIIが存在する。本明細書において、サイトIに結合親和性を有する薬剤は、サイトIプローブまたはサイトI薬物とも称し、サイトIIに結合親和性を有する薬剤は、サイトIIプローブまたはサイトII薬物とも称する。 In this specification, a site probe or a site drug means a drug that binds to the drug binding site of albumin. Site I and site II exist as typical drug binding sites of albumin in aqueous humor. In the present specification, an agent having binding affinity for site I is also referred to as a site I probe or site I drug, and an agent having binding affinity for site II is also referred to as a site II probe or site II drug.
本発明において，眼房水中アルブミンに結合親和性を有する第一の薬剤は，投与の目的に沿った薬剤であれば治療薬または診断薬のいずれでもよい。第二の薬剤は，治療あるいは診断目的とは関係なく、第一の薬剤またはその活性本体（代謝物）と眼房水中アルブミンに対する結合部位が共通し、第一の薬剤またはその活性本体の眼房水中アルブミンへの結合を阻害するものであればよい。第一の薬剤が眼房水中アルブミンの複数の異なる結合部位に結合親和性を有する場合、複数の第二の薬剤を用いても良い。さらに、第二の薬剤は、その本来の薬理作用が臨床的に許容されるものであること、常用量の範囲が広く、服用後の血中濃度が高く維持できること等を考慮して選択すればよい。 In the present invention, the first drug having binding affinity for aqueous humor albumin may be either a therapeutic drug or a diagnostic drug as long as it is a drug that meets the purpose of administration. Regardless of the purpose of treatment or diagnosis, the second drug has a common binding site for the first drug or its active substance (metabolite) and albumin in the aqueous humor, and the first drug or its active substance in the atrial chamber. Any substance that inhibits binding to albumin in water may be used. When the first drug has binding affinity for a plurality of different binding sites of albumin in aqueous humor, a plurality of second drugs may be used. Furthermore, the second drug should be selected in consideration of its original pharmacological action clinically acceptable, wide range of normal doses, and high blood concentration after administration. Good.
眼房水中アルブミンのサイトIに結合親和性を有する薬剤としては、フェニルブタゾン、ワルファリン、バルプロ酸、アスピリン、ブコローム、セファゾリン、サリチル酸、セフトリアキソン、スルファメチゾール、カンレノン酸、ブメタニド、ピレタニド、バルサルタン、ダンシル−Ｌ−アスパラギン等が挙げられる。サイトIIに結合親和性を有する薬剤としては、ジクロフェナク、イソプロピルウノプロストン、脂肪酸、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ナブメトンの主代謝物（6-メトキシ-2-ナフタレン酢酸（6-methoxy-2-naphthylacetic acid：6MNA））、ナプロキセン、ケトプロフェン、カルプロフェン、スプロフェン、プロペネシド、ジアゼパム、ダンシルサルコシン、ダンシル−Ｌ−プロリン、インドキシル硫酸等が挙げられる。本発明に好適な脂肪酸は中鎖脂肪酸および長鎖脂肪酸であり、なかでも中鎖脂肪酸が好適である。中鎖脂肪酸として、例えば、カプリル酸およびカプリン酸が挙げられる。 Drugs having binding affinity for Site I of albumin in aqueous humor include phenylbutazone, warfarin, valproic acid, aspirin, bucolome, cefazolin, salicylic acid, ceftriaxone, sulfamethizole, canrenonic acid, bumetanide, piretanide, Valsartan, dansyl-L-asparagine, etc. are mentioned. Drugs with binding affinity for Site II include diclofenac, isopropyl unoprostone, fatty acids, flurbiprofen, ibuprofen, and the main metabolites of nabumetone (6-methoxy-2-naphthylacetic acid (6-methoxy-2-naphthylacetic acid) acid: 6MNA)), naproxen, ketoprofen, carprofen, suprofen, propeneside, diazepam, dansyl sarcosine, dansyl-L-proline, indoxyl sulfate and the like. Fatty acids suitable for the present invention are medium-chain fatty acids and long-chain fatty acids, among which medium-chain fatty acids are preferred. Examples of medium chain fatty acids include caprylic acid and capric acid.
好ましい態様において、第一の薬剤はジクロフェナクであり、第二の薬剤は中鎖脂肪酸である。 In a preferred embodiment, the first agent is diclofenac and the second agent is a medium chain fatty acid.
別の好ましい態様において、第一の薬剤はイソプロピルウノプロストンであり、第二の薬剤は中鎖脂肪酸である。 In another preferred embodiment, the first agent is isopropyl unoprostone and the second agent is a medium chain fatty acid.
第一の薬剤および第二の薬剤の投与量、および第一の薬剤と第二の薬剤の投与時期は、第二の薬剤による第一の薬剤の眼房水中アルブミンへの結合阻害、および第一の薬剤の治療薬または診断薬としての所望の作用が得られるように、適宜選択される。 The dose of the first drug and the second drug, and the timing of administration of the first drug and the second drug are determined by inhibiting the binding of the first drug to albumin in the aqueous humor by the second drug and the first drug. These drugs are appropriately selected so as to obtain a desired action as a therapeutic agent or diagnostic agent.
本発明の眼科用組み合わせ剤のそれぞれの製剤は、それぞれ独立して溶液、乳液または懸濁液のような液体、またはゲル、眼軟膏のような半固体の形をとることができる。 Each formulation of the ophthalmic combination of the present invention can independently take the form of a solution, a liquid such as an emulsion or suspension, or a semi-solid form such as a gel or eye ointment.
水性の溶液剤、懸濁剤用希釈剤としては、蒸留水、生理食塩水が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤用希釈剤としては、植物油、流動パラフィン、鉱物油、プロピレングリコール、ｐ−オクチルドデカノール等がある。また涙液と等張にすることを目的として塩化ナトリウム、ほう酸、クエン酸ナトリウム等の等張化剤、ｐＨを例えば５.０〜８.０程度に一定に保持することを目的としてほう酸緩衝液、りん酸緩衝液等の緩衝剤を加えることができる。さらに、亜硫酸ナトリウム、プロピレングリコール等の安定剤、エデト酸ナトリウム等のキレート剤、グリセリン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー等の増粘剤、メチルパラベン、ピロピルパラベン等の防腐剤を含んでいてもよい。 Diluent water and physiological saline are contained as an aqueous solution and diluent for suspension. Non-aqueous solutions and suspension diluents include vegetable oil, liquid paraffin, mineral oil, propylene glycol, p-octyldodecanol and the like. In addition, an isotonic agent such as sodium chloride, boric acid, sodium citrate, etc. for the purpose of making it isotonic with tear fluid, borate buffer solution for the purpose of keeping the pH constant, for example, about 5.0-8.0. A buffering agent such as a phosphate buffer can be added. Furthermore, stabilizers such as sodium sulfite and propylene glycol, chelating agents such as sodium edetate, thickeners such as glycerin, carboxymethylcellulose, and carboxyvinyl polymer, and preservatives such as methylparaben and propylparaben may be included.
