JP6211680B2 - プルランゲルならびにその製造方法および利用 - Google Patents
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Description
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、プルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法を提供する。
(プルランゲル)
本発明に係るプルランゲルは、複数のプルランが架橋されてなる。プルランは、グルコース3分子がα−1,4結合したマルトトリオースがα−1,6結合で繋がった多糖類である。本発明に係るプルランゲルを構成するプルランの平均分子量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すればよいが、例えば、20kDa〜1600kDaであり得る。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「A〜B」は、「A以上かつB以下」を意味する。
<製造方法1>
プルランゲルの製造方法の一実施形態では、プルランと下記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む。
プルランゲルの製造方法の別の実施形態では、プルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む。この製造方法は、特に、球状のプルランマイクロゲルおよびプルランナノゲルを製造する場合に好ましい。
プルランゲルの製造方法のさらに別の実施形態では、プルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、当該水溶液および当該水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる。この製造方法は、特に、球状のプルランマイクロゲルおよびプルランナノゲルを製造する場合に好ましい。
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がさらに架橋されているプルランゲルを製造する場合、上記水溶液はタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をさらに含んでいる。したがって、プルランゲルの製造方法の別の実施形態では、プルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む。さらに別の実施形態では、プルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む。またさらに別の実施形態では、プルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを含む水溶液を撹拌する工程と、当該工程後に当該水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と、乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、当該水溶液および当該水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる。
オルガノゲルを製造する場合は、上述の製造方法で得られたプルランゲルを乾燥させる工程と当該乾燥させたプルランゲルを有機溶剤に浸漬する工程とをさらに含む。
プルラン以外の多糖類を含んでいるプルランゲル(ハイブリッドゲル)を製造する場合、上記水溶液に当該多糖類を含ませればよい。多糖類の種類は上述のとおりである。当該多糖類は、1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。水溶液中の当該多糖類の濃度は特に限定されないが、例えば、1%〜10%(w/v)(2種類以上の場合には合計した濃度)とすることができる。
内部に任意の物体を保持させたプルランゲルを製造する場合、例えば、上記水溶液に当該物体を含ませればよい。
(プルランゲル乾燥物)
本発明に係るプルランゲル乾燥物は、上述のプルランゲルを乾燥させた乾燥物である。プルランゲル乾燥物の大きさおよび形状は特に限定されず、使用目的に応じて適宜設定すればよい。乾燥させるプルランゲルは、タンパク質等が架橋されたプルランゲル、または薬剤が含浸されたプルランゲルであってもよい。プルランゲル乾燥物は、水等の液体に浸漬すると、当該液体を吸い、元のプルランゲルに戻る。
プルランゲル乾燥物の製造方法の一実施形態では、上述の種々の形態のプルランゲルを乾燥させる工程を含む。
