JP6225623B2 - Method for detecting methicillin resistance gene - Google Patents
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Description
本発明は、迅速、確実かつ簡便なメチシリン耐性遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用するメチシリン耐性遺伝子の検出方法、ならびに該検出方法を実行するための試薬に関する。 The present invention relates to an oligonucleotide for detecting methicillin resistance gene quickly, reliably and simply, a method for detecting a methicillin resistance gene using the oligonucleotide, and a reagent for carrying out the detection method.
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、メチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ遺伝子）を獲得した黄色ブドウ球菌であり、幅広い抗生物質に対する耐性を示す。また、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌属でもメチシリン耐性遺伝子を獲得することがある。
メチシリン耐性を試験する方法としては、薬剤感受性試験、メチシリン耐性遺伝子がコードするＰＢＰ−２’を抗ＰＢＰ−２’抗体を用いたイムノアッセイで検出する方法、メチシリン耐性遺伝子又は該遺伝子と連鎖するＤＮＡをＰＣＲで増幅して検出する方法などが実施されている（非特許文献１、非特許文献２）。
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a Staphylococcus aureus that has acquired a methicillin resistance gene (mecA gene) and exhibits resistance to a wide range of antibiotics. In addition, a methicillin resistance gene may be obtained in staphylococci other than Staphylococcus aureus.
Methods for testing methicillin resistance include drug susceptibility testing, a method of detecting PBP-2 ′ encoded by a methicillin resistance gene by immunoassay using an anti-PBP-2 ′ antibody, a methicillin resistance gene or DNA linked to the gene. A method of detecting by amplification by PCR has been implemented (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
薬剤感受性試験およびイムノアッセイ法は検査の前段階として被験者から得られた黄色ブドウ球菌を培養する必要がある。このため培養に要する時間も含めると検査には一日以上を要する。 Drug susceptibility testing and immunoassay methods require culturing Staphylococcus aureus obtained from the subject as a preliminary step in the test. For this reason, it takes more than one day for examination, including the time required for culture.
これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌の遺伝子以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌の遺伝子を検出することが可能である（非特許文献３）。 On the other hand, in the examination by nucleic acid amplification such as PCR, it is possible to detect the genes of Staphylococcus aureus present in clinical samples such as nasal swabs and pus in addition to the cultured genes of Staphylococcus aureus ( Non-patent document 3).
核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も一般的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。 In the method using nucleic acid amplification, how to detect the nucleic acid amplification product becomes a problem. As the most common detection method, there is a method of visually recognizing an amplification product by agarose gel electrophoresis. However, this method may cause contamination due to carryover of amplification products.
この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて正確性に優れたメチシリン耐性遺伝子検出方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１に記載の検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。 As a method for solving this problem, a method for detecting a methicillin-resistant gene having excellent accuracy using a fluorescent dye-labeled probe QProbe that has a characteristic of quenching when bound to a target nucleic acid has been proposed (Patent Document 1). In the detection method described in Patent Document 1, since nucleic acid amplification and nucleic acid detection can be performed continuously, it is not necessary to open the reaction system after nucleic acid amplification, and carry-over contamination can be prevented.
本発明者らは、より優れたメチシリン耐性遺伝子検出方法の確立を目指して、液状における保存安定性に着目した。すなわち本発明が解決しようとする課題は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。 The present inventors have focused on storage stability in a liquid state with the aim of establishing a better methicillin resistance gene detection method. That is, the problem to be solved by the present invention is to provide a nucleic acid primer set for constituting a composition having good storage stability in liquid for detecting a methicillin resistance gene, and a composition comprising the nucleic acid primer set. The present invention relates to a method for detecting a methicillin resistance gene using the method.
核酸増幅検査を行うための検出試薬には一定期間保存可能であることが求められる。検査を行うごとに試薬を調製する必要がなければ迅速な検査が可能となる。また、試薬調製時に外来ＤＮＡ等によるコンタミネーションが生じる危険を大幅に低減もしくは排除することができ、結果として検査の正確性の向上にも寄与する。しかし特許文献１に記載の検出系は一定期間の安定性については確認されていなかった。 A detection reagent for performing a nucleic acid amplification test is required to be able to be stored for a certain period of time. If it is not necessary to prepare a reagent for each test, a quick test can be performed. In addition, the risk of contamination due to foreign DNA or the like during reagent preparation can be greatly reduced or eliminated, and as a result, it contributes to an improvement in test accuracy. However, the detection system described in Patent Document 1 has not been confirmed for a certain period of stability.
一方、特許文献２にはＤＮＡポリメラーゼとマグネシウムイオンおよび核酸プライマーとを別の液状組成物にすることで、液状における保存安定性を向上させる方法が記載されている。しかし前記文献では使用する核酸プライマーの違いによって保存期間が左右されるかどうかについて十分な検証がされていなかった。 On the other hand, Patent Document 2 describes a method for improving storage stability in a liquid state by using DNA polymerase, magnesium ions, and a nucleic acid primer as separate liquid compositions. However, in the above-mentioned document, sufficient verification has not been made as to whether the storage period depends on the difference in the nucleic acid primer used.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、メチシリン耐性遺伝子の一部領域を特異的に増幅し、かつ冷蔵で保存可能な組成物を提供できる核酸プライマーを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のような構成からなる。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found a nucleic acid primer that can specifically amplify a partial region of a methicillin resistance gene and can provide a composition that can be stored refrigerated, thereby completing the present invention. It came to. That is, the present invention has the following configuration.