眼軟膏は、ワセリン、ゼレン５０、プラスチベース、マクロゴール等を基剤とし、親水性を高めることを目的として界面活性剤を加えることができる。また、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシビニルポリマーなどのゼリー剤等を含んでいてもよい。 The eye ointment is based on petrolatum, zelene 50, plastibase, macrogol and the like, and a surfactant can be added for the purpose of enhancing hydrophilicity. Moreover, jelly agents, such as carboxymethylcellulose, methylcellulose, and carboxyvinyl polymer, may be included.
本発明はまた、眼房水中アルブミンに結合親和性を有する第一の薬剤を含有する眼科用製剤であって、第一の薬剤と同じ眼房水中アルブミンの結合部位に結合親和性を有する第二の薬剤を含む眼科用製剤が投与された後に投与されることに特徴付けられる眼科用製剤に関する。 The present invention also provides an ophthalmic preparation containing a first drug having binding affinity for albumin in aqueous humor, wherein the second drug has binding affinity at the same binding site of albumin in aqueous humor as the first drug. The present invention relates to an ophthalmic preparation characterized in that it is administered after an ophthalmic preparation containing any of the above drugs is administered.
本発明はさらに、眼房水中アルブミンに結合親和性を有する第一の薬剤と同じ眼房水中アルブミンの結合部位に結合親和性を有する第二の薬剤を含有する眼科用製剤であって、第一の薬剤を含有する眼科用製剤の投与に先だって投与されることに特徴付けられる眼科用製剤に関する。 The present invention further relates to an ophthalmic preparation comprising a second drug having a binding affinity at the binding site of albumin in the aqueous humor and the first drug having a binding affinity to albumin in the aqueous humor, The present invention relates to an ophthalmic preparation characterized by being administered prior to administration of an ophthalmic preparation containing any of the above drugs.
２．体液中のアルブミンの薬物に対する結合性を調べる方法
採取可能な体液（眼房水、血清等）中には必ずアルブミンが存在する。アルブミンの薬物に対する結合は、１）結合部位が同じであれば必ず置換現象が生じる、２）アルブミンの同一結合部位に結合するサイトプローブ（サイト薬物）であれば必ず結合定数の高い方が強く結合する（結合定数の高いサイトプローブは必ず遊離率が低くなる）、という性質を示す。したがって、上記の１）あるいは２）にしたがわないアルブミンは特殊な性質を有するアルブミンあるいは特殊な環境下のアルブミンであると判断することができる。
2. Method for examining the binding property of albumin to a drug in body fluid Albumin is always present in body fluids that can be collected (such as aqueous humor and serum). As for the binding of albumin to a drug, 1) a substitution phenomenon always occurs if the binding sites are the same. 2) If the site probe (site drug) binds to the same binding site of albumin, the higher binding constant always binds stronger. (The site probe with a high binding constant always has a low release rate). Therefore, it can be determined that albumin that does not comply with the above 1) or 2) is albumin having a special property or albumin in a special environment.
上記１）の性質を有するか否かは、
（１）対象とするアルブミンを、第一のサイトプローブと接触させる、
（２）第一のサイトプローブと接触させたアルブミンを、第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる第二のサイトプローブと接触させる、および
（３）第一のサイトプローブの遊離濃度を測定する
ことにより調べることができる。第一のサイトプローブの遊離濃度が増加すれば置換現象が生じたということであり、対象とするアルブミンが上記１）の性質を有することがわかる。一方、遊離濃度が増加しなかった場合、対象とするアルブミンは上記１）の性質を有さないことがわかる。本方法においては、通常、第一のサイトプローブの濃度はアルブミン濃度の１／５以下、第二のサイトプローブの濃度はアルブミン濃度の２／３以上とすればよい。一般的に、タンパク結合で問題となる薬物の結合定数は1.0×105 M-1以上であるため、第一のサイトプローブの結合定数にもよるが、本方法においては1.0×105 M-1以上の結合定数を有する第二のサイトプローブが特に好適である。
Whether or not it has the above property 1)
(1) bringing the target albumin into contact with the first site probe;
(2) contacting albumin contacted with the first site probe with a second site probe having a binding affinity at the same binding site as the first site probe and different from the first site probe; and (3) It can be examined by measuring the free concentration of the first site probe. If the free concentration of the first site probe increases, it means that a substitution phenomenon has occurred, and it can be seen that the target albumin has the property 1) above. On the other hand, when the free concentration does not increase, it can be seen that the target albumin does not have the property of 1). In this method, normally, the concentration of the first site probe may be 1/5 or less of the albumin concentration, and the concentration of the second site probe may be 2/3 or more of the albumin concentration. In general, since the binding constant of a drug that is a problem in protein binding is 1.0 × 10 5 M −1 or more, it depends on the binding constant of the first site probe, but in this method, 1.0 × 10 5 M − A second site probe having a binding constant of 1 or more is particularly suitable.
上記２）の性質を有するか否かは、
（１）対象とするアルブミンを、以下のサイトプローブとそれぞれ接触させる：
（ａ）第一のサイトプローブ、および
（ｂ）第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる血清アルブミンに対する結合定数を有する第二のサイトプローブ、
（２）第一のサイトプローブとの結合性を、第二のサイトプローブとの結合性と比較する、
ことにより調べることができる。血清アルブミンに対する結合定数の高いサイトプローブが結合定数の低いサイトプローブよりも対象とするアルブミンに強く結合する場合、対象とするアルブミンは上記２）の性質を有することがわかる。比較の容易性のため、第二のサイトプローブの血清アルブミンに対する結合定数は、第一のサイトプローブの結合定数よりも２倍以上高いことが好ましい。また、第一および第二のサイトプローブの濃度は、アルブミン濃度の１／５以下にすることが好ましい。これにより、各サイトプローブによる相互の置換現象（阻害）が生じず、１つの眼房水サンプル等に全てのサイトプローブを一度に添加し、試験することができる。アルブミンとして眼房水中アルブミンを用いる場合、各サイトプローブの結合定数は1.0×105 M-1-5.0×107 M-1の範囲であることが好ましい。
Whether or not it has the above property 2)
(1) The target albumin is brought into contact with each of the following site probes:
(A) a first site probe; and (b) a second site probe having binding affinity for the same binding site as the first site probe and having a binding constant for serum albumin different from that of the first site probe. ,
(2) The binding property with the first site probe is compared with the binding property with the second site probe.