(薬学的組成物)
本発明に係るプルランゲルは、薬剤の徐放性を有する薬学的組成物として利用することができる(実施例を参照)。また、本発明に係るプルランゲルは、アジュバント効果を有する薬学的組成物として利用することができる(実施例を参照)。
薬学的組成物の製造方法の一実施形態では、上述の製造方法によって製造された種々の形態のプルランゲルを乾燥させる工程と、乾燥させたプルランゲルを、上述の薬剤を含む液体に浸漬する工程とを含む。
本発明に係るタンパク質検出キットは、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸が上記一般式(1)で表される構造によってプルランに架橋されているプルランゲルまたはその乾燥物を備える。
本発明のプルランゲルフィルムは、食品分野で利用することもできる。例えば、本発明のプルランゲルフィルムは透明で光沢があるため、食品の光沢剤として利用することができ、食品の表面にコーティングすることにより、食品の艶出しを行うことができる。プルランゲルフィルムは可食性を有しているため、そのまま食品とともに食べることができる。また、本発明のプルランゲルフィルムは食品を包むためのフィルムとして利用することもできる。本発明のプルランゲルフィルムは、酸素の透過率が低いため、食品の酸化を防ぎ、品質の劣化を低減する。さらに、本発明のプルランゲルフィルムは、表面に印刷することが可能であり、幅広い印刷インクを用いることができる。また、色素等をプルランゲルに含浸させて乾燥させることによって、着色したプルランゲルフィルムを作製することもできる。また、プルランゲルフィルムの表面に様々な物質を貼り付けることができる。
本発明に係るプルランゲルは、複数のプルランが架橋されてなる。
本発明に係るプルランゲルにおいて、さらにタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されていてもよい。
本発明はまた、複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であってプルランと上記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法を提供する。
100mLの水に、平均分子量200kDaのプルラン(6g,林原社製)を加え、さらに5%重曹水溶液(2mL,和光純薬社製)を加えてpHを7に調整した。ここに塩化シアヌル(0.2g,関東化学社製)のアセトン(2mL,和光純薬社製)溶液を加えた。塩化シアヌルのアセトン溶液を添加するとpHが徐々に低下したため、pH7を維持するよう5%重曹液を適宜添加した。次いで、氷中(0〜1℃)において3時間、約300rpmの速度でこの水溶液を撹拌した。その後、撹拌を停止し、50mLチューブに水溶液を15mLずつ5本に入れ、それぞれ、37℃、25℃、4℃、氷中(0〜1℃)および−20℃において18時間静置したところ、プルランゲルを作製することができた(−20℃に置いたものは凍結していたので、室温で自然解凍しゲル化を確認した)。
常温の水100mLに、平均分子量200kDaのプルラン(10g,林原社製)を加え溶解した。ここに塩化シアヌル(0.2g,関東化学社製)を加えて約5分間撹拌した。この水溶液を15mLずつ50mLチューブ5本に入れ、それぞれpHを3.5、5.0、7.0、8.0、および10.0に調整した。pHは、調整前でpH3.5であり、pH5.0、7.0および8.0は5%重曹水溶液で調整し、5%重曹水溶液のpHが8.3であったため、pH10.0の条件のものは、5%炭酸ナトリウム水溶液で調整した。
100mLの水に、平均分子量200kDaのプルラン(10g,林原社製)を加え、さらに5%重曹水溶液(6mL)を加え、ここに塩化シアヌル(0.2g,ナカライテスク社製)の粉末を加えた。1分間撹拌した後、pHが7.0となるよう5%重曹水溶液を適量加えた。次いで、常温(約22℃)において5〜10分間、500rpmの速度でこの水溶液を撹拌した。その後、撹拌を停止し、4℃において18時間静置したところ、プルランゲルを作製することができた。必要に応じ、このプルランゲルをグリシン溶液(5%,味の素社製)に24時間浸漬し残存活性基をマスキングした。
20mLの水に、平均分子量200kDaのプルラン(2g,林原社製)、塩化シアヌル(40mg,ナカライテスク社製)、タンパク質を加えた。用いたタンパク質は、組み換えDer f 2(20mg,自社製)、ネコHGF(20mg,自社製)、ネコIFN(10mg,自社製)、およびBSA(20mg,和光純薬社製)である。実施例1と同様の方法で撹拌し、4℃で静置することにより、タンパク質を架橋したプルランゲルを作製することができた。
