JP6216917B2 - Human oncostatin M antibody and method of use - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト細胞上の膜受容体に結合するオンコスタチンMによって生成される生物学的活性を中和することができるヒト抗体及び使用に関する。 The present invention relates to human antibodies and uses that can neutralize the biological activity produced by Oncostatin M that binds to membrane receptors on human cells.
オンコスタチンM(OSM)は、単球、マクロファージ、好中球、及び活性化Tリンパ球によって分泌されるサイトカインのIL−6ファミリーの28kDa多機能メンバーである(Tanaka & Miyajima,Rev Physiol Biochem Pharmacol 149:39〜53,2003)。分泌OSMのカルボキシ末端付近のタンパク質分解開裂は、2つのN−結合グリコシル化部位を有する209のアミノ酸長である完全な活性形態のOSMを生じる。OSMは、共通の受容体サブユニットであるgp130タンパク質を共有する、(IL−6、IL−11、白血病阻害因子(LIF)、カルジオトロフィン−1、毛様体神経栄養因子(CNTF)、及びカルジオトロフィン様サイトカイン(CLC))を含むサイトカインのIL−6ファミリーに属する。ヒトにおいて、OSMは、gp130及びLIFRαサブユニット、又はgp130及びOSMRβサブユニットからなる受容体ヘテロダイマーを通してシグナル伝達する。IL−6ファミリーの他のサイトカインとは対照的に、OSMは、直接かつ任意の更なる膜結合共受容体の不在下でgp130に結合する(Gearing et al.,Science 255:1434〜1437,1992)。OSMがgp130に結合した後、OSMRβ又はLIFRαは、高親和性シグナル伝達複合体を形成するように動員される(Mosley et al.,J Biol Chem 271:32635〜32643,1996)。いずれかの受容体の活性化は、JAK/STAT経路を介したシグナル伝達をもたらす(Auguste et al.,J Biol Chem 272:15760〜15764,1997)。 Oncostatin M (OSM) is a 28 kDa multifunctional member of the IL-6 family of cytokines secreted by monocytes, macrophages, neutrophils, and activated T lymphocytes (Tanaka & Miyajima, Rev Physiol Biochem Pharmacol 149). : 39-53, 2003). Proteolytic cleavage near the carboxy terminus of secreted OSM results in a fully active form of OSM that is 209 amino acids long with two N-linked glycosylation sites. OSM shares a common receptor subunit, gp130 protein, (IL-6, IL-11, leukemia inhibitory factor (LIF), cardiotrophin-1, ciliary neurotrophic factor (CNTF), And the cardiotrophin-like cytokine (CLC)) belongs to the IL-6 family of cytokines. In humans, OSM signals through a receptor heterodimer consisting of gp130 and LIFRα subunits, or gp130 and OSMRβ subunits. In contrast to other cytokines of the IL-6 family, OSM binds to gp130 directly and in the absence of any additional membrane-bound co-receptors (Gearing et al., Science 255: 1434-1437, 1992). ). After OSM binds to gp130, OSMRβ or LIFRα is recruited to form a high affinity signaling complex (Mosley et al., J Biol Chem 271: 32635-32643, 1996). Activation of either receptor results in signaling through the JAK / STAT pathway (Auguste et al., J Biol Chem 272: 15760-15764, 1997).
OSMは、本質的に、免疫系起源の細胞によって生成され、そのシグナル伝達受容体の広域な分布のため、細胞成長の調節、神経発達、及び細胞外マトリックス組成物の調節を含む、様々な生物学的活性に関連している。 OSM is essentially produced by cells of immune system origin and because of its broad distribution of signaling receptors, includes various organisms, including cell growth regulation, neurodevelopment, and regulation of extracellular matrix composition. Related to pharmacological activity.
その名前が示唆するように、オンコスタチンMは、発癌性過程に関連する。しかしながら、OSMは、肺線維症等の有害な状態をもたらす炎症性及び肥大性経路の初期事象にも関与する。よって、シグナル遮断抗体がgp130発現細胞に対して臨床的に有応な細胞毒性、細胞増殖抑制、又は免疫調節作用を及ぼし得る受容体シグナル伝達(gp130シグナル伝達)事象を遮断することができるヒトOSMに特異的なヒト抗体を提供する必要がある。 As its name suggests, Oncostatin M is associated with an oncogenic process. However, OSM is also involved in early events of the inflammatory and hypertrophic pathways that lead to deleterious conditions such as pulmonary fibrosis. Thus, a human OSM that can block receptor signaling (gp130 signaling) events that a signal blocking antibody can exert clinically responsive cytotoxicity, cytostatic, or immunomodulatory effects on gp130-expressing cells. There is a need to provide specific human antibodies.
本発明は、OSM及びOSM結合受容体の、宿主対象の細胞、組織、又は臓器に対する相互作用に関連する1つ以上の生物活性に関連する活性を遮断することができるOSM結合モノクローナル抗体を提供する。宿主細胞において発現するための核酸によってコードされ得る例示的なOSM結合モノクローナル抗体のアミノ酸配列が提供される。本発明のOSMモノクローナル抗体のうちの1つ以上は、本発明の抗体によって結合されるとき、シグナル伝達複合体であるgp130及びLIFRα又はgp130及びOSMRβの受容体構成要素との相互作用を防止し、それによって、リガンドライゲーション誘導シグナル伝達及び下流生物学的活性を防止するOSMの表面上のエピトープを画定する。 The present invention provides OSM-binding monoclonal antibodies that can block the activity of one or more biological activities associated with the interaction of OSM and OSM-coupled receptors with cells, tissues, or organs of a host subject. . An amino acid sequence of an exemplary OSM binding monoclonal antibody that can be encoded by a nucleic acid for expression in a host cell is provided. One or more of the OSM monoclonal antibodies of the present invention, when bound by the antibodies of the present invention, prevent interaction with the signal transduction complex gp130 and LIFRα or gp130 and OSMRβ receptor components; Thereby defining epitopes on the surface of OSM that prevent ligand ligation-induced signaling and downstream biological activity.
本発明の一態様は、配列番号13〜18に単独で記載されるアミノ酸配列を含む、若しくは配列番号1〜3に記載されるFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3の特定の位置での抗原結合ドメイン、配列番号27〜29及び47によって表されるCDR3を含む、又は配列番号23〜26に単独で記載されるアミノ酸配列を含む、若しくは配列番号5〜8及びそれらの変異体に記載される特定の位置で抗原結合ドメイン、及び配列番号19〜22によって表されるCDR3を含む、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有するヒトOSMタンパク質と反応する単離された抗体である。特定の実施形態では、ヒトOSM結合抗体は、配列番号49〜55から選択される可変ドメインを含む。 One embodiment of the present invention includes the amino acid sequence described alone in SEQ ID NOS: 13 to 18, or antigen binding at a specific position of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 described in SEQ ID NOs: 1 to 3 A domain, comprising CDR3 represented by SEQ ID NO: 27-29 and 47, or comprising an amino acid sequence described alone in SEQ ID NO: 23-26, or specified in SEQ ID NO: 5-8 and variants thereof An isolated antibody that reacts with a human OSM protein having the antigen-binding ability of a monoclonal antibody comprising an antigen-binding domain at the position and CDR3 represented by SEQ ID NOs: 19-22. In certain embodiments, the human OSM binding antibody comprises a variable domain selected from SEQ ID NOs: 49-55.
本発明の別の実施形態では、完全長IgG構造として使用されるモノクローナル抗体結合ドメインは、ヒトIgG定常ドメイン又はその特定の変異体に由来する定常ドメインを有し、OSMの、OSM受容体構成要素を提示する細胞への結合を防止するために、薬学的調製物において治療用分子として使用される。別の実施形態では、結合ドメインは、OSMの、OSM受容体構成要素を提示する細胞への結合を防止することができる治療用分子として使用するための抗体断片として構成される。本発明の一態様では、これらに限定されないが、13〜28及び30〜46及び配列番号29及び47によって提供される変異体等の、本発明のOSM結合ドメインのうちの1つ以上を含む、薬学的に許容される製剤、送達系、又はオンコスタチンM関連状態を治療するキット若しくは方法を提供する。 In another embodiment of the invention, the monoclonal antibody binding domain used as the full-length IgG structure has a constant domain derived from a human IgG constant domain or a specific variant thereof, and is an OSM receptor component of OSM. Is used as a therapeutic molecule in pharmaceutical preparations to prevent binding to cells presenting. In another embodiment, the binding domain is configured as an antibody fragment for use as a therapeutic molecule that can prevent binding of OSM to cells presenting OSM receptor components. In one aspect of the invention, including but not limited to one or more of the OSM binding domains of the invention, such as, but not limited to, variants provided by 13-28 and 30-46 and SEQ ID NOs: 29 and 47, Pharmaceutically acceptable formulations, delivery systems, or kits or methods for treating oncostatin M related conditions are provided.
本明細書に引用する、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない刊行物はすべて、それらがあたかも本明細書に完全に記載されているのとまったく同様に本願に援用するものである。 All publications cited herein, including but not limited to patents and patent applications, are hereby incorporated by reference in their entirety as if fully set forth herein.
略語
BSA=ウシ血清アルブミン;CDR=相補性決定領域;Cyno=カニクイザル(Macaca fascicularis);DN=糖尿性腎障害;ECD=細胞外ドメイン;FR=フレームワーク;H=重鎖;IPF=間質性肺関節炎;L=軽鎖;Ig=免疫グロブリン;Mab=モノクローナル抗体;OSM=オンコスタチンM;OA=変形性関節症;PBS=リン酸緩衝生理食塩水;RA=関節リウマチ;VL=可変軽鎖;VH=可変重鎖。
Abbreviations BSA = bovine serum albumin; CDR = complementarity determining region; Cyno = cynomolgus monkey (Macaca fascicularis); DN = diabetic nephropathy; ECD = extracellular domain; FR = framework; H = heavy chain; IPF = interstitial Pulmonary arthritis; L = light chain; Ig = immunoglobulin; Mab = monoclonal antibody; OSM = oncostatin M; OA = osteoarthritis; PBS = phosphate buffered saline; RA = rheumatoid arthritis; VH = variable heavy chain.
定義
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に組み込むことのできる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)若しくはそのリガンド結合部、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク(FR)領域若しくはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などが挙げられるが、これらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を更に含むことを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、又は抗体の構造及び/若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖並びに単一ドメイン抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、(i)Fab断片、VL、VH、CL及びCH、ドメインからなる一価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VH及びCH、ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単腕(single arm)のVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al.,(1989)Nature 341:544〜546);並びに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは別個の遺伝子によりコードされているが、これらのドメインは組み換え方法を使用して合成リンカーにより連結することができ、合成リンカーは、VL及びVH領域を対にして、一価分子を形成する単一タンパク質鎖(単鎖Fv(scFv)として知られる、例えば、Birdら(1988)Science 242:423〜426、及びHustonら(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879〜5883を参照のこと)として作製することを可能にする。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、scFvコンストラクトのライブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のDNAにスプライスしてもよい。そのようなライブラリの1つの例は、「HuCAL:ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」(Knappik,A.et al.J Mol Biol(2000)296(1):57〜86)である。
Definitions As used herein, “antibody” includes whole antibodies and any antigen-binding fragment or short chain thereof. Thus, an antibody can be incorporated into an antibody of the invention with at least one complementarity determining region (CDR) of the heavy chain or light chain or its ligand binding portion, heavy chain or light chain variable region, heavy chain or Any protein or peptide-containing molecule, including but not limited to a light chain constant region, a framework (FR) region or any portion thereof, or at least a portion of an immunoglobulin molecule, including but not limited to Including. The term “antibody” is intended to further include antibodies, digested fragments, specific portions and variants thereof, including antibody mimetics, or portions of antibodies that mimic antibody structure and / or function or Single chain antibodies and fragments thereof are included, including specific fragments or portions thereof. Functional fragments include antigen binding fragments against a preselected target. Examples of binding fragments encompassed by the term “antigen-binding portion” of an antibody are: (i) a monovalent fragment consisting of a Fab fragment, VL, VH, CL and CH, domain; (ii) an F (ab ′) 2 fragment A bivalent fragment comprising two Fab fragments joined by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of VH and CH, domains; (iv) a VL and VH domain of a single arm of an antibody (V) a dAb fragment consisting of a VH domain (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR). Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by separate genes, these domains can be linked by a synthetic linker using recombinant methods, the synthetic linker comprising the VL and VH regions. Paired to form a single protein chain (known as single chain Fv (scFv), eg, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426, and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 5879-5883). Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion” of an antibody. These antibody fragments are obtained using conventional techniques known to those skilled in the art, and these fragments are screened for utility in the same manner as intact antibodies. Conversely, after screening for antigen-binding ability using a library of scFv constructs, conventional techniques may be used to splice to other DNA encoding human germline gene sequences. One example of such a library is the “HuCAL: Human Combinatorial Antibody Library” (Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000) 296 (1): 57-86).
用語「CDR」は、抗原結合に関与する、又はその原因である、抗体の相補性決定領域又は高頻度可変領域アミノ酸残基を指す。抗体のヒトIgGサブタイプの高頻度可変領域、即ちCDRは、Kabat et al.(1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)に記載されているように、軽鎖可変部ドメイン内の残基24〜34(L−CDR1)、50〜56(L−CDR2)、及び89〜97(L−CDR3)と、重鎖可変部ドメイン内の31〜35(H−CDR1)、50〜65(H−CDR2)、及び95〜102(H−CDR3)とからのアミノ酸残基、並びに/又は高頻度可変ループ(即ち、(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901〜917(1987))により記載されているように、軽鎖可変部ドメイン内の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、及び91〜96(L3)と、重鎖可変部ドメイン内の26〜32(H1)、53〜55(H2)又は現在のH2 Chothia画定の52〜57、及び96〜101(H3))からのそれらの残基を含む。Chothia及びLeskは、構造的に保存されたHVを「正準構造」と呼ぶ。フレームワーク又はFR1−4残基は、高頻度可変領域以外の及び高頻度可変領域を囲む、それらの可変ドメイン残基である。Chothia及びLeskの付番システムは、小文字表記、例えば30a、30b、30c等で表される特定の残基の拡張を示すことにより、ループ内の残基の数の相違を考慮する。最近では、共通の付番システムであるinternational ImMunoGeneTics information system(登録商標)(IMGT)(LaFranc,et al.2005.Nucl Acids Res.33:D593〜D597)が開発され、広く採用されている。 The term “CDR” refers to the complementarity determining region or hypervariable region amino acid residue of an antibody involved in or responsible for antigen binding. The hypervariable region, or CDR, of the human IgG subtype of the antibody is described in Kabat et al. As described in (1991 Sequences of Proteins of Immunological Intersect, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), The light chain variable region 34 in the light chain R-part 34 ), 50-56 (L-CDR2), and 89-97 (L-CDR3), and 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2), and 95-95 within the heavy chain variable domain. 102 (H-CDR3) and / or hypervariable loops (ie (Chotia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Thus, residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), and 91-96 (L3) in the light chain variable region and 26-32 (H1), 53-33 in the heavy chain variable domain. 55 (H2) or present H2 Chothia defined 52-57 and 96-101 (H3)). Chothia and Lesk refer to structurally conserved HVs as “canonical structures”. Framework or FR1-4 residues are those variable domain residues other than and surrounding the hypervariable region. The Chothia and Lesk numbering system takes into account differences in the number of residues in a loop by showing the expansion of specific residues represented in lowercase notation, eg, 30a, 30b, 30c, etc. Recently, an international ImmunGeneTics information system (registered trademark) (IMGT) (LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33: D593-D597), which is a common numbering system, has been developed and widely adopted.
本明細書において、CDRは、アミノ酸配列と、連番による軽鎖又は重鎖内の位置との両方の観点において意味される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のCDRの「位置」が、種間で保存され、ループと呼ばれる構造に存在するとき、構造上の特徴により可変ドメイン配列を整合する付番システムを使用することにより、CDR及びフレームワーク残基は、容易に同定される。この情報は、1つの種の免疫グロブリンから、典型的にヒト抗体からのアクセプターフレームワークの中へのCDR残基のグラフト化及び置換に使用される。 As used herein, CDR is meant both in terms of amino acid sequence and position within the light or heavy chain by sequential number. By using a numbering system that aligns variable domain sequences by structural features when the CDR "position" within the structure of an immunoglobulin variable domain is conserved between species and is present in a structure called a loop, CDRs and framework residues are easily identified. This information is used to graft and replace CDR residues from one species of immunoglobulin, typically into an acceptor framework from a human antibody.
用語「成熟」は、ポリペプチドの特性を変更する目的のために、抗体の可変領域における指向された変化に適用される。当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されるように、V領域配列における多くの位置は、抗原の認識に影響を及ぼすことができる。本来、抗体は、変異したものである体細胞の進行性過程により高親和性及び特異性を獲得する。この過程は、親和性、又は可溶性若しくは耐酸化性等の生物物理学的パラメータを強化する一方で、それらが種を反映するように(この場合ヒト抗体)、各抗体鎖の配列一体性を維持しながら、並行選択及び標的変異を可能にするようにインビトロで模倣され得る。指向された変化又は「変異」を行う過程は、典型的に、コード配列のレベルで実施され、強化された特性の選択についてのサブライブラリを作成することにより達成され得る。 The term “maturity” applies to directed changes in the variable region of an antibody for the purpose of altering the properties of the polypeptide. As known in the art and described herein, many positions in the V region sequence can affect antigen recognition. Inherently, antibodies acquire high affinity and specificity through the progressive process of somatic cells that are mutated. This process enhances affinity or biophysical parameters such as solubility or oxidation resistance while maintaining sequence integrity of each antibody chain so that they reflect species (in this case human antibodies) However, it can be mimicked in vitro to allow parallel selection and target mutation. The process of making directed changes or “mutations” is typically performed at the level of the coding sequence and can be accomplished by creating sub-libraries for enhanced property selection.
本明細書で使用される「OSM」は、OSMポリペプチドをコードするコード配列を含む、オンコスタチンMポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。ヒトOSMは、ヒトosm遺伝子(遺伝子5008)の生成物である。 As used herein, “OSM” refers to an oncostatin M polypeptide or polynucleotide comprising a coding sequence that encodes an OSM polypeptide. Human OSM is the product of the human osm gene (gene 5008).
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖等の、化学的に活性な表面分子の分類からなり、通常、特異的な三次元構造特性並びに特異的な電荷特性を有する。構造的及び非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するという点で区別される。 The term “epitope” means a protein determinant capable of specific binding to an antibody. Epitopes usually consist of a class of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and usually have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Structural and nonstructural epitopes are distinguished in that binding to the former but not the latter is lost in the presence of denaturing solvents.
本明細書で使用されるとき、KDは、解離定数、詳細には既定の抗原についての抗体の解離定数KDを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は、既定の抗原について、有するKDが10-8M以下、より好ましくは10-9M以下、更に好ましくは10-10M以下である。KDの逆数は、KA、会合定数である。本明細書で使用されるとき、用語「kdis」又は「k2」又は「kd」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すよう意図されている。「KD」は、解離速度(k2)(「オフ速度(koff」)とも呼ばれる)と結合速度(k1)(又は「オン速度(kon)」)との比である。よってKDは、k2/k1又はkoff/konに等しく、モル濃度(M)として表現される。ここで、KDが小さくなるほど、結合は強くなる。よって、KDが10-6M(又は1マイクロM)とは、10-9M(又は1nM)に比べ、弱い結合を表わす。 As used herein, K D is the dissociation constant, in particular to refer to the dissociation constant, K D, the antibody for the default antigen, is a measure of the affinity of the antibody for a specific target. High affinity antibodies, the default antigen, K D with the 10 -8 M or less, more preferably 10 -9 M or less, still more preferably not more than 10 -10 M. The reciprocal of K D is K A , the association constant. As used herein, the term “k dis ” or “k 2 ” or “k d ” is intended to refer to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction. “K D ” is the ratio of the dissociation rate (k 2 ) (also referred to as “off rate (k off ))) to the binding rate (k 1 ) (or“ on rate (k on ) ”). Thus, K D is equal to k 2 / k 1 or k off / k on and is expressed as molar concentration (M). Here, as the K D is small, the coupling becomes stronger. Therefore, a K D of 10 −6 M (or 1 microM) represents a weaker bond than 10 −9 M (or 1 nM).
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。この用語はまた、「組み換え抗体」及び「組み換えモノクローナル抗体」も含み、(a)動物、又は抗体分泌動物細胞と融合パートナーとの融合により調製されたハイブリドーマから単離された抗体、(b)抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、(c)組み換えの、ヒト又は他の種のコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びに(d)免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライスすることを含む任意の他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体、などの全ての抗体は、組み換え手段により調製、発現、作製又は単離される。本明細書で使用されるとき、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に有さない抗体を指すことが意図される。しかしながら、ヒトOSMのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する、単離された抗体は、他の関連した抗原、例えば他の種(例えば、OSM種ホモログ)由来の抗原に対して交差反応性を有する場合がある。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び/又は化学物質を実質的に含まない場合もある。本発明の一実施形態では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確に規定された組成物中で混ぜ合わせる。 The term “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” as used herein refers to the preparation of antibody molecules of single molecular composition. A monoclonal antibody composition displays a single binding specificity and affinity for a particular epitope. The term also includes “recombinant antibodies” and “recombinant monoclonal antibodies”, (a) antibodies isolated from animals or hybridomas prepared by fusion of antibody-secreting animal cells with a fusion partner, (b) antibodies (C) antibodies isolated from recombinant human or other species combinatorial antibody libraries, and (d) immunity All antibodies, such as antibodies prepared, expressed, produced or isolated by any other means, including splicing globulin gene sequences to other DNA sequences, are prepared, expressed, produced or isolated by recombinant means. It is. As used herein, an “isolated antibody” is intended to refer to an antibody that is substantially free of other antibodies with different antigen specificities. However, an isolated antibody that specifically binds to an epitope, isoform, or variant of human OSM is against other related antigens, eg, antigens from other species (eg, OSM species homologs). May have cross-reactivity. In addition, an isolated antibody may be substantially free of other cellular material and / or chemicals. In one embodiment of the invention, combinations of “isolated” monoclonal antibodies with different specificities are combined in a well-defined composition.
本明細書で使用されるとき、「特異的な結合」、「免疫特異的な結合」及び「免疫特異的に結合する」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。通常、抗体の結合における解離定数(KD)は10-7M以下であり、抗体が特定の抗原に結合する際のKDは、特定の抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン、又は他の任意の特定のポリペプチド)に結合する際のKDと比較して1/2以下である。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。本明細書で使用されるとき、「高度に特異的な」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対的なKDが、他のリガンドに対する抗体の結合に関するKDの少なくとも10倍小さいことを意味する。 As used herein, “specific binding”, “immunospecific binding” and “immunospecific binding” refer to an antibody that binds to a predetermined antigen. Usually, the dissociation constant for binding of the antibody (K D) is less than 10 -7 M, K D when the antibody binds to a particular antigen, a non-specific antigen other than the specific antigen (e.g., BSA, casein , or 1/2 or less as compared to the K D in coupling to other any particular polypeptide of). The expressions “an antibody recognizing an antigen” and “an antibody specific for an antigen” are used interchangeably herein with the term “an antibody that binds specifically to an antigen”. As used herein, "highly specific" binding that is relative K D of an antibody to a particular target epitope, at least 10 times a K D for binding of antibodies small to other ligands means.
本明細書で使用されるとき、「タイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、IgA、IgE、IgM又はIgG)を指す。幾つかの抗体クラスは、同様に重鎖定常領域によりコードされるサブクラス又は「アイソタイプ」(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)を更に包含する。抗体は、抗体の生物学的機能を更に強化する定常領域ドメイン内の特定の残基でタンパク質に結合されるオリゴ糖によって更に修飾され得る。例えば、ヒト抗体アイソタイプにおいて、IgG1、IgG3、及びわずかながらIgG2は、マウスIgG2a抗体と同様、エフェクター機能を提示する。 As used herein, “type” refers to the antibody class (eg, IgA, IgE, IgM or IgG) encoded by the heavy chain constant region genes. Some antibody classes further include subclasses or “isotypes” (eg, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) that are also encoded by heavy chain constant regions. An antibody can be further modified by oligosaccharides attached to the protein at specific residues in the constant region domain that further enhance the biological function of the antibody. For example, in human antibody isotypes, IgG1, IgG3, and slightly IgG2 present effector functions as do mouse IgG2a antibodies.
「エフェクター」機能又は「エフェクターポジティブ(effector positive)」は、抗体が抗原特異的結合ドメインから区別されるドメインを含み、ドメインは、受容体、又は補体などの他の血液成分と相互作用して、例えばマクロファージの動員、及び抗体の抗原結合ドメインに結合された細胞の破壊をもたらす事象を引き起こすことができる。抗体は、エフェクター分子の結合により仲介される数種のエフェクター機能を有する。例えば、抗体に対する補体のC1成分の結合は、補体系を活性化させる。補体の活性化は、オプソニン作用と、細胞の病原体の溶解に重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、また自己免疫過敏症にも関与し得る。更に、抗体は、Fc領域を介して細胞に結合し、抗体Fc領域上のFc受容体部位が細胞上のFc受容体(FcR)に結合する。IgG(γ受容体)、IgE(η受容体)、IgA(α受容体)及びIgM(μ受容体)を含む、抗体の異なるクラスに特異的な多数のFc受容体が存在する。細胞表面上のFc受容体に対する抗体の結合は、多数の重要で多様な生物学的応答を誘発し、生物学的応答には、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体の排除、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解(抗体依存性細胞介在性細胞傷害、又はADCCと称される)、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、並びに免疫グロブリン産生の制御が含まれる。 “Effector” function or “effector positive” includes a domain in which an antibody is distinguished from an antigen-specific binding domain, which interacts with other blood components such as receptors or complement. For example, it can trigger events that result in the recruitment of macrophages and the destruction of cells bound to the antigen binding domain of an antibody. Antibodies have several effector functions mediated by the binding of effector molecules. For example, binding of the C1 component of complement to an antibody activates the complement system. Complement activation is important for opsonization and lysis of cellular pathogens. Complement activation stimulates an inflammatory response and may also be involved in autoimmune hypersensitivity. Furthermore, the antibody binds to the cell via the Fc region, and the Fc receptor site on the antibody Fc region binds to the Fc receptor (FcR) on the cell. There are a number of Fc receptors specific for different classes of antibodies, including IgG (γ receptor), IgE (η receptor), IgA (α receptor) and IgM (μ receptor). Antibody binding to Fc receptors on the cell surface elicits a number of important and diverse biological responses, including phagocytosis and destruction of antibody-coated particles, elimination of immune complexes, killer cells Lysis of antibody-coated target cells by (referred to as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, or ADCC), release of inflammatory mediators, passage through the placenta, and control of immunoglobulin production.