Can be examined. When a site probe having a high binding constant for serum albumin binds to target albumin more strongly than a site probe having a low binding constant, it is found that the target albumin has the property 2) above. For ease of comparison, it is preferable that the binding constant of the second site probe to serum albumin is two times higher than that of the first site probe. Further, the concentration of the first and second site probes is preferably 1/5 or less of the albumin concentration. Thereby, the mutual substitution phenomenon (inhibition) by each site probe does not occur, and all site probes can be added to one aqueous humor sample or the like at a time for testing. When using aqueous humor albumin as the albumin, the binding constant of each site probe is preferably in the range of 1.0 × 10 5 M −1 -5.0 × 10 7 M −1 .
本発明の方法は、サイトIプローブまたはサイトIIプローブのいずれについても行うことができる。サイトIプローブまたはサイトIIプローブとしては、本発明の眼科用組み合わせ剤にについて記載したものが挙げられる。 The method of the present invention can be performed for either Site I or Site II probes. Examples of the site I probe or the site II probe include those described for the ophthalmic combination of the present invention.
本発明の方法を実施するためのキットは、第一および第二のサイトプローブを含み、第一および第二のサイトIプローブ、並びに第一および第二のサイトIIプローブの全てを含んでいてもよい。 The kit for carrying out the method of the present invention includes first and second site probes, and may include all of the first and second site I probes and the first and second site II probes. Good.
生体内の様々な場所に存在する体液や、病態時のみに生じてくる体液（腹水や胸水など）を対象に本発明の方法を実施することで、それぞれの体液中に含まれるアルブミンの性質の特殊性、あるいはそのアルブミンが特殊な環境下のアルブミンであるかどうかを判断することができる。本発明の方法は、病態診断のための検査法となりうる。 By carrying out the method of the present invention for bodily fluids present in various locations in the living body or bodily fluids (such as ascites and pleural effusions) that occur only during pathological conditions, the properties of albumin contained in each bodily fluid It is possible to determine the specificity or whether the albumin is albumin under a special environment. The method of the present invention can be a test method for diagnosing a disease state.
I．眼房水中アルブミンと薬物との結合
１．方法
１）各患者由来の眼房水サンプルにおける眼房水中アルブミン濃度の測定
白内障患者２６人から採取した眼房水サンプル各20μＬを、pH=7.4 リン酸バッファー 60μLにて４倍希釈し、そのすべてを『コバス用消耗品 コバスカップwith HOLE』に移し、『コバス コバス試薬 U-ALBII』を試薬として用い『コバス インテグラ４００プラス』で測定を行った。
使用した機器
・ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 ディスクリート方式臨床化学自動分析装置
『コバス インテグラ４００プラス』
使用した試薬
・ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 コバスシステム アルブミンキット
『コバス コバス試薬 U-ALBII』
I. Binding of albumin to aqueous humor and drug Method 1) Measurement of albumin concentration in aqueous humor in each patient-derived aqueous humor sample 20 μL of each aqueous humor sample collected from 26 cataract patients was diluted 4-fold with 60 μL of pH = 7.4 phosphate buffer. Was transferred to “Cobas Consumables Cobas Cup with HOLE”, and “Cobas Cobas Reagent U-ALBII” was used as a reagent, and measurement was performed with “Cobas Integra 400 Plus”.
Equipment used: Roche Diagnostics Co., Ltd. Discrete automatic clinical chemistry analyzer "Cobas Integra 400 Plus"
Reagents used: Roche Diagnostics Co., Ltd. Cobas System Albumin Kit "Cobas Cobas Reagent U-ALBII"
２）各患者由来の眼房水サンプルにおけるジクロフェナク濃度の測定
（i）検量線試料は、血清をアルブミン濃度が2μMになるように67mM リン酸バッファー(pH=7.4)で希釈し調製した。その調製液40μLに対しジクロフェナクを0.5、1.0、1.5μMになるように添加し、内部標準用試料（IS）である4−ヒドロキシ安息香酸ヘキシルも24μMになるように添加した。眼房水サンプル40μLに対しても4−ヒドロキシ安息香酸ヘキシルを24μMになるように添加した。
（ii）眼房水サンプルと（i）の検量線試料各40μLに対し、3N塩酸を各200μL、シクロヘキサンを各2.5ｍL添加した。これを10分振とうした後、4000rpm、10分間遠心分離し、有機層を2mLずつ採取して減圧吸引し乾固させた。
（iii）（ii）の抽出物に移動相を120μL添加して調製し、このうち50μLをHPLCに注入し測定した。移動相については、精製水1291.7mL＋アセトニトリル1200mL＋メタノール250mL＋酢酸8.3mLで調製したもの（全量2750mLとして調製）を使用した。流速は1mL/minで行った。ＵＶ検出器は島津製作所『SPD-10Avp』を使用し、波長は275nmで測定した。測定用プログラムは島津製作所『LCsolution』を使用した。
（iv）検量線用試料の、ジクロフェナクとISのピークの面積の比から検量線を作成し、各眼房水サンプルの結果から総ジクロフェナク濃度を算出した。
抽出に使用した機器
・東京理科器械『遠心エバポレーター CVE−200D』
・タイテック『レシプロシェーカー SR-2w』
・久保田製作所『ユニバーサル冷却遠心機 5922』
2) Measurement of diclofenac concentration in aqueous humor samples from each patient (i) Calibration curve samples were prepared by diluting serum with 67 mM phosphate buffer (pH = 7.4) so that the albumin concentration was 2 μM. Diclofenac was added to 40 μL of the prepared solution so as to be 0.5, 1.0, and 1.5 μM, and hexyl 4-hydroxybenzoate as an internal standard sample (IS) was also added to 24 μM. 4-Hydroxybenzoate hexyl was also added to 24 μM of 40 μL of aqueous humor sample.
(Ii) 200 μL each of 3N hydrochloric acid and 2.5 mL each of cyclohexane were added to each 40 μL of the aqueous humor sample and the calibration curve sample of (i). This was shaken for 10 minutes and then centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes, and 2 mL of each organic layer was collected and sucked under reduced pressure to dryness.
(Iii) 120 μL of mobile phase was added to the extract of (ii), and 50 μL of this was injected into the HPLC for measurement. As the mobile phase, 1291.7 mL of purified water + 1200 mL of acetonitrile + 250 mL of methanol + 8.3 mL of acetic acid (prepared as a total amount of 2750 mL) was used. The flow rate was 1 mL / min. The UV detector used was “SPD-10Avp” manufactured by Shimadzu Corporation, and the wavelength was measured at 275 nm. Shimadzu Corporation “LCsolution” was used as the measurement program.
