JP6216531B2 - 細胞増殖抑制剤およびがんの予防・治療剤 - Google Patents
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(化学構造)
本明細書に開示のmiR−205類似体は、下記化学式1または化学式2で表されるものである。
化学式1および化学式2において、BPは、ベンゼンピリジン骨格(BP骨格)を表す。BP骨格はベンゼン環およびピリジン環を有する骨格であれば特に制限されないが、例えば、下記化学式3で表されるものであることが好ましい。
上述した本発明に係るmiRNA−205類似体は、その塩基配列に基づき、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することができる。また、このようにして製造されたmiRNAのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の双方の3’末端にBP骨格を導入する手法についても、従来公知の知見(例えば、国際公開第2007/094135号パンフレットや特開2011−251912号公報など)が適宜参照されうる。
生細胞数、mRNAの発現量およびルシフェラーゼ活性はそれぞれ3サンプル測定し、その平均値±標準偏差(Mean±SD)を求め、コントロールを100%あるいは1.0としたときの相対値を示した。実験に用いた各miRNAあるいはsiRNAをトランスフェクションした場合の結果をスチューデントのt検定(有意水準5%)にて有意差検定を行った。
ヒト悪性黒色腫由来細胞株A2058およびMewoをヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入し、製造者のプロトコールに従って維持した。
A2058細胞またはMewo細胞を、トランスフェクションの前日に、6穴プレートに0.5×105細胞/ウェルの濃度で播種した。miR−205の代表的な模倣体としては、野生型miR−205と同一の配列を有し、一般に入手可能なPre−miR−205−5p(アプライドバイオシステムズ)を用いた。細胞のトランスフェクションには、Pre−miR−205−5pのほか、3’オーバーハング領域に上記化学式3で表される芳香族ベンゼンピリジン類似体が付加され、かつミスマッチ部位のパッセンジャー鎖の少なくとも1つをマッチさせた合成miR−205類似体(北海道システム・サイエンス株式会社)を用いた。また、トランスフェクションは、カチオン性リポソームであるリポフェクトアミンRNAiMAX(インビトロジェン)を10nMの濃度で用い、製造者のリポフェクションのプロトコールに従って行った。なお、各miRNAについては、最終濃度が20nMとなるように調整し、培地に添加した。また、コントロール(陰性対照)としては、Dharmacon社製のコントロールRNAを培地に添加した。
上述したように各miRNA類似体をトランスフェクションし、72時間培養した後に0.5%トリプシン-EDTA(ethlenediaminetetraacetic acid、SIGMA、St. Louis、MO、USA)を用いて、細胞を回収し、トリパンブルーを用いた色素排除法にて、改良Neubauer型血球計算盤(ERMA、東京)を用いて生細胞数を計測した。結果を図1および図2に示す。これらの図に示すように、上述したS1〜S8のいくつかは、コントロール(陰性対照)に対して有意に高い細胞増殖抑制作用を示した。
miRNAのin vitroでの安定性を評価するために、BP修飾されていない合成miR−205類似体であるmiR−205/S1およびmiRNA−205/S3を北海道システム・サイエンス株式会社から入手した。
BALB/cSlc-nu/nu(ヌード)マウスを日本エスエルシー株式会社から入手した。A2058細胞を100μlあたり1×106個まで濃縮し、各マウスの背中に皮下投与した。腫瘍体積は式:0.5236L1(L2)2(ここで、L1は腫瘍の長径であり、L2は腫瘍の短径である)に従って算出した。まず、miRNA投与の頻度を決定するために、腫瘍細胞の接種7日目にPre−miR−205−5pまたはmiR−205BP/S3(0.1nmol)のOpti-MEM(Invitrogen)溶液(50μl)を2μlのカチオン性リポソーム(リポフェクトアミンRNAiMAX)と混合し、得られた混合物を腫瘍に一度に注射した。注射後0、24、48、72または96時間後にマウスを解剖し、移植した腫瘍の全組織を摘出してtotal RNAを抽出し、次いでmiR−205類似体の発現レベルを評価した。
miR−205BP/S3(類似体1)のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:2〕
miR−205BP/S3(類似体1)のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:3〕
miR−205BP/S7(類似体2)のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:4〕
miR−205BP/S7(類似体2)のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:5〕
Pre−miR−205−5p(ヒトの野生型miR−205)のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:6〕
Pre−miR−205−5p(ヒトの野生型miR−205)のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:7〕
miR−205BP/S1のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:8〕
miR−205BP/S1のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:9〕
miR−205BP/S2のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:10〕
miR−205BP/S2のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:11〕
miR−205BP/S4のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:12〕
miR−205BP/S4のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:13〕
miR−205BP/S5のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:14〕
miR−205BP/S5のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:15〕
miR−205BP/S6のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:16〕
miR−205BP/S6のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
〔配列番号:17〕
miR−205BP/S8のガイド鎖のRNA配列である。
〔配列番号:18〕
miR−205BP/S8のパッセンジャー鎖のRNA配列である。
Claims (5)
- 下記化学式1または化学式2で表されるmiR−205類似体:
- 請求項1に記載のmiR−205類似体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
- 請求項1に記載のmiR−205類似体を有効成分として含有する医薬。
- 請求項1に記載のmiR−205類似体を有効成分として含有する、がんの予防および/または治療剤。
- 前記がんが、悪性黒色腫である、請求項4に記載の予防および/または治療剤。
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JP2013073192A JP6216531B2 (ja) | 2013-03-29 | 2013-03-29 | 細胞増殖抑制剤およびがんの予防・治療剤 |
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