用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドを形成するためにペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基を含む分子を意味する。アミノ酸が50個未満の低分子ポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれることもある。ポリペプチドは「タンパク質」と呼ばれることもある。 The term “polypeptide” means a molecule comprising amino acid residues joined by peptide bonds to form a polypeptide. A small polypeptide of less than 50 amino acids is sometimes referred to as a “peptide”. Polypeptides are sometimes referred to as “proteins”.
概論
本発明は、OSMタンパク質及び開裂生成物を結合し、それらの生物学的活性を中和することができる単離されたMabを提供する。特に、本発明のOSM結合mAbは、gp130に対するOSM結合を遮断する、又はOSM結合gp130によるLIFRa又はOSMRbの動員を防止することができる。いずれの場合においても、本発明のOSM mAbは、OSM誘導gp130受容体シグナル伝達を遮断することができる。
Overview The present invention provides isolated Mabs that can bind OSM proteins and cleavage products and neutralize their biological activity. In particular, the OSM binding mAb of the present invention can block OSM binding to gp130 or prevent mobilization of LIFRa or OSMRb by OSM binding gp130. In either case, the OSM mAb of the present invention can block OSM induced gp130 receptor signaling.
STAT3のリン酸化反応は、様々な病理学的状況において、線維芽細胞によるコラーゲンの過剰産生をもたらすことが報告されてきた(Lim et al.Oncogene 23(39):5416〜25,2006、Huang et al.J Cell Biochem 81(1):102〜13,2001)。これらの特性は、RA、OA、並びに特発性肺線維症(IPF)及び糖尿性腎障害(DN)等の線維性適応症に対するこれらの抗体の治療的価値の可能性を示す。 STAT3 phosphorylation has been reported to result in overproduction of collagen by fibroblasts in various pathological situations (Lim et al. Oncogene 23 (39): 5416-25, 2006, Huang et al. al. J Cell Biochem 81 (1): 102-13, 2001). These properties indicate the potential therapeutic value of these antibodies for fibrotic indications such as RA, OA, and idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) and diabetic nephropathy (DN).
ヒトOSM遺伝子生成物であるOSM(NCBI受託番号NP_065391)は、長さが25アミノ酸のシグナルペプチド及び残基234と235との間にタンパク質分解性開裂部位を有する、長さが252アミノ酸のプレプロポリペプチド(配列番号11)である。これは、残基31から152と、及び74から192との間に2つの内部ジスルフィドを形成する5つのシステイン残基を有する分泌タンパク質である(Kallestad JC,et al.J Biol Chem.1991 May 15;266(14):8940〜5)。残基100及び217に2つの潜在的なN−結合グリコシル化部位が存在し、真核生物細胞内で生成されるとき、タンパク質はグリコシル化される。ヒトOSMは、残基105に遊離スルフヒドリルを有する。
The human OSM gene product, OSM (NCBI accession number NP — 065391), is a 252 amino acid long prepropoly having a 25 amino acid signal peptide and a proteolytic cleavage site between residues 234 and 235. It is a peptide (SEQ ID NO: 11). This is a secreted protein with five cysteine residues that form two internal disulfides between residues 31-152 and 74-192 (Kallestad JC, et al. J Biol Chem. 1991 May 15 266 (14): 8940-5). When there are two potential N-linked glycosylation sites at
カニクイザルOSMタンパク質の配列は、公的なドメインで入手することができなかったが、注釈ゲノム配列(NW_001095169)に由来する1867bp mRNA(NCBI番号:XM_001110148)について自動計算により生成された記録が存在した。カニクイザルOSM配列を得るために、RNAがカニクイザルPBMCから単離され、次に、遺伝子がRT−PCRによってこのcDNAから増幅され、配列決定された。クローン化された配列の推定翻訳(配列番号12)は、本出願人による同時係属中の出願(米国第12/648430号)に開示されるように、推定カニクイザル(Rhesus)配列と99.6%同一であり、ヒトOSMタンパク質配列と92%同一であり、マウスOSMタンパク質配列と41%同一であることが分かった。 The sequence of cynomolgus OSM protein was not available in the public domain, but there was a record generated by automatic calculation for 1867 bp mRNA (NCBI number: XM_001110148) derived from the annotation genome sequence (NW_001095169). To obtain the cynomolgus OSM sequence, RNA was isolated from cynomolgus monkey PBMC, and then the gene was amplified from this cDNA by RT-PCR and sequenced. A putative translation of the cloned sequence (SEQ ID NO: 12) is 99.6% of the putative cynomolgus monkey (Rhesus) sequence and 99.6% as disclosed in co-pending application (US 12/648430) by the applicant. It was found to be identical, 92% identical to the human OSM protein sequence and 41% identical to the mouse OSM protein sequence.
したがって、本発明は、OSM結合gp130シグナル伝達に起因する下流生物学的活性を阻害することができるヒト由来OSM結合Mabの同定を対象とし、Mabは、
OSMの存在下で細胞の増殖を回復させる、組織外植片における関節内(関節部)マトリックスのOSM誘発軟骨細胞分解を阻害する、
ヒト肺線維芽細胞におけるOSM依存STAT3リン酸化反応を効率的に中和する、及びOSM誘発サイトカイン放出を防止する能力を示す。
Thus, the present invention is directed to the identification of human-derived OSM binding Mabs that can inhibit downstream biological activity resulting from OSM binding gp130 signaling,
Inhibits OSM-induced chondrocyte degradation of intra-articular (joint) matrix in tissue explants, restoring cell proliferation in the presence of OSM;
2 shows the ability to efficiently neutralize OSM-dependent STAT3 phosphorylation in human lung fibroblasts and prevent OSM-induced cytokine release.
1.本発明の抗体の組成物
本発明のOSM中和抗体は、インビトロ、原位置、及び/又はインビボで少なくとも1つのOSM活性又はOSM受容体結合を阻害する、遮断する、又はそれに干渉し、OSM活性又はリガンド結合を促進、刺激、誘発、又は作動させず、そしてまた抗体結合がOSM受容体のOSM誘導ライゲーションの下流作用、特に、宿主細胞のシグナル伝達等の、OSMとのgp130相互作用も模倣しない抗体である。好適なOSM中和抗体、特定部分、又は変異体は、任意に、これらに限定されないが、RNA、DNA、又はタンパク質合成、タンパク質放出、細胞活性化、増殖又は分化、抗体分泌、OSM受容体シグナル伝達、OSM開裂、OSM結合、OSM又はgp130の誘発、合成、又は分泌等の、少なくとも1つのOSM活性又は機能に影響を及ぼすこともできる。
1. Compositions of Antibodies of the Invention An OSM neutralizing antibody of the invention inhibits, blocks or interferes with at least one OSM activity or OSM receptor binding in vitro, in situ, and / or in vivo. Or does not promote, stimulate, induce or actuate ligand binding, and antibody binding also does not mimic gp130 interactions with OSM, such as downstream effects of OSM-induced ligation of OSM receptors, particularly host cell signaling It is an antibody. Suitable OSM neutralizing antibodies, specific portions, or variants are optionally, but not limited to, RNA, DNA, or protein synthesis, protein release, cell activation, proliferation or differentiation, antibody secretion, OSM receptor signal It may also affect at least one OSM activity or function, such as transmission, OSM cleavage, OSM binding, OSM or gp130 induction, synthesis, or secretion.
本発明は、OSM結合又はOSMによるLIFR動員後、gp130シグナル伝達を阻害することができる抗ヒトOSMモノクローナル抗体の発見に基づく。pIXコートタンパク質に結合されるフィラメント状のファージ粒子上に提示されるFabライブラリの形態の抗体結合ドメイン(WO第29085462A1号を参照し、また以下に更に記載される)は、OSMを結合する能力に対して選択された。gp130を使用した競合アッセイは、OSMに結合されるとき、OSMがgp130に結合するのを防止した、これらのFabを区別するために使用された。別の方法としては、Fabは、OSMに結合されるとき、gp130結合に対するLIFR動員を防止することができた。細胞に基づく(A375、ヒトメラノーマ細胞)アッセイは、OSM発現宿主細胞のgp130媒介pSTAT3活性化を阻害することができる幾つかの候補抗体を同定するために使用された。 The present invention is based on the discovery of anti-human OSM monoclonal antibodies that can inhibit gp130 signaling after OSM binding or LIFR mobilization by OSM. Antibody binding domains in the form of Fab libraries displayed on filamentous phage particles that are bound to pIX coat proteins (see WO 290885462A1 and further described below) are capable of binding OSM. Selected against. A competition assay using gp130 was used to distinguish these Fabs that, when bound to OSM, prevented OSM from binding to gp130. Alternatively, Fab could prevent LIFR recruitment for gp130 binding when bound to OSM. The cell-based (A375, human melanoma cell) assay was used to identify several candidate antibodies that can inhibit gp130-mediated pSTAT3 activation of OSM expressing host cells.
本明細書に記載されるOSM結合抗体は、ヒトOSMタンパク質の活性形態上に少なくとも2つの特異な領域を認識し、OSM上に抗体又は類似する機能遮断能力を有する他の化合物の標的に適した複数の部位を更に発見したことを示す。よって、アミノ酸配列として本明細書に提供される抗体結合ドメインの発現及び精製は、OSM中和活性を示す新規分子の選択手段を提供することができるツールを更に提供する。 The OSM binding antibodies described herein recognize at least two specific regions on the active form of the human OSM protein and are suitable for targeting antibodies on OSM or other compounds with similar function blocking capabilities Indicates that more sites were discovered. Thus, expression and purification of the antibody binding domain provided herein as an amino acid sequence further provides a tool that can provide a means of selecting new molecules that exhibit OSM neutralizing activity.
一実施形態において、抗ヒトOSM抗体は、配列番号49〜55に示すようなアミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)又は重鎖可変(VH)領域を含む結合領域を有し、抗体又はその結合部分は、OSMに免疫特異的に結合する。本発明の別の実施形態では、配列番号54又は55及びその抗原結合部分を含む重鎖を含み、OSMタンパク質に結合し、加えて、
1.100pM未満のKDでヒトOSMに結合する、
2.500pM未満のKDでカニクイザルOSMに結合する、
3.2ng/mLのヒトOSMの存在下で、OSMの不在下の90%のレベルまでA375−S2細胞の増殖を回復させることができる、
4.2ng/mLのカニクイザルOSMの存在下で、OSMの不在下の90%のレベルまでA375−S2細胞の増殖を回復させることができる、
5.組織外植片における関節内(関節部)マトリックスのOSM誘発軟骨細胞分解を阻害する、
6.正常なヒト肺線維芽細胞(NHLF)におけるOSM依存STAT3リン酸化反応を効率的に中和する、又は
7.マウスにおいてOSMで全身誘発された後のサイトカイン放出を遮断する等の、本発明の抗体の特異的な機能特性を有する。
In one embodiment, the anti-human OSM antibody has a binding region comprising a light chain variable (VL) or heavy chain variable (VH) region comprising an amino acid sequence as shown in SEQ ID NOs: 49-55, and the antibody or binding thereof The moiety binds immunospecifically to OSM. In another embodiment of the invention, comprising a heavy chain comprising SEQ ID NO: 54 or 55 and an antigen binding portion thereof, which binds to an OSM protein, in addition,
1. binds to human OSM with a K D of less than 100 pM,
2. Binds to cynomolgus monkey OSM with a K D of less than 500 pM
In the presence of 3.2 ng / mL human OSM, A375-S2 cell proliferation can be restored to a level of 90% in the absence of OSM.
In the presence of 4.2 ng / mL cynomolgus monkey OSM, A375-S2 cell proliferation can be restored to a level of 90% in the absence of OSM.
5. Inhibits OSM-induced chondrocyte degradation of intra-articular (joint) matrix in tissue explants,
6). 6. efficiently neutralize OSM-dependent STAT3 phosphorylation in normal human lung fibroblasts (NHLF), or It has specific functional properties of the antibodies of the invention, such as blocking cytokine release after systemic induction with OSM in mice.
本発明の別の態様では、本明細書に記載される上記に言及される生物学的活性の幾つか又は全てを示す抗体、特に、M55及びM71結合ドメインと命名されるMabの構造上の特徴は、OSMに結合する等の、本発明の抗体の少なくとも1つの機能特性を保持する構造的に関連するヒト抗OSM抗体を生成するために使用される。より具体的には、M55及びM71の1つ以上のCDR領域(配列番号1及び8の特定の残基等)は、更なる組み換えにより遺伝子操作を受けた、本発明のヒト抗OSM抗体を生成するために、配列番号13〜28、30〜46等の、既知のヒトフレームワーク領域及びCDRと組み換えにより組み合わされ得る。 In another aspect of the invention, structural features of antibodies exhibiting some or all of the above mentioned biological activities described herein, particularly Mabs designated M55 and M71 binding domains. Are used to generate structurally related human anti-OSM antibodies that retain at least one functional property of an antibody of the invention, such as binding to OSM. More specifically, one or more CDR regions of M55 and M71 (such as certain residues of SEQ ID NOs: 1 and 8) have undergone genetic manipulation by further recombination to produce human anti-OSM antibodies of the invention. In order to do so, it can be recombinantly combined with known human framework regions and CDRs, such as SEQ ID NOs: 13-28, 30-46.
一実施形態では、本発明の抗体は、FR1、2、及び/又は3を含み、IGVH1〜69(配列番号1)又はIGVH5−51(配列番号3)の配列を有し、配列番号13〜22からなる群から選択されるCDRからの1つ以上の残基は、配列番号1又は3のCDR位置に存在し、一方、抗体がOSMに結合する能力(例えば、保存的置換)をなおも保持する。したがって、別の実施形態では、遺伝子操作を受けた抗体は、配列番号13〜22に列挙されるCDR又は配列番号29若しくは47によって与えられるL−CDR3の変異体と、例えば90%、95%、98%、又は99.5%同一である1つ以上のCDRから構成され得る。 In one embodiment, an antibody of the invention comprises FR1, 2, and / or 3, has the sequence of IGVH1-69 (SEQ ID NO: 1) or IGVH5-51 (SEQ ID NO: 3), and SEQ ID NOs: 13-22 One or more residues from a CDR selected from the group consisting of are present in the CDR position of SEQ ID NO: 1 or 3 while still retaining the ability of the antibody to bind to OSM (eg, conservative substitutions). To do. Thus, in another embodiment, the genetically engineered antibody is a CDR listed in SEQ ID NOs: 13-22 or a variant of L-CDR3 provided by SEQ ID NO: 29 or 47, such as 90%, 95%, It may be composed of one or more CDRs that are 98%, or 99.5% identical.
単純なOSMへの結合に加え、上述のもの等の、遺伝子操作を受けた抗体は、結合がインビボでGP130陽性細胞増殖の抑制をもたらす、OSMタンパク質又はその開裂生成物のGP130陽性細胞への結合を阻害する能力等の、本発明の抗体の他の機能特性の保持について選択され得る。 In addition to simple OSM binding, genetically engineered antibodies, such as those described above, bind OSM protein or its cleavage products to GP130 positive cells, where binding results in suppression of GP130 positive cell growth in vivo. Can be selected for retention of other functional properties of the antibodies of the invention, such as the ability to inhibit.
本発明のヒトモノクローナル抗体は、例えば標準的なELISAにより、OSMに対する結合について試験することができる。 Human monoclonal antibodies of the invention can be tested for binding to OSM, for example, by standard ELISA.
2.OSM中和抗体の生成
本明細書において、配列番号1、3、8のライブラリフレームワークを含む指定される重鎖及び軽鎖配列を含み、かつ配列番号13〜28、30〜46のCDRを有する、M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71、及びM83により例示される、所望の生物活性スペクトルを示すOSM中和抗体は、様々な技法により生成され得る。
2. Generation of OSM neutralizing antibodies As used herein, comprises designated heavy and light chain sequences comprising library frameworks of SEQ ID NOs: 1, 3, 8 and have CDRs of SEQ ID NOs: 13-28, 30-46 , M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71, and M83, showing the desired biological activity spectrum Neutralizing antibodies can be generated by a variety of techniques.
別の実施形態では、配列番号11の残基51〜227のわずか5〜全て、又はその核酸コード配列を含む、本発明の抗体により結合されたエピトープは、OSMの産生に関連する疾患又は疾患の症状を治療し、防止し、又は寛解させる目的において、宿主内で本発明の抗体を直接生成するために、対象を免疫化するために使用され得る。 In another embodiment, an epitope bound by an antibody of the invention comprising as little as 5 to all of residues 51-227 of SEQ ID NO: 11, or a nucleic acid coding sequence thereof, is associated with a disease or disorder associated with the production of OSM. For purposes of treating, preventing, or ameliorating symptoms, it can be used to immunize a subject to produce antibodies of the invention directly in a host.
一実施形態及び本明細書で例示されるように、ヒト抗体は、ファージライブラリから選択され、この場合のファージは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、ライブラリは、例えば、単鎖抗体(scFv)、Fab、又は対合している又はしていない抗体可変領域を示す幾つかの他の構造等のヒト抗体結合ドメインを発現する(Vaughan et lo al.Nature Biotechnology14:309〜314(1996):Sheets et al.PITAS(USA)95:6157〜6162(1998))、Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)、Marks et al.J.Mol.Biol.,222:581(1991))。本発明のヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイ法を用いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングして調製することもできる。ヒト抗体単離のためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野にて確立されている。例えば、Ladner et al.に付与された米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号及び同第5,571,698号、Dower et al.に付与された米国特許第5,427,908号及び同第5,580,717号、McCafferty et al.に付与された米国特許第5,969,108号及び同第6,172,197号、並びにGriffiths et al.に付与された米国特許第5,885,793号、同第6,521,404号、同第6,544,731号、同第6,555,313号、同第6,582,915号及び同第6,593,081号を参照されたい。 As exemplified in one embodiment and herein, the human antibody is selected from a phage library, wherein the phage comprises human immunoglobulin genes, such as a single chain antibody (scFv), Fab. Or expressing a human antibody binding domain, such as some other structure that represents an antibody variable region that is or is not paired (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al PITAS (USA) 95: 6157-6162 (1998)), Hoogenboom and Winter, J. MoI. Mol. Biol. , 227: 381 (1991), Marks et al. J. et al. Mol. Biol. 222: 581 (1991)). The human monoclonal antibody of the present invention can also be prepared by screening a library of human immunoglobulin genes using the phage display method. Such phage display methods for human antibody isolation are established in the art. For example, Ladner et al. U.S. Pat. Nos. 5,223,409, 5,403,484 and 5,571,698, to Dower et al. U.S. Pat. Nos. 5,427,908 and 5,580,717, McCafferty et al. U.S. Pat. Nos. 5,969,108 and 6,172,197, and Griffiths et al. US Pat. Nos. 5,885,793, 6,521,404, 6,544,731, 6,555,313, 6,582,915 and See US Pat. No. 6,593,081.
ファージクローンは、生物選抜として知られる多工程手順により選択され、それを通して同定される。生物選抜は、ファージ提示タンパク質リガンド変異体(ファージ提示ライブラリ)を標的とインキュベートし、洗浄法により未結合ファージを取り除き、特定的に結合ファージを溶出することにより実行される。溶出されたファージは、標的に最良の結合を提示する抗体断片を持つこれらのファージクローンを好む特定の配列のプールを富化する結合及び任意の増幅の更なるサイクルが行われる前に、任意に増幅される。数回後に、個々のファージクローンが特徴付けされ、クローンにより提示されたペプチドの配列が、ファージビリオンの対応するDNAを配列決定することにより決定される。 Phage clones are selected and identified through a multi-step procedure known as bioselection. Biological selection is performed by incubating a phage-displayed protein ligand variant (phage display library) with the target, removing unbound phage by a washing method and specifically eluting the bound phage. The eluted phage is optionally treated before further cycles of binding and any amplification are performed to enrich for a pool of specific sequences that prefer those phage clones with antibody fragments that display the best binding to the target. Amplified. Several times later, individual phage clones are characterized and the sequence of the peptides displayed by the clones is determined by sequencing the corresponding DNA of the phage virion.
FabファージpIXライブラリ
ファージ提示技術の特定の実施形態では、Shi et al.J Mol Biol 397:385〜396,2010、第WO29085462A1号、及びUS第12/546850号に記載され、本明細書に更に詳述される、pIXファージコートタンパク質上に提示される合成Fabライブラリは、ヒト生殖系列遺伝子由来のヒトIgG配列のレパートリーから結合剤を選択するために使用される。ライブラリは、配列が天然源から単離されたヒト抗体に存在することが観察された頻度に基づき選択された既知のIGV及びIGJ生殖系列配列によりコードされた4つのVL及び3つのVHドメイン上に構築された。選択されたVH(IMGT命名法)は、IGHV1〜69(配列番号1)、IGHV3〜23(配列番号2)、又はIGHV5〜51(配列番号3)である。VH設計における多様性は、CDR3領域に可変長の配列を有する重鎖を生成し、一定の長さを保持するH−CDR1及びH−CDR2において多様性位置を制限する。フレームワーク4(H−FR4)は、ライブラリの全メンバーの中で一定に保たれた(配列番号4)。
Fab Phage pIX Library In certain embodiments of phage display technology, Shi et al. Synthetic Fab libraries displayed on pIX phage coat proteins described in J Mol Biol 397: 385-396, 2010, WO290885462A1, and US 12/546850 and described in further detail herein are: Used to select binding agents from a repertoire of human IgG sequences from human germline genes. The library is on four VL and three VH domains encoded by known IGV and IGJ germline sequences selected based on the frequency with which the sequence was observed to be present in human antibodies isolated from natural sources. It was constructed. The selected VH (IMGT nomenclature) is IGHV 1-69 (SEQ ID NO: 1), IGHV 3-23 (SEQ ID NO: 2), or IGHV 5-51 (SEQ ID NO: 3). Diversity in VH design generates heavy chains with variable length sequences in the CDR3 region, limiting diversity positions in H-CDR1 and H-CDR2 that retain a certain length. Framework 4 (H-FR4) remained constant among all members of the library (SEQ ID NO: 4).
この場合、169ライブラリにおいて、X1は、A又はGであり、X2は、G又はWであり、X3は、I又はSであってもよく、X4は、P又はAであってもよく、X5は、I又はYであってもよく、X6は、F又はNであってもよい。 In this case, in the 169 library, X 1 is A or G, X 2 is G or W, X 3 may be I or S, and X 4 is P or A. X 5 may be I or Y, and X 6 may be F or N.
この場合、323ライブラリにおいて、X1は、S、D、N、又はTであってもよく、X2は、A、G、又はWであってもよく、X3は、S又はHであってもよく、X4は、V、A、N、又はGであってもよく、X5は、S、N、K、又はWであってもよく、X6は、Y、S、G、又はQであってもよく、X7は、S又はDであってもよく、X8は、S又はGであってもよい。
In this case, in the 323 library, X 1 may be S, D, N, or T, X 2 may be A, G, or W, and X 3 is S or H. X 4 may be V, A, N, or G, X 5 may be S, N, K, or W, and X 6 is Y, S, G, Or Q, X 7 may be S or D, and X 8 may be S or G.
この場合、551ライブラリにおいて、X1は、S、N、又はTであってもよく、X2は、S又はGであってもよく、X3は、I又はRであってもよく、X4は、D又はYであってもよく、X5は、G又はSであってもよく、X6は、D又はYであってもよい。 In this case, in the 551 library, X 1 may be S, N, or T, X 2 may be S or G, X 3 may be I or R, and X 4 may be D or Y, X 5 may be G or S, and X 6 may be D or Y.
WGQGTLVTVSS(配列番号4)を有するFR4又はJH領域(11残基)は、上記の配列に連結されて、完全な重鎖可変領域を形成する。 The FR4 or JH region (11 residues) with WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4) is linked to the above sequence to form a complete heavy chain variable region.
多様化を標的としたH−CDR1及びH−CDR2位置は、1)生殖系列遺伝子の多様性、及び2)既知の構造の抗体−抗原複合体における抗原との接触に見られる頻度、により決定された(Almagro J Mol Recognit.17:132〜143,2004)。選択された位置でのアミノ酸の多様性は、1)生殖系列における使用、2)ヒトの再配置されたV遺伝子で最も頻繁に観察されるアミノ酸、3)単一塩基体細胞変異に起因すると推定されるアミノ酸、及び4)抗原認識の一因となるアミノ酸の生化学的及び生物物理学的特性、により決定された。 H-CDR1 and H-CDR2 positions targeted for diversification are determined by 1) the diversity of germline genes, and 2) the frequency found in contact with antigens in antibody-antigen complexes of known structure. (Almagro J Mol Recognition. 17: 132-143, 2004). Amino acid diversity at selected positions is presumed to be due to 1) use in the germline, 2) the most frequently observed amino acids in human rearranged V genes, 3) single base cell mutations And 4) the biochemical and biophysical properties of the amino acids that contribute to antigen recognition.