(Iv) A calibration curve was created from the ratio of the area of the diclofenac and IS peaks of the sample for the calibration curve, and the total diclofenac concentration was calculated from the results of each aqueous humor sample.
Equipment used for extraction: Tokyo Science Instruments "Centrifuge evaporator CVE-200D"
・ Tytec "Reciprocating Shaker SR-2w"
・ KUBOTA "Universal cooling centrifuge 5922"
３）各患者由来の眼房水サンプルにおける眼房水中アルブミンとジクロフェナクの結合性
（i）67mM リン酸バッファー(pH=7.4)にジクロフェナクを0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μM（もしくは0.03、0.05、0.07、0.09、0.11μＭ）になるように添加した。これら5サンプルを検量線試料とした。
（ii）限外濾過器の膜洗浄は『ミニセント−10』に蒸留水を各500μLいれ、3700rpm、5分の条件で限外ろ過して行った。この操作を2回繰り返した後、蒸留水が入っていない状態で1回限外ろ過してろ過膜の水分を除去し、限外濾過器のカップ部分を蒸留水で洗浄して、限外濾過器の膜とカップ部分を1時間程度乾燥させた。
（iii）各眼房水サンプル50μLを、限外濾過器にいれ、3500rpm、7〜9分限外ろ過し、ろ液を得た。（i）の検量線用試料も同様の処理をした。
（iv）（iii）のろ液15μLをHPLCに注入し測定した。移動相は、水987.5ｍＬ＋アセトニトリル1500ｍＬ＋メタノール250ｍＬ＋酢酸12.5ｍＬで調製したもの（全量2750mLとして調製）を使用した。流速は1mL/minで行った。UV検出器は島津製作所『SPD-20A』を使用し、波長は275nmとした。測定用プログラムは、島津製作所『CLASS-VP Ver.6.1』を使用した。
（v）検量線用試料の結果をもとに検量線を作成し、各眼房水サンプルの結果から遊離のジクロフェナク濃度を算出した。
3) Binding of aqueous humor albumin and diclofenac in aqueous humor samples from each patient (i) 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 μM (or 0.03, 0.05) diclofenac in 67 mM phosphate buffer (pH = 7.4) 0.07, 0.09, 0.11 μM). These 5 samples were used as calibration curve samples.
(Ii) Membrane cleaning of the ultrafilter was performed by adding 500 μL of distilled water to “Minicent-10” and performing ultrafiltration under conditions of 3700 rpm for 5 minutes. After repeating this operation twice, ultrafiltration is performed once in the absence of distilled water to remove moisture from the filtration membrane, and the ultrafiltration cup part is washed with distilled water to perform ultrafiltration. The membrane and cup part of the vessel were dried for about 1 hour.
(Iii) 50 μL of each aqueous humor sample was placed in an ultrafilter and ultrafiltered at 3500 rpm for 7 to 9 minutes to obtain a filtrate. The sample for the calibration curve (i) was subjected to the same treatment.
(Iv) 15 μL of the filtrate of (iii) was injected into the HPLC and measured. The mobile phase used was 987.5 mL water + 1500 mL acetonitrile + 250 mL methanol + 12.5 mL acetic acid (prepared as a total volume of 2750 mL). The flow rate was 1 mL / min. The UV detector used was Shimadzu “SPD-20A”, and the wavelength was 275 nm. Shimadzu Corporation “CLASS-VP Ver.6.1” was used as the measurement program.
(V) A calibration curve was created based on the results of the calibration curve sample, and the free diclofenac concentration was calculated from the results of each aqueous humor sample.
４）眼房水中アルブミンまたは血清アルブミンとサイトプローブとの結合性
（i）眼房水中アルブミン
各患者から採取した眼房水サンプルを複数混合してプール眼房水とした。プール眼房水のアルブミン濃度および総ジクロフェナク濃度は、測定していた個々の眼房水サンプルのデータから算出した。プール眼房水を約60〜75μＬに分注し（眼房水の量は同一系の実験では同一である）、実験目的に応じてサイトプローブとして機能する薬剤を添加し、さらにサイトプローブ阻害物質を添加した。サンプルを3500rpm、7〜9分（限外ろ過の時間は同一系の実験では同一である）で限外ろ過し、ろ液中の遊離のサイトプローブの濃度をHPLCで測定した。
4) Binding ability between albumin in aqueous humor or serum albumin and cytoprobe (i) Albumin in aqueous humor A plurality of aqueous humor samples collected from each patient were mixed to form pooled aqueous humor. Pool aqueous humor albumin concentration and total diclofenac concentration were calculated from the data of the individual aqueous humor samples being measured. Dispense pool aqueous humor into about 60-75 μL (the amount of aqueous humor is the same in the same system experiment), add a drug that functions as a site probe depending on the purpose of the experiment, and a site probe inhibitor Was added. The sample was ultrafiltered at 3500 rpm, 7-9 minutes (ultrafiltration time is the same in the same system experiment), and the concentration of free site probe in the filtrate was measured by HPLC.
（ii）血清アルブミン
ヒトアルブミン粉末を、所定の濃度（実験目的により異なるが、基本的に同時に測定する眼房水中アルブミン濃度と同一濃度）となるように、pH＝7.4、67mMリン酸バッファーで溶解した（以下、血清アルブミンと称す）。血清も同様のバッファーで希釈した（以下、希釈血清と称す）。サンプルに、サイトプローブとして機能する薬剤を添加し、さらにサイトプローブ阻害物質を添加した。サンプルを3500rpm、7〜9分で限外ろ過した（限外ろ過の時間は同一系の実験では同一である）のち、ろ液中の遊離のサイトプローブの濃度をHPLCで測定した。サイトIプローブであるフェニルブタゾンとワルファリン、および、サイトIIプローブであるフルルビプロフェンとジクロフェナクは、下記のHPLCの機器と条件にて同時定量できる。
(Ii) Serum albumin Human albumin powder is dissolved in pH = 7.4, 67 mM phosphate buffer so that it has a predetermined concentration (depending on the purpose of the experiment, but basically the same concentration as the albumin concentration in aqueous humor). (Hereinafter referred to as serum albumin). Serum was also diluted with the same buffer (hereinafter referred to as diluted serum). A drug functioning as a site probe was added to the sample, and a site probe inhibitor was further added. The sample was ultrafiltered at 3500 rpm for 7-9 minutes (ultrafiltration time was the same in the same system experiment), and the concentration of free cytoprobe in the filtrate was measured by HPLC. The site I probes phenylbutazone and warfarin, and the site II probes flurbiprofen and diclofenac can be simultaneously quantified using the following HPLC equipment and conditions.
