JP6196975B2 - ポリペプチドの安定化 - Google Patents
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Description
R1は、水素又はC1〜6アルキルを表し、
R4は、水素を表し、又は
R1及びR4は、それらが結合する原子と一緒になってピロリジン環を形成し、
R2は、水素、C1〜6アルキル又は-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3を表し、
R3は、C1〜6アルキルを表す]
及び/又は
式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル
Xは、-S(O)2-又は-S+(Rc)-を表し、
Ra及びRbは、独立にC1〜6アルキルを表し、
Rcは、カルボキシレートアニオン及びアミン(-NH2)成分で置換されたC1〜6アルキルを表す]
の水溶液を用意するステップ、及び
(b)溶液を乾燥させてポリペプチドを取り込んだ組成物を形成するステップ
を含む方法を提供する。
・ 本発明の方法により得られる組成物;
・ ポリペプチドがワクチン免疫原である本発明の組成物、及び場合によってはアジュバントを含むワクチン;
・ ワクチンとして使用するための、ポリペプチドがワクチン免疫原である本発明の組成物;
・ ワクチン免疫原を取り込んだワクチンを調製するための方法であって、(a)(i)ワクチン免疫原、(ii)式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び(iii)1種以上の糖の水溶液を用意するステップ、及び(b)場合によっては、アジュバント、バッファー、抗生物質及び/又は添加剤を混合物に加えるステップ、及び(c)溶液を乾燥させて前記ワクチン免疫原を取り込んだ組成物若しくは固体組成物を形成するステップを含む方法;
・ ポリペプチドを保存するための、式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル及び1種以上の糖の使用;
・ 乾燥前のポリペプチドを保存するための方法であって、(a)(i)ポリペプチド、(ii)1種以上の糖、及び(iii)式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステルの水溶液を用意するステップ、及び(b)密封容器中、場合によっては冷蔵庫又はフリーザー中に、最大5年間溶液を保存するステップを含む方法;
・ (i)ポリペプチド、(ii)1種以上の糖、及び(iii)式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステルを含むバルク水溶液であって、密封容器中に提供され、乾燥前に冷蔵庫又はフリーザー中に保存されるバルク水溶液;
・ 乾燥前に前記ポリペプチドを含む水溶液中でポリペプチドを保存するための、式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び1種以上の糖の使用、及び
・ ポリペプチドを含む乾燥又はフリーズドライ製品である組成物の再懸濁剤としての、式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び1種以上の糖の使用。
本発明は、式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び1種又は2種以上の糖によるポリペプチドの保存に関する。ポリペプチドは、水溶液中で式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び1種以上の糖と接触させ、次いで、ポリペプチドが存在する得られた溶液を乾燥させて、ポリペプチドを取り込んだ組成物を形成する。
生理的活性があるポリペプチドなどの任意のポリペプチドが、本発明における使用に適している。例えばポリペプチドは、6〜14アミノ酸などの15アミノ酸未満の小ペプチド(例えば、オキシトシン、シクロスポリン)、15〜50アミノ酸のより大きなペプチド(例えば、カルシトニン、成長ホルモン放出ホルモン1〜29(GHRH))、50〜250アミノ酸長の小タンパク質(例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン)、250アミノ酸長を超えるより大きなタンパク質、又は2本以上のポリペプチド鎖の複合体を含むマルチサブユニットタンパク質であってよい。