［項１］
下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなる、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセット。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目〜１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目〜３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
［項２］
前記核酸プライマーセットを含む組成物が、液体で３ヶ月以上の冷蔵保存が可能である、項１に記載の核酸プライマーセット。
［項３］
項１または２に記載の核酸プライマーセットであって、該組成物に含まれる核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列を有し、リバースプライマーが配列番号６〜８のいずれで示される塩基配列を有する、核酸プライマーセット。
［項４]
以下の（１）〜（３）の工程を含む、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法。
（１）項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
［項５］
前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される、項４に記載の方法。
［項６］
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基がシトシンである、項４または５に記載の方法。
［項７］
前記核酸プローブが、配列番号９または１０で示される塩基配列を有する、項４から６のいずれかに記載の方法。
［項８］
項４から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセットを含む組成物。
［項９］
項４から７のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項１から３のいずれかに記載の核酸プライマーセット、または、項８に記載の組成物を含むキット。
[Claim 1]
A nucleic acid primer set for detecting a methicillin resistant gene, comprising a forward primer represented by (A) below and a reverse primer represented by (B) below.
(A) Nucleic acid primer (B) sequence having a base sequence in which the 1560th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 3 ′ end and any of the 1526 to 1534 bases of the sequence is the 5 ′ end Nucleic acid primer having a base sequence having the 385th base of the base sequence indicated by No. 2 as the 3 ′ end and the 352nd to 359th bases of the sequence as the 5 ′ end [Claim 2]
Item 2. The nucleic acid primer set according to Item 1, wherein the composition containing the nucleic acid primer set is liquid and can be refrigerated for 3 months or longer.
[Section 3]
The nucleic acid primer set according to Item 1 or 2, wherein the nucleic acid primer set included in the composition has a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5 as a forward primer, and a reverse primer as a SEQ ID NO: A nucleic acid primer set having a base sequence represented by any of 6-8.
[Section 4]
A method for detecting a methicillin resistance gene in a sample, comprising the following steps (1) to (3).
(1) A step of amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a composition comprising the nucleic acid primer set according to any one of Items 1 to 3, (2) a nucleic acid amplification product obtained by step (1), and the nucleic acid A step of hybridizing a part of the amplification product and a nucleic acid probe capable of forming a complex to form a complex (3) A step of detecting the complex obtained in step (2) [Section 5]
The sample is selected from whole blood, blood culture medium, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, nasal wipe, pharyngeal wipe, sputum, catheter washing solution, tissue section, and those diluted with an appropriate solution. Item 5. The method according to Item 4.
[Claim 6]
Item 6. The method according to Item 4 or 5, wherein at least one end of the nucleic acid probe is fluorescently labeled, and the base of the nucleic acid probe labeled nucleic acid is cytosine.
[Claim 7]
Item 7. The method according to any one of Items 4 to 6, wherein the nucleic acid probe has a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 10.
[Section 8]
Item 8. A composition for carrying out the method according to any one of Items 4 to 7, comprising the nucleic acid primer set according to any one of Items 1 to 3.
[Claim 9]
A kit for carrying out the method according to any one of Items 4 to 7, comprising the nucleic acid primer set according to any one of Items 1 to 3 or the composition according to Item 8.
本発明によれば、良好な保存安定性を有する液状のメチシリン耐性遺伝子検出用検出試薬、および該試薬を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法が提供可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a liquid detection reagent for detecting a methicillin resistance gene having good storage stability and a method for detecting a methicillin resistance gene using the reagent.
本発明は、メチシリン耐性遺伝子を検出するための、液状において良好な保存安定性を有する組成物を構成するための核酸プライマーセット、および該核酸プライマーセットを含む組成物を用いてメチシリン耐性遺伝子を検出するための方法等に関する。 The present invention detects a methicillin resistance gene using a nucleic acid primer set for constituting a composition having good storage stability in liquid for detecting a methicillin resistance gene, and a composition containing the nucleic acid primer set It is related with the method to do.
核酸プライマーセット
本発明の様態の一つは、メチシリン耐性遺伝子を検出するための核酸プライマーセットである。該核酸プライマーセットは、下記の（Ａ）で示されるフォワードプライマーと、下記の（Ｂ）で示されるリバースプライマーとからなり、このセットを含む組成物を含む反応液によってメチシリン耐性遺伝子の一部領域を増幅することができる。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１５６０番目の塩基を３´末端とし、該配列の１５２６番目〜１５３４番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３８５番目の塩基を３´末端とし、該配列の３５２番目〜３５９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プライマー
Nucleic acid primer set One aspect of the present invention is a nucleic acid primer set for detecting a methicillin resistant gene. The nucleic acid primer set is composed of a forward primer shown in the following (A) and a reverse primer shown in the following (B), and a partial region of the methicillin resistance gene by a reaction solution containing a composition containing this set. Can be amplified.
(A) Nucleic acid primer (B) sequence having a base sequence in which the 1560th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the 3 ′ end and any of the 1526 to 1534 bases of the sequence is the 5 ′ end Nucleic acid primer having a base sequence having the 385th base of the base sequence indicated by No. 2 as the 3 'end and any 352nd to 359th base of the sequence as the 5' end
上記において、配列番号１はメチシリン耐性遺伝子配列の相補的配列であり、配列番号２はメチシリン耐性遺伝子配列である。配列情報はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から取得している（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＢＸ５７１８５６）。 In the above, SEQ ID NO: 1 is a complementary sequence of a methicillin resistance gene sequence, and SEQ ID NO: 2 is a methicillin resistance gene sequence. Sequence information is obtained from NCBI (National Center for Biotechnology Information) (ACCESSION No. BX571856).
核酸プライマーセットは、通常は１種類（１配列）以上のフォワードプライマーと１種類（１配列）以上のリバースプライマーとで構成される。好ましくは１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとで構成される。 The nucleic acid primer set is usually composed of one type (one sequence) or more forward primers and one type (one sequence) or more reverse primers. Preferably, it is composed of one kind of forward primer and one kind of reverse primer.
このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列を有するものと、リバースプライマーとして配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列を有するものとの組合せが好ましい。 As such a nucleic acid primer set, in particular, one having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 5 as a forward primer and one having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 8 as a reverse primer The combination with is preferred.
組成物
本発明の別の一つの様態は、メチシリン耐性遺伝子を検出する方法に用いるための前記核酸プライマーセットを含む組成物である。
前記組成物は、メチシリン耐性遺伝子を検出する方法に用いるためのキットの構成試薬の一部分であってもよい。
Composition Another aspect of the present invention is a composition comprising the nucleic acid primer set for use in a method for detecting a methicillin resistance gene.