ライブラリは、最終長が7〜14残基である以下の(式I)に示されるように、ヒト抗体のレパートリー(Shiら、2010、上記)を模倣するVH(H3)のCDR3に多様性を組み込む。5000を超えるヒト可変領域のCDR3の中で、アミノ酸グリシン(G)及びアラニン(A)は、全位置において頻繁に使用される。加えて、アスパラギン酸(D)は位置95で頻繁に用いられ、チロシン(Y)はJセグメントの正準領域に先行する位置で頻繁にコード化される。アミノ酸フェニルアラニン(F)、アスパラギン酸(D)、及びチロシン(Y)は、これらの位置のIgGに使用される位置99〜101で優先される。多くの場合、これらの位置は、H−CDR3に対して構造上の支持としての機能を果たし、抗原及び/IgGの表面に、あまりアクセス可能ではないため、位置99のアミノ酸フェニルアラニン+ロイシン(50/50比)、位置100のアスパラギン酸、及び位置101のチロシンは、固定される。よって、式Iの配列は、配列番号1、2、又は3と配列番号4との間に挿入され、完全なVHを作製する。
−(D)−(N)n(N+O)m(F)DY− (I)
式中、
(D)=Asp(D)及びGly(G)豊富位置。
(N)n=Ala(A)及びGly(G)豊富位置、n=3−7。
(O)m=Ala(A)、Gly(G)、及びY(Tyr)豊富、m=1−4。
(F)=Phe(F)優先位置。
The library shows diversity in CDR3 of VH (H3), which mimics the repertoire of human antibodies (Shi et al., 2010, supra) as shown in (Formula I) below with a final length of 7-14 residues. Include. Among the more than 5000 human variable region CDR3s, the amino acids glycine (G) and alanine (A) are frequently used at all positions. In addition, aspartic acid (D) is frequently used at position 95, and tyrosine (Y) is frequently encoded at positions preceding the canonical region of the J segment. The amino acids phenylalanine (F), aspartic acid (D), and tyrosine (Y) are preferred at positions 99-101 used for IgG at these positions. In many cases, these positions serve as structural support for H-CDR3 and are less accessible to the surface of the antigen and / IgG, so the amino acid phenylalanine + leucine at position 99 (50 / 50 ratio), aspartic acid at
-(D)-(N) n (N + O) m (F) DY- (I)
Where
(D) = Asp (D) and Gly (G) rich positions.
(N) n = Ala (A) and Gly (G) rich positions, n = 3-7.
(O) m = Ala (A), Gly (G), and Y (Tyr) rich, m = 1-4.
(F) = Phe (F) priority position.
ライブラリの様々な変形は、同様にヒト生殖系列レパートリーに由来する固定された又は多様化された軽鎖と対合する工程を包含する。本発明において、4つの軽鎖ライブラリVLカッハ゜遺伝子(Kawasaki et al.2001.Eur J Immunol 31:1017〜1028及びその後、Schaeble & Zachau,1993 Biol Chem Hoppe Seyler 374:1001〜1022)は、A27(IGKV3−20*01)、B3(IGKV4−1*01)、L6(IGKV3−11*01)、及びO12(IGKV1−39*01)であり、この場合、カッコ内の遺伝子名は、推定された対応するIMGT遺伝子である。Fabは、ジシストロニックベクターの発現を介してpIX上に提示され、VH−CH1ドメインは、コートタンパク質配列に融合し、VL−CLカッパ又はVL−CLラムダは、VH−CH1と自己会合する遊離ポリペプチドとして発現する。CDR領域には下線を施す。 Various variants of the library include pairing with fixed or diversified light chains derived from the human germline repertoire as well. In the present invention, the four light chain library VL Cach genes (Kawasaki et al. 2001. Eur J Immunol 31: 1017-1028 and then Schable & Zachau, 1993 Biol Chem Hope Seyler 374: 1001-1102K) are defined as A27 ( -20 * 01), B3 (IGKV4-1 * 01), L6 (IGKV3-11 * 01), and O12 (IGKV1-39 * 01), where the gene name in parentheses is the estimated correspondence The IMGT gene. The Fab is presented on pIX via expression of a dicistronic vector, the VH-CH1 domain is fused to the coat protein sequence, and VL-CL kappa or VL-CL lambda is a free poly that self-associates with VH-CH1. Expressed as a peptide. The CDR region is underlined.
Vカッパ(Vk)生殖系列遺伝子に基づく軽鎖可変ライブラリ Light chain variable library based on Vkappa (Vk) germline gene
各可変領域スカフォールドの特定位置での多様性を下の表1に要約し、この場合、アミノ酸一文字コードが使用され、図1に示されるように、選択的に特定位置で存在する。 The diversity at each specific position of each variable region scaffold is summarized in Table 1 below, where an amino acid single letter code is used and is optionally present at a specific position, as shown in FIG.
ライブラリの全てのVL CDR3は、7つの残基を有し、最初の2つの残基は、グルタミン(Gln、Q)であり、Kabat残基95に対応する残基は、プロリン(Pro、P)である。L−CDR3において、配列は、QQX1X2X3X4PX5T(配列番号9)に対応し、この場合、多型は、下の表の通りであり、残基位置は、Kabatに従う。 All VL CDR3s in the library have seven residues, the first two residues are glutamine (Gln, Q), and the residue corresponding to Kabat residue 95 is proline (Pro, P) It is. In L-CDR3, the sequence corresponds to QQX 1 X 2 X 3 X 4 PX 5 T (SEQ ID NO: 9), in which case the polymorphism is as in the table below and the residue position follows Kabat .
様々な配列は、遺伝子間で長さが変動し、高頻度可変ループ又はCDR内の特定の残基位置での多様性は、Al−Lazikani B,Lesk AM,Chothia C,1997(Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins.J Mol Biol 273:927〜948)に画定される残基付番を使用して、以下のように説明され得る。このシステムにおいて、高頻度可変ループの長さの変化は、所与の残基において、a、b、c等のサブ位置の表記によって提供される。 Various sequences vary in length from gene to gene, and diversity at specific residue positions within the hypervariable loop or CDR is described in Al-Lazikani B, Less AM, Chothia C, 1997 (Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol 273: 927-948) and can be described as follows. In this system, the change in length of the hypervariable loop is provided by the notation of subpositions such as a, b, c, etc. at a given residue.
JK4、FGQGTKVEIK(配列番号10)等のフレームワーク4(FR4)セグメントは、完全なヒト軽鎖可変領域を形成するために使用された。 Framework 4 (FR4) segments such as JK4, FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 10) were used to form the complete human light chain variable region.
0.2〜20nMの様々なタンパク質標的に対するFab親和性は、初期の選択で示された。 Fab affinity for various protein targets from 0.2 to 20 nM was shown in the initial selection.
再組み換えVL又はVH多様性からなる結合パラメータを改善するための、組み込まれた成熟過程のための方法、又は別の方法としては、指向された若しくは限定されたVL改変は、参考刊行物に記載される、本明細書に教示される、及び当該技術分野に公知であるものと組み合わされたライブラリ用に設計され、使用されるベクター及びプライマーを使用して達成される。 Methods for integrated maturation processes, or alternatively directed or limited VL modifications, to improve binding parameters consisting of recombined VL or VH diversity are described in the reference publications. To be achieved using vectors and primers designed and used for libraries in combination with those taught herein and known in the art.
OSM結合免疫グロブリンドメインの代替え供給源
本明細書に開示されるヒトMabの特徴を備えたOSM結合抗体が作製されるか、又は結合断片が、Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法(ハイブリドーマ法)を含む、多くの方法により形成された免疫グロブリンドメインから供給され得る。ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター若しくはマカクザル等の他の適切な宿主動物を上記のように免疫して、免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産生し得るリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59〜103(Academic Press,1986))。
Alternative Sources of OSM-binding Immunoglobulin Domains OSM-binding antibodies with the characteristics of the human Mabs disclosed herein are made, or binding fragments are the standard of Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Can be supplied from immunoglobulin domains formed by a number of methods, including novel somatic cell hybridization methods (hybridoma methods). In the hybridoma method, mice or other suitable host animals such as hamsters or macaques are immunized as described above to produce antibodies that specifically bind to the proteins used for immunization or to induce lymphocytes that can be produced. . Alternatively, lymphocytes may be immunized in vitro. Lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusing agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practices, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). )).
OSM中和抗体はまた、任意に、本明細書に記載される、及び/又は当該技術分野において既知であるように、ヒト抗体のレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ヒト以外の霊長類など)の免疫化により生じる場合もある。ヒト抗OSM抗体を生成する細胞を、このような動物から単離し、本明細書に記載の方法のような、好適な方法を用いて不死化してもよい。或いは、抗体をコードする配列は、クローニングし、好適なベクターに導入し、また本明細書に教示する方法及び当該技術分野において既知である方法により抗体の発現及び単離のために宿主細胞をトランスフェクトするために用いることができる。 An OSM neutralizing antibody is also optionally a transgenic animal (eg, mouse, rat) that is capable of producing a repertoire of human antibodies, as described herein and / or as known in the art. , Hamsters, non-human primates, etc.). Cells that produce human anti-OSM antibodies may be isolated from such animals and immortalized using suitable methods, such as the methods described herein. Alternatively, the sequence encoding the antibody can be cloned, introduced into a suitable vector, and the host cell transfected for expression and isolation of the antibody by methods taught herein and methods known in the art. Can be used to effect.
それらの生殖系構造にヒト免疫グロブリン(Ig)遺伝子座を有するトランスジェニックマウスの使用により、正常ヒト免疫系が許容性を示すヒト自己抗原を含む種々の標的に対する高親和性完全ヒトモノクローナル抗体が単離される(Lonberg,Nらの米国特許第5569825号、米国特許第6300129号、及び1994,Nature 368:856〜9、Green,L.et al.,1994,Nature Genet.7:13〜21、Green,L.& Jakobovits,1998,Exp.Med.188:483〜95、Lonberg,N and Huszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65〜93、Kucherlapatiらの米国特許第6713610号、Bruggemann,M.et al.,1991,Eur.J.Immunol.21:1323〜1326、Fishwild,D.et al.,1996,Nat.Biotechnol.14:845〜851、Mendez,M.et al.,1997,Nat.Genet.15:146〜156、Green,L.,1999,J.Immunol.Methods 231:11〜23、Yang,X.et al.,1999,Cancer Res.59:1236〜1243、Bruggemann,M.and Taussig,M J.,Curr.Opin.Biotechnol.8:455〜458,1997、Tomizukaらの国際公開特許第02043478号)。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を分断又は欠失させ、内因性遺伝子によりコードされた、抗体を産生する動物の能力を除去することができる。加えて、Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)及びMedarex(San Jose,Calif.)などの会社は、上述したような技術を使用して、選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供するよう従事し得る。 The use of transgenic mice that have human immunoglobulin (Ig) loci in their germline structure has resulted in a single high-affinity fully human monoclonal antibody against a variety of targets, including human self-antigens for which the normal human immune system is permissive. (Lonberg, N et al., US Pat. No. 5,569,825, US Pat. No. 6,0012,309, and 1994, Nature 368: 856-9, Green, L. et al., 1994, Nature Genet. 7: 13-21, Green , L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188: 483-95, Lonberg, N and Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol.13: 65-93, Kucherlapati et al. Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol.21: 1323-1326, Fishwild, D. et al., 1996, Nat.Biotechnol.14: 845-851, Mendez, M. et al. 1997, Nat. Genet. 15: 146-156, Green, L., 1999, J. Immunol.Methods 231: 11-23, Yang, X. et al., 1999, Cancer Res. Bruggemann, M. and Taussig, MJ, Curr. Opin.Biotechnol.8: 455-458, 1997, Tomizuka et al. Such mouse endogenous immunoglobulin loci can be disrupted or deleted to eliminate the animal's ability to produce antibodies encoded by the endogenous gene. In addition, Abgenix, Inc. Companies such as (Freemont, Calif.) And Medarex (San Jose, Calif.) May be engaged to provide human antibodies directed against selected antigens using techniques such as those described above.
パンニング戦略における標的リガンド及び免疫原性抗原として使用するためのポリペプチドの調製は、組み換えタンパク質産生等の任意の好適な技法を使用して実施され得る。精製タンパク質、又は全細胞若しくは細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態の標的リガンド若しくはその断片、又は免疫化の場合、抗原は、動物の身体内で、前記抗原又はその一部をコードする核酸から新規に形成されてもよい。 Preparation of polypeptides for use as target ligands and immunogenic antigens in a panning strategy can be performed using any suitable technique, such as recombinant protein production. In the case of immunization, an antigen is a nucleic acid that encodes said antigen or part thereof, in the form of a purified protein, or a target ligand in the form of a whole cell or a protein mixture comprising cell or tissue extracts or fragments thereof. May be newly formed.
本発明の単離された核酸は、当技術分野にて周知のように、(a)組み換え方法、(b)合成技術、(c)精製技術、又はそれらの組み合わせを使用して形成することができる。モノクローナル抗体をコードするDNAは、容易に単離され、当該技術分野において既知である方法(例えば、ヒト抗体領域の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる)を用いて配列決定される。ハイブリドーマを作製する場合、かかる細胞は、かかるDNA源として機能し得る。或いは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリ等のコード配列及び翻訳産物が連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡略化される。ファージ選択後、ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体を作製するために用い、哺乳動物の細胞、昆虫細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。 Isolated nucleic acids of the invention can be formed using (a) recombinant methods, (b) synthetic techniques, (c) purification techniques, or combinations thereof, as is well known in the art. it can. DNA encoding the monoclonal antibody is easily isolated and known in the art (eg, oligonucleotide probes capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of the human antibody region) Sequence). When producing hybridomas, such cells can function as such a source of DNA. Alternatively, selection of binding agents and nucleic acids is simplified using display technologies in which coding sequences and translation products are linked, such as phage or ribosome display libraries. After phage selection, antibodies encoding regions derived from the phage are isolated and used to generate whole antibodies, including human antibodies or any other desired antigen-binding fragment, used in mammalian cells, insect cells, yeast, And can be expressed in any desired host, including bacteria.
ヒト抗体
本発明は更に、ヒトOSMに結合するヒト免疫グロブリン(又は抗体)を提供する。これらの抗体はまた、遺伝子操作を受けた又は適応されたとして特徴付けされ得る。免疫グロブリンは、実質的にヒト生殖系列免疫グロブリンからの可変領域(複数可)を有し、抗原認識に関与することが知られる残基において指向された変形、例えば、KabatのCDR又は構造的に画定されるような高頻度可変ループを含む。存在する場合、定常領域(1つ以上)も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト抗体は、少なくとも約10-6M(1マイクロM)、約10-7M(100nM)、10-9M(1nM)以下のOSMに対するKDを示す。親和性の変化に影響を及ぼす、例えば、OSMに対するヒト抗体の親和性を改善する、又はそのKDを減少させるために、CDR残基又は他の残基のいずれかの置換が行われ得る。
Human Antibodies The present invention further provides human immunoglobulins (or antibodies) that bind to human OSM. These antibodies can also be characterized as having undergone genetic engineering or adapted. Immunoglobulins have variable region (s) substantially from human germline immunoglobulin and are directed at residues known to be involved in antigen recognition, eg, Kabat CDRs or structurally Includes a highly variable loop as defined. When present, the constant region (s) are also substantially from human immunoglobulin. Human antibodies exhibit a K D for OSM of at least about 10 −6 M (1 microM), about 10 −7 M (100 nM), 10 −9 M (1 nM) or less. It influences the affinity of the change, for example, to improve affinity human antibodies to OSM, or to reduce its K D, or substituted CDR residues or other residues may be performed.
OSMに結合するヒト抗体を産生するための供給源は、好ましくは、フィラメント状ファージ粒子上に提示されるヒト由来Fabのレパートリーを使用する、ヒトOSMに結合し、カニクイザルOSMと交差反応することができると同定された配列番号13〜55として記載される可変領域、フレームワーク、及び/又はCDRとして本明細書に提供される配列である。 The source for producing a human antibody that binds to OSM preferably binds to human OSM and cross-reacts with cynomolgus OSM using a repertoire of human-derived Fabs displayed on filamentous phage particles. Sequences provided herein as variable regions, frameworks, and / or CDRs described as SEQ ID NOs: 13-55 identified as capable.
ヒト可変ドメインフレームワークが、CDRの起源である親可変フレームワークと同一又は同様の立体構造(conformation)をとる場合、CDRのいずれかをヒト可変ドメインフレームワークに置換することにより、その正確な空間配向が維持される可能性が最も高い。最終Mabに対合される重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、又はヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来してもよく、又は数種のヒト抗体及び/若しくは生殖系列配列のコンセンサス配列であってもよい。 If the human variable domain framework has the same or similar conformation as the parent variable framework from which the CDR originates, then replacing any of the CDRs with the human variable domain framework will result in its exact space. Most likely orientation is maintained. The heavy and light chain variable framework regions paired to the final Mab can be derived from the same or different human antibody sequences. The human antibody sequence may be the sequence of a naturally occurring human antibody, may be derived from a human germline immunoglobulin sequence, or may be a consensus sequence of several human antibodies and / or germline sequences. May be.
好適なヒト抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列と、既知のヒト抗体の配列とのコンピュータ比較により同定される。比較は重鎖と軽鎖とで別々に行われるが、原理はそれぞれに関して類似している。 Suitable human antibody sequences are identified by computer comparison of the murine variable region amino acid sequences with known human antibody sequences. The comparison is done separately for heavy and light chains, but the principles are similar for each.
経験的方法に関しては、所望の活性、結合親和性又は特異性をスクリーニングし得る変異体配列のライブラリを形成することが特に簡便であることが見出されている。そのような変異体のライブラリを形成するための1つのフォーマットは、ファージディスプレイベクターである。別の方法としては、変異体は、可変ドメイン内に標的残基をコードする核酸配列を無作為化又は多型化するための代替え又は既知の方法を使用して生成され得る。 With regard to empirical methods, it has been found to be particularly convenient to form a library of variant sequences that can be screened for the desired activity, binding affinity or specificity. One format for forming such a library of variants is a phage display vector. Alternatively, variants can be generated using alternative or known methods for randomizing or polymorphizing nucleic acid sequences encoding target residues within the variable domain.
更なる置換が必要であるか否かを決定する他の方法と、置換されるアミノ酸残基の選択とは、コンピュータモデリングを用いて達成することができる。免疫グロブリン分子の3次元画像を生成するコンピュータハードウェア及びソフトウェアは広く入手可能である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖又はそのドメインに関する解明された構造から出発して生成される。モデリングされる鎖のアミノ酸配列の、解明された3次元構造の鎖又はドメインとの類似性が比較され、最大の配列類似性を示す鎖又はドメインが分子モデル構成の出発点として選択される。解明された出発構造は、モデリングされている免疫グロブリン鎖又はドメイン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の差異を許容するよう変更される。次いで、変更された構造は、複合体免疫グロブリンに組み立てられる。最終的に、モデルは、エネルギー最小化し、また全部の原子が互いから適切な距離内に存在し、結合の長さと角度とが化学的に許容し得る限界内にあることを検証することにより精密化される。 Other methods of determining whether further substitution is necessary and the selection of amino acid residues to be substituted can be accomplished using computer modeling. Computer hardware and software that generate three-dimensional images of immunoglobulin molecules are widely available. In general, molecular models are generated starting from solved structures for immunoglobulin chains or domains thereof. The similarity of the amino acid sequence of the modeled chain with the solved chain or domain of the three-dimensional structure is compared, and the chain or domain that exhibits the greatest sequence similarity is selected as the starting point for the molecular model construction. The elucidated starting structure is altered to allow for differences between the actual amino acid in the immunoglobulin chain or domain being modeled and the amino acid in the starting structure. The altered structure is then assembled into a complex immunoglobulin. Ultimately, the model is refined by minimizing energy and verifying that all atoms are within the proper distance from each other and that the bond length and angle are within chemically acceptable limits. It becomes.
コードの縮重により、多様な核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするであろう。所望の核酸配列は、デノボ(de nova)固相DNA合成、又は所望のポリヌクレオチドの早期に調製された変異体のPCR変異誘発により生成され得る。本願に記載される抗体をコードする全ての核酸は、本発明に明白に含まれる。 Due to the degeneracy of the code, a variety of nucleic acid sequences will encode each immunoglobulin amino acid sequence. The desired nucleic acid sequence can be generated by de nova solid phase DNA synthesis, or PCR mutagenesis of early prepared variants of the desired polynucleotide. All nucleic acids encoding the antibodies described in this application are expressly included in the present invention.
本明細書に記載されるように生成されたヒト抗体の可変セグメントは、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に結合される。抗体は、軽鎖及び重鎖定常領域の両方を含む。重鎖定常領域は、通常、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、更にCH4ドメインを含むことがある。 The variable segment of a human antibody produced as described herein is typically attached to at least a portion of a human immunoglobulin constant region. Antibodies include both light and heavy chain constant regions. The heavy chain constant region usually includes CH1, hinge, CH2, CH3, and further a CH4 domain.
ヒト抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、及びIgEを含む抗体の任意のクラス、並びにIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む任意のサブクラス(アイソタイプ)からの任意のタイプの定常ドメインを含んでもよい。ヒト化抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、定常ドメインは通常、補体結合性定常ドメインであり、クラスは一般にIgG1である。かかる細胞毒性が望ましくないとき、定常ドメインは、IgG2クラスであってもよい。ヒト化抗体は、2つ以上のクラス又はアイソタイプからの配列を含んでもよい。 A human antibody may comprise any type of constant domain from any class of antibodies including IgM, IgG, IgD, IgA, and IgE, and any subclass (isotype) including IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. Good. If humanized antibodies are desired to exhibit cytotoxic activity, the constant domain usually a complement-binding constant domain, class is generally a IgG 1. When such cytotoxic is not desirable, the constant domain may be IgG 2 class. A humanized antibody may comprise sequences from more than one class or isotype.
場合により定常領域に結合されたヒト化軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクター内に挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター(1つ以上)内の制御配列に操作可能に結合される。そのような対照配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結配列を含む(Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029(1989)、WO第90/07861号、Co et al.,J.Immunol.148,1149(1992)を参照、これらは、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。 Nucleic acids encoding the humanized light and heavy chain variable regions, optionally joined to the constant region, are inserted into expression vectors. The light and heavy chains can be cloned into the same or different expression vectors. A DNA segment encoding an immunoglobulin chain is operably linked to control sequences in an expression vector (s) that ensures expression of the immunoglobulin polypeptide. Such control sequences include signal sequences, promoters, enhancers, and transcription termination sequences (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1000029 (1989), WO 90/07861, Co. et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992), which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes).
3.抗OSM抗体の使用方法
以下により詳細に記載されるように、本発明は、M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71、及びM83の可変ドメインを有する単離されたモノクローナル抗体がOSM上の重複エピトープに結合し、インビトロ及び/又はインビボOSM阻害活性を提示することを示す。有意に、選択されたMAbの反応性は、gp130とのOSM相互作用を用量依存的に遮断する、gp130の存在下でOSMシグナル伝達を減少させる、A375細胞のOSM刺激された増殖を減少させる、マクロファージ刺激された軟骨細胞コラーゲン産生を防止する、又はインビボでOSMによるサイトカイン放出を減少させる能力を含む。
3. Methods of Use of Anti-OSM Antibodies As described in more detail below, the present invention relates to M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, FIG. 3 shows that isolated monoclonal antibodies with variable domains of M69, M71, and M83 bind to overlapping epitopes on OSM and display in vitro and / or in vivo OSM inhibitory activity. Significantly, the reactivity of the selected MAbs dose-dependently blocks OSM interaction with gp130, reduces OSM signaling in the presence of gp130, reduces OSM-stimulated proliferation of A375 cells, Includes the ability to prevent macrophage-stimulated chondrocyte collagen production or reduce cytokine release by OSM in vivo.
本発明に記載したようなモノクローナル抗体の特性を考慮すると、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト及び動物におけるOSM関連の状態を治療又は予防するための治療剤及び予防剤の両方として好適である。 In view of the properties of monoclonal antibodies as described in the present invention, antibodies or antigen-binding fragments thereof are suitable as both therapeutic and prophylactic agents for treating or preventing OSM-related conditions in humans and animals.
一般に、使用は、本発明の治療有効量若しくは予防有効量の1つ以上のモノクローナル抗体又は抗原結合断片、又は同様の結合及び生物学的活性スペクトルを有するように選択された抗体若しくは分子を、感染しやすい対象又はOSM活性が免疫学的障害若しくは腫瘍成長及び転移等の病理学的後遺症を有することが知られる状態を示す者に投与する工程を含む。Fab及びF(ab’)2断片を含む、抗体の任意の活性型を投与することができる。 In general, use involves infecting a therapeutically or prophylactically effective amount of one or more monoclonal antibodies or antigen-binding fragments of the invention, or antibodies or molecules selected to have similar binding and biological activity spectra. Administering to a subject susceptible to or a condition known to have pathological sequelae such as immunological disorders or tumor growth and metastasis in OSM activity. Any active form of the antibody can be administered, including Fab and F (ab ') 2 fragments.
好ましくは、用いられる抗体は、MAbに対する免疫反応が、許容できないほど短い循環半減期を生じさせない、又は被験体においてMAbに対する免疫反応を誘導するように、レシピエント種と適合する。投与されるMAbは、細胞溶解又は細胞毒性メカニズムを使用して標的細胞集団を枯渇させるために、対象のFc受容体への結合及びADCCメカニズムの活性化等の幾つかの二次機能を示すか、又はそれらは、標的細胞集団を保存するために、これらの二次エフェクターを制限することにより、又はその欠失により遺伝子操作を受けてもよい。 Preferably, the antibody used is compatible with the recipient species such that an immune response against MAb does not produce an unacceptably short circulating half-life or induces an immune response against MAb in a subject. Does the administered MAb exhibit some secondary function such as binding to the subject Fc receptor and activation of the ADCC mechanism to deplete the target cell population using cytolytic or cytotoxic mechanisms? Or they may be genetically manipulated by constraining these secondary effectors or by deletion thereof to preserve the target cell population.
個体の治療は、治療的に有効な量の本発明の抗体を投与することを含み得る。抗体は、以下に記載のようなキットで提供されてもよい。抗体は、例えば等量の混合物として投与されてもよく、又は個別に連続して提供されても、又は一度に投与されてもよい。レシピエント患者内でOSMに結合可能な抗体若しくはその断片、又はOSMに対して保護できる抗体を患者に提供する際、投与される薬剤の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、既往歴などの因子に応じて変動するであろう。 Treatment of an individual can include administering a therapeutically effective amount of an antibody of the invention. The antibody may be provided in a kit as described below. The antibodies may be administered, for example, as an equal volume mixture, or may be provided separately in series, or administered at once. In providing a patient with an antibody or fragment thereof that can bind to OSM in an recipient patient, or an antibody that can be protected against OSM, the dose of drug administered can be determined based on the patient's age, weight, height, sex, systemic It will vary depending on factors such as the medical condition and past medical history.