本発明において使用するための抗体は、完全抗体、又はその抗原若しくはリガンド結合断片のいずれかであってよい。
一実施形態では、抗体は免疫グロブリン(Ig)モノマー、ジマー、テトラマー、ペンタマー、又は他のオリゴマーである。各々の抗体モノマーは4本のポリペプチド鎖を含むことができる(例えば、従来の抗体は2本の同一重鎖と2本の同一軽鎖からなる)。或いは、各々の抗体モノマーは2本のポリペプチド鎖からなる(例えば、1つの重鎖抗体が2本の同一重鎖からなる)。
抗原結合断片は、抗原又はリガンド結合能力を保持する抗体、例えばFab、F(Ab')2、Fv、ジスルフィド結合Fv、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、直鎖状抗体、ドメイン抗体又は多重特異性抗体の任意の断片であってよい。このような断片は1種以上の抗原又はリガンド結合部位を含む。一実施形態では、抗原又はリガンド結合断片は、4個のフレームワーク領域(例えばFR1、FR2、FR3及びFR4)並びに3個の相補性決定領域(例えばCDR1、CDR2及びCDR3)を含む。抗原又はリガンドと結合する断片の能力を検出するのに適した方法、例えばイムノアッセイ及びファージディスプレイは当技術分野でよく知られている。
完全抗体又はその断片はリンカーなどの他の成分と結合させることが可能であり、これらを使用して2個以上の断片又は抗体を1個に接合することができる。このようなリンカーは化学的リンカーであってよく、又は断片又は完全抗体との融合タンパク質の形で存在することができる。したがってリンカーを使用して、同じ又は異なる結合特異性を有する完全抗体又は断片を1個に接合することができる。
一実施形態では、抗体又は抗原若しくはリガンド結合断片は、異なる天然抗体由来の配列を含むキメラ抗体又はその断片である。例えば、キメラ抗体又は抗体断片は、特定種若しくは抗体クラスの抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である重鎖及び/又は軽鎖であって、一方で鎖の残り部分が別種若しくは抗体クラスの抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である、重鎖及び/又は軽鎖の一部分を含むことができる。典型的には、キメラ抗体又は抗体断片は、マウスとヒト抗体成分のキメラを含む。
任意の標的抗原と結合可能である、抗体又は抗原若しくはリガンド結合断片は、本発明の方法において使用するのに適している。抗体又は抗体断片は、自己免疫障害(例えば、I型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病及び重症筋無力症)と関連した抗原又はリガンド、癌若しくは炎症状態と関連した抗原又はリガンド、骨粗しょう症と関連した抗原、アルツハイマー病と関連した抗原、又は細菌若しくはウイルス抗原と結合することができる。
例えば、適切なモノクローナル抗体は、(例えばKohler et al Nature256:495(1975)により最初に記載されたような)ハイブリドーマ法によって、組換えDNA法によって、及び/又は単離後にファージ若しくは他の抗体ライブラリーから得ることができる。
任意のタンパク質酵素が、本発明において使用するのに適している。このような酵素は活性部位を含み、基質と結合することができる。酵素は、1本のポリペプチド鎖からなるモノマーであってよい。或いは酵素は、多数のポリペプチド鎖からなるジマー、テトラマー又はオリゴマーであってよい。ジマー、テトラマー又はオリゴマーは、それぞれホモ-又はヘテロ-ジマー、テトラマー又はオリゴマーであってよい。例えば酵素は、完全な生物活性又は酵素機能を得る前に、凝集体(例えば、ジマー、テトラマー又はオリゴマー)を形成する必要があり得る。酵素はアロステリック酵素、アポ酵素又はホロ酵素であってよい。
DNAase、例えば嚢胞性線維症を有する子供の肺粘液においてDNAを切断するPulmozyme又はDornaseなどの組換えDNAaseI、
胃リパーゼ、膵臓外分泌リパーゼ機能不全と関連した脂質吸収不良の治療用の組換え哺乳動物胃リパーゼであるMeripaseなど、
マンノース末端グルコセレブロシダーゼ、ゴーシェ病、酵素グルコセレブロシダーゼの欠損により引き起こされる遺伝性障害の治療用の組換えマンノース末端グルコセレブロシダーゼであるCerezymeなど、
関連グリコーゲン貯蔵疾患、ファブリー病の治療に使用されるα-ガラクトシダーゼ、