（iii）使用した機器
島津製作所 島津高速液体クロマトグラフ
・送液ユニット：島津製作所『LC-10ADvp』
・ＵＶ検出器：島津製作所『SPD-20A』
・デガッサー：島津製作所『DGU-14A』
・システムコントローラー：島津製作所『SCL-10Avp』
・カラムオーブン：島津製作所『CTO-10Avp』
・測定プログラム：島津製作所『CLASS-VP Ver.6.1』
HPLC条件
移動相：水987.5ｍＬ＋アセトニトリル1500ｍＬ＋メタノール250ｍＬ＋酢酸12.5ｍＬ（全量2750mLとして調製）
カラム：関東化学株式会社『Hiber RT 250-4.0 LiChrosorb RP-18(7μm)』
UV検出器波長：275nm
流速：1mL/min
(Iii) Equipment used Shimadzu Shimadzu high-performance liquid chromatograph / liquid transfer unit: Shimadzu LC-10ADvp
・ UV detector: Shimadzu Corporation “SPD-20A”
・ Degasser: Shimadzu Corporation “DGU-14A”
System controller: Shimadzu “SCL-10Avp”
・ Column oven: Shimadzu Corporation “CTO-10Avp”
・ Measurement program: Shimadzu Corporation “CLASS-VP Ver.6.1”
HPLC conditions Mobile phase: water 987.5 mL + acetonitrile 1500 mL + methanol 250 mL + acetic acid 12.5 mL (prepared as a total volume of 2750 mL)
Column: Kanto Chemical Co., Ltd. “Hiber RT 250-4.0 LiChrosorb RP-18 (7 μm)”
UV detector wavelength: 275nm
Flow rate: 1mL / min
２．結果
１）眼房水中アルブミン濃度
採取した眼房水中のアルブミン濃度は0.3〜0.6μMであり、個体間の差が大きいことが分かった。
2. Results 1) Albumin concentration in aqueous humor The albumin concentration in the collected aqueous humor was 0.3 to 0.6 μM, and it was found that there was a large difference between individuals.
２）眼房水中ジクロフェナク濃度
採取した眼房水中のジクロフェナク濃度は0.03〜1.06μMであり、個体間の差が大きいことが分かった。
2) Diclofenac concentration in aqueous humor The concentration of diclofenac in the collected aqueous humor was 0.03 to 1.06 μM, and it was found that the difference between individuals was large.
３）眼房水中アルブミンとジクロフェナクの結合性
ジクロフェナクの眼房水中アルブミンとの結合率は30〜90％であり、個体間の差は大きいものの高い結合率を有する患者も存在することが明らかとなった。
3) Binding ability of albumin in aqueous humor and diclofenac The binding rate of diclofenac to albumin in aqueous humor is 30-90%, and it is clear that there are some patients with high binding rate although the difference between individuals is large. It was.
４）眼房水中アルブミンおよび血清アルブミンに対するサイトIプローブおよびサイトIIプローブの結合性の比較
図１および図２に示すように、眼房水中アルブミンとサイトIプローブおよびサイトIIプローブの結合率の大小（図１）は、血清アルブミンと各サイトプローブの結合定数の大小（図２）に一致した。このことより、血清アルブミンに結合するサイトIプローブおよびサイトIIプローブは眼房水中のアルブミンに間違いなく結合していることが分かった。
なお、血清アルブミンにおけるサイトIプローブであるフェニルブタゾンとワルファリンの結合定数は、フェニルブタゾン（7.0×105 M-1）の方がワルファリン（1.5×105 M-1）より大きい。また、血清アルブミンにおけるサイトIIプローブであるフルルビプロフェンとジクロフェナクの結合定数はフルルビプロフェン（3.6×107 M-1）の方がジクロフェナク（3.3×106 M-1）より大きい。
実験条件
アルブミン濃度：1.87μＭ
フェニルブタゾン濃度：0.4μＭ
ワルファリン濃度：0.4μＭ
フルルビプロフェン濃度：0.4μＭ
ジクロフェナク濃度：0.4μＭ
4) Comparison of binding properties of Site I probe and Site II probe to aqueous albumin and serum albumin As shown in FIG. 1 and FIG. FIG. 1) coincided with the magnitude of the binding constant between serum albumin and each site probe (FIG. 2). This indicates that the site I and site II probes that bind to serum albumin are definitely bound to albumin in the aqueous humor.
The binding constant between phenylbutazone and warfarin, which are site I probes in serum albumin, is greater for phenylbutazone (7.0 × 10 5 M −1 ) than for warfarin (1.5 × 10 5 M −1 ). In addition, the binding constant between flurbiprofen, which is a site II probe in serum albumin, and diclofenac is larger for flurbiprofen (3.6 × 10 7 M −1 ) than for diclofenac (3.3 × 10 6 M −1 ).
Experimental condition Albumin concentration: 1.87 μM
Phenylbutazone concentration: 0.4 μM
Warfarin concentration: 0.4 μM
Flurbiprofen concentration: 0.4 μM
Diclofenac concentration: 0.4 μM
５）眼房水中アルブミンとジクロフェナクの結合に対するカプリン酸の影響
ジクロフェナクの血清アルブミンへの結合は中鎖脂肪酸により強い結合阻害を受ける（「II．血清アルブミンと薬物との結合」参照）ことから、ジクロフェナクの眼房水中アルブミンへの結合に対するカプリン酸の影響を調べた。
図３に示されるように、眼房水中アルブミンに結合したジクロフェナクはカプリン酸により結合阻害を受けなかった。
実験条件
アルブミン濃度：1.87μＭ
ジクロフェナク濃度：0.4μＭ
カプリン酸濃度：1.87μＭ
5) Effect of capric acid on binding between albumin and diclofenac in aqueous humor Since diclofenac is strongly inhibited by medium chain fatty acids from binding to serum albumin (see “II. Binding of serum albumin to drug”), diclofenac Of capric acid on the binding of albumin to albumin in aqueous humor.
As shown in FIG. 3, diclofenac bound to aqueous albumin was not inhibited by capric acid.