同様の手法で、本発明のモノクローナル抗体の他の治療的使用は、本モノクローナル抗体のうちの1つに対して上昇された抗イディオタイプ抗体を使用する、患者の能動免疫化である。エピトープの構造を模倣した抗イディオタイプによる免疫化は、能動的な抗OSM応答を誘発し得る(Linthicum,D.S.and Farid,N.R.,Anti−idiotypes,Receptors,and Molecular Mimicry(1988),pp 1〜5 and 285〜300)。 In a similar manner, another therapeutic use of the monoclonal antibodies of the invention is active immunization of patients using an anti-idiotype antibody raised against one of the monoclonal antibodies. Immunization with an anti-idiotype that mimics the structure of the epitope can elicit an active anti-OSM response (Linticum, DS and Farid, N.R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988). ), Pp 1-5 and 285-300).
同様に、能動免疫は、ワクチンの成分として、1つ以上の抗原性及び/又は免疫原性エピトープを投与することにより誘導され得る。ワクチン接種は、予防的に又は治療的に、レシピエントがこの生物学的機能領域に対して保護抗体を生成できるのに十分な量を経口又は非経口的に投与することにより実施し得る。宿主は、純粋なペプチド断片、又は改変されたペプチドの抗原性/免疫原性ペプチドで能動免疫され得る。元来のタンパク質配列に対応していない1つ以上のアミノ酸を、元来のペプチド又は切頭型のペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に添加してもよい。かかる追加のアミノ酸は、ペプチドを別のペプチド、大きな担体タンパク質、又は支持体に結合させるのに有用である。これらの目的に有用なアミノ酸としては、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、及びこれらの誘導体が挙げられる。別のタンパク質改変技術は、例えば、NH2−アセチル化又はCOOH−末端アミド化を用いて、別のタンパク質又はペプチド分子又は支持体に、ペプチドを結合又は融合させる更なる手段を提供することもできる。 Similarly, active immunity can be induced by administering one or more antigenic and / or immunogenic epitopes as a component of a vaccine. Vaccination can be carried out prophylactically or therapeutically by administering orally or parenterally in an amount sufficient to allow the recipient to generate protective antibodies against this biological functional area. Hosts can be actively immunized with pure peptide fragments, or modified peptide antigenic / immunogenic peptides. One or more amino acids that do not correspond to the original protein sequence may be added to the amino or carboxyl terminus of the original or truncated peptide. Such additional amino acids are useful for binding a peptide to another peptide, large carrier protein, or support. Amino acids useful for these purposes include tyrosine, lysine, glutamic acid, aspartic acid, cysteine, and derivatives thereof. Other protein modification techniques can also provide additional means of attaching or fusing the peptide to another protein or peptide molecule or support using, for example, NH2-acetylation or COOH-terminal amidation.
望ましくないOSM生物活性に対する保護が可能な抗体は、OSM関連の症状又は病理の軽減、回復又は寛解を達成するのに十分な量でレシピエント対象に提供されることが意図される。十分な又は「治療的に有効な量」とは、薬剤の、用量、投与経路などが、そのような応答に影響を与えるのに十分な場合、症候の軽減に「有効」である量をさす。抗体投与に対する反応は、被験体の罹患組織、器官、又は細胞を分析することにより、又は画像化技術により、又は組織サンプルのエクスビボ分析により、測定され得る。剤の存在が、レシピエント患者の生理に検出可能な変化をもたらす場合、その剤は生理学的に重要である。 It is contemplated that antibodies capable of protecting against undesirable OSM biological activity are provided to the recipient subject in an amount sufficient to achieve reduction, recovery or remission of OSM-related symptoms or pathologies. A sufficient or “therapeutically effective amount” refers to an amount that is “effective” in reducing symptoms if the dose, route of administration, etc., of the drug are sufficient to affect such a response. . Response to antibody administration can be measured by analyzing a subject's diseased tissue, organ, or cell, or by imaging techniques, or by ex vivo analysis of a tissue sample. An agent is physiologically important if the presence of the agent causes a detectable change in the physiology of the recipient patient.
治療適用
本発明のOSM中和抗体、その抗原結合断片、又は特定の変異体を使用して、細胞、組織、臓器又は動物(哺乳動物及びヒトを含む)内で測定し又は効果をもたらして、OSM又OSMを発現する細胞により媒介、影響又は調節される状態の発生を診断し、監視し、調節し、治療し、軽減し、予防を補助する、又は状態の症状を軽減することができる。よって、本発明は、当該技術分野において既知のように、又は本明細書に記載されているように、本発明の少なくとも1つのOSM抗体を用いて、細胞、組織、臓器、動物、又は患者における少なくとも1つのOSM関連疾患を調節又は治療するための方法を提供する。
Therapeutic application Using the OSM neutralizing antibodies, antigen-binding fragments, or specific variants thereof of the present invention to measure or produce effects in cells, tissues, organs or animals (including mammals and humans) The occurrence of a condition mediated, affected or regulated by cells expressing OSM or OSM can be diagnosed, monitored, regulated, treated, reduced, aided in prevention, or reduced in symptoms of the condition. Thus, the present invention relates to cells, tissues, organs, animals, or patients using at least one OSM antibody of the present invention as known in the art or as described herein. Methods are provided for modulating or treating at least one OSM-related disorder.
OSMは、炎症に関与する様々な疾患状態において上方制御することが知られており、骨形成、軟骨分解、コレステロールの取り込み、痛み、及び炎症を含む様々な生物学的役割にかかわってきた。特別な適応症については以下に論述する。 OSM is known to be up-regulated in various disease states involved in inflammation and has been implicated in various biological roles including bone formation, cartilage degradation, cholesterol uptake, pain, and inflammation. Special indications are discussed below.
適応症
本発明の発明者は、OSMが軟骨破壊を媒介することを示し、OSMが組織外植片からの関節内マトリックスにおいて、軟骨細胞分解をもたらすことを示した。OSMは、T.Cawston et al(1998,Arthritis and Rheumatism,41(10)1760〜1771)に示されるように軟骨からのコラーゲン放出を促進することができるTNFα等のサイトカイン放出も促進し、現在、M71結合ドメインとして例示される抗体が全身性サイトカイン放出を遮断することができる。本発明の抗体であるM55、M64、M69、及びM71は、マクロファージ−軟骨細胞共培養系においてプロテオグリカン合成をOSM特異的抗体の不在下で見られるレベルより上に増加させる能力を示した。
Indications The inventors of the present invention have shown that OSM mediates cartilage destruction and that OSM results in chondrocyte degradation in the intra-articular matrix from tissue explants. The OSM As shown in Cawston et al (1998, Arthritis and Rheumatism, 41 (10) 1760-1771), it also promotes the release of cytokines such as TNFα that can promote the release of collagen from cartilage, and is now exemplified as an M71 binding domain Antibodies that are capable of blocking systemic cytokine release. The antibodies of the present invention, M55, M64, M69, and M71, showed the ability to increase proteoglycan synthesis above the level seen in the absence of OSM-specific antibodies in a macrophage-chondrocyte co-culture system.
本発明者は、本発明の中和抗OSM抗体を投与することにより、インビボでIL−6、IP−10、及びKC等のOSM誘導サイトカイン及びケモカイン放出を阻害することを更に示した。IP−10、すなわちインターフェロンγ誘発タンパク質10kDa又は低誘発性サイトカインB10は、ヒトにおいて、CXCL10遺伝子(C−X−Cモチーフケモカイン10(CXCL10))によりコードされるタンパク質である。CXCL10は、単球/マクロファージ、T細胞、NK細胞、及び樹状細胞における化学誘引、並びに内皮細胞へのT細胞付着促進等の幾つかの役割に起因する。現在ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド1(CXCL1)として知られるKCは、以前はGRO1癌遺伝子、GROα、好中球活性化タンパク質3(NAP−3)、及びメラノーマ成長刺激活性α(MSGA−α)とも呼ばれたCXCケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ヒトにおいて、このタンパク質は、CXCL1遺伝子によりコードされる。CXCL1は、マクロファージ、好中球、及び上皮細胞によって発現し、好中球化学誘引物質活性を有する。
The inventors have further shown that administration of neutralizing anti-OSM antibodies of the invention inhibits OSM-induced cytokine and chemokine release, such as IL-6, IP-10, and KC, in vivo. IP-10, i.e. interferon gamma-inducing
したがって、本発明によると、変形性関節症、炎症性関節症、又は炎症性障害等の関節性プロテオグリカン分解性疾患の治療又は予防用の薬剤の製造において、M5、M6、M9、M10、M42、M45、M53、M54、M55、M62、M63、M65、M66、M67、M68、M69、M71、及びM83の群から選択される抗体又は抗体断片の使用が提供される。OSMの拮抗薬の具体的な使用は、薬剤の製造において、軟骨からのコラーゲン放出を防止する又は減少させることである。本発明は、gp130へのOSM結合を遮断する有効量のそのような抗体をそのような障害に罹患する患者に投与する工程を含む、炎症性関節症若しくは炎症性障害の治療又は予防のための方法を更に提供する。 Therefore, according to the present invention, in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of articular proteoglycan degrading diseases such as osteoarthritis, inflammatory arthropathy, or inflammatory disorders, M5, M6, M9, M10, M42, There is provided the use of an antibody or antibody fragment selected from the group of M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71, and M83. A specific use of OSM antagonists is to prevent or reduce collagen release from cartilage in the manufacture of drugs. The invention relates to the treatment or prevention of inflammatory arthropathy or inflammatory disorders comprising administering to a patient suffering from such a disorder an effective amount of such an antibody that blocks OSM binding to gp130. A method is further provided.
本発明の抗体は、OSMが、直接又は間接的に、炎症性サイトカインの放出等を通して組織又は臓器、特に皮膚、肺、及び関節部に病変形成をもたらす炎症性過程の治療用の調製物に使用され得る。そのような病態は、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、神経障害性関節症、反応性関節炎、回旋腱板裂傷関節症、リウマチ熱、ライター症候群、全身性進行性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、多発性筋炎、類肉腫症、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、CNS炎症性障害、抗原−抗体複合体媒介疾患、自己免疫溶血性貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス病、レイノー病、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、AIDSの自己免疫合併症、萎縮性胃炎、及びアジソン病、内毒血症、若しくは敗血性ショック(敗血症)、又は敗血症の症状の1つ以上、並びに他の種類の急性及び慢性炎症を含む。本発明の方法からより具体的に利益を得ることができるこれらの患者は、大腸菌、インフルエンザ菌B、ナイセリア髄膜炎、ブドウ球菌、又は肺炎球菌の感染に罹患する者である。敗血症のリクスのある患者は、火傷、創傷、腎不全又は肝不全、外傷、火傷、易感染性(HIV)、造血性新生物、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、又は心臓粘液腫に罹患する者を含む。 The antibodies of the present invention are used in preparations for the treatment of inflammatory processes in which OSM causes lesion formation in tissues or organs, particularly skin, lungs and joints, directly or indirectly through the release of inflammatory cytokines, etc. Can be done. Such conditions include osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, neuropathic arthritis, reactive arthritis, rotator cuff tear arthropathy, rheumatic fever, Reiter syndrome, systemic progressive Sclerosis, primary biliary cirrhosis, pemphigus, pemphigoid, necrotizing vasculitis, myasthenia gravis, multiple sclerosis, lupus erythematosus, polymyositis, sarcoidosis, granulomatosis, vasculitis, Pernicious anemia, CNS inflammatory disorder, antigen-antibody complex-mediated disease, autoimmune hemolytic anemia, Hashimoto's thyroiditis, Graves' disease, Raynaud's disease, glomerulonephritis, dermatomyositis, chronic active hepatitis, celiac disease, AIDS self Includes one or more of immune complications, atrophic gastritis, and Addison's disease, endotoxemia, or septic shock (sepsis), or symptoms of sepsis, and other types of acute and chronic inflammation. Those patients who can benefit more specifically from the methods of the present invention are those suffering from infection with E. coli, Haemophilus influenzae B, Neisseria meningitis, staphylococci, or pneumococci. Patients with sepsis risk suffer from burns, wounds, renal or liver failure, trauma, burns, susceptibility to infection (HIV), hematopoietic neoplasia, multiple myeloma, Castleman's disease, or cardiac myxoma Including
OSMに関連し、本発明の抗体を用いた治療又は予防療法に適している他の状態は、肺線維症、糖尿性腎障害、特発性肺線維症、全身性硬化症、及び肝硬変等の線維性疾患を含む。本発明の抗体の使用の別の適応症は、後根神経節の神経に関与する侵害受容性痛の治療又は防止においてである。 Other conditions related to OSM and suitable for treatment or prophylactic therapy using the antibodies of the present invention are fibers such as pulmonary fibrosis, diabetic nephropathy, idiopathic pulmonary fibrosis, systemic sclerosis, and cirrhosis. Includes sexually transmitted diseases. Another indication for the use of the antibodies of the invention is in the treatment or prevention of nociceptive pain involving the nerves of the dorsal root ganglia.
投与及び用量
本発明は、OSM中和抗体の安定な製剤を提供するものであって、好ましくは、水性リン酸緩衝生理食塩水又は混合塩水だけでなく、保存加工された溶液及び製剤、並びに、薬学的用途又は家畜への使用に適した多目的の保存加工された製剤であり、薬学上許容できる製剤には少なくとも1つのOSM中和抗体が含まれている。好適な媒体及びその製剤(他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691〜1092、具体的にはpp.958〜989に記載されている。
Administration and Dosage The present invention provides stable formulations of OSM neutralizing antibodies, preferably not only aqueous phosphate buffered saline or mixed saline, but also stored solutions and formulations, and A multi-purpose preserved formulation suitable for pharmaceutical use or use in livestock, wherein the pharmaceutically acceptable formulation includes at least one OSM neutralizing antibody. Suitable vehicles and formulations thereof (including other human proteins such as human serum albumin) are described in, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D. et al. B. ed. , Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-11092, specifically pp. 958-989.
本明細書に記載される安定した若しくは保存加工された製剤又は溶液におけるOSM中和抗体は、当該技術分野に周知の移植片、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプにおいて製剤又は当業者が認識する他の手段を使用して、静脈内(I.V.)、筋肉内(I.M.)、皮下(S.C.)、経皮、肺動脈、経粘膜を含む様々な送達方法を介して本発明により患者に投与され得る。 OSM neutralizing antibodies in stable or preserved formulations or solutions described herein may be formulated in implants, osmotic pumps, cartridges, micropumps well known in the art or others recognized by those skilled in the art. This method can be used via various delivery methods including intravenous (IV), intramuscular (IM), subcutaneous (SC), transdermal, pulmonary artery, transmucosal. It can be administered to a patient according to the invention.
例えば、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段等の身体部分又は腔に対して部位特異的投与を行ってもよい。 For example, parenteral, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraarticular, intrabronchial, intraperitoneal, intracapsular, intrachondral, sinus, intracavitary, intracerebellar, intraventricular, intracolonic, intracervical, intragastric, Intrahepatic, intramyocardial, intraosseous, intrapelvic, intrapericardial, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatic, intrapulmonary, intrarectal, intrarenal, intraretinal, spinal cord, intracapsular, intrathoracic, intrauterine, bladder Site-specific administration may be performed on body parts or cavities such as internal, intralesional, bolus, intravaginal, rectal, buccal, sublingual, intranasal, or transdermal means.
一般的に、抗体の全身投与量を投与する場合、約1ng/kg〜100ng/kg、100ng/kg〜500ng/kg、500ng/kg〜1μg/kg、1μg/kg〜100μg/kg、100μg/kg〜500μg/kg、500μg/kg〜1mg/kg、1mg/kg〜50mg/kg、50mg/kg〜100mg/kg、100mg/kg〜500mg/kg(レシピエントの体重)の範囲の投与量の抗体をレシピエントに提供することが望ましいが、より少ない又はより多い投与量を投与してもよい。もちろん、本発明の拮抗薬の好適な投与量は、治療される疾患又は障害、投与経路、及び治療される個人の年齢及び体重、並びに拮抗薬の性質等の要因によって変動する。特定の任意の投与量に拘束されることなく、例えば、非経口的投与において、0.01〜20mg/kgの日用量の本発明の抗体(又は他の巨大分子)(通常、上記の薬学的組成物の一部として存在する)が、典型的な成人を治療するのに好適であってもよいと考えられている。 Generally, when administering systemic doses of antibodies, about 1 ng / kg to 100 ng / kg, 100 ng / kg to 500 ng / kg, 500 ng / kg to 1 μg / kg, 1 μg / kg to 100 μg / kg, 100 μg / kg Antibodies at doses ranging from ~ 500 μg / kg, 500 μg / kg to 1 mg / kg, 1 mg / kg to 50 mg / kg, 50 mg / kg to 100 mg / kg, 100 mg / kg to 500 mg / kg (recipient body weight) While it is desirable to provide it to the recipient, smaller or larger doses may be administered. Of course, the preferred dosage of the antagonists of the present invention will vary depending on factors such as the disease or disorder being treated, the route of administration, the age and weight of the individual being treated, and the nature of the antagonist. Without being constrained by any particular dose, for example, parenteral administration, a daily dose of 0.01-20 mg / kg of the antibody (or other macromolecule) of the present invention (usually the pharmaceutical agent described above) It is believed that it may be suitable for treating a typical adult.
治療は、単回投与スケジュール、又は好ましくは、治療の一次過程が、1〜10回別個に投与され、次いで反応を維持又は強化するのに必要な時間間隔他の投与量を投与し(例えば第2の投与量を1〜4ヶ月間投与)、必要に応じて数ヶ月後次の投与(1又は複数)を行う、複数回投与スケジュールで行われ得る。好適な治療スケジュールの例としては、(i)0、1ヶ月及び6ヶ月、(ii)0、7日、及び1ヶ月、(iii)0及び1ヶ月、(iv)0及び6ヶ月、又は疾患症状を低減する、又は疾患の重篤度を低下させると予測される所望の反応を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。 Treatment is a single dose schedule, or preferably, the primary course of treatment is administered separately 1 to 10 times, followed by administration of other doses at time intervals necessary to maintain or enhance the response (eg, first dose). 2 doses for 1 to 4 months), and may be performed on a multiple dose schedule, with the next administration (s) being performed several months later as needed. Examples of suitable treatment schedules include (i) 0, 1 and 6 months, (ii) 0, 7 days, and 1 month, (iii) 0 and 1 month, (iv) 0 and 6 months, or disease Other schedules sufficient to induce a desired response that is expected to reduce symptoms or reduce the severity of the disease.
本発明の抗体は、単独で、又はステロイド(プレドニゾンなど)、シクロホスファミド、シクロスポリンA、若しくはプリン類似体(例えば、メトトレキサート、6−チオグアニン等)等の免疫抑制薬、又は抗リンパ球抗原抗体、抗白血球抗原抗体、TNF拮抗薬(例えば、抗TNF抗体)、若しくはTNF阻害剤(例えば、可溶性TNF受容体)等の抗体、又はNSAID若しくは他のサイトカイン阻害剤等の薬剤と組み合わされて使用され得る。 The antibody of the present invention may be used alone or as an immunosuppressant such as a steroid (such as prednisone), cyclophosphamide, cyclosporin A, or a purine analog (such as methotrexate, 6-thioguanine), or an anti-lymphocyte antigen antibody , Anti-leukocyte antigen antibody, TNF antagonist (eg, anti-TNF antibody), or antibody such as TNF inhibitor (eg, soluble TNF receptor), or used in combination with drugs such as NSAID or other cytokine inhibitors obtain.
ここで、以下の具体的及び非限定的な実施例を参照して、本発明を説明する。 The invention will now be described with reference to the following specific and non-limiting examples.
実施例1:試薬及びアッセイ
OSM結合抗体を選択し、特徴付けるために、ヒト及びカニクイザルOSMの構築物が哺乳動物の細胞発現のために生成された。ヒトOSM(NM_020530によってコードされたNP_065391)は、227のアミノ酸(配列番号11)の完全長の分泌タンパク質に加工される252のアミノ酸前駆体であり、これは、より完全な活性成熟形態のアミノ酸1〜184に更に加工されるプロタンパク質である。ヒトOSM cDNAは、OriGene(カタログ番号SC121421)から注文し、OriGeneクローンからヒトOSMのORFをPCRにより増幅し、タンパク質精製のためのヘキサHisタグ、及び部位指向タンパク質ビオチン化のためのAviTag(配列番号56)と共にシグナルペプチド(マウスIgG1)を導入した。後者は、受容体と相互作用するOSMの周辺に存在するリジン残基の無作為な化学ビオチン化を避けるために選択された。
Example 1: Reagents and Assays To select and characterize OSM-binding antibodies, human and cynomolgus OSM constructs were generated for mammalian cell expression. Human OSM (NP — 065391 encoded by NM — 020530) is a 252 amino acid precursor that is processed into a full-length secreted protein of 227 amino acids (SEQ ID NO: 11), which is the more complete active mature form of amino acid 1 A proprotein that is further processed to ~ 184. Human OSM cDNA was ordered from OriGene (Cat. No. SC121421), human OSM ORFs were amplified by PCR from OriGene clones, hexa-His tag for protein purification, and AviTag (Sequence ID No.) for site-directed protein biotinylation. 56) and a signal peptide (mouse IgG1) was introduced. The latter was chosen to avoid random chemical biotinylation of lysine residues present around the OSM that interacts with the receptor.
カニクイザルOSMは、cDNAを得るためにSuperscript III first strand synthesis system(InVitrogen)を使用して、カニクイザルPBMCのRNAからクローン化され、次に、米国特許出願第12/648430号に記載されるように、ヒトOSM配列から設計したUTRプライマーを使用してPCR増幅された。発現した完全長タンパク質を配列番号12に示し、切断された、活性形態は51〜227の184の残基により表される。 Cynomolgus OSM was cloned from cynomolgus PBMC RNA using Superscript III first strand synthesis system (InVitrogen) to obtain cDNA, and then as described in US patent application Ser. No. 12 / 648,430. PCR was amplified using UTR primers designed from human OSM sequences. The expressed full-length protein is shown in SEQ ID NO: 12, and the cleaved, active form is represented by residues 184 of 51-227.
ヒト及びカニクイザルOSMの前駆体及び成熟形態は、HEK 293で発現し、標準的な方法論を使用して精製された。タンパク質の機能的活動は、対照として大腸菌由来の市販のヒトOSM(R&D Systems、カタログ番号295−OM)を使用して、A375−S2細胞増殖及びpSTAT3シグナル伝達アッセイにおいて試験された。 Precursor and mature forms of human and cynomolgus monkey OSM were expressed in HEK 293 and purified using standard methodology. The functional activity of the protein was tested in the A375-S2 cell proliferation and pSTAT3 signaling assay using a commercial human OSM from E. coli (R & D Systems, catalog number 295-OM) as a control.
Mabs
対照抗体が使用された場合、CNTO6234と命名されるヒトIgG1アイソタイプ抗体が使用された。
Mabs
When a control antibody was used, a human IgG1 isotype antibody designated CNTO6234 was used.
化学ビオチン化
サイトカイン上のアミン残基を標的とするNHS−エステルケミストリー(EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotinylation Kit、Pierce,#21435)を使用して、組み換えヒトOSMをビオチン化した。ビオチンカップリング反応は、1モルの抗原当り1モルのビオチンの標的標識効率について最適化された。後者は、結合及び機能活性の損失を最小にし、一方で、タンパク質集団のほぼ完全な標識を確実にする。反応の完了時に、EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotinylation Kit(Pierce)に含まれるZeba Desalt Spin Columnsを使用して、遊離ビオチン試薬及び残りの脱離基からタンパク質を精製した。約80%の出発原料を回収した。ビオチンの取り込みのレベルを測定するために、1モルのヒトOSM当り約1モルのビオチンを示す、HABAアッセイ(Pierce Biotin Quantitation Kit,#28005)を使用した。ビオチン化タンパク質におけるストレプトアビジンカップリング及びgp130−Fc(R&D Systems、カタログ番号671−GP)結合の両方を検証するために、Octet機器(ForteBIO)を使用した。Octet測定値は、ビオチン化ヒトOSMが未標識の出発原料と基本的に同一のプロファイルで、gp130に結合したことを示した。
Chemical biotinylation Recombinant human OSM was biotinylated using NHS-ester chemistry (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit, Pierce, # 21435) targeting amine residues on cytokines. The biotin coupling reaction was optimized for the target labeling efficiency of 1 mole biotin per mole antigen. The latter minimizes binding and loss of functional activity while ensuring nearly complete labeling of the protein population. Upon completion of the reaction, the protein was purified from the free biotin reagent and the remaining leaving groups using the Zeba Desert Spin Columns included in the EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit (Pierce). Approximately 80% starting material was recovered. To measure the level of biotin uptake, a HABA assay (Pierce Biotin Quantation Kit, # 28005) was used, which shows approximately 1 mole of biotin per mole of human OSM. An Octet instrument (ForteBIO) was used to verify both streptavidin coupling and gp130-Fc (R & D Systems, catalog number 671-GP) binding in biotinylated proteins. Octet measurements showed that biotinylated human OSM bound to gp130 with essentially the same profile as the unlabeled starting material.