アデノシンデアミナーゼ(ADA)、ADA障害、重症合併型免疫不全症を治療するため使用されるPegademaseなど、
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、フェニルケトン尿症の治療のために使用されるペグ化組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼKuvanなど、
組織プラスミノゲンアクチベータ、血中フィブリン溶解における血液凝固を治療するため使用されるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ、
尿酸オキシダーゼ、遺伝子改変酵母により生成され、白血病若しくはリンパ腫がある患者における高尿酸血症の治療若しくは予防において使用される組換え尿酸オキシダーゼであるElitek(ラスブリカーゼ)など、
小児急性リンパ芽球性白血病の治療において使用されるL-アスパラギナーゼ、
血友病がある患者によって使用される第VIIa因子、
血友病Bの治療で使用される第IX因子、及び
スーパーオキシドジスムターゼ、家族性筋萎縮性側索硬化症の治療に使用されるウシスーパーオキシドジスムターゼOrgoteinなど。
本発明において使用するのに適したワクチン免疫原は、ワクチンの任意の免疫原成分を含む。ワクチン免疫原は、特定疾患又は医学状態に対するワクチンとして使用すると、個体中で免疫応答を誘導し得る抗原を含む。ワクチン免疫原はワクチン調製物の製剤化前に単独で提供することができ、又はそれはワクチン調製物の一部として提供することができる。ワクチン免疫原はサブユニットワクチン、ワクチン若しくはトキソイドとして有用なコンジュゲートであってよい。ワクチン免疫原は、タンパク質、細菌特異的タンパク質、ムコタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、多糖、ペプチドグリカン、核タンパク質又は融合タンパク質であってよい。
適切なサブユニットワクチン免疫原は、微生物(例えばウイルス若しくは細菌)由来の、タンパク質、リポタンパク質又は糖タンパク質の任意の免疫原サブユニットを含む。或いは、サブユニットワクチン免疫原は、腫瘍関連タンパク質などの疾患関連抗原に由来してよい。サブユニットワクチン免疫原は、天然に存在する分子又は合成タンパク質サブユニットであってよい。ワクチン免疫原は、完全長ウイルス若しくは細菌タンパク質、糖タンパク質若しくはリポタンパク質、又は完全長ウイルス若しくは細菌タンパク質、糖タンパク質若しくはリポタンパク質の断片であってよい。
本発明はトキソイドに適用可能である。トキソイドは、例えば病原体、動物又は植物由来であり、免疫原性であるが(例えば、遺伝子突然変異、化学処理により、又は別成分との結合により)不活性化され標的対象に対する毒性が除去された毒素である。例えば毒素は、タンパク質、リポタンパク質、多糖、リポ多糖又は糖タンパク質であってよい。したがってトキソイドは、トキソイド化されたエンドトキシン又はエクソトキシンであってよい。
コンジュゲートワクチン免疫原は、結合する抗原の免疫原性を刺激する、担体成分(例えば、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、又はこれらの任意の免疫刺激性誘導体若しくは断片)と抗原(例えば、多糖若しくは他のハプテン)のコンジュゲートであってよい。例えば、コンジュゲートワクチン免疫原は、対象の免疫原(例えば、多糖)と結合した、組換えタンパク質、組換えリポタンパク質又は組換え糖タンパク質であってよい。
式(I)及び(II)の化合物は生理的に許容される塩若しくはエステルとして存在し得る。
典型的には、R1は水素又はC1〜6アルキルを表し、R4は水素を表す。
典型的にはRaとRbが独立にC1〜4アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はtert-ブチル、より好ましくはメチル若しくはエチルを表す。
本発明中で使用するのに適した糖には、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノース及びマルトースなどの還元糖、及び好ましくはスクロースとラフィノース、より好ましくはスクロースなどの非還元糖がある。糖は単糖、二糖、三糖、又は他のオリゴ糖であってよい。用語「糖」は糖アルコールを含む。したがって一実施形態では、非還元糖又は糖アルコールの使用が好ましい。