The composition may be a part of a component reagent of a kit for use in a method for detecting a methicillin resistance gene.
前記組成物には前記核酸プライマーセットが含まれる。前記組成物に含まれるその他の成分は特に限定されないが、後述する核酸プローブは前記組成物に含まれることが好ましく、マグネシウムイオンが前記組成物に含まれることが好ましい。前記組成物に添加されるマグネシウムイオンの形態は特に限定されないが、塩化マグネシウムや硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩として添加することが好ましい。
また、前記組成物として既存の核酸増幅用キットに含まれる試薬を利用してもよい。
The composition includes the nucleic acid primer set. The other components contained in the composition are not particularly limited, but a nucleic acid probe described later is preferably contained in the composition, and magnesium ions are preferably contained in the composition. The form of magnesium ions added to the composition is not particularly limited, but it is preferably added as a magnesium salt such as magnesium chloride or magnesium sulfate.
Moreover, you may utilize the reagent contained in the existing kit for nucleic acid amplification as said composition.
前記組成物にはＤＮＡポリメラーゼは含まれないほうが好ましい。これは、ＤＮＡポリメラーゼと核酸プライマーセットとを混合したまま保存しておくと、非特異産物が生じる可能性が考えられるためである。
本明細書では、ＤＮＡポリメラーゼ等が含まれ、かつ前記核酸プライマーセットや核酸プローブが含まれない組成物を、前記組成物と区別して核酸増幅用試薬と記載する。
Preferably, the composition does not contain DNA polymerase. This is because a non-specific product may be generated if the DNA polymerase and the nucleic acid primer set are mixed and stored.
In the present specification, a composition containing DNA polymerase or the like and not containing the nucleic acid primer set or the nucleic acid probe is referred to as a nucleic acid amplification reagent in distinction from the composition.
保存
本発明の核酸プライマーセットを含む組成物は、液体で長期間冷蔵保存することが可能である。
本明細書における「保存することが可能（保存可能）」とは、組成物の核酸増幅性能が保存によって損なわれないことを意味する。また、組成物中に、例えば核酸プローブなど、前記核酸プライマーセットによって生じる増幅産物を検出する機能を有する構成物が含まれる場合は、前記構成物による前記増幅産物の検出性能が損なわれないことも含める。
Storage The composition containing the nucleic acid primer set of the present invention can be stored in a liquid for a long period of time.
As used herein, “can be stored (storable)” means that the nucleic acid amplification performance of the composition is not impaired by storage. In addition, when the composition includes a component having a function of detecting an amplification product generated by the nucleic acid primer set, such as a nucleic acid probe, the detection performance of the amplification product by the component may not be impaired. include.
本明細書における保存前とは、組成物を調製した直後の状態を指す。また、保存後とは所定の期間、所定の条件で静置した後の状態を指す。 In this specification, the term “before storage” refers to a state immediately after the composition is prepared. The term “after storage” refers to a state after standing for a predetermined period of time under predetermined conditions.
保存によって性能が損なわれないとは、必ずしも保存前後で性能変化が全く無いことを意味しない。組成物の性能としては、該組成物を適切な核酸増幅用試薬と混合した場合に標的としている核酸に対する核酸増幅性能および増幅産物検出性能が保たれていればよい。 The fact that performance is not impaired by storage does not necessarily mean that there is no performance change before and after storage. As the performance of the composition, it is sufficient that the nucleic acid amplification performance and the amplification product detection performance for the target nucleic acid are maintained when the composition is mixed with an appropriate nucleic acid amplification reagent.
上記の性能が保たれていることを判定する方法は、当業者が実施できる方法であれば特に限定されない。少なくとも１つ以上の方法で確認できれば、他の方法の結果にかかわらず性能は保たれているとしてよい。
性能が保たれていることの判定は、増幅産物検出の実施方法によっても異なるが、例えば、検出方法がアガロースゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動であれば、増幅産物のバンドが通常実施される方法で検出可能であれば、核酸増幅性能は保たれているとしてよい。
また、蛍光標識プローブなど、蛍光物質を利用して検出する方法を用いるのであれば、例えば、検出反応で得られる蛍光強度や蛍光変化量などのシグナル値を測定し、当該シグナル値が保存前組成物を用いて核酸増幅および増幅産物検出を実施して得られるシグナル値の３０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であれば、核酸増幅性能および増幅産物検出性能は保たれているとしてよい。
The method for determining that the above performance is maintained is not particularly limited as long as it can be performed by those skilled in the art. If it can be confirmed by at least one method, the performance may be maintained regardless of the result of other methods.
Judgment that the performance is maintained depends on the method of detecting the amplification product.For example, if the detection method is agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis, the band of the amplification product is usually used. If it can be detected, the nucleic acid amplification performance may be maintained.
In addition, if a detection method using a fluorescent substance such as a fluorescently labeled probe is used, for example, a signal value such as a fluorescence intensity or a fluorescence change amount obtained by a detection reaction is measured, and the signal value is a composition before storage. 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, of the signal value obtained by performing nucleic acid amplification and amplification product detection using the product, More preferably, the nucleic acid amplification performance and the amplification product detection performance may be maintained if they are 80% or more, more preferably 90% or more.