インビトロ標的ビオチン化
15残基AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE)(配列番号56)は、内因性BirA基質BCCPと類似するビオチンアクセプター動態を有する(Beckett et.al.1999,Protein Science)。関心のタンパク質に連結される際、1つのアクセプターリジン残基を有するAviTagは、1つの位置でのみビオチン化される。組み換えカニクイザルOSMは、Avidityから商業的に入手可能なビオチン−タンパク質リガーゼ及び試薬を使用して、インビトロで部位特異的にビオチン化された。一価のストレプトアビジン親和性樹脂を使用して、ビオチン化カニクイザルOSMを精製した。得られたタンパク質の質は、SDS−PAGE及びSEC−HPLCによって評価された。ビオチンの取り込みのレベルを測定するために、1モルのカニクイザルOSM当り約1モルのビオチンを示す、HABAアッセイ(Pierce Biotin Quantitation Kit,#28005)が使用された。ビオチン化タンパク質におけるストレプトアビジンカップリング及びgp130−Fcキメラ結合の両方を検証するために、Octet機器(ForteBIO)を使用した。Octet測定値は、ビオチン化カニクイザルOSMが未標識の出発原料と基本的に同一のプロファイルで、gp130に結合したことを示した。
In Vitro Target Biotinylation 15 Residue AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO: 56) has biotin acceptor kinetics similar to the endogenous BirA substrate BCCP (Beckett et. Al. 1999, Protein Science). When linked to a protein of interest, AviTag with one acceptor lysine residue is biotinylated at only one position. Recombinant cynomolgus monkey OSM was site-specific biotinylated in vitro using biotin-protein ligase and reagents commercially available from Avidity. Biotinylated cynomolgus OSM was purified using monovalent streptavidin affinity resin. The quality of the obtained protein was evaluated by SDS-PAGE and SEC-HPLC. To measure the level of biotin uptake, a HABA assay (Pierce Biotin Quantitation Kit, # 28005) was used which shows approximately 1 mole of biotin per mole of cynomolgus OSM. An Octet instrument (ForteBIO) was used to verify both streptavidin coupling and gp130-Fc chimera binding in biotinylated proteins. Octet measurements showed that biotinylated cynomolgus OSM bound to gp130 with essentially the same profile as the unlabeled starting material.
固相免疫アッセイ
最初のファージ−Fabパンニングには、TBS中の2μg/mLのビオチン化ヒトOSM又はカニクイザルOSMでコーティングされたNEUTRAVIDIN(商標)ELISAプレート(Pierce)を使用した。4℃で一晩インキュベートし、遮断、そして洗浄した後、パンニングの各回からのポリクローナルファージプールの1:100希釈物を添加した。pVIIIに特異的なHRP抱合モノクローナル、M13ファージ主要コートタンパク質(GE Healthcare、カタログ番号27−9421−01)、次に、化学発光基質POD(Roche、カタログ番号11582950001)の添加、そしてPerkinElmer機器で読み取り、結合ファージを検出した。
Solid Phase Immunoassay For initial phage-Fab panning, NETRAVIDIN ™ ELISA plates (Pierce) coated with 2 μg / mL biotinylated human OSM or cynomolgus OSM in TBS were used. After overnight incubation at 4 ° C., blocking and washing, a 1: 100 dilution of the polyclonal phage pool from each round of panning was added. pRP-specific HRP-conjugated monoclonal, M13 phage major coat protein (GE Healthcare, catalog number 27-9421-01), followed by addition of chemiluminescent substrate POD (Roche, catalog number 11582950001) and read on a PerkinElmer instrument, Bound phage was detected.
個々のクローンの最初のスクリーニングは、大腸菌の上清からの分泌された可溶性Fab−Hisタンパク質を使用して実施された。可溶性Fab−Hisタンパク質を含有する細菌由来の上清は、ELISA形式で結合を行うために使用された。Black MaxiSorpプレート(Nunc、カタログ番号437111)を1μg/mLのヒツジ抗ヒトFd(CH1)抗体(The Binding Site、カタログ番号PC075)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、遮断した後、50μLの未希釈の細菌由来の上清(Fab−Hisタンパク質を含有する)を添加し、穏やかに振盪しながら室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、20nMのビオチン化ヒト又はカニクイザルOSMを、捕捉したFabに添加した。室温で1時間後、SA−HRP(Invitrogen、カタログ番号43−4323)を添加し、上述のように化学発光検出を行った。20nMの濃度のヒトOSMを用いた一次結合ELISAスクリーニングが、ナノモルの親和性範囲の親和性でクローンの検出を可能にすることが計算された。 Initial screening of individual clones was performed using secreted soluble Fab-His protein from E. coli supernatant. Supernatant from bacteria containing soluble Fab-His protein was used to perform binding in an ELISA format. Black MaxiSorp plates (Nunc, catalog number 437111) were coated with 1 μg / mL sheep anti-human Fd (CH1) antibody (The Binding Site, catalog number PC075) and incubated at 4 ° C. overnight. After washing and blocking the plate, 50 μL of undiluted bacterial supernatant (containing Fab-His protein) was added and incubated for 1 hour at room temperature with gentle shaking. The plate was washed and 20 nM biotinylated human or cynomolgus OSM was added to the captured Fab. After 1 hour at room temperature, SA-HRP (Invitrogen, catalog number 43-4323) was added and chemiluminescence detection was performed as described above. It was calculated that primary binding ELISA screening with 20 nM concentration of human OSM would allow detection of clones with affinities in the nanomolar affinity range.
エピトープビニング
エピトープビニングは、ヒトIgG1変換mAb及び市販の抗体であるMAB29(OSMRβ/LIFRα動員遮断剤(R遮断剤)として知られる)を使用して実施された結合特徴に基づきMAbを分類するために実施された競合アッセイである。
Epitope binning Epitope binning is used to classify MAbs based on binding characteristics performed using human IgG1 converted mAbs and the commercially available antibody MAB29 (known as OSMRβ / LIFRα mobilization blocker (R blocker)). Competitive assay performed.
384ウェル多重アレイプレート(Meso Scale Discovery(MSD)、L25XA−4)の各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4(Sigma,P3813)中の2.5μg/mLの抗ヒトFc(Jackson Immuno,709−005−149)を添加した。プレートを4℃で一晩インキュベートし、次に室温で1時間、50μLのMSD遮断剤Aで遮断した。384多重アレイプレートを3回洗浄し(PBS pH7.4、0.05%のTween 20(Scytek、PBT010))、各ウェルに1.0μg/mLの試験mAbの溶液を添加し、次に室温で1時間、滴定プレート振盪器上でレベル6で振盪させた。プレートを前回同様、3回洗浄した。 Each well of a 384 well multiplex array plate (Meso Scale Discovery (MSD), L25XA-4) is 2.5 μg / mL anti-human in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 (Sigma, P3813). Fc (Jackson Immuno, 709-005-149) was added. Plates were incubated overnight at 4 ° C. and then blocked with 50 μL of MSD Blocker A for 1 hour at room temperature. The 384 multiplex array plate was washed 3 times (PBS pH 7.4, 0.05% Tween 20 (Scytek, PBT010)) and a solution of 1.0 μg / mL test mAb was added to each well, then at room temperature. Shake at level 6 on a titration plate shaker for 1 hour. The plate was washed 3 times as before.
並行して、5μg/mLの競合mAbの溶液及び1μg/mLのビオチン化OSM(R&D Systems、295−OM−010/CF)を、MSDアッセイ緩衝液(1:3の遮断緩衝液とPBS pH7.4、0.05%のTween 20)中で別の96ウェルプレート(COSTAR、3357)で混合し、室温で1時間、滴定プレート振盪器上でレベル3で振盪させた。競合抗体及びビオチン化OSMのプレ複合体を384多重アレイプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間振盪させた(滴定プレート振盪器上でレベル6)。プレートを3回洗浄し、各ウェルにストレプトアビジンスルホTAG(MSD、R32Ad−S)を添加し、室温で30分間振盪させた(滴定プレート振盪器上でレベル6)。プレートを3回洗浄し、各ウェルに、蒸留水(MSD、R92TC−1)で1:4に希釈した読み取り緩衝液Tを添加した。プレートをMSD S6000機器上で読み取った。
In parallel, a solution of 5 μg / mL competing mAb and 1 μg / mL biotinylated OSM (R & D Systems, 295-OM-010 / CF) were added to MSD assay buffer (1: 3 blocking buffer and PBS pH7. 4. Mixed in another 96 well plate (COSTAR, 3357) in 0.05% Tween 20) and shaken at
自己競合からのシグナル(最大シグナルにおいて2〜4倍減少)と共に、競合mAbが不在(最大シグナル)のビオチン化OSMの存在下で試験mAbにおいて獲得されたシグナルに基づきデータを解釈した。エピトープ競合は、競合mAbの存在下の値が自己競合からの値の3つの標準偏差内であったときに割り当てられた。 Data were interpreted based on the signal obtained in the test mAb in the presence of biotinylated OSM in the absence of competing mAb (maximum signal) along with the signal from self-competition (2-4 fold decrease at maximum signal). Epitope competition was assigned when the value in the presence of competing mAb was within 3 standard deviations of the value from self-competition.
A375細胞
A375細胞(ATCC;CRL−1619)は、悪性メラノーマに由来するヒト上皮細胞である。A375−S2細胞(ATCC;CRL−1872、IL−1に敏感なCRL−1619の亜系統)は、T−175培養フラスコ(Corning、カタログ番号431080)中の10%のFBS(Gibco)で補われた完全成長培地(DMEM/GlutaMax−I,Gibco)中で培養され、約80%のコンフルエントになったとき、1:20の継代培養比で、3日〜4日毎に継代培養された。
A375 cells A375 cells (ATCC; CRL-1619) are human epithelial cells derived from malignant melanoma. A375-S2 cells (ATCC; CRL-1872, a sub-line of CRL-1619 sensitive to IL-1) are supplemented with 10% FBS (Gibco) in a T-175 culture flask (Corning, catalog number 431080). Cultured in complete growth medium (DMEM / GlutaMax-I, Gibco) and subcultured every 3-4 days at a subculture ratio of 1:20 when confluent about 80%.
A375−S2細胞増殖(BrdU取り込み)アッセイ
ヒト又はカニクイザルOSMによるA375−S2細胞増殖の減少を、化学発光ELISAを使用して、BrdU取り込みにより測定した。オンコスタチンMは、A375−S2ヒトメラノーマ細胞系において増殖を減少させた(Zarling et al.PNAS 83:9739〜9743)。この細胞系は、抗体発見の全段階で抗オンコスタチンM抗体を評価するために使用された。A375−S2細胞を、T−150組織培養フラスコ(BD Falcon 35−5001)中で、95% O2−5% CO2、37℃のDMEM(Gibco 11995)+10% FBS(Gibco 16140)+1% Pen/Strep(Gibco 15140)に維持し、1週間に2回1:10に分けた。
A375-S2 Cell Proliferation (BrdU Uptake) Assay Reduction of A375-S2 cell proliferation by human or cynomolgus OSM was measured by BrdU incorporation using a chemiluminescent ELISA. Oncostatin M reduced proliferation in the A375-S2 human melanoma cell line (Zarling et al. PNAS 83: 9739-9743). This cell line was used to evaluate anti-oncostatin M antibodies at all stages of antibody discovery. A375-S2 cells were cultured in T-150 tissue culture flasks (BD Falcon 35-5001) with 95% O2-5% CO2, 37 ° C. DMEM (Gibco 111995) + 10% FBS (Gibco 16140) + 1% Pen / Strep (Gibco 15140) and split 1:10 twice a week.
増殖アッセイを実施するために、細胞をトリプシン処理(0.25%、Gibco 25200)して、T150フラスコから取り出し、次に、黒色のTCコーティングされたプレート(BD Falcon 353948)の内部48ウェルで、200μLのDMEM/FBS/Pen−Strep中で、2000細胞/ウェルの密度で平板培養した。37℃/95% O2−5% CO2で一晩インキュベートした後、培地を取り出し、180μLの新しい培地と交換した。最終濃度の10Xで試験溶液の全てを含有する別のプレートを調製した。適切な実験状態を生成するために、このプレートから20μLを細胞プレートの対応するウェルに移した。各実験状態は、3つ組で試験された。中和を評価した任意の実験において、抗体及びオンコスタチンMは、細胞に添加される少なくとも1時間の間、一緒にインキュベートされた。次に、プレートを37℃/95% O2−5% CO2で更に72時間インキュベートした。この時点で、化学発光BrdU細胞増殖ELISA(Roche 11669915001)を実施した。BrdU標識試薬を4時間培養物に添加した。次に、培地を取り出し、100μLの固定溶液を各ウェルに添加した。室温で30分後、溶液を取り出し、100μL/ウェルの抗BrdU−POD溶液を添加した。室温で2時間後、プレートをPBS−Tweenで洗浄し、100μLのSuper Signal Pico(Thermo Scientific 37069)を各ウェルに添加した。次に、Perkin Elmer Victor3機器を使用して、発光を読み取った。 To perform a proliferation assay, cells were trypsinized (0.25%, Gibco 25200) and removed from the T150 flask, then in the inner 48 wells of a black TC-coated plate (BD Falcon 353948) Plated at a density of 2000 cells / well in 200 μL DMEM / FBS / Pen-Strep. After overnight incubation at 37 ° C./95% O 2-5% CO 2, the medium was removed and replaced with 180 μL of fresh medium. Another plate was prepared containing all of the test solution at a final concentration of 10X. To generate the appropriate experimental conditions, 20 μL from this plate was transferred to the corresponding well of the cell plate. Each experimental state was tested in triplicate. In any experiment that evaluated neutralization, the antibody and Oncostatin M were incubated together for at least 1 hour added to the cells. The plates were then incubated for an additional 72 hours at 37 ° C / 95% O2-5% CO2. At this point, a chemiluminescent BrdU cell proliferation ELISA (Roche 11669915001) was performed. BrdU labeling reagent was added to the culture for 4 hours. The medium was then removed and 100 μL of fixative solution was added to each well. After 30 minutes at room temperature, the solution was removed and 100 μL / well of anti-BrdU-POD solution was added. After 2 hours at room temperature, the plate was washed with PBS-Tween and 100 μL Super Signal Pico (Thermo Scientific 37069) was added to each well. The luminescence was then read using a Perkin Elmer Victor3 instrument.
最初の実験は、増殖の抑制における実験室内で生成したCHO細胞由来組み換えヒト及びカニクイザルのオンコスタチンMの用量応答を決定するために行われた。1〜5希釈で100ng/mLの開始濃度から0.0244ng/mLの最終濃度までOsmを試験した。増殖の%阻害は、ビヒクル対照で処理された細胞と比較して計算された。そのような実験の結果を図2Aに示す。ヒト又はカニクイザルのオンコスタチンMの濃度が増加すると、対応してBrdU取り込みが減少した。抗増殖活性及びEC50の作用の両方の程度に基づいたヒト及びカニクイザルのオンコスタチンMの抗増殖活性は、区別不能である。 The first experiment was conducted to determine the dose response of on-costatin M in laboratory-generated recombinant human and cynomolgus monkeys in the suppression of proliferation. Osm was tested from a starting concentration of 100 ng / mL to a final concentration of 0.0244 ng / mL at 1-5 dilutions. % Inhibition of proliferation was calculated relative to cells treated with vehicle control. The results of such an experiment are shown in FIG. 2A. Increasing concentrations of human or cynomolgus monkey oncostatin M correspondingly reduced BrdU incorporation. The antiproliferative activity of human and cynomolgus monkey Oncostatin M based on both the degree of antiproliferative activity and the effect of EC50 is indistinguishable.
これらの実験に基づき、抗オンコスタチンM抗体を評価し、比較するために、2ng/mLの濃度のオンコスタチンが使用され、それは、この濃度が増殖を約80%阻害し、抗体の用量応答を決定するための大きなウィンドウを提供するからである。抗体の完全な用量範囲は、2ng/mLのヒト又はカニクイザルのオンコスタチンMの存在下で評価された。加えて、アイソタイプ対照は、使用された抗オンコスタチンM抗体の最高濃度の実験に含まれた。アッセイウィンドウは、未処理対照ウェル(最大増殖)と2ng/mLのオンコスタチンMだけ(最小増殖)でインキュベートされたウェルとの間の相違により画定され、抗体の任意の濃度での%中和は、このウィンドウ内で画定された。 Based on these experiments, a concentration of 2 ng / mL of oncostatin was used to evaluate and compare anti-oncostatin M antibodies, which inhibits proliferation by approximately 80% and increases antibody dose response. This is because it provides a large window for making decisions. The complete dose range of the antibody was evaluated in the presence of 2 ng / mL human or cynomolgus monkey oncostatin M. In addition, an isotype control was included in the experiment with the highest concentration of anti-oncostatin M antibody used. The assay window is defined by the difference between untreated control wells (maximum growth) and wells incubated with 2 ng / mL Oncostatin M alone (minimum growth), and% neutralization at any concentration of antibody is Defined within this window.
A375−S2 Phospho−STAT3アッセイを使用したpSTAT3シグナル伝達
OSMは、細胞表面受容体gp130に結合し、OSMRβにより受容体ヘテロ二量体化を誘発して、シグナル伝達分子STAT3の活性化(リン酸化反応)を含む細胞内シグナル伝達カスケードを開始させることにより、A375−S2細胞の成長を阻害する(Kortylewski et al.,Oncogene 18:3742〜3753,1999)。STAT3シグナル伝達の乱れは、A375−S2細胞のOSM成長阻害を破壊し、STAT3活性化がOSMシグナル伝達において主要な工程であることを示す(Heinrich et al.,Biochem.J.374:1〜20,2003)。A375−S2細胞におけるSTAT3リン酸化反応は、OSM濃度依存であることが示され、刺激された細胞でそれを測定するための市販のキットが入手可能である。A375−S2細胞におけるOSM誘発STAT3リン酸化反応の中和は、Mab候補の一次スクリーニングアッセイとして選択された。
PSTAT3 signaling using the A375-S2 Phospho-STAT3 assay OSM binds to the cell surface receptor gp130 and induces receptor heterodimerization by OSMRβ to activate the signaling molecule STAT3 (phosphorylation) Inhibiting the growth of A375-S2 cells by initiating an intracellular signaling cascade including (Kortylewski et al., Oncogene 18: 3742-3753, 1999). Disturbances in STAT3 signaling disrupt OSM growth inhibition in A375-S2 cells, indicating that STAT3 activation is a major step in OSM signaling (Heinrich et al., Biochem. J. 374: 1-20). , 2003). STAT3 phosphorylation in A375-S2 cells has been shown to be OSM concentration dependent and commercial kits are available to measure it in stimulated cells. Neutralization of OSM-induced STAT3 phosphorylation in A375-S2 cells was selected as the primary screening assay for Mab candidates.
OSM誘発STAT3リン酸化反応の抗体中和において、A375−S2細胞は、完全成長培地で200μL中25,000細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレート(Corning、カタログ番号3596)に播種され、24時間インキュベートされる。10μg/mLから開始して1:5に連続希釈された実験用mAbと共に3時間室温で予めインキュベートされた5ng/mLのヒトOSM(組み換えの哺乳動物の細胞由来、OSMN1−1)を含有する溶液で細胞を処理する。対照は、未処理細胞、刺激された細胞(5ng/mLのOSMのみ)、及びhIgG1アイソタイプ対照mAbを含む。全ての処理は、特に記載のない限り、3つ組で実施される。 In antibody neutralization of OSM-induced STAT3 phosphorylation, A375-S2 cells were seeded in 96-well tissue culture plates (Corning, catalog # 3596) at 25,000 cells / well in 200 μL in complete growth medium and incubated for 24 hours. Is done. Solution containing 5 ng / mL human OSM (derived from recombinant mammalian cells, OSMN1-1) pre-incubated for 3 hours at room temperature with experimental mAb serially diluted 1: 5 starting from 10 μg / mL Treat cells with. Controls include untreated cells, stimulated cells (5 ng / mL OSM only), and hIgG1 isotype control mAb. All processing is performed in triplicate unless otherwise noted.
pSTAT3内容物の分析は、Phospho−STAT3 Whole−Cell Lysate Kit(MSD、カタログ番号K150DID−1、ロット番号K0010570)、次に製造者のプロトコルを使用して行われる。簡潔に、細胞を200μL/ウェル容積で10分間処理し、処理溶液を取り出し、50μLの細胞MSD溶解緩衝液を多重チャネルピペットを介して添加する。プレートを軌道振盪器(300RPM)上に5分間設置する。その後、30μLの各溶解物をMSD phospho−STAT3の96ウェルプレートに移す。プレートを密封し、室温で1時間、軌道振盪器(300RPM)上に設置し、150μLのMSD洗浄緩衝液で3回洗浄し、25μLの二次検出抗体抱合体(抗pSTAT3−Ru(bpy)32+)を各ウェルに添加し、再度密封し、室温で1時間、軌道振盪器(300RPM)上でインキュベートする。プレートを前と同様に洗浄し、150μLのMSD読み取り緩衝液(トリプロピルアミン溶液)を各ウェルに添加した。プレートをMSD SECTOR Imager 6000機器上で読み取る。 Analysis of the pSTAT3 contents is performed using the Phospho-STAT3 Whole-Cell Lysate Kit (MSD, catalog number K150DID-1, lot number K0010570) and then the manufacturer's protocol. Briefly, cells are treated at 200 μL / well volume for 10 minutes, the processing solution is removed, and 50 μL of cell MSD lysis buffer is added via a multichannel pipette. Place plate on orbital shaker (300 RPM) for 5 minutes. Thereafter, 30 μL of each lysate is transferred to an MSD phospho-STAT3 96 well plate. The plate was sealed and placed on an orbital shaker (300 RPM) for 1 hour at room temperature, washed 3 times with 150 μL MSD wash buffer, and 25 μL secondary detection antibody conjugate (anti-pSTAT3-Ru (bpy) 32+ ) Is added to each well, resealed and incubated on an orbital shaker (300 RPM) for 1 hour at room temperature. The plate was washed as before and 150 μL of MSD reading buffer (tripropylamine solution) was added to each well. The plate is read on an MSD SECTOR Imager 6000 instrument.
インライン成熟された親及び対照mAbの完全なEC50用量応答曲線を得、正規化した% pSTAT3シグナルとしてプロットした。 Complete EC50 dose response curves of in-line matured parent and control mAbs were obtained and plotted as normalized% pSTAT3 signal.
表面プラズモン共鳴(Biacore)による親和性測定
前述のヒト又はカニクイザルOSM構築物を用い、Biacore 3000光バイオセンサー(Biacore)を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により結合親和性を測定した。アミンカップリングケミストリーの製造者の指示を用いて、抗マウス(Jackson、カタログ番号315−005−046)及び抗ヒト(Jackson、カタログ番号109−005−098)の抗IgG Fc抗体混合物をカルボキシメチル化デキストラン表面のCM−5チップ(Biacore、カタログ番号BR−1000−14)にカップリングすることにより、バイオセンサー表面を調製した。抗OSM抗体の約19,000RU(反応単位)を、4つのフローセルそれぞれに固定化した。ランニング緩衝液(DPBS+0.005% P20+3mM EDTA)の中で25℃で速度実験を実施した。100nM〜0.412nMの範囲の連続希釈ヒト及びカニクイザルOSM ECDをランニング緩衝液中で調製した。約200RUのmAbをセンサーチップのフローセル2〜4の上に捕捉した。フローセル1は、参照表面として用いた。mAbの捕捉に続いて、抗原を50μL/分で3分間注入(結合相)し、次いで緩衝液フロー(解離相)を10分間注入した。100mMのH3PO4(Sigma、カタログ番号7961)の50μL/分での18秒注入の2つのパルスによってチップ表面を再生した。
Affinity measurement by surface plasmon resonance (Biacore) Binding affinity was measured by surface plasmon resonance (SPR) using the
BIAevaluationソフトウェア(Biacore、バージョン3.2)を使用して、収集したデータを加工した。先ず、アナライト注入の参照サブトラクション曲線から、バッファ注入によって生成された曲線を引くことにより、データからの2倍の参照サブストラクションが行われた。データの速度分析を、1:1の結合モデルと全体的適合を用いて実施した。各mAbの結果を、Ka(オン速度)、Kd(オフ速度)、及びKD(親和性定数)の形で報告した。 The collected data was processed using BIAevaluation software (Biacore, version 3.2). First, the reference subtraction from the data was doubled by subtracting the curve generated by buffer injection from the reference subtraction curve of the analyte injection. A rate analysis of the data was performed using a 1: 1 binding model and global fit. The results for each mAb were reported in the form of Ka (on rate), Kd (off rate), and K D (affinity constant).
実施例2:OSM結合FABの選択
新規Fab−pIXライブラリは、Shi et al.J Mol Biol397:385〜396,2010、WO第09085462A1号、U.S.第12/546850号に記載され、本明細書の上記において、IMGT命名法において、IGHV1−69(配列番号1)、IGHV3−23(配列番号2)、又はIGHV5−51(配列番号3)で使用される重鎖ヒト生殖系列フレームワークに言及する169、323、及び551と呼ばれる。3つの重鎖ライブラリフレームワークは、4つの軽鎖ライブラリVLカッハ゜フレームワーク:A27(IGKV3−20*01(配列番号5))、B3(IGKV4−1*01(配列番号6))、L6(IGKV3−11*01(配列番号7))、及びO12(IGKV1−39*01(配列番号8))と組み合わされる。ライブラリにおいて、Fabs V領域は、重鎖に配列番号4及び軽鎖に配列番号10を含むJ領域(FR4)の追加により完成する。重鎖CDR3は、7〜14残基の可変長のものである。各ライブラリの完全なV領域の例は、図1に示され、付番され、CDR領域はKabatに従い示される。
Example 2: Selection of OSM-binding FAB A new Fab-pIX library was prepared by Shi et al. J Mol Biol 397: 385-396, 2010, WO 0908462A1, U.S. Pat. S. 12/546850, as used herein above and in IMGT nomenclature with IGHV1-69 (SEQ ID NO: 1), IGHV3-23 (SEQ ID NO: 2), or IGHV5-51 (SEQ ID NO: 3) Referred to as 169, 323, and 551 which refer to the heavy chain human germline framework. The three heavy chain library frameworks are the four light chain library VL Cach frameworks: A27 (IGKV3-20 * 01 (SEQ ID NO: 5)), B3 (IGKV4-1 * 01 (SEQ ID NO: 6)), L6 (IGKV3 -11 * 01 (SEQ ID NO: 7)), and O12 (IGKV1-39 * 01 (SEQ ID NO: 8)). In the library, the Fabs V region is completed by the addition of a J region (FR4) comprising SEQ ID NO: 4 in the heavy chain and SEQ ID NO: 10 in the light chain. The heavy chain CDR3 has a variable length of 7 to 14 residues. Examples of complete V regions for each library are shown and numbered in FIG. 1, and CDR regions are shown according to Kabat.