本発明中で、ポリペプチド、1種以上の糖、及び式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステルを含む水溶液を乾燥する。任意の適切な水溶液を使用することができる。溶液は緩衝処理することができる。溶液はHEPES、リン酸緩衝、トリス緩衝又は純水溶液であってよい。溶液は、1種以上の共溶媒を場合によっては含むことができる。共溶媒の一例はt-ブチルアルコールである。
・ 0.01〜0.5Mのスクロース、例えば0.05〜0.15M又は約0.1M; 0.001〜0.05Mのラフィノース、例えば0.005〜0.015M又は約0.01M; 0.05M〜1.5Mの式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩、好ましくはDMG、例えば0.1M〜1.2M、又は約1M;及び0.05M〜1.5Mの式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩、好ましくはMSM、例えば0.1M〜1.2M、又は約0.1M、約0.3M、約0.7M又は約1M、
・ 0.1〜1.0Mのスクロース、例えば約0.15M又は約0.45M、0.1〜0.5Mのラフィノース、例えば約0.2M又は約0.25M、及び0.05M〜1.5Mの式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩、好ましくはDMG、例えば0.1M〜1.3M、又は約0.6M又は約1.3M、
・ 1.0〜1.8Mのスクロース、例えば1.1〜1.6M又は約1.1M又は1.2M又は1.4M、0.01〜0.5Mのラフィノース、例えば0.05〜0.3M又は約0.15M、及び0.1〜0.5Mの式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩、好ましくはTMG、例えば0.2〜0.4M又は約0.1M、又は
・ 0.3〜0.7Mの糖アルコール、好ましくはマンニトール、例えば0.4〜0.6M又は約0.5M、0.1M〜1.5Mの式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩、好ましくはDMG、例えば0.3M〜1M又は約0.6M、及び0.1M〜1.5Mの第二の式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩、好ましくはTMG、例えば0.3M〜1M又は約0.5M。
フリーズドライは、腐敗しやすい物質を保存するため、又は物質を輸送により好都合にするために、典型的に使用される脱水プロセスである。フリーズドライは、固体タンパク質及びワクチン製剤を製造するのに重要なステップとなる。しかしながら、生体物質は、手順中凍結ストレスと乾燥ストレスの両方に曝され、これによってタンパク質がアンフォールディング又は変性状態になり得る。さらに、凍結生体物質からの水蒸気放散速度は非常に遅く、したがってこのプロセスは時間を消費するものである。本発明の保存技法は、フリーズドライ手順の脱水及び/又は熱ストレスに対して生体物質を保護することができる。
特定の実施形態では、約1300Paでの真空脱水を使用して乾燥を実施する。しかしながら、真空脱水は本発明には必要ではなく、他の実施形態では、ポリペプチドと接触させた保存混合物をスピン処理(即ち、回転脱水)し、又は(以下でさらに記載するように)フリーズドライする。有利なことに、本発明の方法は、ポリペプチドを含有する保存混合物を真空に曝すステップをさらに含む。20,000Pa以下、好ましくは10,000Pa以下の圧力で真空を施すことが好都合である。少なくとも10時間、好ましくは16時間以上の間、真空を施すことが有利である。当業者に知られているように、真空施用の時間はサンプルのサイズ、使用する機器及び他のパラメータに依存する。
別の実施形態では、本発明の保存混合物と混合したポリペプチドを噴霧乾燥又は噴霧フリーズドライすることによって、乾燥を実施する。これらの技法は当業者にはよく知られており、ガス、例えば空気、無酸素ガス若しくは窒素、又は噴霧フリーズドライの場合、液体窒素を介して供給液体を乾燥する方法を含む。供給液体は、液滴のスプレーまで霧状にする。次いで液滴は、乾燥チャンバー内でのガスとの接触により、又は液体窒素を用いて乾燥させる。