ネコHGFを架橋したプルランゲルを、4℃の条件下および−20℃の凍結条件下で静置して作製した。これらのプルランゲルをホモミキサー(プライミクス社製,型番HOMOMIXER MARKII Model2.5)を用いて、最大回転数で1分間の条件で粉砕した。4℃条件のプルランゲルの粉砕後の顕微鏡画像を図1の(a)に示す。−20℃条件のプルランゲルの粉砕後の顕微鏡画像を図1の(b)に示す。
実施例1と同様の方法において4℃で静置して作製したプルランゲルを、−20℃で凍結させた。7日後、解凍を行ったところ、元のプルランゲルに戻った。
実施例1と同様の方法において4℃で静置して作製したプルランゲルを、3mLバイアル瓶に1mL入れ、凍結乾燥装置(東京理化器械社製,型番FDU-2100+DRC-1100)の自動運転条件下で凍結乾燥し、プルランゲル乾燥物を作製した。
実施例1と同様の方法において4℃で静置して作製したプルランゲルを、実施例7の条件下で凍結乾燥し、プルランゲル乾燥物を作製した。この乾燥物に、組み換えDer f 2(1mg)を含む水1mLを加え、25℃で5分間静置した。その結果、乾燥物内部まで浸水し、外観は凍結乾燥前のゲルに戻り、タンパク質含浸プルランゲルが作製できた。
(投与試料の作製)
Der f 2−プルラン結合体(Der f 2−P結合体):100mLの水に、平均分子量200kDaのプルラン(2g,林原社製)を加え、さらに5%重曹水溶液(2mL,和光純薬社製)を加えて溶解した。ここに塩化シアヌル(125mg,関東化学社製)のアセトン(2mL,和光純薬社製)溶液を加えた。塩化シアヌルのアセトン溶液を添加するとpHが徐々に低下したため、pH7を維持するよう5%重曹液を適宜添加した。次いで、氷中(0〜1℃)において3時間、約300rpmの速度でこの水溶液を撹拌した。また、この水溶液に組み換えDer f 2を100mg添加した。その後、37℃で18時間撹拌し続けた。この溶液にグリシン(5g,味の素社製)を加えて37℃で2時間撹拌し、残存活性基をマスキングした。この溶液からカラムクロマトグラフィーおよび限外ろ過膜を用いて、未反応のDer f 2、プルラン、塩化シアヌル等の試薬類を除去し、PBSにバッファー交換してDer f 2−プルラン結合体サンプルとした。このDer f 2−プルラン結合体は、プルラン同士は結合しておらず、PBS中にプルラン誘導体として溶解している。
これらのサンプルを、各群ラット2匹に頸部皮下投与(2回:開始時および7日後)した。定期的(開始時、7日後、14日後、21日後、および28日後)に採血して、血清中のDer f 2特異的IgGの推移をELISA法により吸光度の値で比較した。
W/O分散によるプルランのマイクロゲル化を検討した。実施例3の方法で操作し、10分間撹拌後に18時間静置するところを静置時間10分間とし、架橋反応がある程度進行し溶液が僅かに糸を引く状態であることを確認した後、この液を1mLから10mLの範囲で50mLのオイル(オリーブオイル、パナセート810、またはヒマワリ油)に滴下して、100rpmから1,000rpmの範囲、および30分から3時間の範囲で撹拌して分散させ、マイクロサイズの球状ゲルの作製を検討した。
実施例3の方法で操作し、10分間撹拌後に18時間静置するところを静置時間30分間とし、架橋反応がある程度進行し溶液が糸を引く状態であることを確認した後、ポリプロピレン製の板上に薄く伸ばした。これを25℃で48時間静置して自然乾燥し、プルランゲルフィルムを作製した。これと同時にBSA(20mg,和光純薬社製)を添加し、タンパク質を架橋させたプルランゲルも同様の操作で作製した。もう一つの形態として、タンパク質を架橋させていないプルランゲルフィルムをBSA液(1mg/mL)に10分間浸漬した後10分間水洗した、タンパク質含浸プルランゲルフィルムを作製した。また、比較として、プルラン(林原社製)を水に溶解してポリプロピレン製の板上に薄く伸ばし、これを25℃で48時間静置して自然乾燥して、プルランフィルムを作製した。
水(90mL)にプルラン(10g,林原社製)および重曹(400mg)を加えて完全に溶解させた。氷中にて5℃以下まで冷却後、塩化シアヌル(200mg,関東化学社製)のアセトン(2mL)溶液を加え、均一溶液となるまで5℃以下で攪拌し、プルラン10%−塩化シアヌル2%のワニスを調製した。これをゲル化前にルミラーフィルム(T60,膜厚100μm,東レ社製)上にバーコーター(#80)で展開し、一昼夜常温常圧で乾燥させた。得られたプルランゲルフィルム(膜厚16μm)を剥離して、酸素透過率測定に供した。酸素透過率測定は、測定器:OX−TRAN2/21(MOCON社製)を用いて行い、測定条件は23℃,50%RHとした。