初期の一式の抗OSMファージ提示ヒットは、市販のグリコシル化ヒトOSMを使用して同定された。Fab−pIXファージ提示ライブラリは、常磁性ストレプトアビジン(SA)ビーズ(Invitrogen、カタログ番号112.05D)上に捕捉したビオチン化ヒトOSM(R&D Systems、カタログ番号295−OM)、次に公開されたファージ選択のプロトコル(Marks and Bradbury,Antibody Engineering,Vol.248:161〜176,Humana Press,2004)を使用してパンニングされた。簡潔に、ビオチン化ヒトOSMが100nMの最終濃度に未抱合ビーズ上に前吸着されたファージライブラリに添加され、穏やかに回転させながら1時間インキュベートされた。遮断されたSAビーズを添加し、結合ファージによりビオチン化OSMを捕捉するために15分間インキュベートした。磁気的に捕捉したファージ/抗原/ビーズ複合体を1mLのTBSTで5回、1mLのTBSで1回洗浄した。最後のTBS洗浄の除去後、1mLの指数的に成長するTG1細胞(Stratagene、カタログ番号200123)を添加し、振盪させずに30分間、37℃でインキュベートした。感染細菌をLB/寒天(1%グルコース/100μg/mLカルベニシリン)プレート(Teknova、カタログ番号L5804)上に撒き、37℃で一晩インキュベートした。菌叢をこすり落とし、グリセロールストック[15%グリセロール/カルベニシリン(100μg/mL)/2xYT]を調製し、−80℃で保管した。2回目のパンニング用のファージを調製するために、25mLの2xYT/カルベニシリン(100μg/mL)を25μLの細菌由来のグリセロールストックと共に播種し、ほぼ0.5のOD600まで、37℃で成長させた。ヘルパーファージVCSM13(Stratagene、カタログ番号200251)を約10:1の感染の多重度で培養物に添加し、振盪させずに30分間、37℃でインキュベートを行った。細菌を沈降させ、ペレットを誘導培地(2xYT/Carb/Kan/IPTG)に再懸濁し、一晩30℃で成長させた。ファージを2% PEG/0.25M NaCl(最終濃度)で沈殿させ、2mLのPBSに再懸濁した。初回のファージを4℃で保管し、2回目のパンニングを行うために使用した。パンニングパラメータは、1回目が100nMの抗原、室温で1時間インキュベート、TBSTで洗浄5x、次にTBSで洗浄1x;2回目が10nMの抗原、室温で1時間インキュベート、TBSTで洗浄10x/TBSで洗浄1x;そして3回目が1nMの抗原、16時間(一晩)4℃でインキュベート、TBSTで洗浄10x/TBSで洗浄1xであった。
An initial set of anti-OSM phage display hits was identified using commercially available glycosylated human OSM. The Fab-pIX phage display library is a biotinylated human OSM (R & D Systems, catalog number 295-OM) captured on paramagnetic streptavidin (SA) beads (Invitrogen, catalog number 112.05D), then the published phage Panned using the protocol of choice (Marks and Bradbury, Antibody Engineering, Vol. 248: 161-176, Humana Press, 2004). Briefly, biotinylated human OSM was added to a phage library pre-adsorbed on unconjugated beads to a final concentration of 100 nM and incubated for 1 hour with gentle rotation. Blocked SA beads were added and incubated for 15 minutes to capture biotinylated OSM by bound phage. The magnetically captured phage / antigen / bead complex was washed 5 times with 1 mL TBST and once with 1 mL TBS. After removal of the last TBS wash, 1 mL of exponentially growing TG1 cells (Stratagene, catalog number 200123) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes without shaking. Infected bacteria were plated on LB / agar (1% glucose / 100 μg / mL carbenicillin) plates (Teknova, catalog number L5804) and incubated overnight at 37 ° C. The bacterial flora was scraped off, and a glycerol stock [15% glycerol / carbenicillin (100 μg / mL) / 2 × YT] was prepared and stored at −80 ° C. To prepare phage for the second round of panning, 25 mL of 2 × YT / carbenicillin (100 μg / mL) was seeded with 25 μL of glycerol stock from bacteria and grown at 37 ° C. to an OD600 of approximately 0.5. Helper phage VCSM13 (Stratagene, catalog number 20000251) was added to the culture at a multiplicity of infection of about 10: 1 and incubated at 37 ° C. for 30 minutes without shaking. The bacteria were allowed to settle and the pellet was resuspended in induction medium (2xYT / Carb / Kan / IPTG) and grown overnight at 30 ° C. Phages were precipitated with 2% PEG / 0.25M NaCl (final concentration) and resuspended in 2 mL PBS. The first phage was stored at 4 ° C. and used to perform the second panning. Panning parameters: 1x 100nM antigen, 1 hour incubation at room temperature, 5x wash with TBST, then 1x wash with TBS; 2x 10nM antigen, 1 hour incubation at room temperature, wash with TBST 10x / TBS wash 1x; and the third was 1 nM antigen, 16 hours (overnight) incubated at 4 ° C., washed with TBST 10 × / washed with
Fabが抗ヒトFd(CH1)抗体で捕捉され、ビオチン化ヒトOSMが20nMで添加され、結合OSMがSA−HRPにより検出された成功例がELISAにより監視された。 Successful cases where Fab was captured with anti-human Fd (CH1) antibody, biotinylated human OSM was added at 20 nM, and bound OSM was detected by SA-HRP were monitored by ELISA.
カニクイザルOSMと交差反応することが示された、提示Fabとしての30(30)の固有の重鎖−軽鎖対合がELISAにより同定された。重鎖は、169(IGHV1−69由来)及び551(IGHV5−51由来)ライブラリからの配列を表し、4つ全てのライブラリ生殖系列起源(A27、B3、L6、及びO12)を表す軽鎖可変領域と組み合わされた。 Thirty (30) unique heavy chain-light chain pairs as display Fabs that were shown to cross-react with cynomolgus OSM were identified by ELISA. The heavy chain represents sequences from the 169 (from IGHV1-69) and 551 (from IGHV5-51) libraries and represents the light chain variable region representing all four library germline origins (A27, B3, L6, and O12). Combined with.
実施例3:OSM結合MABの特徴付け
4つの螺旋体束構造のOSMは、比較的非構造的なループによって結合されるA、B、C、及びDと呼ばれる4つのα螺旋状セグメントを特徴とする。OSMは、配列番号1のアミノ酸及び残基Q16、Q20、G120、N123、N124による接触を含むように決定された螺旋体A及びC(部位II)に位置する表面を介してgp130と相互作用する(Deller et al.Structure 8(8):863〜874,2000、Liu et al.Int.J.Mol.Med.23:161〜172,2009)。OSMRβ及びLIFRα(部位III)とのOSM相互作用に関与する表面は、螺旋体Dに位置する残基によって主に画定されると考えられている(Dellerら、同章)。
Example 3: Characterization of OSM-coupled MAB The four-helical bundle OSM is characterized by four alpha helical segments called A, B, C, and D that are joined by relatively unstructured loops. . OSM interacts with gp130 through the surface located in helices A and C (site II) determined to include amino acids of SEQ ID NO: 1 and contacts by residues Q16, Q20, G120, N123, N124 ( Deller et al. Structure 8 (8): 863-874, 2000, Liu et al.Int.J.Mol.Med.23: 161-172, 2009). The surface responsible for OSM interaction with OSMRβ and LIFRα (site III) is thought to be defined primarily by residues located in helix D (Deller et al., Ibid.).
gp130へのOSM結合の防止(部位II又はB遮断剤)又はLIFRa若しくはOSMRb(部位III又はR遮断剤)のOSM結合gp130動員の防止のいずれかを通してOSM誘導gp130シグナル伝達を防止することができるOSMに対して高親和性結合剤を選択することが目的である。 OSM capable of preventing OSM-induced gp130 signaling through either prevention of OSM binding to gp130 (site II or B blocker) or prevention of OSM binding gp130 mobilization of LIFRa or OSMRb (site III or R blocker) The purpose is to select a high affinity binding agent.
最初に選択されたOSM結合Fabの30のうち29が、完全長ヒトIgG1 Mabに変換するためにベクターにクローン化された。特徴付けアッセイは、
(1)エピトープ群又は「ビン」を同定するための競合結合、(2)表面プラズモン共鳴(Biacore)による親和性測定、及び(3)pSTAT3シグナル伝達を遮断する能力、であった。全てのスクリーニング及びアッセイは、実施例1に記載するように、哺乳動物の細胞生成(グリコシル化)されたヒト及びカニクイザルタンパク質を使用して行われた。
Of the 30 selected OSM binding Fabs, 29 were cloned into vectors for conversion to full-length human IgG1 Mabs. The characterization assay is
(1) competitive binding to identify epitope groups or “bins”, (2) affinity measurement by surface plasmon resonance (Biacore), and (3) ability to block pSTAT3 signaling. All screening and assays were performed using mammalian cell-generated (glycosylated) human and cynomolgus proteins as described in Example 1.
結果
pSTAT3及びELISA結合アッセイの対照MAB295(R&D Systems)に対するそのランク付けに基づき選択されたmAbのサブセットの親和性測定のデータを表3に示す。
Results Affinity measurement data for a subset of mAbs selected based on their ranking against the pSTAT3 and ELISA binding assay control MAB295 (R & D Systems) is shown in Table 3.
ビニングアッセイの結果は、M5、M6、及びM9が相互に競合したが、MAB295と競合しなかったことを示した。M10は、MAB295と競合しなかった。これらの4つのmAbは、gp130シグナル伝達の機能的中和剤であることもpSTAT3アッセイによって示された。したがって、M10はR遮断剤であり、M5、M6、及びM9は、gp130へのOSM結合を遮断する(B遮断剤)であるということになる。 Binning assay results showed that M5, M6, and M9 competed with each other but did not compete with MAB295. M10 did not compete with MAB295. These four mAbs were also shown by the pSTAT3 assay to be functional neutralizers of gp130 signaling. Therefore, M10 is an R blocker, and M5, M6, and M9 block OSM binding to gp130 (B blocker).
治療誘導のための標的親和性は、親和性(KD)が約1nMであると測定されたOSM−gp130相互作用と明確に競合する必要性によって決定された。したがって、OSMにおいて100pM以下のKDの標的親和性が所望された。 Target affinity for treatment induction was determined by the need to clearly compete with the OSM-gp130 interaction, whose affinity (K D ) was measured to be about 1 nM. Therefore, the target affinity of 100pM or less a K D in OSM is desired.
治療候補の100pM親和性の必要条件に合致した誘導体を生成するために、OSM−gp130相互作用遮断剤であると分かったM5、M6、及びM9の中和MAb+M10がインライン成熟のために選択された。mAbがヒトOSM(500pM未満のKD)の5倍以内の親和性でカニクイザルOSMに結合することが更に望ましい特性であった。 Neutralized MAbs + M10 of M5, M6, and M9, which were found to be OSM-gp130 interaction blockers, were selected for in-line maturation to generate derivatives that meet the 100 pM affinity requirements of treatment candidates . It was a further desirable property that mAbs bind to cynomolgus OSM with an affinity within 5 times that of human OSM (K D <500 pM).
これら4つのMabの結合ドメインの組成物は、表4に示されるように指定される4つの固有の重鎖及び軽鎖対を表すことが分かった。 The composition of the binding domains of these four Mabs was found to represent four unique heavy and light chain pairs designated as shown in Table 4.
完全な可変領域配列は、本明細書で上述されるファージライブラリを生成するために使用された生殖系列配列を含み、したがって、固定された残基は、未変異の親生殖系列残基と合致する。そのようなものとして、各V領域は、配列番号1〜3又は5〜8と呼ばれるスカフォールド内の指定されたCDR1及びCDR2、次にCDR3(表3及び4)、そして軽鎖可変領域(LCについては表5、そしてHCについては表6)において、次に重鎖については配列番号4、及び軽鎖については配列番号10としてJ領域からなる。 The complete variable region sequence includes the germline sequence used to generate the phage library described hereinabove, and thus the fixed residue matches the unmutated parental germline residue. . As such, each V region is designated CDR1 and CDR2, then CDR3 (Tables 3 and 4), and light chain variable regions (for LC) in a scaffold called SEQ ID NOs 1-3 or 5-8. In Table 5 and for HC in Table 6), followed by the J region as SEQ ID NO: 4 for heavy chain and SEQ ID NO: 10 for light chain.
HC可変領域H2は、配列番号1に由来するFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3を含み、この場合、X1=Aであり、X2=Gであり、X3=Iであり、X4=Pであり、X5=Iであり、X6=Fであり、H−CDR2に更なる変異を有する。ライブラリ551(H14、H17、及びH135)からのHCは、配列番号3に由来するFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3を含み、この場合、X1=Sであり、X2=S又はGであり、X3=Iであり、X4=Yであり、X5=Gであり、X6=Y又はDである。4つのHCのそれぞれは、固有のCDR3(配列番号19〜22)からなる。 The HC variable region H2 includes FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 derived from SEQ ID NO: 1, where X 1 = A, X 2 = G, X 3 = I, X 4 = a P, an X5 = I, an X 6 = F, have additional mutations in H-CDR2. HC from library 551 (H14, H17, and H135) contains FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 derived from SEQ ID NO: 3, where X 1 = S and X 2 = S or G Yes, X 3 = I, X 4 = Y, X 5 = G, and X 6 = Y or D. Each of the four HCs consists of a unique CDR3 (SEQ ID NOs: 19-22).
選択されたFabのLC可変領域は全て、B3ライブラリに由来し、本明細書及び参照刊行物に記載されるように、ライブラリ多様化の開始配列として使用されたIGKV4−1(B3)としてIMGTデータベースに表される精選された生殖系列配列を含む。4つの軽鎖のうちの3つは、CDR1が異なり、H−CDR2が同一であった。4つの選択されたLC可変FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3のコンセンサス配列は、配列番号8に由来し、この場合、X1は、Y、S、又はAであり、X2は、K、E、又はNであり、X3は、Y、W、又はFであり、X4は、常にWである。 All LC variable regions of the selected Fab were derived from the B3 library, and as described in this specification and reference publications, the IMGT database as IGKV4-1 (B3) used as the starting sequence for library diversification. Including a selected germline sequence represented by Three of the four light chains were different in CDR1 and identical in H-CDR2. The consensus sequence of the four selected LC variable FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 is derived from SEQ ID NO: 8, where X 1 is Y, S, or A and X 2 is K, E or N, X 3 is Y, W or F, and X 4 is always W.
2つの固有のCDR3配列が同定された。L−CDR3は、式Q−Q−(S,Y)−(F,Y)−S−(F,T)−PLTにより表されるコンセンサス配列(配列番号29)によって表され得る。 Two unique CDR3 sequences were identified. L-CDR3 may be represented by the consensus sequence (SEQ ID NO: 29) represented by the formula QQ- (S, Y)-(F, Y) -S- (F, T) -PLT.
実施例4.親和性再選択
実施例3に記載されるOSMM5、OSMM6、OSMM9、及びOSMM10の4つのV領域対合は、親和性を改善するために、軽鎖再選択のために選択された。効率的かつ能率的な様式で一次選択から多数の抗体を親和性成熟させるために、Shi et al.J Mol Biol 397:385〜396,2010及びWO第09085462A1号並びにU.S.第12/546850号に記載される「インライン」成熟過程が使用された。簡潔に、選択の初回に得た抗原特異的クローンのVH領域は、対応するVLスカフォールドのライブラリ(この場合、B3ベースのV領域(配列番号8))と組み合わされた。
Example 4 Affinity reselection Four V region pairs of OSMM5, OSMM6, OSMM9, and OSMM10 described in Example 3 were selected for light chain reselection to improve affinity. In order to affinity mature many antibodies from primary selection in an efficient and efficient manner, Shi et al. J Mol Biol 397: 385-396, 2010 and WO 09084622A1 and U.S. Pat. S. The “in-line” maturation process described in 12/546850 was used. Briefly, the V H region of the antigen-specific clone obtained at the first selection was combined with the corresponding library of VL scaffolds, in this case the B3-based V region (SEQ ID NO: 8).
3つの新しいライブラリが作製され、1つは多様VL鎖の供給源として一次選択に使用されたVLライブラリを使用し、2つの更なるライブラリは、既知の構造の最近の抗原−抗体複合体の分析に基づき設計された(Raghuanthan et al.,J.Mol.Recognit,2010)。残基は、特異性決定残基使用(SDRU)とも呼ばれる標的タンパク質の結合に最も関与している可能性があるこれらの残基に基づく多様化について選択された。Vカッパ軽鎖において、これは、標的がタンパク質、ペプチド、又は低分子ハプテンであるか否かにより僅かに異なる、Chothia及びLeskによって画定される高頻度可変ループを中心とする3つの接触領域であることが決定された。表5は、親和性成熟に使用されたVLライブラリを示し、この場合、B3は、発見段階中に使用された同じライブラリであり、ライブラリ2の「SDRM集中」は、SDRU残基及び多様性の集中に基づいており、NNKは、無作為化ライブラリである。表において、「X」は、NNKミックスにより生成された任意のアミノ酸+1つの終止コドンを意味する。 Three new libraries were created, one using the VL library used for the primary selection as a source of diverse VL chains, and two additional libraries, recent antigen-antibody complexes of known structure (Raghuanthan et al., J. Mol. Recognit, 2010). Residues were selected for diversification based on those residues that may be most responsible for target protein binding, also called specificity determining residue usage (SDRU). In the Vkappa light chain, this is the three contact regions centered on the hypervariable loop defined by Chothia and Lesk, slightly different depending on whether the target is a protein, peptide, or small molecule hapten. It was decided. Table 5 shows the VL library used for affinity maturation, where B3 is the same library used during the discovery phase, and the “SDRM concentration” in library 2 is the SDRU residue and diversity. NNK is a randomized library. In the table, “X” means any amino acid generated by NNK mix + 1 stop codon.
表7にライブラリー1、2及び3の多様性がまとめてある。最終ライブラリの分析中、当初の設計の一部でなく、したがって、合成法の結果として導入された幾つかのアミノ酸を同定した。ジヌクレオチドを使用して合成されたライブラリ2に関し、こうしたアミノ酸は、S(位置30c)、T(位置30d)、EK(位置30f)、IW(位置32)、TV(位置50)、I(位置92)、D(位置93)、及びF(位置96)であった。
Table 7 summarizes the diversity of
Fab−Hisタンパク質は、3回目のパンニング生産物、及び対応する親Fabより高い結合シグナルを有する個々のヒットを同定するために採用されたモノクローナルFab−His ELISAから調製された。2nM及び0.2nMの2つの濃度のビオチン化ヒト抗原がこれらのランク付けELISAに使用された。各親クローンの結合シグナルは、100%として設定された。元来の重鎖及び軽鎖V領域を含む親Fabと比較した場合、最大9倍(900%)改善された結合を示すM6及びM9の親和性成熟から22のヒットがあった。重鎖及び軽鎖のこれらの新しい対合の幾つかを更なる評価のために選択した。 Fab-His protein was prepared from a third round of panning product and a monoclonal Fab-His ELISA employed to identify individual hits with a higher binding signal than the corresponding parent Fab. Two concentrations of biotinylated human antigen, 2 nM and 0.2 nM, were used in these ranking ELISAs. The binding signal for each parent clone was set as 100%. There were 22 hits from affinity maturation of M6 and M9 showing up to 9-fold (900%) improved binding when compared to the parental Fab containing the original heavy and light chain V regions. Some of these new pairs of heavy and light chains were selected for further evaluation.
MAB295対照並びに親mAbのM6及びM9と比較したヒト及びカニクイザルOSMのインライン成熟mAbの親和性(KD)を表8にまとめ、これらのmAbのCDR組成物を表9に示す。幾つかの場合において、LCVは、H14及びH17の両方と対合された。その生物物理学的特性及び機能特性に基づき指定された候補治療誘導であった特定のmAbは灰色で強調される。 The affinity (K D ) of human and cynomolgus OSM inline mature mAbs compared to MAB295 controls and parental mAbs M6 and M9 are summarized in Table 8, and the CDR compositions of these mAbs are shown in Table 9. In some cases, LCV was paired with both H14 and H17. The particular mAb that was designated candidate treatment induction based on its biophysical and functional properties is highlighted in gray.
選択された候補のLC−CDR3多様性Q−Q−(S,Y)−(F,Y)−S−(F,T)−PLT(配列番号29)を減らし、再選択された高親和性LC−CDR3のコンセンサス配列は、QQY−(F,Y)−STP−(L,I)−T(配列番号47)として表される。 Reduced candidate LC-CDR3 diversity QQ- (S, Y)-(F, Y) -S- (F, T) -PLT (SEQ ID NO: 29) and reselected high affinity The consensus sequence of LC-CDR3 is represented as QQY- (F, Y) -STP- (L, I) -T (SEQ ID NO: 47).
再選択されたmAbにおいて、H14及びH17のVHは、配列番号48により与えられ、配列番号14(CDR1)及び配列番号17(CDR2)を含む共通のFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3を共有する。 In the reselected mAb, the VHs of H14 and H17 are given by SEQ ID NO: 48 and share a common FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 comprising SEQ ID NO: 14 (CDR1) and SEQ ID NO: 17 (CDR2) .
ヒト及びカニクイザルA375−S2細胞増殖を減少させる能力
インライン成熟抗体を評価するために、1〜5希釈で5μg/mL又は1μg/mLから開始して、それぞれ、0.0016又は0.00032μg/mLに至るまで用量応答が実施された。M71による中和を図2Bに示す。抗体の濃度が増加すると、ヒト及びカニクイザルオンコスタチンMの両方の抗増殖作用が中和される。用量応答曲線は、ヒト(開記号)及びカニクイザル(閉記号)オンコスタチンMを用いた3つの別個の実験からのデータを使用して計算された。表10は、ヒト及びカニクイザルオンコスタチンMに対するM55、M64、M69、及びM71のIC50(95%信頼区間)をまとめる。
Ability to reduce human and cynomolgus monkey A375-S2 cell proliferation To assess in-line mature antibodies, starting at 5 μg / mL or 1 μg / mL at 1-5 dilution, to 0.0016 or 0.00032 μg / mL, respectively A dose response was performed. Neutralization with M71 is shown in FIG. 2B. Increasing the concentration of antibody neutralizes the antiproliferative effects of both human and cynomolgus monkey oncostatin M. Dose response curves were calculated using data from three separate experiments with human (open symbol) and cynomolgus monkey (closed symbol) Oncostatin M. Table 10 summarizes the IC 50 (95% confidence interval) of M55, M64, M69, and M71 for human and cynomolgus monkey oncostatin M.
ヒトgp130競合
競合実験は、実施例1に記載されるBiacore 3000光学バイオセンサー(Biacore)を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、インライン成熟+上記の表からの選択された新しい結合剤用に選択された抗OSM mAbとヒトgp130との間で行われた。
Human gp130 competition Competition experiments were performed using surface plasmon resonance (SPR) using the
バイオセンサー表面は、製造者の指示に従い、各試験mAbをカルボキシメチル化デキストラン表面のCM−5チップ(Biacore、カタログ番号BR−1000−14)にカップリングすることにより調製された。各試験mAbの約4,000〜15,000RU(反応単位)は、機器の4つのフローセルの1つに固定された。競合実験は、ランニング緩衝液(DPBS+0.005% P20+3mM EDTA)の中で25℃で実施された。ヒトOSM(実験室内、OSMN1−1)をランニング緩衝液中で30nMに希釈し、固定されたmAbを含むフローセルのそれぞれの上に3μL/分で3分間注入した。ヒトOSM捕捉後、300nMで競合mAb又はヒトgp130−Fcのいずれかを3分間注入し(会合段階)、次に3分間緩衝層を流した(解離段階)。100mMのH3PO4(Sigma、カタログ番号7961)の50μL/分での12秒の2つのパルスによってチップ表面を再生した。BIAevaluationソフトウェア、バージョン3.2(Biacore)を用いて、回収したデータを加工した。最初に、ヒトOSMの注入時にセンサーグラムを整合した。次に、ヒトOSMの結合レベル(RU)、競合mAb、又はgp130−Fcを記録した。競合mAb又はgp130−FcがOSM表面上に注入されたときの結合(RU)の上昇は、固定された試験mAbとの競合がないことを示し、逆もまた同様である。フローセル(Fc1など)固定されたmAbは、表10の水平のサンプル列に沿って表示される。 The biosensor surface was prepared by coupling each test mAb to a carboxymethylated dextran surface CM-5 chip (Biacore, catalog number BR-1000-14) according to the manufacturer's instructions. Approximately 4,000 to 15,000 RU (reaction units) of each test mAb was immobilized on one of the four flow cells of the instrument. Competition experiments were performed at 25 ° C. in running buffer (DPBS + 0.005% P20 + 3 mM EDTA). Human OSM (laboratory, OSMN1-1) was diluted to 30 nM in running buffer and injected at 3 μL / min for 3 minutes onto each of the flow cells containing immobilized mAbs. After capture of human OSM, either competitive mAb or human gp130-Fc was injected at 300 nM for 3 minutes (association phase) and then the buffer layer was flushed for 3 minutes (dissociation phase). The chip surface was regenerated by two 12 second pulses of 100 mM H 3 PO 4 (Sigma, catalog number 7961) at 50 μL / min. The collected data was processed using BIAevaluation software, version 3.2 (Biacore). First, the sensorgram was matched at the time of human OSM injection. Next, human OSM binding levels (RU), competing mAbs, or gp130-Fc were recorded. An increase in binding (RU) when a competitive mAb or gp130-Fc is injected over the OSM surface indicates no competition with the immobilized test mAb, and vice versa. The mAb immobilized on the flow cell (such as Fc1) is displayed along the horizontal sample row in Table 10.
M2は、OSMに結合するgp130と競合しないことが知られている市販の抗体MAB295と競合することが以前示された。競合結合アッセイを示す結果は、M54、M55、M64、M69、及びM71がOSM抗原においてヒトgp130−Fcと競合することを示した(表11)。 M2 was previously shown to compete with the commercially available antibody MAB295, which is known not to compete with gp130 binding to OSM. Results showing a competitive binding assay indicated that M54, M55, M64, M69, and M71 compete with human gp130-Fc on OSM antigen (Table 11).