本発明における「冷蔵」とは、一般的な冷蔵庫や低温室などの温度条件を指し、冷蔵保存とは前記条件で保存することを指す。冷蔵の温度上限は１０℃であるが、９℃であってもよいし、８℃であってもよいし、７℃であってもよいし、６℃であってもよいし、５℃であってもよいし、凍結しない範囲でさらに低い温度であってもよい。冷蔵の温度下限は凍結しない温度であればよいが、０℃であってもよいし、１℃であってもよいし、２℃であってもよいし、１０℃を超えない範囲でさらに高い温度であってもよい。温度の上限と下限の組み合わせは前記の範囲であれば任意だが、たとえば、７℃から１０℃、２℃から５℃の範囲に維持すればよい。 In the present invention, “refrigeration” refers to a general temperature condition such as a refrigerator or a cold room, and refrigerated storage refers to storage under the above-described conditions. The upper temperature limit for refrigeration is 10 ° C, but it may be 9 ° C, 8 ° C, 7 ° C, 6 ° C, or 5 ° C. It may be present, or it may be a lower temperature as long as it does not freeze. The lower temperature limit of refrigeration is not limited as long as it does not freeze, but it may be 0 ° C, 1 ° C, 2 ° C, or even higher within a range not exceeding 10 ° C. It may be temperature. The combination of the upper limit and the lower limit of the temperature is arbitrary as long as it is within the above range.
前記核酸プライマーセットを用いることで、冷蔵で保存可能な組成物を用意することが可能になる。保存期間としては少なくとも３ヶ月間は保存可能であり、好ましくは６ヶ月間、さらに好ましくは７ヶ月間、さらに好ましくは８ヶ月間、さらに好ましくは９ヶ月間、さらに好ましくは１０ヶ月間、さらに好ましくは１１ヶ月間、さらに好ましくは１２ヶ月間、さらに好ましくは１３ヶ月間、さらに好ましくは１４ヶ月間、さらに好ましくは１５ヶ月間、さらに好ましくは１８ヶ月間、さらに好ましくは２４ヶ月間保存可能である。 By using the nucleic acid primer set, it is possible to prepare a composition that can be stored refrigerated. The storage period is at least 3 months, preferably 6 months, more preferably 7 months, more preferably 8 months, more preferably 9 months, more preferably 10 months, more preferably Can be stored for 11 months, more preferably 12 months, more preferably 13 months, more preferably 14 months, more preferably 15 months, more preferably 18 months, more preferably 24 months. .
核酸プローブ
後述の本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法において用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
Nucleic acid probe The nucleic acid probe used in the methicillin resistant gene detection method of the present invention described later is not particularly limited as long as it can form a complex with a part or all of the nucleic acid amplification product amplified by the nucleic acid primer set. . More preferably, it is a nucleic acid probe that specifically forms a complex only with the nucleic acid amplification product and does not form a complex with a nucleic acid having other base sequence, more preferably a part of the nucleic acid amplification product or A nucleic acid probe having the same or complementary base sequence as the entire base sequence.
このような核酸プローブとして、配列番号９、１０の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。 As such a nucleic acid probe, the nucleic acid probe shown by the base sequence of sequence number 9, 10 can be illustrated.
上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。 The nucleic acid probe may or may not be labeled with a nucleic acid. In the case of labeling, the position and number of the nucleic acid to be labeled are not limited, but preferably the nucleic acid at the end of the nucleic acid probe is labeled, and more preferably, one of the ends is labeled. is there. More preferably, the base of the terminal nucleic acid to be labeled is cytosine.
標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。 The labeling substance is not particularly limited, but is preferably a fluorescent substance, more preferably a fluorescent substance that exhibits fluorescence alone and quenches when it forms a hybrid with the target nucleic acid. Examples of the fluorescent substance include, but are not limited to, fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives, and the like. Examples of commercially available fluorescent dyes include BODIPY FL (trademark, manufactured by Molecular Probes), FluorePrime (trademark, Amersham). Pharmacia), Fluoredite (trademark, manufactured by Millipore), FAM (ABI), Cy3 and Cy5 (Amersham Pharmacia), TAMRA (Molecular Probes), carboxyrhodamine 6G (CR6G), and the like.
メチシリン耐性遺伝子の検出方法
本発明の異なる様態として、試料中のメチシリン耐性遺伝子を検出する方法が挙げられる。該方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）前記の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
Method for Detecting Methicillin Resistance Gene A different aspect of the present invention is a method for detecting a methicillin resistance gene in a sample. The method includes the following steps (1) to (3).
(1) Amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing a composition containing the nucleic acid primer set (2) A nucleic acid amplification product obtained by step (1), a part of the nucleic acid amplification product, and a complex A step of hybridizing with a nucleic acid probe capable of forming a complex to form a complex (3) a step of detecting the complex obtained in step (2)
本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。メチシリン耐性遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。 The method for detecting a methicillin resistant gene of the present invention is not particularly limited except that the above steps are included. If a methicillin resistance gene can be detected, a new step may be added to the above step.
該方法で用いられるメチシリン耐性遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記のものを用いることができる。さらに、例えばメチシリン耐性遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。 As the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe for amplifying and detecting the methicillin resistance gene used in the method, those described above can be used. Furthermore, for example, for the purpose of amplifying and detecting a gene different from the methicillin resistance gene, addition of a nucleic acid primer or nucleic acid probe different from the nucleic acid primer set and nucleic acid probe is not particularly limited.
被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
Amplification of test nucleic acid The test nucleic acid in the present invention may be, for example, single-stranded or double-stranded. In the case of a double strand, for example, it is preferable to include a step of dissociating the double strand into a single strand by heating in order to hybridize a test nucleic acid and a probe to form a hybrid.
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる The type of the test nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA such as total RNA and mRNA, and the like. Examples of the test nucleic acid include nucleic acids contained in samples such as a blood culture sample of S. aureus, a catheter washing solution, and a biological sample. These samples may be used as they are, or those diluted with an appropriate solution may be used. Suitable solutions include water, saline, buffer solution, alkaline aqueous solution, acidic aqueous solution, nucleic acid extraction reagent, surfactant, organic solvent and the like.
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
Although it does not restrict | limit especially as said biological sample, For example, pus, pleural effusion, cerebrospinal fluid, throat wiping liquid, nasal cavity wiping liquid, sputum, tissue section, blood (whole blood) etc. are mentioned.
A method for collecting a sample, a method for preparing a nucleic acid such as DNA or RNA, and the like are not limited, and conventionally known methods can be employed.