20mLの水に、平均分子量200kDaのプルラン(2g,林原社製)、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン(1g,和光純薬社製)および5%重曹(和光純薬社製)水溶液を1.5mL加え1分間(約500rpm)撹拌した。そこに塩化シアヌル(40mg,ナカライテスク社製)を加え、約10分間(500rpm)撹拌した後、25℃で18時間静置したところ溶液部分全てがゲル化し一つの塊になった。
23mLの水に、プルラン(1.40g,林原社製)、デキストラン硫酸ナトリウム(0.60g,和光純薬社製)および重曹(100mg)を加えて完全に溶解した。次いで、そこに塩化シアヌル(50mg,関東化学社製)のアセトン(1mL)溶液を加え、1分間(300rpm)撹拌した後、室温で一昼夜静置してゲル化させた。水(10mL)を加えてゲルをポリトロンホモジナイザーで破砕(13,000rpm)した後、エタノール400mLに注ぎ、ろ過および真空乾燥(50℃)した。次いで、ラボミルサープラスで粉砕し、粉末状のプルラン−デキストラン硫酸ナトリウムハイブリッドゲル(1.72g)を得た。
キトサン10(750mg,和光純薬社製)を水(15mL)に分散させ、1M塩酸(2.9mL)を加えて完全に溶解させた後、重曹溶液でpH6.0に調整した。そこにプルラン(500mg,林原社製)および水を加えて液量25mLとした後、塩化シアヌル(31mg,関東化学社製)のアセトン(0.5mL)溶液を加え、1分間(300rpm)撹拌した後、室温で一昼夜静置してゲル化させた。ゲルをスパチュラで破砕した後、エタノール(300mL)に注ぎ、ろ過および真空乾燥(50℃)した。次いで、ラボミルサープラスで粉砕し、粉末状のプルラン−キトサンハイブリッドゲル(1.00g)を得た。
実施例12と同様の方法でプルラン8%−塩化シアヌル2.5%の前駆体溶液(5mL)を調製し、そこにラウリル硫酸ナトリウム(250mg)を加えて穏やかに攪拌した。これとは別にDKS NL−15(2.82g,第一工業製薬製)およびDKS NL−50(0.71g,第一工業製薬製)のヘキサン(30mL)混合液を調製した後、上記水溶液を加えて、ボルテックスで激しく攪拌し乳化させた。室温で一晩静置した後、ゲル沈殿を遠心分離回収し、ヘキサン/水=1/1混合液で分散および遠心分離回収を繰り返して乳化剤を除去した。最後に水分散させ200×gで沈殿する巨大粒子を除去してプルランマイクロゲルを得た。プルランマイクロゲルの粒子径を測定した(LA−950V2,堀場製作所製)結果、8.6μm(体積基準90%径)であった(図6)。
プルラン以外の多糖類でゲルを作製することが可能か実験した。プルラン以外の多糖類として、常温で水に溶解するものを用いた。用いた多糖類は、デキストラン40,000、デキストラン200,000、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、およびアラビアガム、の11種類である。これら各2gを水20mLに加え撹拌し溶解した。一部溶解しなかったものについては、溶解するまで水を加えそこから20mL採取した。
水酸化ナトリウム水溶液(0.1M、0.5M)20mLにそれぞれプルラン(2g,林原社製)を溶解したところ、発色(淡黄色〜黄褐色)が見られた。その水溶液のpHを測定したところ0.1MがpH12.6であり、0.5MがpH13.5であった。それぞれの水溶液に塩化シアヌル(60mg,ナカライテスク社製)のアセトン(400mL,和光純薬社製)溶液を加えたところ、塩化シアヌルのアセトン溶液を滴下した部分が直ちにゲル化し、撹拌しても均一にはならず、18時間静置後に確認したところ、ムラがある一部白濁したゲルとなった。このように、水酸化ナトリウムを用いる場合には、プルラン自体が何らかの化学反応を起こし、構造が変化している可能性が示唆された。
水酸化ナトリウム水溶液(0.1M、0.5M)20mLにそれぞれプルラン(2g,林原社製)を溶解したところ、発色(淡黄色〜黄褐色)が見られた。対照として、本発明で用いる重曹についても同時に実施した。重曹水溶液(0.5M)20mLにプルラン(2g,林原社製)を溶解したところ、無色透明で水酸化ナトリウムを用いた時とは異なり発色しなかった。これら水溶液のpHを測定したところ、水酸化ナトリウムの方は、0.1MがpH12.2、0.5MがpH13.2であり、重曹の方はpH8.4であった。それぞれの水溶液に粉末の塩化シアヌル(60mg,ナカライテスク社製)を加え10分間撹拌したところ、重曹を用いたものは塩化シアヌルが均一に分散して溶解したが、水酸化ナトリウムを用いたものは、粉末の塩化シアヌルの周りがゲル化しダマ状になり溶け残った。その影響からか18時間静置後、0.1Mはゲル化しなかった。0.5Mはゲル化したが、色のついたゲルとなった。一方の重曹を用いたものは、無色透明なゲルとなった。水酸化ナトリウム水溶液にプルランを溶解して作製したゲルは、重曹を用いた本発明のゲルとは外観上異なるものとなった。そのため、ゲルの化学構造も異なっていると考えられる。