さらなる実施形態では、本発明の保存混合物と混合したポリペプチドを流動床乾燥することによって、乾燥を実施する。この技法は当業者にはよく知られており、制御速度条件下で生成層にガス(例えば空気)を通して流動状態を作製することを、典型的には含む。この技法は、粒子状製品材料の乾燥、冷却、凝集、顆粒化及びコーティングの段階を含むことができる。流動ガスにより、及び/又は流動層に浸した他の加熱表面(例えば、パネル若しくはチューブ)により、熱を供給することができる。冷却ガス及び/又は流動層に浸した冷却表面を使用して、冷却を実施することができる。凝集及び顆粒化のステップは当業者にはよく知られており、得られる製品の性質に応じて様々な方法で実施することができる。粉末、顆粒若しくは錠剤などの粒子状製品のコーティングは、制御条件下で流動粒子に液体を噴霧することにより実施することができる。
低い残留水分率を有する組成物を得ることができる。冷蔵温度を超える温度、例えば4℃〜56℃以上の範囲内、又は冷蔵温度より低い温度、例えば0〜-70℃以下の範囲で長期保存をもたらす、一定レベルの残留水分率が得られる。したがって乾燥組成物は、10重量%以下、5重量%以下、2重量%以下又は1重量%以下の残留水分率を有し得る。残留水分率は、0.5%以上、1%以上であることが好ましい。典型的には乾燥組成物は、0.5〜10重量%、及び好ましくは1〜5重量%の残留水分率を有する。
しかしながら、本発明の方法のさらなる実施形態では、ポリペプチドを含む混合物を固形担体上で乾燥させる。固形担体は、ビーズ、試験管、マトリックス、プラスチック担体、マイクロタイター皿、マイクロチップ(例えば、シリコン、シリコン-ガラス又はゴールドチップ)又は膜を含むことができる。別の実施形態では、本発明の方法により保存したポリペプチド粒子をその上で乾燥又は結合させる、固形担体を提供する。
本発明では、ポリペプチドの保存用の賦形剤も提供する。賦形剤は、(a)場合によっては、スクロース、ラフィノース、スタチオース、トレハロースなどの1種以上の糖、又は糖アルコール若しくはこれらの任意の組合せ、及び(b)式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステルを含む。1種以上の糖が存在することが好ましい。賦形剤はこれらの成分からなる、又は本質的になることが好ましい。
本発明の組成物は典型的には固体である。組成物は典型的には乾燥、好ましくはフリーズドライさせる。
・ 式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び1種以上の糖を含み、好ましくは糖により形成されたマトリックス内にポリペプチドを取り込み、示差走査熱量測定(DSC)により分析すると、結晶溶解による吸熱が観察されず、好ましくは再結晶化による発熱が観察されないフリーズドライ組成物、
・ 式(I)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は式(II)の化合物又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び1種以上の糖を含み、好ましくは糖により形成されたマトリックス内にポリペプチドを取り込み、示差走査熱量測定(DSC)により分析すると、結晶溶解による吸熱が観察されず、好ましくは再結晶化による発熱が観察されない固体フリーズドライケーク。
ホルモン、増殖因子、ペプチド又はサイトカインなどのポリペプチドに関する保存は、脱水、凍結、0℃未満、-5℃未満、-10℃未満、-15℃未満、-20℃未満、-25℃未満の温度、フリーズドライ、室温、-10℃超、-5℃超、0℃超、5℃超、10℃超、15℃超、20℃超、25℃超又は30℃超の温度の条件に曝された下での、物理的若しくは化学的分解、凝集及び/又は生物活性の消失に対するポリペプチドの耐性、細胞成長、細胞増殖若しくは細胞分化を刺激する能力、細胞シグナル伝達経路を刺激する、ホルモン受容体と結合する、又は抗体結合に関するエピトープを保存する能力などを指す。ポリペプチドの保存は、幾つかの異なる方法で測定することができる。例えば、ポリペプチドの物理的安定性は、例えば濁度若しくは色及び/又は清澄性の目視により決定する、UV光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定する、凝集、沈殿及び/又は変性を検出する手段を使用して測定することができる。
非晶質型の保存ポリペプチドによって長期の間ポリペプチドを貯蔵することができ、ポリペプチドの貯蔵寿命が最大になる。ポリペプチドの効能及び有効性は保たれる。本発明により保存したポリペプチドを施す個々の使用は、ポリペプチドの性質に依存する。しかしながら典型的には、ポリペプチドを使用する前に、ポリペプチドを取り込んだ乾燥非晶質固体マトリックスから、ポリペプチドの水溶液を元に戻す。