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。 Subsequently, the isolated genomic DNA is used as a template to amplify a sequence containing a base site to be detected by a nucleic acid amplification method such as PCR using the above-described nucleic acid primer set. The specific nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate. For example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transscription-mediated amplification (LMP) method, SDA (Strand Displacement Amplification method), SDA (Strand Displacement Amplification method). It is preferable to use the PCR method. In each of these methods, the conditions for the amplification reaction are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。 When the PCR method is used for nucleic acid amplification, the DNA polymerase to be used is not particularly limited, but α-type DNA polymerase is preferably used. The reason will be described below.
本発明プローブが含まれる反応系でメチシリン耐性遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のメチシリン耐性遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にメチシリン耐性遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。 When a methicillin resistance gene is amplified in a reaction system containing the probe of the present invention, the nucleic acid probe can bind to a methicillin resistance gene of the sample or an amplification product thereof during the nucleic acid amplification step. The nucleic acid probe bound to the methicillin resistance gene during the nucleic acid amplification step inhibits the nucleic acid amplification reaction by the nucleic acid primer and DNA polymerase.
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるメチシリン耐性遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。 PolI type DNA polymerases such as Taq DNA Polymerase are known to have 5'-3 'exonuclease activity. Due to this activity, when there is a nucleic acid bound to a methicillin resistance gene as a template during the nucleic acid amplification reaction, the bound nucleic acid is degraded by exonuclease activity. For this reason, the nucleic acid probe in the reaction system may be reduced, causing a problem in the nucleic acid detection process. Therefore, it is not preferable to carry out the present invention using PolI type DNA polymerase.
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。 On the other hand, α-type DNA polymerases such as KOD DNA Polymerase (derived from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1) do not have 5'-3 'exonuclease activity but have 3'-5' exonuclease activity. Therefore, the use of α-type DNA polymerase not only solves the above problem, but also exhibits high accuracy in the nucleic acid amplification step due to the 3′-5 ′ exonuclease activity.
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。 Usually, α-type DNA polymerase has a 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, and therefore the nucleic acid amplification rate tends to be lower than that of PolI-type enzyme. However, although KOD DNA Polymerase is an α-type DNA polymerase, it has high DNA synthesis activity, has a DNA synthesis rate of 100 bases / second or more, and has excellent elongation efficiency. Therefore, it is preferable to use KOD DNA Polymerase (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) among the α-type DNA polymerases for carrying out the present invention.
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
In addition, a mutant type in which α-type DNA polymerase is mutated to achieve a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more, or a DNA polymerase composition in which the performance is achieved by a combination of wild type and / or mutant type Can be used as a DNA polymerase suitable for the practice of the present invention.
For example, as a DNA polymerase having a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more in addition to the above KOD DNA Polymerase, “KOD FX (Toyobo, Trademark)”, “KOD-Plus- (Toyobo, Trademark)”, “KOD” Dash (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), PrimeSTAR HS DNA polymerase (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can also be used.
Among these, KOD-Plus- having both high accuracy and DNA synthesis activity is desirable.
ＤＮＡ合成活性
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
DNA synthesis activity In the present invention, DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleic acid by covalently binding α-phosphate of deoxyribonucleoside 5′-triphosphate to 3′-hydroxyl group of oligonucleotide or polynucleotide annealed to template DNA. Refers to the activity of catalyzing the reaction of introducing deoxyribonucleoside 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
When the enzyme activity is high, the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer. In the present invention, 25 μl of the following solution A, 5 μl of each of solution B and C, and 10 μl of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring. Then, it is ice-cooled, 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added, and after stirring, it is further ice-cooled for 10 minutes. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. taking measurement. One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
A: 40 mM Tris-HCl (pH 7.5)
16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 μg / ml BSA
B: 2 μg / μl activated calf thymus DNA
C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
E: 1 μg / μl carrier DNA
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
3'-5 'exonuclease activity In the present invention, the 3'-5' exonuclease activity refers to an activity of excising the 3 'terminal region of DNA and releasing 5'-mononucleotide.
The activity was measured using 50 μl of a reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg tritium-labeled E. coli DNA) is dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube and DNA polymerase is added. After reacting at 75 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 μl of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 μl of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 μl of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のメチシリン耐性遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
Complex formation between nucleic acid amplification product and probe The methicillin resistant gene detection method of the present invention is designed to form a complex with the nucleic acid amplification product obtained in step (1) and a part of the nucleic acid amplification product. The nucleic acid probe is hybridized to form a complex.
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
The timing of adding a nucleic acid probe to a sample containing a nucleic acid amplification product is not particularly limited. For example, it may be added to the reaction system of the amplification reaction before, during or after the nucleic acid amplification reaction. May be.
Especially, since an amplification reaction and a detection reaction described later can be performed continuously, it is preferable to add them before the amplification reaction. Thus, when the probe is added before the nucleic acid amplification reaction, for example, as described later, it is preferable to add a fluorescent dye or a phosphate group to the 3 ′ end.
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。 The probe may be added to a liquid sample containing a nucleic acid amplification product, or may be mixed with a nucleic acid amplification product in a solvent. The solvent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known solvents such as a buffer solution such as Tris-HCl, a solvent containing KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol and the like, and a PCR reaction solution.
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
Detection of Complex of Nucleic Acid Amplification Product and Probe In the step shown in (3) of the above method, the method for detecting the complex obtained is not particularly limited. For example, a method by melting curve analysis can be mentioned.
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
In the case of melting curve analysis, for example, the following is performed.
When a solution containing double-stranded DNA is heated, the absorbance at 260 nm increases. This is because hydrogen bonds between both strands in double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting). When all the double-stranded DNAs are dissociated into single-stranded DNA, the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of only double-stranded DNA), thereby melting. Can be determined to be completed.
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のメチシリン耐性遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。 In the present invention, the measurement of the signal fluctuation accompanying the temperature change for performing the melting curve analysis can be performed by measuring the absorbance at 260 nm based on the principle as described above, but the signal of the label added to the probe of the present invention is measured. It is preferable to measure. For this reason, it is preferable to use a labeled probe as a probe used in the method for detecting a methicillin resistance gene of the present invention.