A375細胞においてpSTAT3を遮断する能力
M6及びM9の5ng/mLのhOSMの存在下又は不在下で、A375細胞及びこれらのMabのインライン成熟変異体において実施された、計算されたpSTAT3阻害のEC50値を表12に示す。
Ability to block pSTAT3 in A375 cells Calculated EC50 values of pSTAT3 inhibition performed in A375 cells and inline mature mutants of these Mabs in the presence or absence of 5 ng / mL hOSM of M6 and M9 Table 12 shows.
実施例5.生物活性
マクロファージ−軟骨細胞共培養アッセイ
マクロファージ−軟骨細胞共培養系において、M71を評価した。分化マクロファージは、オンコスタチンMを生成することが知られている(Hasegawa et al.Rheumatology 38:612〜617,1999)。OSMは、軟骨マトリックスの大部分を作り上げる高度に硫酸化されたプロテオグリカンアグリカン(GAG)の合成を減少させることができる。
Example 5 FIG. Bioactivity Macrophage-chondrocyte co-culture assay M71 was evaluated in a macrophage-chondrocyte co-culture system. Differentiated macrophages are known to produce Oncostatin M (Hasegawa et al. Rheumatology 38: 612-617, 1999). OSM can reduce the synthesis of highly sulfated proteoglycan aggrecan (GAG) that makes up the bulk of the cartilage matrix.
抗ヒトオンコスタチンM抗体は、組み換えHEK生成His−Aviタグ付けされたヒト及びカニクイザルのオンコスタチンMを使用して発見され、これらの抗体の活性は、これらの分子並びにR&D Systems(295−OM)の細菌由来の組み換えヒトオンコスタチンMを使用して評価された。his−aviタグ(HEK生成Osm)又はグリコシル化(細菌由来の組み換えOsm)の欠損のいずれかのため、これらのいずれも天然の内因性ヒトオンコスタチンMと同一ではない。マクロファージは、オンコスタチンMを分泌することが知られており(Grove et al.,J Lipid Res 32:1889〜97,1991)、オンコスタチンMは、ヒト軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を減少させる(Sanchez et al.OA and Cart.12:810−10,2004)。よって、マクロファージ−軟骨細胞共培養系は、抗ヒトオンコスタチンM抗体が内因性又は天然のヒトオンコスタチンMを中和する能力を決定するために使用された。簡潔に、40,000の正常なヒト関節軟骨細胞を含有する単一のアルギン酸塩ビーズを分化ヒトマクロファージの存在下で72時間培養した。これらの実験は、用量範囲の抗オンコスタチンM抗体の存在下で行われた。実験の終わりに、放射能35SO4の取り込みによりプロテオグリカン合成を測定した。 Anti-human oncostatin M antibodies were discovered using recombinant HEK-generated His-Avi tagged human and cynomolgus monkey oncostatin M, and the activity of these antibodies is related to these molecules and R & D Systems (295-OM). Was evaluated using recombinant human oncostatin M from a number of bacteria. None of these are identical to native endogenous human oncostatin M, either due to a lack of his-avi tag (HEK-generated Osm) or glycosylation (recombinant Osm from bacteria). Macrophages are known to secrete oncostatin M (Grove et al., J Lipid Res 32: 1889-97, 1991), and oncostatin M decreases proteoglycan synthesis in human chondrocytes (Sanchez et al. al., OA and Cart.12: 810-10, 2004). Thus, the macrophage-chondrocyte co-culture system was used to determine the ability of anti-human oncostatin M antibodies to neutralize endogenous or native human oncostatin M. Briefly, single alginate beads containing 40,000 normal human articular chondrocytes were cultured for 72 hours in the presence of differentiated human macrophages. These experiments were performed in the presence of a dose range of anti-oncostatin M antibody. At the end of the experiment, proteoglycan synthesis was measured by incorporation of radioactive 35 SO 4 .
CD14+末梢血単球をAllCellから得た。0.5mLのマクロファージ培地(10%の熱失活されたFBS、1%のNEAA、及び1%のPen−Strepを含むRPMI+グルタミン)中で、2.5×105細胞/ウェルの48ウェルプレート上で単球を培養した。細胞を100ng/mLのマクロファージ−コロニー刺激因子(M−CSF)で処理した。48時間後、培地を交換して、非付着細胞を取り除いた。6日目に、M−CSF含有マクロファージ培地を、M−CSFを含まないマクロファージ培地と交換した。8日目に、マクロファージ培地を軟骨細胞培地(10%のウシ胎児血清を含む50%のHam’s F−12/50% DMEM)と交換し、単一のアルギン酸塩ビーズ軟骨細胞培養物(Articular Engineering #CDD−H−2200)を各ウェルに添加した。R&D Systems Human Oncostatin M DuoSet(DY295)を使用してオンコスタチンMレベルの分析用に条件付きマクロファージ培地のアリコートを確保し、−80℃で保管した。 CD14 + peripheral blood monocytes were obtained from AllCell. On a 48-well plate at 2.5 × 105 cells / well in 0.5 mL macrophage medium (RPMI + glutamine with 10% heat-inactivated FBS, 1% NEAA, and 1% Pen-Strep) Monocytes were cultured with. Cells were treated with 100 ng / mL macrophage-colony stimulating factor (M-CSF). After 48 hours, the medium was changed to remove non-adherent cells. On day 6, the M-CSF containing macrophage medium was replaced with macrophage medium without M-CSF. On day 8, the macrophage medium was replaced with chondrocyte medium (50% Ham's F-12 / 50% DMEM with 10% fetal calf serum) and a single alginate bead chondrocyte culture (Articular) Engineering # CDD-H-2200) was added to each well. An aliquot of conditional macrophage medium was secured for analysis of oncostatin M levels using R & D Systems Human Oncostatin M DuoSet (DY295) and stored at −80 ° C.
アルギン酸塩ビーズ−マクロファージ共培養物を、20μg/mLの抗ヒトオンコスタチンM抗体(M64、M71、M55、M69)の存在下、又は用量範囲(5μg/mL〜0.00076μg/mL;1〜3希釈)の抗体(M71及びM55)の存在下のいずれかで、維持した。加えて、ヒトIgG1アイソタイプ対照(CNTO6234)が、試験された抗オンコスタチンM抗体の最高濃度でプレートに含まれた。他の対照は、軟骨細胞のみ(共培養ではない)及び2ng/mLのヒトオンコスタチンMの存在下の軟骨細胞であった。加えて、マクロファージのみを含有するウェルは、オンコスタチンMの産生を測定するために維持された。72時間の共培養後、更に20時間の間、10μCi/mLの放射能35SO4(Perkin−Elmer NEX041H002MC)を各ウェルに添加した。 Alginate bead-macrophage co-cultures were administered in the presence of 20 μg / mL anti-human oncostatin M antibody (M64, M71, M55, M69) or dose range (5 μg / mL to 0.00076 μg / mL; 1-3 In the presence of diluted antibodies (M71 and M55). In addition, a human IgG1 isotype control (CNTO6234) was included in the plate with the highest concentration of anti-oncostatin M antibody tested. Other controls were chondrocytes alone (not co-cultured) and chondrocytes in the presence of 2 ng / mL human oncostatin M. In addition, wells containing only macrophages were maintained to measure oncostatin M production. After 72 hours of co-culture, 10 μCi / mL of radioactive 35SO4 (Perkin-Elmer NEX041H002MC) was added to each well for an additional 20 hours.
35SO4の取り込みは、CPC沈殿法(MP BIomedicals(#190177))を使用して測定された。35SO4と共に20時間インキュベートした後、標識された培地を取り出し、各ビーズをCa及びMgを含むDPBSで2回洗浄した。2回目の洗浄後、200μLのクエン酸緩衝液(150mMのNaCl、55mMのクエン酸Na、ph 6.8)を各ビーズに添加した。ビーズが溶解されるまで、プレートを37℃で10〜15分間インキュベートした。各ウェルからの100μLのアリコートを1%のCPCで予備湿潤したMillipore Multiscreen 96ウェルフィルタプレートに移し、次に10μLの10%のCPCを5分間各ウェルに添加した。次に、フィルタが乾くまで、プレートに真空を適用した。次に、各ウェルを200μLの1%のCPCで2回洗浄し、フィルタが乾くまで、毎回プレートに真空を適用した。次に、プラスチックの底をプレートから取り外し、シーラ(Perkin Elmer #6005185)と交換した。シンチレーション流体(50μL、Perkin Elmer #6013621)を各ウェルに添加し、プレートシーラをプレートの上に適用した。次に、プレートをTop Count読み取り器上で数えた。 35 SO 4 uptake was measured using the CPC precipitation method (MP Biomedicals (# 190177)). After incubation with 35 SO 4 for 20 hours, the labeled medium was removed and each bead was washed twice with DPBS containing Ca and Mg. After the second wash, 200 μL citrate buffer (150 mM NaCl, 55 mM Na citrate, ph 6.8) was added to each bead. The plate was incubated at 37 ° C. for 10-15 minutes until the beads were dissolved. A 100 μL aliquot from each well was transferred to a Millipore Multiscreen 96 well filter plate pre-wetted with 1% CPC, then 10 μL of 10% CPC was added to each well for 5 minutes. Next, vacuum was applied to the plate until the filter was dry. Each well was then washed twice with 200 μL of 1% CPC and a vacuum was applied to the plate each time until the filter was dry. The plastic bottom was then removed from the plate and replaced with a sealer (Perkin Elmer # 6005185). Scintillation fluid (50 μL, Perkin Elmer # 6013361) was added to each well and a plate sealer was applied over the plate. The plates were then counted on a Top Count reader.
20μg/mLで、M64、M71、M55、及びM69は、プロテオグリカン合成を抗体の不在下で観察されたレベルより上に増加させ、一方、アイソタイプ対照は効果がなかった(図3)。別の実験において、M71は、プロテオグリカン合成を軟骨細胞のみにより示されたレベル(100%中和として定義される)に用量を依存的に増加させ、EC50は30ng/mLであり、アイソタイプ対照は効果がなかった。これらのデータは、マクロファージ由来Osmが共培養された軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を減少させ、抗ヒトオンコスタチンM抗体が天然のオンコスタチンMを中和したことを示す。 At 20 μg / mL, M64, M71, M55, and M69 increased proteoglycan synthesis above the level observed in the absence of antibody, while the isotype control had no effect (FIG. 3). In another experiment, M71 increased proteoglycan synthesis dose-dependently to the level indicated by chondrocytes alone (defined as 100% neutralization), EC50 was 30 ng / mL, and isotype control was effective There was no. These data indicate that anti-human oncostatin M antibody neutralized native oncostatin M, reducing proteoglycan synthesis in chondrocytes co-cultured with macrophage-derived Osm.
ヒト肺線維芽細胞Phospho−STAT3アッセイ
OSMは、正常なヒト肺線維芽細胞において増殖及びコラーゲン産生を誘発する(Scaffidi et al.,Br.J.Pharmacol 136:793〜801,2002)。線維芽細胞によるコラーゲンの過剰産生は、多くの病理学的状態の主な特徴である(Lim et al.Oncogene 23(39):5416〜25,2006、Huang et al.J Cell Biochem 81(1):102〜13,2001)。オンコスタチンM受容体シグナル伝達は、JAK−STAT経路を活性化し、STAT3のリン酸化反応は、シグナル伝達経路における初期事象である(Auguste et al.(1997)Signaling of Type II Oncostatin M Receptor.J Biol Chem 272:15760〜15764)。オンコスタチンMがpSTAT3を生成する能力は、R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset(DYC4607−5)を用いて、正常なヒト肺維芽細胞(NHLF)において決定された。次に、このアッセイは、M55及びM71がオンコスタチンMシグナル伝達を中和する能力を決定するために使用された。
Human Lung Fibroblast Phospho-STAT3 Assay OSM induces proliferation and collagen production in normal human lung fibroblasts (Scaffidi et al., Br. J. Pharmacol 136: 793-801, 2002). Overproduction of collagen by fibroblasts is a major feature of many pathological conditions (Lim et al. Oncogene 23 (39): 5416-25, 2006, Huang et al. J Cell Biochem 81 (1). : 102-13, 2001). Oncostatin M receptor signaling activates the JAK-STAT pathway, and STAT3 phosphorylation is an early event in the signaling pathway (Auguste et al. (1997) Signaling of Type II Oncostatin M Receptor. J Biol. Chem 272: 15760-15764). The ability of Oncostatin M to generate pSTAT3 was determined in normal human lung fibroblasts (NHLF) using R & D Systems human / mouse pSTAT3 Duoset (DYC4607-5). This assay was then used to determine the ability of M55 and M71 to neutralize oncostatin M signaling.
これらの実験は、Lonza所有FGM−2(CC−3132)培地中で成長させたLonza(CC−2512)からのNHLFを使用して行われた。簡潔に、細胞をFGM−2中で、25,000細胞/ウェルで平板培養し、24時間培養した。次に、細胞をオンコスタチンM抗体又は抗体+オンコスタチンMで10分間処理した。この10分間のインキュベーション中の温度依存作用を避けるために、処置を調製するために使用された溶液の全ては、予め加温され、37℃に維持された。10分間の処理後、培地を吸引して取り除き、完全溶解緩衝液と交換した。溶解緩衝液(pH=7.2)は、1%のNP−40、1%のデオキシコール酸ナトリウム、0.1%のSDS、0.15MのNaCl、及び0.01Mのリン酸ナトリウムからなり、4℃で保管された。使用する時に、完全溶解緩衝液は、Protease Inhibitor Cocktail(Roche,11836153001)1錠、及び110μLのHALTホスファターゼ阻害剤(Thermo Scientific 78420)を11mLの溶解緩衝液に添加することによって調製された。10分間の溶解工程後、得られた溶解物は、pSTAT3検出ができる状態である。 These experiments were performed using NHLF from Lonza (CC-2512) grown in Lonza proprietary FGM-2 (CC-3132) medium. Briefly, cells were plated at 25,000 cells / well in FGM-2 and cultured for 24 hours. Cells were then treated with Oncostatin M antibody or antibody + Oncostatin M for 10 minutes. To avoid temperature dependent effects during this 10 minute incubation, all of the solutions used to prepare the treatment were pre-warmed and maintained at 37 ° C. After 10 minutes of treatment, the medium was removed by aspiration and replaced with complete lysis buffer. The lysis buffer (pH = 7.2) consists of 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15M NaCl, and 0.01M sodium phosphate. Stored at 4 ° C. When used, complete lysis buffer was prepared by adding 1 tablet of Protease Inhibitor Cocktail (Roche, 118361533001) and 110 μL of HALT phosphatase inhibitor (Thermo Scientific 78420) to 11 mL of lysis buffer. After the 10 minute dissolution step, the resulting lysate is ready for pSTAT3 detection.
オンコスタチンM用量応答を決定するために、NHLF細胞を用量範囲のOSM(1〜4希釈で100ng/mL〜0.024ng/mL、3つ組ウェル)で処理した。各ウェルのOsmの濃度が処理に必要な最終濃度より10X高い予め加温したPBS+1%のBSA中で希釈プレートを調製し、培地のみのウェルが、未処理対照として含まれた。培地を培養プレートから完全に取り除き、180μLの予め加温されたFGM−2と交換した。タイマーを10分間開始させ、次に20μLを希釈プレートの各ウェルから培養プレートの対応するウェルに移した。10分後、細胞プレート中の処置溶液を吸引により完全に取り除き、100μLの完全溶解緩衝液と交換した。インキュベーション時間の差を最小にするために、溶解緩衝液を処理と同じ順序でウェルに添加した。次に、アッセイプレートを10分間振盪器に設置した。振盪後、溶解物は、後の試験のために−80℃で凍結されるか、又は抗pSTAT3でコーティングされたELISAプレートに直接移されるかのいずれかであった。ELISA(R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset)は、1)90μLの溶解物又は標準物のみが各ウェルに添加された、及び2)SuperSignal Pico(ThermoScientific 37069)がHRP基質として使用されたことを除き、製造者の指示に従い行われた。ELISAプレートは、Victor3プレート読み取り器上で発光について読み取られた。 To determine the oncostatin M dose response, NHLF cells were treated with a dose range of OSM (100 ng / mL to 0.024 ng / mL, triplicate well at 1-4 dilutions). Dilution plates were prepared in pre-warmed PBS + 1% BSA where the concentration of Osm in each well was 10X higher than the final concentration required for treatment, and media-only wells were included as untreated controls. The medium was completely removed from the culture plate and replaced with 180 μL of pre-warmed FGM-2. The timer was started for 10 minutes and then 20 μL was transferred from each well of the dilution plate to the corresponding well of the culture plate. After 10 minutes, the treatment solution in the cell plate was completely removed by aspiration and replaced with 100 μL of complete lysis buffer. To minimize the difference in incubation time, lysis buffer was added to the wells in the same order as the treatment. The assay plate was then placed on a shaker for 10 minutes. After shaking, the lysates were either frozen at −80 ° C. for later testing or transferred directly to ELISA plates coated with anti-pSTAT3. ELISA (R & D Systems human / mouse pSTAT3 Duoset), 1) Only 90 μL of lysate or standard was added to each well, and 2) SuperSignal Pico (ThermoScientific 37069) was used as the HRP substrate, This was done according to the manufacturer's instructions. The ELISA plate was read for luminescence on a Victor3 plate reader.
M55及びM71がNHLFのOSMシグナル伝達を中和する能力を評価するために、細胞を2ng/mLのヒトOsmの存在下、用量範囲の抗OSM抗体(3つ組ウェル、1〜10希釈で500ng/mL〜0.005ng/mL、又は1〜2希釈で50ng/mL〜1.563ng/mL)で処理した。アイソタイプ対照(最高濃度の抗OSM抗体)用に含まれたウェル、並びに未処理対照及びOSMのみで処理された細胞の両方に抗体を含まない希釈プレートが、最終濃度の20Xで抗体用量応答処置用にPBS中で調製された。ヒトオンコスタチンMは、FGM−2中で40ng/mL(最終濃度の20X)で別に調製された。20Xの抗体及びOSM溶液は、10Xの処置溶液を生成するために希釈プレート中で等容量で混合され、プレートを37℃で1時間インキュベートし、OSMを抗体に結合させた。1時間後、培地を培養プレートから取り除き、180μLの予め加温されたFGM−2と交換した。タイマーを10分間開始させ、20μLを希釈プレートの各ウェルから培養プレートの対応するウェルに移した。10分後、細胞プレート中の溶液を吸引により完全に取り除き、100μLの完全溶解緩衝液と交換した。インキュベーション時間の差を最小にするために、溶解緩衝液を処理と同じ順序でウェルに添加した。次に、アッセイプレートを10分間振盪器に設置した。振盪後、溶解物は、後の試験のために−80℃で凍結されるか、又は抗pSTAT3でコーティングされたELISAプレートに直接移されるかのいずれかであった。ELISA(R&D Systems human/mouse pSTAT3 Duoset)は、1)90μLの溶解物又は標準物のみが各ウェルに添加された、及び2)SuperSignal Pico(ThermoScientific 37069)がHRP基質として使用されたことを除き、製造者の指示に従い行われた。ELISAプレートは、Victor3プレート読み取り器上で発光について読み取られた。 To assess the ability of M55 and M71 to neutralize NHLF's OSM signaling, cells were treated with a dose range of anti-OSM antibody (triplicate wells, 500 ng at 1-10 dilution) in the presence of 2 ng / mL human Osm. / ML to 0.005 ng / mL, or 50 ng / mL to 1.563 ng / mL at 1-2 dilution). Wells included for isotype control (highest concentration of anti-OSM antibody) and dilution plates without antibody in both untreated control and cells treated with OSM alone are for antibody dose response treatment at final concentration of 20X. Prepared in PBS. Human oncostatin M was prepared separately at 40 ng / mL (final concentration 20X) in FGM-2. 20X antibody and OSM solution were mixed in equal volumes in a dilution plate to produce a 10X treatment solution, and the plate was incubated at 37 ° C for 1 hour to allow the OSM to bind to the antibody. After 1 hour, the medium was removed from the culture plate and replaced with 180 μL of pre-warmed FGM-2. The timer was started for 10 minutes and 20 μL was transferred from each well of the dilution plate to the corresponding well of the culture plate. After 10 minutes, the solution in the cell plate was completely removed by aspiration and replaced with 100 μL of complete lysis buffer. To minimize the difference in incubation time, lysis buffer was added to the wells in the same order as the treatment. The assay plate was then placed on a shaker for 10 minutes. After shaking, the lysates were either frozen at −80 ° C. for later testing or transferred directly to ELISA plates coated with anti-pSTAT3. ELISA (R & D Systems human / mouse pSTAT3 Duoset), 1) Only 90 μL of lysate or standard was added to each well, and 2) SuperSignal Pico (ThermoScientific 37069) was used as the HRP substrate, This was done according to the manufacturer's instructions. The ELISA plate was read for luminescence on a Victor3 plate reader.
ヒトオンコスタチンMは、約1ng/mLのEC50でNHLF細胞においてpSTAT3を増加させた。オンコスタチンM用量応答の例を図4Aに提供する。この例において、EC50は0.90ng/mLであり、95%信頼区間は0.70〜1.17ng/mLであった。抗オンコスタチンM抗体の中和能力は、2ng/mLのオンコスタチンMの存在下で決定され、データの全ては、抗体が存在しない2ng/mLのOSMの存在下の発光に正規化された。図4Bは、M71によるOSM誘発STAT3リン酸化反応の用量依存中和を示す。M71の濃度が増加すると、STAT3リン酸化反応の程度が減少する。用量応答曲線は、6つの別個の実験からのデータから計算され、計算されたM71のIC50は8.9ng/mLであり、95%信頼区間は6.9〜11.6ng/mLであった。 Human oncostatin M increased pSTAT3 in NHLF cells with an EC50 of approximately 1 ng / mL. An example of oncostatin M dose response is provided in FIG. 4A. In this example, the EC50 was 0.90 ng / mL and the 95% confidence interval was 0.70 to 1.17 ng / mL. The neutralizing ability of anti-oncostatin M antibody was determined in the presence of 2 ng / mL of oncostatin M, and all of the data was normalized to luminescence in the presence of 2 ng / mL of OSM in the absence of antibody. FIG. 4B shows dose-dependent neutralization of OSM-induced STAT3 phosphorylation by M71. As the concentration of M71 increases, the degree of STAT3 phosphorylation decreases. Dose response curves were calculated from data from 6 separate experiments with a calculated M71 IC50 of 8.9 ng / mL and a 95% confidence interval of 6.9 to 11.6 ng / mL.
実施例6:インビボでの活性
M71は、ヒトオンコスタチンMの全身性投与後のインビボでサイトカインの産生を遮断するその能力について評価された。ヒトオンコスタチンMの腹腔内注入は、おそらくマウス白血病阻害因子受容体を通して、及びそれと相互作用して特定の血清サイトカインのレベルを増加させる。
Example 6: In vivo activity M71 was evaluated for its ability to block cytokine production in vivo after systemic administration of human oncostatin M. Intraperitoneal injection of human oncostatin M probably increases the level of certain serum cytokines through and interacts with the mouse leukemia inhibitory factor receptor.
ヒトオンコスタチンMのマウスへの全身(i.p.)投与は、抗オンコスタチンMモノクローナル抗体がインビボ設定で中和する能力を評価するためのモデルとして開発された。マウスは、200μLのPBS中の10μgのヒトオンコスタチンM又はPBSビヒクル対照でi.p.注入された。1時間後、マウスをCO2で麻酔し、末端心穿刺により血液を採取した。個々の血液サンプルを氷上で20分間凝固させ、次に3500rpmで10〜15分間回転させた。血清サンプルは、製造者の指示により、MilliplexマウスMAPサイトカイン/ケモカインマルチプレックス(32)パネルを用いて分析されるまで凍結させた。サンプルの分析は、ビヒクル対照と比較して、ヒトオンコスタチンMがパネルの他のサイトカインに対して作用することなくマウスKC、IP−10、MCP−1、IL−6、及びエオタキシンの血清レベルを顕著に増加させたことを示した。これらのデータは、ヒトオンコスタチンMの注入が、おそらく抗オンコスタチンM抗体がインビボで中和する能力を試験するために使用され得るマウス白血病阻害因子受容体との相互作用を通してサイトカイン放出を誘発することを示す(Richards et al.J Immunol.159:2431〜37,1997、Lindberg et al.,Mol Cell Biol 18:3357〜3367,1988)。 Systemic (ip) administration of human oncostatin M to mice has been developed as a model for evaluating the ability of anti-oncostatin M monoclonal antibodies to neutralize in an in vivo setting. Mice were injected i.p. with 10 [mu] g human oncostatin M or PBS vehicle control in 200 [mu] L PBS. p. Injected. After 1 hour, the mice were anesthetized with CO 2 and blood was collected by terminal cardiac puncture. Individual blood samples were allowed to clot on ice for 20 minutes and then rotated at 3500 rpm for 10-15 minutes. Serum samples were frozen until analyzed using a Milliplex mouse MAP cytokine / chemokine multiplex (32) panel according to the manufacturer's instructions. Analysis of the samples revealed serum levels of mouse KC, IP-10, MCP-1, IL-6, and eotaxin without human oncostatin M acting on other cytokines in the panel compared to vehicle control. It showed a significant increase. These data suggest that human oncostatin M infusion induces cytokine release through interaction with the mouse leukemia inhibitory factor receptor, which can possibly be used to test the ability of anti-oncostatin M antibodies to neutralize in vivo (Richards et al. J Immunol. 159: 2431-37, 1997, Lindberg et al., Mol Cell Biol 18: 3357-3367, 1988).