Experimental condition Albumin concentration: 1.87 μM
Diclofenac concentration: 0.4 μM
Capric acid concentration: 1.87 μM
６）眼房水中アルブミンとジクロフェナクの結合に対する各種サイトIプローブおよびサイトIIプローブの影響
ジクロフェナクの血清アルブミンへの結合は、サイトIIプローブであるフルルビプロフェンやイブプロフェンにより強い結合阻害を受ける（「II．血清アルブミンと薬物との結合」参照）。そこで、フルルビプロフェンやイブプロフェンによるジクロフェナクの眼房水中アルブミンへの結合に対する影響を調べた。加えて、サイトIプローブであるフェニルブタゾンについても同様のことを調べた。
図４に示されるように、ジクロフェナクの眼房水中アルブミンへの結合は、サイトIIプローブであるフルルビプロフェンやイブプロフェンにより結合阻害を受けなかった。さらに、サイトIプローブであるフェニルブタゾンにも結合阻害を受けなかった。この結果から、点眼されたジクロフェナクの眼房水中アルブミンへの結合は、サイトIプローブおよびIIプローブにより置換できないことが判明した。眼房水中アルブミンへ一旦結合した目的薬物は、結合阻害しにくい性質があることが推察された。
実験条件
アルブミン濃度：1.86μＭ
フルルビプロフェン濃度：1.2μＭ
フェニルブタゾン濃度：2.0μＭ
イブプロフェン濃度：2.0μＭ
ジクロフェナク濃度：0.19μＭ
プローブ添加順：フルルビプロフェン→イブプロフェン
6) Influence of various site I and site II probes on the binding of albumin and diclofenac in aqueous humor The binding of diclofenac to serum albumin is strongly inhibited by the site II probes flurbiprofen and ibuprofen ("II See "Binding of serum albumin and drug"). Therefore, the effect of flurbiprofen and ibuprofen on the binding of diclofenac to albumin in aqueous humor was investigated. In addition, the same thing was investigated about phenylbutazone which is a site I probe.
As shown in FIG. 4, the binding of diclofenac to albumin in the aqueous humor was not inhibited by the site II probes flurbiprofen and ibuprofen. Furthermore, phenylbutazone, a site I probe, was not inhibited by binding. From this result, it was found that the binding of instilled diclofenac to albumin in the aqueous humor cannot be replaced by the Site I and II probes. It was speculated that the target drug once bound to the aqueous humor albumin has a property that it is difficult to inhibit the binding.
Experimental conditions Albumin concentration: 1.86 μM
Flurbiprofen concentration: 1.2 μM
Phenylbutazone concentration: 2.0 μM
Ibuprofen concentration: 2.0 μM
Diclofenac concentration: 0.19μM
Probe addition order: flurbiprofen → ibuprofen
７）眼房水中アルブミンに対する目的薬物の結合阻害
上記６）の結果より、眼房水中アルブミンにおいては、一旦結合した薬物は結合阻害しにくい性質があることが推察された。プール房水中には既にジクロフェナクが含まれていることから、眼房水に含まれていないサイトII薬物であるフルルビプロフェンを用い、結合阻害物質としてサイトII薬物であるイブプロフェンを用いて、先に、イブプロフェンを添加し、一時間後にフルルビプロフェンを添加する阻害実験を行った。
図５に示されるように、イブプロフェンの添加によりサンプル中の遊離のフルルビプロフェン濃度は1.43倍増加し、フルルビプロフェンの眼房水中アルブミンへの結合はイブプロフェンにより阻害された。この結果から、目的薬物の眼房水アルブミンへの結合を阻害するためには、目的薬物と同じ結合サイトに結合する阻害物質を先に添加する必要があることが明らかとなった。
実験条件
アルブミン濃度：1.86μＭ
フルルビプロフェン濃度：1.2μＭ
イブプロフェン濃度：4.0μＭ
ジクロフェナク濃度：0.19μＭ
プローブ添加順：イブプロフェン→フルルビプロフェン（イブプロフェン添加して45分後にフルルビプロフェンを添加。）
7) Inhibition of binding of target drug to albumin in aqueous humor From the result of 6) above, it was presumed that in albumin in aqueous humor, once bound drug is difficult to inhibit binding. Since diclofenac is already contained in the pooled aqueous humor, using flurbiprofen, a site II drug not contained in aqueous humor, and using ibuprofen, a site II drug, as a binding inhibitor, In addition, an inhibition experiment was conducted in which ibuprofen was added and flurbiprofen was added one hour later.
As shown in FIG. 5, the addition of ibuprofen increased the free flurbiprofen concentration in the sample by 1.43 times, and the binding of flurbiprofen to albumin in aqueous humor was inhibited by ibuprofen. From this result, it became clear that in order to inhibit the binding of the target drug to aqueous humor albumin, it is necessary to first add an inhibitor that binds to the same binding site as the target drug.
Experimental conditions Albumin concentration: 1.86 μM
Flurbiprofen concentration: 1.2 μM
Ibuprofen concentration: 4.0 μM
Diclofenac concentration: 0.19μM
Probe addition order: ibuprofen → flurbiprofen (flurubiprofen is added 45 minutes after ibuprofen is added.)
II．血清アルブミンと薬物との結合
上記Iと同様にして、血清アルブミンと薬物との結合を検討した。
１）血清アルブミンとジクロフェナクとの結合性
図６に示されるように、ジクロフェナクの血清アルブミンに対する結合はサイトIIプローブ（イブプロフェン、フルルビプロフェン）によって阻害されたが、サイトIプローブ（ワルファリン、フェニルブタゾン）によっては阻害されなかった。これら結果は、ジクロフェナクがサイトIIに結合していることを示す。
実験条件
アルブミン濃度:4.0μＭ
ジクロフェナク濃度：1.0μＭ
ワルファリン濃度：3.0μＭ
フェニルブタゾン濃度：3.0μＭ
フルルビプロフェン濃度：3.0μＭ
イブプロフェン濃度：3.0μＭ
II. Binding of serum albumin and drug In the same manner as in I above, binding of serum albumin and drug was examined.
1) Binding of serum albumin to diclofenac As shown in FIG. 6, the binding of diclofenac to serum albumin was inhibited by a site II probe (ibuprofen, flurbiprofen), but a site I probe (warfarin, phenylbuta). Zon) was not inhibited. These results indicate that diclofenac is bound to site II.
Experimental conditions Albumin concentration: 4.0 μM
Diclofenac concentration: 1.0 μM
Warfarin concentration: 3.0 μM
Phenylbutazone concentration: 3.0 μM
Flurbiprofen concentration: 3.0 μM
Ibuprofen concentration: 3.0 μM
２）血清アルブミンとジクロフェナクの結合に対する中鎖脂肪酸および長鎖脂肪酸の影響
図７に示されるように、ジクロフェナクの血清アルブミンへの結合は、中鎖脂肪酸（カプリル酸およびカプリン酸）および長鎖脂肪酸（オレイン酸）により結合阻害を受けた。ジクロフェナク結合阻害は、中鎖脂肪酸のほうが長鎖脂肪酸より強かった。
実験条件
アルブミン濃度:3.0μＭ
ジクロフェナク濃度：1.0μＭ
n-カプリル酸濃度：3.0、6.0μＭ
カプリン酸濃度：3.0、6.0μＭ
オレイン酸濃度：3.0、6.0μＭ
2) Effect of medium and long chain fatty acids on the binding of serum albumin and diclofenac As shown in FIG. 7, the binding of diclofenac to serum albumin is dependent on medium chain fatty acids (caprylic acid and capric acid) and long chain fatty acids ( Oleic acid) inhibited binding. Diclofenac binding inhibition was stronger for medium chain fatty acids than for long chain fatty acids.