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。 Examples of the labeled probe include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization. In the former probe, no signal is shown when a hybrid (double strand) is formed with the detection target sequence, and a signal is shown when the probe is released by heating. In the case of the latter probe, a signal is shown by forming a hybrid (double strand) with the sequence to be detected, and the signal decreases (disappears) when the probe is released by heating. Therefore, by detecting the signal from the label under signal-specific conditions (absorbance and the like), the progress of melting can be grasped in the same manner as the absorbance measurement at 260 nm.
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。 As a specific example of the labeled probe, for example, a probe that is labeled with a fluorescent dye, exhibits fluorescence alone, and fluorescence decreases (for example, quenches) by hybridization is preferable. Such a phenomenon is generally called a fluorescence quenching phenomenon. As a probe using this fluorescence quenching phenomenon, a probe generally called a guanine quenching probe is preferable. Such a probe is known as a so-called QProbe (registered trademark). A guanine quenching probe is, for example, a fluorescent dye designed so that the base at the 3 ′ end or 5 ′ end of an oligonucleotide becomes cytosine, and light emission becomes weaker when the base cytosine at the end approaches a complementary base guanine. It is a probe labeled at the end. In the probe of the present invention, for example, a fluorescent dye exhibiting a fluorescence quenching phenomenon may be bound to cytosine at the 3 ′ end of the oligonucleotide, or the 5 ′ end of the oligonucleotide is designed to be cytosine. It may be combined.
本発明のメチシリン耐性遺伝子の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。 In the probe used in the method for detecting a methicillin resistance gene of the present invention, for example, a phosphate group may be added to the 3 'end. As will be described later, a test nucleic acid (target nucleic acid) for detecting the presence or absence of a gene can be prepared by a nucleic acid amplification method such as PCR. In this case, the probe of the present invention is allowed to coexist in the reaction system of the nucleic acid amplification reaction. be able to. In such a case, if a phosphate group is added to the 3 'end of the probe, the probe itself can be sufficiently prevented from extending due to the nucleic acid amplification reaction. The same effect can be obtained by adding a labeling substance as described above to the 3 'end.
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。 Dissociation of the obtained PCR amplification product and hybridization between the single-stranded DNA obtained by the dissociation and the labeled probe can be performed, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。 The heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 98 ° C. The heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。 The dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be hybridized, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step. As temperature conditions, it is 35-50 degreeC, for example.
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。 The volume and concentration of each composition in the reaction system (reaction system) of the hybridization process are not particularly limited. As a specific example, in the reaction system, the concentration of DNA is, for example, 0.01-100 μmol / L, preferably 0.1-10 μmol / L, and the concentration of the labeled probe is, for example, relative to the DNA A range satisfying the addition ratio is preferable, for example, 0.01 to 100 μmol / L, and preferably 0.01 to 10 μmol / L.
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。 Then, the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybrid formed of the amplification product and the labeled probe is measured. Specifically, for example, the reaction solution (hybridized body of the single-stranded DNA and the labeled probe) is heated, and a change in signal value accompanying a temperature rise is measured. As described above, when a probe labeled with a terminal C base (guanine quenching probe) is used, fluorescence is reduced (or quenched) in a hybridized state with single-stranded DNA, and in a dissociated state, Fluoresce. Therefore, for example, the hybrid formed body in which the fluorescence is decreased (or quenched) may be gradually heated, and the increase in the fluorescence intensity accompanying the temperature increase may be measured.
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。 The temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited. For example, the start temperature is room temperature to 85 ° C, preferably 25 to 70 ° C, and the end temperature is 40 to 105 ° C, for example. is there. Moreover, the rate of temperature rise is not particularly limited, but is, for example, 0.05 to 20 ° C./second, and preferably 0.08 to 5 ° C./second.
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。 The presence / absence of the test nucleic acid can be determined, for example, by measuring signal fluctuations during hybridization. That is, when a hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop is measured.
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。 As a specific example, when a labeled probe (for example, a guanine quenching probe) that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, it emits fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated. However, when a hybrid is formed due to a decrease in temperature, the fluorescence is reduced (or quenched). Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease. On the other hand, when a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization, it does not emit fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated, but the hybrid is not released due to a decrease in temperature. Once formed, it will fluoresce. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。 In the present invention, in order to determine the genotype at the target base site, the signal variation may be analyzed and determined as a Tm (melting temperature) value.
メチシリン耐性遺伝子検出キット
本発明のメチシリン耐性遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記メチシリン耐性遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。該キットは、核酸プライマーセットを含む組成物と、ＤＮＡポリメラーゼ等を含む核酸増幅用試薬とは別々の容器に充填されていることが好ましい。
Methicillin Resistance Gene Detection Kit The methicillin resistance gene detection kit of the present invention includes the nucleic acid primer set and can be used in the methicillin resistance gene detection method. It is preferable that the kit further includes the nucleic acid probe and, in addition to that, a reagent necessary for a nucleic acid amplification reaction and / or a nucleic acid amplification product detection reaction as appropriate. In the kit, the composition containing the nucleic acid primer set and the nucleic acid amplification reagent containing DNA polymerase and the like are preferably packed in separate containers.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
〔実施例１：ＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのメチシリン耐性遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
ＭＲＳＡゲノムを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
[Example 1: Detection of methicillin resistance gene from DNA derived from MRSA]
(1) Preparation of sample MRSA genome was prepared with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) and used as a sample. Purified water was used as a negative control (NC).
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis The following reagents were added to the sample and the negative control, respectively, and a methicillin resistant gene was detected under the following conditions. GENECUBE (registered trademark) manufactured by Toyobo Co., Ltd. was used for nucleic acid amplification and melting curve analysis.
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号４）０．２５μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号７）０．０５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号９、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 ＭＲＳＡゲノム１００コピー相当または精製水（３μｌ）
精製水０．４μｌ
A solution containing the following reagents was prepared.