抗体又は抗原結合断片に関する保存は、脱水、凍結、0℃未満、-5℃未満、-10℃未満、-15℃未満、-20℃未満、-25℃未満の温度、フリーズドライ、室温、-10℃超、-5℃超、0℃超、5℃超、10℃超、15℃超、20℃超、25℃超又は30℃超の温度の条件に曝された下での、物理的若しくは化学的分解、及び/又はタンパク質凝集若しくは分解などの生物活性の消失、抗原結合能力の消失、標的を中和する、免疫応答を刺激する、エフェクター細胞を刺激する若しくは補体経路を活性化する能力の消失に対する抗体又は抗原結合断片の耐性を指す。
保存抗体又はその抗原結合断片は、in vivo治療及び予防用途、in vitro及びin vivo診断用途、並びにin vitroアッセイ及び試薬用途で使用することができる。
酵素に関する保存は、脱水、凍結、0℃未満、-5℃未満、-10℃未満、-15℃未満、-20℃未満、-25℃未満の温度、フリーズドライ、室温、-10℃超、-5℃超、0℃超、5℃超、10℃超、15℃超、20℃超、25℃超又は30℃超の温度の条件に曝された下での、物理的分解及び/又はタンパク質分解、触媒活性の低下、基質との結合能力の消失、産物生成、酵素効率又は反応速度の低下(例えば、kcat/Kmの低下)などの、生物活性の消失に対する酵素の耐性を指す。酵素の保存は、幾つかの異なる方法で測定することができる。例えば、酵素の物理的安定性は、例えば濁度若しくは色及び/又は清澄性の目視により決定する、UV光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定する、凝集、沈殿及び/又は変性を検出する手段を使用して測定することができる。
非晶質型の保存酵素によって長期の間酵素を貯蔵することができ、酵素の貯蔵寿命が最大になる。酵素の効能及び有効性は保たれる。本発明により保存した酵素を施す個々の使用は、酵素の性質に依存する。しかしながら典型的には、酵素を使用する前に、酵素を取り込んだ乾燥非晶質固体マトリックスから、酵素の水溶液を元に戻す。
ワクチン免疫原に関する保存は、脱水、凍結、0℃未満、-5℃未満、-10℃未満、-15℃未満、-20℃未満、-25℃未満の温度、フリーズドライ、室温、-10℃超、-5℃超、0℃超、5℃超、10℃超、15℃超、20℃超、25℃超又は30℃超の温度の条件に曝された下での、物理的若しくは化学的分解、及び/又はタンパク質分解などの生物活性の消失、細胞性若しくは体液性免疫応答を刺激する能力の消失、又は抗体産生を刺激する若しくは抗体と結合する能力の消失に対するワクチン免疫原の耐性を指す。
本発明の保存したワクチン免疫原は、ワクチンとして使用する。例えば、保存サブユニットワクチン免疫原、コンジュゲートワクチン免疫原又はトキソイド免疫原は、それぞれサブユニット、コンジュゲート又はトキソイドワクチンとしての使用に適している。ウイルス感染、ウイルス、動物又は昆虫誘導毒性、癌及びアレルギーを非制限的に含めたウイルス感染の後遺症だけには限られないが、これらを含めた幾つかの状態の治療又は予防のため、本発明の保存したワクチン免疫原をワクチンとして使用することができる。このような抗原は、宿主の免疫応答を刺激して体液性及び/又は細胞性抗原特異的応答をもたらす、1種以上のエピトープを含有する。
本発明に従い保存したポリペプチドは、幾つかの場合乾燥若しくはフリーズドライ製品を元の状態にした後、様々な既知の経路及び技法を使用して対象のin vivoに投与することができる。例えば、ポリペプチドは注射溶液、縣濁液又はエマルジョンとして与えることができ、従来型ニードル及びシリンジを使用した非経口、皮下、経口、表皮、真皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内注射により、又は液体ジェット注射システムを使用して投与することができる。ポリペプチドは皮膚若しくは粘膜組織、例えば鼻腔、気管内、腸、舌下、直腸若しくは膣などに局所投与することができ、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微細噴霧物質として与えることができる。
特に指定のない限り、以下の材料、機器及び技法を利用した。
様々な濃度の賦形剤の存在下で二価F(ab')2を加熱刺激し、異なる地点でアッセイした。ELISAアッセイを使用して残留F(ab')2活性を評価した。これは、加熱刺激中続いた損傷度の測定値として使用した。