Experimental conditions Albumin concentration: 3.0 μM
Diclofenac concentration: 1.0 μM
n-Caprylic acid concentration: 3.0, 6.0 μM
Capric acid concentration: 3.0, 6.0 μM
Oleic acid concentration: 3.0, 6.0 μM
３）血清アルブミンとジクロフェナクの結合に対するサイトIIプローブの影響
図８に示されるように、ジクロフェナクはフルルビプロフェンやイブプロフェンにより強い結合阻害を受けた。阻害率は、血清アルブミン濃度が低下するにつれ低下した。
実験条件
アルブミン濃度:4.0、3.0、2.0、1.0、0.75μＭ
フルルビプロフェン濃度：4.0、3.0、2.0、1.0、0.75μＭ
イブプロフェン濃度：4.0、3.0、2.0、1.0、0.75μＭ
ジクロフェナク濃度：0.5μＭ
3) Effect of Site II Probe on the Binding of Serum Albumin and Diclofenac As shown in FIG. 8, diclofenac was strongly inhibited by flurbiprofen and ibuprofen. The inhibition rate decreased as the serum albumin concentration decreased.
Experimental conditions Albumin concentration: 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0.75 μM
Flurbiprofen concentration: 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0.75 μM
Ibuprofen concentration: 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0.75 μM
Diclofenac concentration: 0.5 μM
４）血清アルブミンとフルルビプロフェンの結合に対するイブプロフェンの影響、および血清アルブミンとワルファリンの結合に対するフェニルブタゾンの影響
図９および１０に示されるように、血清アルブミン（3.0μＭ）に対するサイトIIプローブであるフルルビプロフェン（1.2μＭ）の結合は、同じくサイトIIプローブであるイブプロフェン（3.0μＭ）により著しく阻害された。サイトＩプローブであるワルファリン（0.3μＭ）の結合は、同じくサイトＩプローブであるフェニルブタゾン（3.0μＭ）により著しく阻害された。
実験条件
アルブミン濃度:3.0μＭ
ワルファリン濃度：0.3μＭ
フルルビプロフェン濃度：1.2μＭ
フェニルブタゾン濃度：3.0μＭ
イブプロフェン濃度：3.0μＭ
プローブ添加順：ワルファリン→フェニルブタソン、またはフルルビプロフェン→イブプロフェン
4) The effect of ibuprofen on the binding of serum albumin and flurbiprofen and the effect of phenylbutazone on the binding of serum albumin and warfarin As shown in FIGS. 9 and 10, with a site II probe against serum albumin (3.0 μM) The binding of some flurbiprofen (1.2 μM) was markedly inhibited by ibuprofen (3.0 μM), which is also a site II probe. Binding of the site I probe warfarin (0.3 μM) was markedly inhibited by the site I probe phenylbutazone (3.0 μM).
Experimental conditions Albumin concentration: 3.0 μM
Warfarin concentration: 0.3 μM
Flurbiprofen concentration: 1.2 μM
Phenylbutazone concentration: 3.0 μM
Ibuprofen concentration: 3.0 μM
Probe addition order: warfarin → phenylbutazone or flurbiprofen → ibuprofen
５）血清アルブミンとイソプロピルウノプロストンまたはその活性代謝物の結合性
血清アルブミンとサイトIプローブであるワルファリンの結合、および血清アルブミンとサイトIIプローブであるジアゼパムの結合に対するイソプロピルウノプロストンおよびその活性代謝物（カルボン酸体）の影響を調べた。
図１１に示されるに、血清アルブミンとワルファリンの結合は、イソプロピルウノプロストンおよびその活性代謝物によっては阻害されなかった。一方、図１２に示されるに、血清アルブミンとジアゼパムの結合は、イソプロピルウノプロストンおよびその活性代謝物により阻害された。この結果から、イソプロピルウノプロストンおよびその活性代謝物はアルブミンのサイトIIに結合することが示された。
実験条件
アルブミン濃度:3.0μＭ
ワルファリン濃度：1.0μＭ
ジアゼパム濃度：1.0μＭ
イソプロピルウノプロストン濃度：3.0、6.0μＭ
イソプロピルウノプロストン活性代謝物濃度：3.0、6.0μＭ
5) Binding of serum albumin to isopropyl unoprostone or its active metabolite Isopropyl unoprostone and its active metabolism to the binding of serum albumin to the site I probe warfarin and to the binding of serum albumin to the site II probe diazepam. The influence of the product (carboxylic acid form) was examined.
As shown in FIG. 11, the binding of serum albumin and warfarin was not inhibited by isopropyl unoprostone and its active metabolite. On the other hand, as shown in FIG. 12, the binding between serum albumin and diazepam was inhibited by isopropyl unoprostone and its active metabolite. This result indicated that isopropyl unoprostone and its active metabolite bind to site II of albumin.
Experimental conditions Albumin concentration: 3.0 μM
Warfarin concentration: 1.0 μM
Diazepam concentration: 1.0 μM
Isopropyl unoprostone concentration: 3.0, 6.0 μM
Isopropyl unoprostone active metabolite concentration: 3.0, 6.0 μM
III．体液中のアルブミンの薬物に対する結合性
１．検査方法１
眼房水中アルブミンおよび血清アルブミンにそれぞれサイトプローブを添加し、その後アルブミン濃度の約1〜2倍の濃度のサイトプローブ阻害物質（結合阻害薬）を添加して、サイトプローブの遊離濃度を測定した。サイトプローブの遊離濃度が増加すれば、置換現象が生じる正常なアルブミンあるいは正常な環境下のアルブミンであると判断され、サイトプローブの遊離濃度が変化しなければ、特殊なアルブミンあるいは特殊な環境下のアルブミンであると判断される。
図１３〜１５に示されるように、眼房水中アルブミンに結合したサイトIプローブおよびサイトIIプローブは、結合阻害薬により阻害（置換）されなかった。一方、血清アルブミンや希釈血清に結合したサイトIおよびサイトIIプローブは、結合阻害薬により阻害（置換）された。本検査において、眼房水中アルブミンは置換現象を示さず、特殊なアルブミンあるいは特殊な環境下のアルブミンであると判断された。一方、血清アルブミンや希釈血清については、正常なアルブミンあるいは正常な環境下のアルブミンであると判断された。
実験条件
アルブミン濃度：1.87μＭ
ワルファリン濃度：0.3μＭ
ジクロフェナク濃度：0.2μＭ
フルルビプロフェン濃度：1.2μＭ
フェニルブタゾン濃度：2.0μＭ
イブプロフェン濃度：2.0μＭ
III. Binding of albumin in body fluids to drugs Inspection method 1
The site probe was added to albumin in aqueous humor and serum albumin, respectively, and then a site probe inhibitor (binding inhibitor) having a concentration of about 1 to 2 times the albumin concentration was added to measure the free concentration of the site probe. If the free concentration of the cytoprobe increases, it is judged that the albumin is normal albumin in which a substitution phenomenon occurs, or albumin in a normal environment. If the free concentration of the cytoprobe does not change, a special albumin or a special environment It is judged to be albumin.