100 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 4) 0.25 μl
100 μM nucleic acid primer (SEQ ID NO: 7) 0.05 μl
0.3 μl of 10 μM nucleic acid probe (SEQ ID NO: 9, 3 ′ end labeled BODIPY-FL)
KOD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μl
PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μl
Sample MRSA genome equivalent to 100 copies or purified water (3 μl)
0.4 μl purified water
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
Nucleic acid amplification and melting curve analysis 94 ° C, 2 minutes (1 cycle or more)
97 ° C, 1 second 58 ° C, 3 seconds 63 ° C, 5 seconds (over 50 cycles)
94 ° C, 30 seconds, 39 ° C, 30 seconds, 39 ° C to 75 ° C (temperature rises at 0.09 ° C / second)
結果
図１は、前記核酸プライマーセットを用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光量の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。
メチシリン耐性遺伝子が存在する場合、核酸プライマーセットによってメチシリン耐性遺伝子の一部領域が核酸増幅され、続く工程で核酸増幅産物と核酸プローブとがハイブリダイズする。核酸プローブにはハイブリダイズすると消光する性質を持つ蛍光物質が標識されている。その後反応系の温度を上昇させると、ハイブリダイズしていた核酸プローブが核酸増幅産物から解離し発光するため、蛍光量が変化する。従って、蛍光量の変化が検出できればメチシリン耐性遺伝子の存在が確認できる。
図１より、ＭＲＳＡゲノムを試料として上記方法を実施したところ蛍光量の変化が観測され、メチシリン耐性遺伝子が検出された（図１ ＰＣ）。一方、水を試料として同様に実施した場合は遺伝子の検出は認められなかった（図１ ＮＣ）。以上から、本発明の検出方法がメチシリン耐性遺伝子の検出に有効であることが示された。
Results FIG. 1 shows nucleic acid amplification using the above-described nucleic acid primer set, and the change in the amount of fluorescence with the subsequent increase in temperature, the analysis result with the horizontal axis of the graph as the temperature and the vertical axis as the differential value of the fluorescence signal. FIG.
When a methicillin resistance gene is present, a partial region of the methicillin resistance gene is nucleic acid amplified by the nucleic acid primer set, and the nucleic acid amplification product and the nucleic acid probe are hybridized in the subsequent step. The nucleic acid probe is labeled with a fluorescent substance that has the property of quenching when hybridized. Thereafter, when the temperature of the reaction system is raised, the hybridized nucleic acid probe dissociates from the nucleic acid amplification product and emits light, so that the amount of fluorescence changes. Therefore, if a change in the amount of fluorescence can be detected, the presence of the methicillin resistance gene can be confirmed.
From FIG. 1, when the above method was carried out using the MRSA genome as a sample, a change in the amount of fluorescence was observed, and a methicillin resistance gene was detected (FIG. 1 PC). On the other hand, when water was used as a sample in the same manner, no gene was detected (FIG. 1 NC). From the above, it was shown that the detection method of the present invention is effective for detecting a methicillin resistance gene.
〔実施例２：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
[Example 2: Confirmation of storage stability of detection reagent using nucleic acid primer set of the present invention]
(1) Preparation of sample Same as Example 1.
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
試薬
以下の試薬（１）を調製した。
（１）ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号４）１２５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号７）２５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
Reagent The following reagent (1) was prepared.
(1) PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 150 μl, IC Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 50 μl, Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 4) 1250 pmol, Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 7 ) 250 pmol, nucleic acid probe (SEQ ID NO: 9) with 150 pmol added
測定
試薬（１）およびＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を７〜１０℃の条件で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。保存温度は常に一定ではなく上記範囲内で上下していた。
試薬（１） ４μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ ３μｌ
試料 ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
The measuring reagent (1) and KOD Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were stored at 7 to 10 ° C. for 3 months. After completion of storage for 3 months, a reaction solution having the following composition was prepared. The storage temperature was not always constant and was up and down within the above range.
Reagent (1) 4 μl
KOD Mix 3 μl
Sample MRSA genome equivalent to 200 copies or water
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
結果
図２は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図２ ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図２ ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、７〜１０℃で３ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。
Results FIG. 2 shows the results of this example. When the MRSA genome was used as a sample, a detection peak could be confirmed (FIG. 2 PC). On the other hand, when water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 2 NC). From the above, it was revealed that the detection reagent using the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe of the present invention maintained the reagent performance even when stored at 7 to 10 ° C. for 3 months.
〔実施例３：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認延長〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
[Example 3: Extended storage stability confirmation of detection reagent using nucleic acid primer set of the present invention]
(1) Preparation of sample Same as Example 1.
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
試薬
実施例２と同じ。
Same as reagent example 2.
測定
実施例２の試薬（１）を、実施例２と同条件でさらに３ヶ月間追加で保存し、合計６ヶ月間保存した。６ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。
試薬（１） ４μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ ３μｌ
試料 ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
The reagent (1) of Measurement Example 2 was further stored for 3 months under the same conditions as in Example 2, and stored for a total of 6 months. After storage for 6 months, a reaction solution having the following composition was prepared.
Reagent (1) 4 μl
KOD Mix 3 μl
Sample MRSA genome equivalent to 200 copies or water
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
結果
図３は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図３ ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図３ ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、７〜１０℃で６ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。
Results FIG. 3 shows the results of this example. When the MRSA genome was used as a sample, a detection peak could be confirmed (FIG. 3 PC). On the other hand, when water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 3 NC). From the above, it was revealed that the detection reagent using the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe of the present invention maintained the reagent performance even when stored at 7 to 10 ° C. for 6 months.
〔比較例１：異なる核酸プライマー、核酸プローブを用いた検出試薬の保存安定性確認〕（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
Comparative Example 1: Confirmation of Storage Stability of Detection Reagent Using Different Nucleic Acid Primers and Nucleic Acid Probes (1) Preparation of Sample Same as Example 2.
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 2.