賦形剤を用いた固体設定での二価F(ab')2の調製及び加熱刺激
PBS中の二価F(ab')2を-80℃での貯蔵から取り出し、放置して室温で解凍した。固体設定での以下に記載する賦形剤の防御性を決定するため、6.67μg/mlの抗体濃度で300μlの各製剤をガラス製フリーズドライバイアルに等分した。各製剤の詳細は表1中に述べる。
二価F(ab')2の活性をELISAによりアッセイした。PBS中に0.5μg/mlに希釈した抗原(ラットIgG2b-kappa)を、+4℃の制御条件で、96ウエルELISAプレートの横行A〜G、及び横行H中の2つの別のウエルに、100μl/ウエルでコーティングした。これらの対照を使用して後にデータを標準化した。プレートを+4℃で18時間インキュベートし、次いで0.05%のTween20を含有するPBS(洗浄バッファー)で三回洗浄した。ペーパータオル上へのブロッティングにより、プレートを乾燥させた。このブロッティング法は各洗浄ステップで使用した。5%のスキムミルクパウダー及び0.05%のTween20を含有するPBSを用いて、プレートを1.5時間ブロッキングした。サンプルを加える前に、プレートを洗浄バッファーで三回洗浄した。
平均及び標準誤差をそれぞれ二連で得て、指定F(ab')2濃度での棒グラフとしてデータポイントをプロットした。
液体設定における24時間+56℃での加熱処理後の二価F(ab')2断片の活性。
二価F(ab')2が非常に熱不安定であることは図1において見ることができる。二価F(ab')2を(賦形剤あり又はなしで)凍結乾燥すると、加熱刺激の間有意に長く抗体活性が保存される。全てのサンプルがある程度抗体活性を保持しているが、DMGとマンニトールを組合せて含有するサンプルは、これらを含有しないサンプルより抗体活性を保持している。1MのDMGとマンニトールを含有するサンプルは、0.7M又は0.3Mを含有するサンプルよりわずかに良く二価F(ab')2を保護する(図2)。
HRP結合マウス抗淋菌IgGモノクローナル抗体(mAb)を、第2カ月で様々な濃度の賦形剤の存在下及び不在下において+40℃で加熱刺激した。ELISAアッセイを使用して残留HRP結合mAb結合活性を評価した。これは、持続した損傷度/得られた防御の測定値として使用した。即ち抗体結合活性が大きくなると、得られる防御は大きくなる。
賦形剤を用いた固体設定での、マウス抗淋菌IgGHRP結合モノクローナル抗体の調製及び加熱刺激
固体設定での以下に記載する賦形剤の防御性を決定するため、167μg/mlの抗体濃度で300μlの各製剤をガラス製フリーズドライバイアルに等分し、以下に記載するようにVirtis凍結乾燥機でプログラム1を使用して凍結乾燥させた。各製剤の詳細は表4中に述べる。各製剤を作製して、二連において+40℃で2カ月残留結合活性を評価した。
HRP結合マウス抗淋菌IgGの活性をELISAによりアッセイした。抗原(淋菌)は-80℃から取り出し、室温で解凍した。それをPBS中に1.5μg/mlに希釈し、横行A〜G中のELISAプレートウエル、及び陽性対照として働いた横行H中の2ウエルを100μlでコーティングした。プレートを+4℃で18時間インキュベートし、次いで0.05%のTween20を含有するPBS(洗浄バッファー)で三回洗浄した。ペーパータオル上へのブロッティングにより、プレートを乾燥させた。このブロッティング法は各洗浄ステップで使用した。5%のスキムミルクパウダー及び0.05%のTween20を含有するPBS(ブロッキングバッファー)を用いて、振とうしながら+37℃で、プレートを1.5時間ブロッキングした。サンプルを加える前に、プレートを洗浄バッファーで三回洗浄した。
平均及び標準誤差をそれぞれ二連で得て、指定mAb濃度での線グラフ又は棒グラフとしてデータポイントをプロットした。
凍結乾燥及び液体設定における7日間+56℃での加熱処理後の、マウス抗淋菌IgGの活性。
加熱刺激後、HRP結合マウス抗淋菌IgGの結合活性を保存するためマンニトールを加えるとき、DMGには利点がある。
様々な濃度の賦形剤の存在下で二価F(ab')2を加熱刺激し、異なる地点でアッセイした。ELISAアッセイを使用して残留F(ab')2活性を評価した。これは、持続した損傷度の測定値として使用した。
賦形剤を用いた固体設定での二価F(ab')2の調製及び加熱刺激
固体設定での以下に記載する賦形剤の防御性を決定するため、6.7μg/mlの抗体濃度で300μlの各製剤をガラス製フリーズドライバイアルに等分し、実施例2中に記載したようにVirtis凍結乾燥機でプログラム1を使用して凍結乾燥させた。各製剤の詳細は表6中に述べる。