As shown in FIGS. 13 to 15, the site I probe and the site II probe bound to albumin in the aqueous humor were not inhibited (replaced) by the binding inhibitor. On the other hand, Site I and Site II probes bound to serum albumin and diluted serum were inhibited (replaced) by binding inhibitors. In this examination, the albumin in the aqueous humor did not show a substitution phenomenon, and was determined to be special albumin or albumin in a special environment. On the other hand, serum albumin and diluted serum were determined to be normal albumin or albumin in a normal environment.
Experimental condition Albumin concentration: 1.87 μM
Warfarin concentration: 0.3 μM
Diclofenac concentration: 0.2 μM
Flurbiprofen concentration: 1.2 μM
Phenylbutazone concentration: 2.0 μM
Ibuprofen concentration: 2.0 μM
２．検査方法２
血清アルブミンのサイトIあるいはサイトIIに対して明らかに結合定数の異なるサイトプローブを、眼房水中アルブミンと血清アルブミンに一定量（同一モル濃度になるように）添加した。サイトプローブが眼房水中アルブミンに対して血清アルブミンに対する結合定数どおりの結合性を示せば（結合定数が大きいプローブの方が高い結合性を示せば）、血清アルブミンと同様の正常なアルブミンあるいは正常な環境下のアルブミンであると判断され、結合定数どおりの結合性を示さなければ、特殊なアルブミンあるいは特殊な環境下のアルブミンと判断される。
図１および２に示されるように、眼房水中アルブミンとサイトIプローブおよびサイトIIプローブの結合性の大小は、血清アルブミンと各サイトプローブの結合定数の大小に一致した。本検査においては、眼房水中のアルブミンは、血清アルブミンに対する各サイトプローブの結合定数どおりの結合性を示した。
2. Inspection method 2
A constant amount of a site probe having a different binding constant with respect to site I or site II of serum albumin was added to albumin in aqueous humor and serum albumin (so as to have the same molar concentration). If the cytoprobe shows binding to the albumin in the aqueous humor according to the binding constant for serum albumin (if the probe with a higher binding constant shows higher binding), normal albumin similar to serum albumin or normal If it is determined that the albumin is in the environment and does not show the binding property according to the binding constant, it is determined to be special albumin or albumin in a special environment.
As shown in FIGS. 1 and 2, the magnitude of binding between albumin in the aqueous humor and the site I and site II probes matched the magnitude of the binding constant between serum albumin and each site probe. In this test, albumin in the aqueous humor showed binding properties to the serum albumin according to the binding constant of each site probe.
Claims (11)
ジクロフェナク、脂肪酸、フルルビプロフェン、イブプロフェン、6-メトキシ-2-ナフタレン酢酸、ナプロキセン、ケトプロフェン、カルプロフェン、スプロフェン、プロペネシド、ジアゼパム、ダンシルサルコシン、ダンシル−Ｌ−プロリン、およびインドキシル硫酸から選択される第二の薬剤
を別個の製剤中に含む眼科用組み合わせ剤であって、
第一の薬剤の投与前に第二の薬剤が投与される、組み合わせ剤。 A first drug that is isopropyl unoprostone, and diclofenac, fatty acid, flurbiprofen, ibuprofen, 6-methoxy-2-naphthaleneacetic acid, naproxen, ketoprofen, carprofen, suprofen, propeneside, diazepam, dansylsarcosine, dansyl-L An ophthalmic combination comprising in a separate formulation a second agent selected from proline and indoxyl sulfate,
A combination wherein a second drug is administered prior to administration of the first drug.
ジクロフェナク、脂肪酸、フルルビプロフェン、イブプロフェン、6-メトキシ-2-ナフタレン酢酸、ナプロキセン、ケトプロフェン、カルプロフェン、スプロフェン、プロペネシド、ジアゼパム、ダンシルサルコシン、ダンシル−Ｌ−プロリン、およびインドキシル硫酸から選択される第二の薬剤を含む眼科用製剤が投与された後に投与されることを特徴とする、眼科用製剤。 An ophthalmic formulation comprising a first drug that is isopropyl unoprostone,
A first selected from diclofenac, fatty acid, flurbiprofen, ibuprofen, 6-methoxy-2-naphthaleneacetic acid, naproxen, ketoprofen, carprofen, suprofen, propeneside, diazepam, dansylsarcosine, dansyl-L-proline, and indoxyl sulfate An ophthalmic preparation, which is administered after an ophthalmic preparation containing two drugs is administered.
（１）対象とするアルブミンを、以下のサイトプローブとそれぞれ接触させる工程：
（ａ）第一のサイトプローブ、および
（ｂ）第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる血清アルブミンに対する結合定数を有する第二のサイトプローブ、
（２）第一のサイトプローブとの結合性を、第二のサイトプローブとの結合性と比較する工程、
ここで、結合定数の高いサイトプローブの結合性が、結合定数の低いサイトプローブの結合性より低かった場合、前記アルブミンは特殊なアルブミンまたは特殊な環境下のアルブミンと判断される。 A method for examining the specificity of albumin in a body fluid comprising the following steps:
(1) The step of bringing the target albumin into contact with each of the following site probes:
(A) a first site probe; and (b) a second site probe having binding affinity for the same binding site as the first site probe and having a binding constant for serum albumin different from that of the first site probe. ,
(2) comparing the binding property with the first site probe with the binding property with the second site probe;
Here, when the binding property of the site probe having a high binding constant is lower than the binding property of the site probe having a low binding constant, the albumin is determined to be special albumin or albumin in a special environment.
第一のサイトプローブと同じ結合部位に結合親和性を有し、第一のサイトプローブとは異なる血清アルブミンに対する結合定数を有する第二のサイトプローブ
を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。 Having a first site probe, and binding affinity to the same binding site as the first site probe includes a second site probe with a binding constant for different serum albumin from the first site probe, according to claim 7 to 9 kits for carrying out the method according to any one of.
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