M71及びM55は、マウス全身投与モデルで評価された。簡潔に、マウスは、M71又はM55(20、2.0、又は0.2mg/kgのヒトIgG1抗ヒトOsm)、CNTO6234(huIgG1アイソタイプ対照、20mg/kg)、又は10μL/gの容量のPBSで皮下的に投与された。24時間後、次いで各マウスは、0.1%のマウス血清アルブミン(Sigma A3559)を含むPBS(Sigma D8357)中の10μgの実験室内で生成されたCHO細胞由来組み換えヒトオンコスタチンM、又はPBS−MSAビヒクル対照のみ(総容量200μL)のいずれかでi.p.注入された。1時間後、マウスをCO2で麻酔し、末端心穿刺により血液を採取した。個々の血液サンプルを氷上で20分間凝固させ、次に3500rpmで10〜15分間回転させた。血清サンプルは、MilliplexマウスMAPサイトカイン/ケモカインマルチプレックス(32)パネルを用いて分析されるまで凍結させた。血清サンプルを製造者の指示により分析した。
M71 and M55 were evaluated in a mouse systemic administration model. Briefly, mice are in M71 or M55 (20, 2.0, or 0.2 mg / kg human IgG1 anti-human Osm), CNTO6234 (huIgG1 isotype control, 20 mg / kg), or PBS in a volume of 10 μL / g. It was administered subcutaneously. After 24 hours, each mouse was then treated with 10 μg of laboratory-generated recombinant human oncostatin M in PBS (Sigma D8357) containing 0.1% mouse serum albumin (Sigma A3559), or PBS- Either MSA vehicle control alone (
ヒトオンコスタチンMは、キットにより検出された5つサイトカイン(エオタキシン、IL−6、IP−10、KC、及びMCP−1)の血清レベルにおいて大幅な(対合されないStudentのt検定)増加を誘発した。20mg/kgのアイソタイプ対照CNTO6234での前投与は、オンコスタチンM誘発サイトカイン放出に対して作用がなかった。しかしながら、M71による前投与は、2.0及び20mg/kgでIP−10、MCP−1、IL−6、及びエオタキシン並びに20mg/kgでKCの、血清レベルを大幅に減少させた。0.2mg/kgのM71でサイトカインのいずれに対しても作用はなかった。M71及びアイソタイプ対照のIP−10及びMCP−1に対する作用を、それぞれ、図5A及びBに示す。20及び2.0mg/kgの両方での中和はIP−10でのみ見られたが、強い中和はM55であまり観察されなかった。IL−6、エオタキシン、及びMCP−1の血清レベルは、20mg/kgのM55で減少したが、KCレベルでの減少は、M55のいずれの用量でも見られなかった。これらのデータは、抗オンコスタチンM抗体がマウス全身投与モデルにおいて外因性ヒトオンコスタチンMの生物学的作用を中和する能力を示した。 Human oncostatin M induces a significant (unpaired Student's t-test) increase in serum levels of the five cytokines detected by the kit (eotaxin, IL-6, IP-10, KC, and MCP-1) did. Pre-administration with 20 mg / kg isotype control CNTO 6234 had no effect on oncostatin M-induced cytokine release. However, pre-administration with M71 significantly reduced serum levels of IP-10, MCP-1, IL-6, and eotaxin at 2.0 and 20 mg / kg and KC at 20 mg / kg. There was no effect on any of the cytokines at 0.2 mg / kg M71. The effects of M71 and isotype controls on IP-10 and MCP-1 are shown in FIGS. 5A and B, respectively. Neutralization at both 20 and 2.0 mg / kg was only seen with IP-10, but less intense neutralization was observed with M55. Serum levels of IL-6, eotaxin, and MCP-1 were reduced at 20 mg / kg M55, but no reduction in KC levels was seen at any dose of M55. These data showed the ability of anti-oncostatin M antibodies to neutralize the biological effects of exogenous human oncostatin M in a mouse systemic administration model.
IP−10(インターフェロンγ誘発タンパク質10kDa又は低誘発性サイトカインB10)は、ヒトにおいて、CXCL10遺伝子(C−X−Cモチーフケモカイン10(CXCL10))によりコードされるタンパク質である。CXCL10は、単球/マクロファージ、T細胞、NK細胞、及び樹状細胞における化学誘引、並びに内皮細胞へのT細胞付着促進等の、幾つかの役割に起因する。現在ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド1(CXCL1)として知られるKCは、以前はGRO1癌遺伝子、GROα、好中球活性化タンパク質3(NAP−3)、及びメラノーマ成長刺激活性α(MSGA−α)とも呼ばれたCXCケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。ヒトにおいて、このタンパク質は、CXCL1遺伝子によりコードされる。CXCL1は、マクロファージ、好中球、及び上皮細胞によって発現し、好中球化学誘引物質活性を有する。
IP-10 (interferon γ-inducing
実施例7.共結晶学
V領域H17(配列番号51)及びL180(配列番号55)を含むFab断片は、ヒトOSM(配列番号10)残基26〜212と共に結晶化された。
Example 7 Co-crystallography A Fab fragment containing V regions H17 (SEQ ID NO: 51) and L180 (SEQ ID NO: 55) was crystallized with human OSM (SEQ ID NO: 10) residues 26-212.
OSMは、gp130サイトカインファミリーの他のメンバーとその4つの螺旋体束3次元構造を共有する。4つの螺旋体束構造は、比較的非構造的なループによって結合されるA(残基10〜37)、B(残基67〜90)、C(残基105〜131)、及びD(残基159〜185)と呼ばれる4つのα螺旋体セグメントを特徴とする。OSMは、螺旋体A及びCに位置するアミノ酸残基(Q16、Q20、G120、N123、N124)を含むエピトープ指向部位IIを介してgp130と相互作用する(Deller et al.Structure 8(8):863〜874,2000、Liu et al.Int.J.Mol.Med.23:161〜172,2009)。OSMRβ及びLIFRαとのOSM相互作用に関与するエピトープである部位IIIは、大部分は螺旋体Dに位置する残基によって画定されると考えられている(Deller et al.Structure 8(8):863〜874,2000)。 OSM shares its four helical bundle three-dimensional structure with other members of the gp130 cytokine family. The four helical bundle structures are A (residues 10-37), B (residues 67-90), C (residues 105-131), and D (residues) joined by a relatively unstructured loop. 159-185), characterized by four α-helical segments. OSM interacts with gp130 via an epitope-directed site II containing amino acid residues (Q16, Q20, G120, N123, N124) located in helices A and C (Deller et al. Structure 8 (8): 863). 874, 2000, Liu et al. Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009). Site III, an epitope involved in OSM interaction with OSMRβ and LIFRα, is thought to be largely defined by residues located in helix D (Deller et al. Structure 8 (8): 863-). 874, 2000).
結晶化
複合体の結晶化は、0.2μLのタンパク質複合体(10.95mg/mL)及び0.2μLのリザーバ溶液の等容量を分配するOryx4タンパク質結晶化ロボット(Douglas Instruments)を使用して、20℃でシッティングドロップ(sitting-drop)蒸気拡散法により実施された。多重結晶化スクリーニングが実施された。大半の液滴は透明なままであり、複合体の高可溶性を示す。結晶は、0.1MのMES(pH 6.5)、2.4Mの硫酸アンモニウム、及び0.1Mのトリス(pH 8.5)、3.5Mのギ酸ナトリムから得た。
Crystallization Complex crystallization was accomplished using an Oryx4 protein crystallization robot (Douglas Instruments) that dispenses an equal volume of 0.2 μL protein complex (10.95 mg / mL) and 0.2 μL reservoir solution. Performed at 20 ° C. by a sitting-drop vapor diffusion method. Multiple crystallization screening was performed. Most droplets remain clear, indicating the high solubility of the complex. Crystals were obtained from 0.1 M MES (pH 6.5), 2.4 M ammonium sulfate, and 0.1 M Tris (pH 8.5), 3.5 M sodium formate.
結晶構造溶液の結果
H14/L180 Fabと接触するOSM残基は、結合エピトープを構成する。OSMと接触する抗体残基は、結合パラトープを構成する。2つの可変ドメインの6つ全てのCDRは、OSM結合に関与する。接触する残基は表13に記載され、図5に示される。重鎖可変領域H1のCDRと共に、長いCDR−L1は、底部に小さい***を有する谷のような結合部位を形成する(図4C、左側のパネル)。結合時、谷の両側は、2つの螺旋体の間に底部***結合を有する螺旋体A及びCに沿ってOSMの4つの螺旋体束を抱持する(図4C、右側のパネル)。抗体及び抗原結合接触面は、溶媒アクセス可能表面の2,514Å2を埋設する(Abにおいては1225Å2及びAgについては1298Å2)。接触面に多くの荷電残基が存在するが、荷電−荷電対合は存在せず、vdw及びH結合が抗体及び抗原相互作用に最も重要な役割を果たすことを示唆する。
Results of the crystal structure solution The OSM residues in contact with the H14 / L180 Fab constitute a binding epitope. Antibody residues that contact the OSM constitute a binding paratope. All six CDRs of the two variable domains are involved in OSM binding. The contacting residues are listed in Table 13 and shown in FIG. Together with the CDRs of the heavy chain variable region H1, the long CDR-L1 forms a valley-like binding site with a small ridge at the bottom (FIG. 4C, left panel). When joined, both sides of the valley embrace four spiral bundles of OSM along spirals A and C with a bottom raised joint between the two spirals (FIG. 4C, right panel). The antibody and antigen binding contact surface embeds 2,514 2 of the solvent accessible surface (1225 2 for Ab and 1298 2 for Ag). There are many charged residues at the interface, but there is no charge-charge pairing, suggesting that vdw and H-bonds play the most important role in antibody and antigen interactions.
よって、H17/L180 Fabは、gp130、Q20及びG120によって、並びにA及びC螺旋体に沿って接触することが以前に示された残基でOSMに接触する。 Thus, the H17 / L180 Fab contacts OSM with residues previously shown to contact by gp130, Q20 and G120 and along the A and C helices.
実施例8:薬物動態
OSMは、細胞上の細胞表面提示標的とは反対に、炎症性過程に関連する可溶性標的である。本明細書で発見された結合領域を含み、Fcドメインを更に有する完全なIgGの性質は、よって、改変FcR結合を付与する変異体でFcを操作する方法を使用して、その使用に関連する目的及び治療仕様に合わせることができる。
Example 8: Pharmacokinetics OSM is a soluble target associated with inflammatory processes as opposed to cell surface presenting targets on cells. The nature of a complete IgG comprising a binding region discovered herein and further having an Fc domain is therefore related to its use, using methods of engineering Fc with variants that confer modified FcR binding. Can be tailored to purpose and treatment specifications.
本発明の組成物において、循環における活性の維持及び持続性は、治療用モノクローナルIgGの有益な仕様である。したがって、Fcドメインは、新生児受容体(FcRn)に対して強化された親和性を有する。 In the compositions of the present invention, maintenance and persistence of activity in the circulation is a useful specification for therapeutic monoclonal IgG. Thus, the Fc domain has enhanced affinity for the neonatal receptor (FcRn).
N434S(US第7371826号、WO第2006/053301号)と組み合わせて、前述される変異M428L(MedImmune、米国特許第7670600号)を使用して、標準的な組み換え技法を用いて変異した野生型の抗体を構築した。これらの2つのMabであるM71及びM71 L/Sは、標準的な活性アッセイにおいて比較され、ヒト以外の霊長類の循環における持続性について比較された。 Wild type mutated using standard recombination techniques using the previously described mutation M428L (MedImmune, US Pat. No. 7,670,600) in combination with N434S (US Pat. No. 7,371,826, WO 2006/053301). Antibodies were constructed. These two Mabs, M71 and M71 L / S, were compared in a standard activity assay and compared for persistence in the circulation of non-human primates.
アッセイ
M71及びM71 L/Sは、A375−S2増殖アッセイにおいて、並べて比較された。用量応答は、1〜5希釈で1μg/mLの開始濃度から0.00032μg/mLまで評価された。1μg/mLの濃度で、これらの抗体のアイソタイプ対照であるCNTO3930及びCNTO8852は、それぞれ、2ng/mLのヒトオンコスタチンMが増殖を阻害する能力に対して効果がなかった。M71及びM71 L/Sの両方は、1μg/mLでオンコスタチンMの作用を完全に中和し、IC50において測定可能な相違はなかった。
Assays M71 and M71 L / S were compared side by side in the A375-S2 proliferation assay. The dose response was evaluated from 1 μg / mL starting concentration to 0.00032 μg / mL at 1-5 dilutions. At a concentration of 1 μg / mL, the isotype controls of these antibodies, CNTO3930 and CNTO8852, respectively had no effect on the ability of 2 ng / mL human oncostatin M to inhibit proliferation. Both M71 and M71 L / S completely neutralized the action of Oncostatin M at 1 μg / mL, with no measurable difference in IC50.
マウス全身投与モデルにおいて、M71及びM71 L/Sを比較した。簡潔に、マウスは、M71及びM71 L/S(20、10、又は5.0mg/kg)、CNTO3930(huIgG1アイソタイプ対照、20mg/kg)、CNTO8852(Fc変異型のアイソタイプ対照、20mg/kg)、又は10μL/gの容量のPBSで皮下的に投与された。24時間後、各マウスは、0.1%のマウス血清アルブミン(Sigma A3559)を含むPBS(Sigma D8357)中の10μgの室内で生成されたCHO細胞由来組み換えヒトオンコスタチンM、又はPBS−MSAビヒクル対照のみ(総容量200μL)のいずれかでi.p.注入された。1時間後、マウスをCO2で麻酔し、末端心穿刺により血液を採取した。個々の血液サンプルを氷上で20分間凝固させ、次に3500rpmで10〜15分間回転させた。IL−6、MCP−1、エオタキシン、KC、及びIP−10に特異的なビーズからなる特注のMilliporeマウスマルチプレックスを使用して分析するまで血清サンプルを凍結した。いずれのアイソタイプ対照は、ヒトオンコスタチンMによって誘発されたサイトカイン放出に対していずれの作用もなかった。しかしながら、M71及びM71 L/Sの両方は、オンコスタチンM誘発サイトカイン放出を中和し、潜在能又は有効性において明らかな相違はなかった。
M71 and M71 L / S were compared in a mouse systemic administration model. Briefly, mice were M71 and M71 L / S (20, 10 or 5.0 mg / kg), CNTO3930 (huIgG1 isotype control, 20 mg / kg), CNTO8852 (Fc variant isotype control, 20 mg / kg), Alternatively, it was administered subcutaneously in a volume of 10 μL / g PBS. After 24 hours, each mouse was treated with 10 μg of room-produced recombinant CHO cell-derived human oncostatin M in PBS (Sigma D8357) containing 0.1% mouse serum albumin (Sigma A3559), or PBS-MSA vehicle. I. Either in control only (
薬物動態分析
非末端カニクイザル薬物動態研究において、M71及びM71 L/Sの血清半減期を比較した。研究は、総数12匹のカニクイザルを含み、各抗体について皮下(s.c.、n=3)及び静脈内(i.v.、n=3)投与を評価した。3mg/kgの抗体が投与され、研究は60日にわたって行われた。血液サンプルは、1(IV群のみ)時間及び6時間、並びに1、2、4、6、8、12、16、30、37、45、及び60日目に採取された。サンプルからの血清は、試験まで−80℃で凍結された。血清の抗体レベルは、カニクイザル血清において、MesoScale Discoveryプラットホーム用に最適化されたELISAを使用して決定された。ビオチン化捕捉抗体は、M71(マウス抗M71)に対して生じた抗イディオタイプ抗体であった。検出抗体はルテニウム標識された抗ヒトIgGであり、読み出しはMesoScale Discovery化学発光であった。
Pharmacokinetic analysis In non-terminal cynomolgus pharmacokinetic studies, the serum half-life of M71 and M71 L / S were compared. The study included a total of 12 cynomolgus monkeys and evaluated subcutaneous (sc, n = 3) and intravenous (iv, n = 3) administration for each antibody. 3 mg / kg of antibody was administered and the study was conducted over 60 days. Blood samples were collected at 1 (Group IV only) and 6 hours, and at 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 30, 37, 45, and 60 days. Serum from the samples was frozen at −80 ° C. until testing. Serum antibody levels were determined in cynomolgus serum using an ELISA optimized for the MesoScale Discovery platform. The biotinylated capture antibody was an anti-idiotype antibody raised against M71 (mouse anti-M71). The detection antibody was ruthenium-labeled anti-human IgG and the readout was MesoScale Discovery chemiluminescence.
研究の結果を図6A及びBに示す。図6Aは、M71の血清半減期が15.21+/−3.0日であり、M71 L/Sの半減期が29.4+/−2.3日であるi.v.投与からのプロットを示す。同様の結果がs.c.投与(図6B)から得られ、M71においては15.4+/−4日の血清半減期であり、M71 L/Sにおいては32.0+/−5.9日であった。 The results of the study are shown in FIGS. 6A and B. FIG. 6A shows that M71 has a serum half-life of 15.21 +/− 3.0 days and M71 L / S has a half-life of 29.4 +/− 2.3 days i. v. A plot from administration is shown. Similar results are found in s. c. Obtained from the administration (FIG. 6B), it was a serum half-life of 15.4 +/− 4 days for M71 and 32.0 +/− 5.9 days for M71 L / S.
結果は、M71 L/S t 1/2がM71と比較して、約2倍増加したことを示した。
The results showed that M71 L /
Claims (24)
配列番号14のアミノ酸配列を有するH−CDR1と、 H-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14,
配列番号17のアミノ酸配列を有するH−CDR2と、 H-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17,
配列番号21のアミノ酸配列を有するH−CDR3と、 H-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21,
配列番号38のアミノ酸配列を有するL−CDR1と、 L-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
配列番号43のアミノ酸配列を有するL−CDR2と、 L-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
配列番号46のアミノ酸配列を有するL−CDR3と、を含む単離された抗体。 An isolated antibody comprising L-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
配列番号14のアミノ酸配列を有するH−CDR1と、 H-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14,
配列番号17のアミノ酸配列を有するH−CDR2と、 H-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17,
配列番号21のアミノ酸配列を有するH−CDR3と、 H-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21,
配列番号38のアミノ酸配列を有するL−CDR1と、 L-CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38;
配列番号43のアミノ酸配列を有するL−CDR2と、 L-CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
配列番号46のアミノ酸配列を有するL−CDR3と、を含み、 L-CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46,
ここで、前記定常領域が、野生型IgG1定常ドメイン配列を有する抗体と比較して、新生児受容体(FcRn)に対する前記抗体の親和性を強化するように変異したものであり、かつ、前記変異が、M428L及びN434Sであり、付番は、KabatのEU付番に従う、前記単離された抗体。 Here, the constant region is mutated so as to enhance the affinity of the antibody for a neonatal receptor (FcRn) as compared to an antibody having a wild-type IgG1 constant domain sequence, and the mutation is , M428L and N434S, wherein the numbering is according to Kabat's EU numbering.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019037239A (en) * | 2010-10-13 | 2019-03-14 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | Human oncostatin m antibodies and methods of use |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012069433A2 (en) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Glaxo Group Limited | Antigen binding proteins |
US9062120B2 (en) | 2012-05-02 | 2015-06-23 | Janssen Biotech, Inc. | Binding proteins having tethered light chains |
US9550828B2 (en) | 2013-09-05 | 2017-01-24 | Boise State University | Oncostatin M (OSM) antagonists for preventing cancer metastasis and IL-6 related disorders |
CN104083754A (en) * | 2014-07-08 | 2014-10-08 | 武汉大学 | Function and application of type-II oncostatin-M receptor (OSMR) in cerebral apoplexy diseases |
WO2016046738A1 (en) * | 2014-09-24 | 2016-03-31 | Università Degli Studi Di Padova | Composition to induce bone marrow stem cell mobilization |
CN104258396A (en) * | 2014-09-29 | 2015-01-07 | 武汉大学 | Function and application of II-type oncostatin M receptor in treating atherosclerosis |
US10822406B2 (en) | 2015-01-29 | 2020-11-03 | Oxford University Innovation Limited | Method for treating chronic intestinal inflammation and inflammatory bowel disease by administering antagonists of Oncostatin-M (OSM) and/or antagonists of OSM receptor-beta (OSMR) |
WO2017106684A2 (en) * | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies specifically binding hla-dr and their uses |
GB201614627D0 (en) * | 2016-08-30 | 2016-10-12 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Antigen binding proteins |
WO2019084307A1 (en) * | 2017-10-26 | 2019-05-02 | Celldex Therapeutics, Inc. | Anti-mertk antibodies and methods of use thereof |
FR3090637A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-26 | Universite De Poitiers | A specific binding protein capable of specifically binding to human oncostatin M (hOSM) and its uses. |
CN109884320A (en) * | 2019-03-29 | 2019-06-14 | 重庆医科大学 | Application of the oncostatinM as biomarker in preparation sepsis diagnosis reagent |
US11633457B2 (en) | 2019-04-11 | 2023-04-25 | Boise State University | Pharmaceutical compositions comprising oncostatin m (OSM) antagonist derivatives and methods of use |
CN113678044A (en) | 2019-04-12 | 2021-11-19 | 住友电气工业株式会社 | Optical fiber ribbon core wire, mold and method for manufacturing optical fiber ribbon core wire |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5618715A (en) | 1985-12-20 | 1997-04-08 | Oncogen Limited Partnership | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
US5451506A (en) | 1985-12-20 | 1995-09-19 | Oncogen Limited Partnership | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
US5120535A (en) | 1986-11-26 | 1992-06-09 | Oncogen | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
US5681930A (en) | 1985-12-20 | 1997-10-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-oncostatin M monoclonal antibodies |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
US5202116A (en) | 1989-04-10 | 1993-04-13 | Oncogen | Methods for controlling human endothelial cell proliferation and effector functions using oncostatin m |
ZA909842B (en) | 1989-12-08 | 1991-09-25 | Oncogen | Proteins with oncostatin m activity and process for their preparation |
US6713610B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-03-30 | Raju Kucherlapati | Human antibodies derived from immunized xenomice |
NO303226B1 (en) | 1990-03-29 | 1998-06-15 | Bristol Myers Squibb Co | Monoclonal antibody to Onkostatin M, as well as DNA molecule, cell line and hybridoma |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
EP0814159B1 (en) | 1990-08-29 | 2005-07-27 | GenPharm International, Inc. | Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies |
US6300129B1 (en) | 1990-08-29 | 2001-10-09 | Genpharm International | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
GB9019553D0 (en) * | 1990-09-07 | 1990-10-24 | Unilever Plc | Specific binding agents |
ATE463573T1 (en) | 1991-12-02 | 2010-04-15 | Medimmune Ltd | PRODUCTION OF AUTOANTIBODIES ON PHAGE SURFACES BASED ON ANTIBODIES SEGMENT LIBRARIES |
US5585793A (en) | 1994-06-10 | 1996-12-17 | Digital Equipment Corporation | Order preserving data translation |
US5874540A (en) * | 1994-10-05 | 1999-02-23 | Immunomedics, Inc. | CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies |
US20030044772A1 (en) * | 1997-08-04 | 2003-03-06 | Applied Molecular Evolution [Formerly Ixsys] | Methods for identifying ligand specific binding molecules |
US5958442A (en) | 1997-10-24 | 1999-09-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Oncostatin M for treating inflammation |
GB9806530D0 (en) * | 1998-03-26 | 1998-05-27 | Glaxo Group Ltd | Inflammatory mediator |
MXPA01007170A (en) | 1999-01-15 | 2002-07-30 | Genentech Inc | Polypeptide variants with altered effector function. |
US20050208558A1 (en) * | 1999-10-19 | 2005-09-22 | Applera Corporation | Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression or 10,000 or more Drosophila genes and uses thereof |
US6696620B2 (en) * | 2000-05-02 | 2004-02-24 | Epicyte Pharmaceutical, Inc. | Immunoglobulin binding protein arrays in eukaryotic cells |
AU2002239422B2 (en) | 2000-11-30 | 2006-12-07 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies |
JP4336498B2 (en) | 2000-12-12 | 2009-09-30 | メディミューン,エルエルシー | Molecules with extended half-life and compositions and uses thereof |
EP1355948B1 (en) * | 2001-01-12 | 2009-03-11 | Molecules of Man AB | Materials and methods for treatment of hepatitis c |
ATE515515T1 (en) | 2004-03-30 | 2011-07-15 | Glaxo Group Ltd | IMMUNOLOBULINS AGAINST HUMAN OSM |
US7319142B1 (en) * | 2004-08-31 | 2008-01-15 | Monsanto Technology Llc | Nucleotide and amino acid sequences from Xenorhabdus and uses thereof |
KR101027427B1 (en) | 2004-11-12 | 2011-04-11 | 젠코어 인코포레이티드 | Fc VARIANTS WITH INCREASED BINDING TO FcRn |
US7572896B2 (en) * | 2005-02-03 | 2009-08-11 | Raven Biotechnologies, Inc. | Antibodies to oncostatin M receptor |
WO2006138005A2 (en) * | 2005-05-10 | 2006-12-28 | Monsanto Technology, Llc | Genes and uses for plant improvement |
RS53685B1 (en) * | 2005-12-29 | 2015-04-30 | Janssen Biotech Inc. | Human anti-il-23 antibodies, compositions, methods and uses |
AR062435A1 (en) * | 2006-08-18 | 2008-11-05 | Xoma Technology Ltd | PRLR SPECIFIC ANTIBODY (PROLACTIN RECEPTOR) AND ITS USES |
TWI595005B (en) * | 2007-08-21 | 2017-08-11 | 安健股份有限公司 | Human c-fms antigen binding proteins |
AU2008345242B2 (en) * | 2007-10-31 | 2014-02-27 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
ES2564523T3 (en) | 2007-12-19 | 2016-03-23 | Janssen Biotech, Inc. | Design and generation of phage de novo human presentation libraries by fusion with pIX or pVII, vectors, antibodies and methods |
AR070315A1 (en) * | 2008-02-07 | 2010-03-31 | Merck & Co Inc | ANTIBODIES 1B20 ANTAGONISTS OF PCSK9 |
EP2488867B1 (en) * | 2009-10-14 | 2020-09-30 | Janssen Biotech, Inc. | Methods of affinity maturing antibodies |
EA031044B1 (en) * | 2010-10-13 | 2018-11-30 | Янссен Байотек, Инк. | Human oncostatin m antibodies and methods of use thereof |
WO2012069433A2 (en) | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Glaxo Group Limited | Antigen binding proteins |
-
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
JP2019037239A (en) * | 2010-10-13 | 2019-03-14 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | Human oncostatin m antibodies and methods of use |
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