Claims (17)
- 複数のプルランが下記一般式(1)で表される構造によって架橋されてなる、プルランゲル。
(式(1)において、複数ある*のうちの少なくとも2つはプルランとの架橋点である) - さらに、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がプルランに架橋されている、請求項1に記載のプルランゲル。
- 上記タンパク質は、抗体、抗原、受容体、受容体に対するリガンド、酵素、酵素に対するリガンド、もしくはホルモン、またはこれらの何れかの機能的フラグメントである、請求項2に記載のプルランゲル。
- 薬剤が含浸されている、請求項1に記載のプルランゲル。
- 平均粒径が50nm〜1mmである、請求項1〜4の何れか1項に記載のプルランゲル。
- プルラン以外の多糖類を含んでいる、請求項1〜5の何れか1項に記載のプルランゲル。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載のプルランゲルを乾燥させた、プルランゲル乾燥物。
- 複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、
プルランと下記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、
上記工程後に上記水溶液を静置して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法。
(式(2)において、複数あるR1〜R3はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である) - 複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、
プルランと下記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、
上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して架橋を行う工程とを含む、プルランゲル製造方法。
(式(2)において、複数あるR1〜R3はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である) - 複数のプルランが架橋されてなるプルランゲルの製造方法であって、
プルランと下記一般式(2)で表される架橋剤とを含む水溶液を撹拌する工程と、
上記工程後に上記水溶液を水不溶性の液体中で撹拌して乳化する工程と、
乳化した溶液を静置して架橋を行う工程とを含んでおり、
上記水溶液および上記水不溶性の液体のうちの少なくとも何れか一方が、乳化剤を含んでいる、プルランゲル製造方法。
(式(2)において、複数あるR1〜R3はそれぞれ独立に塩素原子、フッ素原子、臭素原子またはヨウ素原子である) - 上記架橋剤は塩化シアヌルである、請求項8〜10の何れか1項に記載のプルランゲル製造方法。
- 上記水溶液は、pH5.0〜pH8.0である、請求項8〜11の何れか1項に記載のプルランゲル製造方法。
- −20℃〜37℃で架橋を行う、請求項8〜12の何れか1項に記載のプルランゲル製造方法。
- 上記プルランゲルはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸がさらに架橋されており、
上記水溶液は当該タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をさらに含んでいる、請求項8〜13の何れか1項に記載のプルランゲル製造方法。 - 薬剤の徐放性を有する薬学的組成物の製造方法であって、
請求項8〜13の何れか1項に記載のプルランゲル製造方法によって作製されたプルランゲルを乾燥させる工程と、
乾燥させたプルランゲルを、上記薬剤を含む液体に浸漬する工程とを含む、薬学的組成物製造方法。 - 上記プルランゲルは、乾燥前の平均粒径が50nm〜1mmである、請求項15に記載の薬学的組成物製造方法。
- 請求項2または3に記載のプルランゲルまたはその乾燥物を備える、タンパク質検出キット。
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