試薬
以下の試薬（２）を調製した。
（２）ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号１１）１５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号１２）７５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
Reagent The following reagent (2) was prepared.
(2) PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 150 μl, IC Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 50 μl, Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 11) 150 pmol, Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 12) ) 750 pmol, nucleic acid probe (SEQ ID NO: 9) with 150 pmol added
測定
試薬（２）およびＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を７〜１０℃で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。
試薬（１） ４μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ ３μｌ
試料 ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
The measurement reagent (2) and KOD Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were stored at 7 to 10 ° C. for 3 months. After completion of storage for 3 months, a reaction solution having the following composition was prepared.
Reagent (1) 4 μl
KOD Mix 3 μl
Sample MRSA genome equivalent to 200 copies or water
結果
図４は本比較例の結果である。この例では、ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合に微弱な検出ピークしか確認できなかった（図４ ＰＣ）。また、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図４ ＮＣ）。以上から、比較例の核酸プライマーセットを用いた検出試薬は保存に問題があった。使用した試薬成分のうち前記実施例と本比較例とで異なるのは核酸プライマーセットのみである。従って、保存可能期間の差は核酸プライマーセットが異なることに由来すると考えられる。以上から、本発明の核酸プライマーセットはより保存に適している検出試薬を提供可能である。
Results FIG. 4 shows the results of this comparative example. In this example, when the MRSA genome was used as a sample, only a weak detection peak could be confirmed (FIG. 4 PC). When water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 4 NC). From the above, the detection reagent using the nucleic acid primer set of the comparative example had a problem in storage. Of the reagent components used, the only difference between the examples and the comparative example is the nucleic acid primer set. Therefore, it is considered that the difference in the storage period can be attributed to different nucleic acid primer sets. From the above, the nucleic acid primer set of the present invention can provide a detection reagent more suitable for storage.
〔実施例４：本発明核酸プライマーセットを用いた検出試薬の保存安定性確認（温度変更）〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
[Example 4: Confirmation of storage stability (temperature change) of detection reagent using nucleic acid primer set of the present invention]
(1) Preparation of sample Same as Example 1.
(2) Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
試薬
以下の試薬（１）を調製した。
（１）ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１５０μｌにＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）５０μｌ、核酸プライマー（配列番号４）１２５０ｐｍｏｌ、核酸プライマー（配列番号７）２５０ｐｍｏｌ、核酸プローブ（配列番号９）１５０ｐｍｏｌを添加したもの
Reagent The following reagent (1) was prepared.
(1) PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 150 μl, IC Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 50 μl, Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 4) 1250 pmol, Nucleic acid primer (SEQ ID NO: 7 ) 250 pmol, nucleic acid probe (SEQ ID NO: 9) with 150 pmol added
測定
試薬（１）およびＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）を２〜５℃の条件で３ヶ月間保管した。３ヶ月間の保管完了後に以下の組成の反応液を調製した。なお、保存温度は一定ではなく上記範囲内で前後していた。
試薬（１） ４μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ ３μｌ
試料 ＭＲＳＡゲノム２００コピー相当または水
The measuring reagent (1) and KOD Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were stored at 2 to 5 ° C. for 3 months. After completion of storage for 3 months, a reaction solution having the following composition was prepared. Note that the storage temperature was not constant and was within the above range.
Reagent (1) 4 μl
KOD Mix 3 μl
Sample MRSA genome equivalent to 200 copies or water
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
Nucleic acid amplification and melting curve analysis Same as Example 1.
結果
図５は本実施例の結果である。ＭＲＳＡゲノムを試料とした場合は検出ピークが確認できた（図５ ＰＣ）。一方、水を試料とした場合は、検出ピークは確認できなかった（図５ ＮＣ）。以上から、本発明の核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いた検出試薬は、実施例１〜３よりも低温である２〜５℃で３ヶ月間保存しても試薬性能は保たれていることが明らかになった。実施例１〜３および本実施例から、本発明の核酸プライマーセットを用いた組成物は、厳密な温度管理を必要とせず一般的な冷蔵条件で保存可能であることが示された。
Results FIG. 5 shows the results of this example. When the MRSA genome was used as a sample, a detection peak could be confirmed (FIG. 5 PC). On the other hand, when water was used as a sample, no detection peak could be confirmed (FIG. 5 NC). As described above, the detection reagent using the nucleic acid primer set and the nucleic acid probe of the present invention can maintain the reagent performance even when stored for 3 months at 2 to 5 ° C., which is lower than those of Examples 1 to 3. It was revealed. From Examples 1 to 3 and this example, it was shown that the composition using the nucleic acid primer set of the present invention can be stored under general refrigeration conditions without requiring strict temperature control.
本発明をメチシリン耐性遺伝子遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れた検出方法を提供できる。さらに、本発明の核酸プライマーセットを用いることで冷蔵で保存可能な検出試薬を提供できる。 By using the present invention for methicillin resistance gene genetic testing, a detection method excellent in both rapidity and accuracy can be provided. Furthermore, a detection reagent that can be stored refrigerated can be provided by using the nucleic acid primer set of the present invention.
Claims (8)
（Ａ）配列番号４で示される塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号７で示される塩基配列を有する核酸プライマー A nucleic acid primer set for detecting a methicillin resistant gene, comprising a forward primer represented by (A) below and a reverse primer represented by (B) below.
(A) a nucleic acid primer having a nucleotide sequence represented by nucleotide primer (B) SEQ ID NO: 7 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4
（１）請求項１または２に記載の核酸プライマーセットを含む組成物を含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程 A method for detecting a methicillin resistance gene in a sample, comprising the following steps (1) to (3).
(1) A step of amplifying a test nucleic acid by a reaction solution containing a composition comprising the nucleic acid primer set according to claim 1 or 2 (2) A nucleic acid amplification product obtained by step (1), and the nucleic acid amplification product A step of hybridizing a part of the nucleic acid probe with a nucleic acid probe capable of forming a complex to form a complex (3) a step of detecting the complex obtained in step (2)
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