二価F(ab')2の活性をELISAによりアッセイした。抗原(ラットIgG2b-kappa)はPBS中に0.5μg/mlに希釈し、ELISAプレートウエルは100μl/でコーティングした。1:400000希釈の正常マウス血清の2対照ウエルも含めた。これらは一貫した結果を与えることが分かり、これらを使用してデータを標準化した。プレートを+4℃で18時間インキュベートし、次いで0.05%のTween20を含有するPBS(洗浄バッファー)で三回洗浄した。ペーパータオル上へのブロッティングにより、プレートを乾燥させた。このブロッティング法は各洗浄ステップで使用した。5%のスキムミルクパウダー及び0.05%のTween20を含有するPBS(ブロッキングバッファー)を用いて、プレートを1.5時間ブロッキングした。サンプルを加える前に、プレートを洗浄バッファーで三回洗浄した。
平均及び標準誤差をそれぞれ二連で得て、指定F(ab')2濃度での棒グラフとしてデータポイントをプロットした。結果は正常マウス血清対照に標準化した。プレートの2陽性対照ウエルの平均で各々の結果を割った(各プレートは別々の陽性対照を有していた)。
液体設定における24時間+56℃での加熱処理後の二価F(ab')2断片の活性。
二価F(ab')2断片が非常に熱不安定であることは図1において見ることができる。凍結乾燥は、基本製剤でさえ+40℃において最大6カ月、抗体結合活性を保つのを手助けする。低い糖濃度を加えるとこの防御は高まり、それはMSM又はDMGを加えると次いでさらに高まる。DMGとMSMを一緒に加えると、低糖でのDMG又はMSM単独のそれより高い防御効果をもたらし、これは相乗効果を示す。
方法
賦形剤の様々な混合物あり及びなしの、HRP結合マウス抗淋菌IgGモノクローナル抗体(mAb)を含有する溶液を調製しアッセイした(「凍結乾燥前」)。次いでこれらの溶液を凍結乾燥させ、生成した固体ケークの幾つかは直後に元の体積に再懸濁しアッセイした(「凍結乾燥後」)。これらのサンプルを使用して、新規な賦形剤混合物の凍結乾燥防御能力を解明した。
全ての条件は、167μg/mlの抗体濃度を含有する300μlアリコートとして凍結乾燥した。4種の賦形剤混合条件の組成物と賦形剤を含まない対照を、表7中に示す。各々が各時間-温度地点で二連凍結乾燥バイアルを供給するほど十分量、及び凍結乾燥前液体対照がアッセイ可能であるほど十分過剰な量を含有するように、これら5つの条件に対応するマスター混合物を調製した。
流体力学的サイズ分布と強度を、HPLC-SECを使用して214nmで追跡した。使用したバッファーは、濃縮硫酸を使用して室温で6.8の最終pHに調節した、0.1M硫酸ナトリウムと0.1Mリン酸ナトリウムであった。バッファーは使用前に0.45フィルターに通した。HPLCで自動的に脱気を行った。流量は0.75mLであった。サンプル注入体積は25μLであった。HPLCはサンプルオートローダーを備えており、サンプルチャンバーは4℃に保った。カラム周囲のカラムジャケットは25℃に保った。各サンプルの吸収プロファイルは注入後24分間追跡した。サンプルは両洗浄ステップで区切ったブロックで注入し、その中でサンプルを含まないバッファー、及び系の一貫した操作を確実にするため働く標準を系に施した。
プロファイルに存在する多くの重複種の複雑性と不明瞭性のため、統合によるピークの定量化は行わなかった。その代わりに、プロファイルを「フィンガープリント」として処理した定量評価を実施した。非対照サンプルのプロファイルで起こった対照(液体、凍結乾燥前)プロファイルに対する変化を記した。明快にするため、各条件の一つの代表的なトレースを提示用に選択した。
以下に記載するピーク領域保持中、ピーク複合の最高地点に重点を置く。(前に論じた標準曲線を使用すると)この地点は8分で始まり1.07MDaの推定サイズと関係がある。HRPは、mAb上の特定表面露出残基と成分を共有結合させる化学的プロセスにより翻訳後に結合した。初期ピークの大きなサイズは、多数の接着部位が利用されたことを示唆する。
図7は、40℃で2カ月後、最大ピーク領域の低下がPBS及びマンニトールのみの条件で観察され、それらはいずれもベースラインレベルに近いピーク領域を示したことを示す。マンニトール以外にいずれもDMGを含有する3個の残りのサンプルは、図6中に示した凍結乾燥前(液体)陽性対照条件の一般的プロファイルを全てが維持する。これら3個のDMG含有サンプルの中で、最大ピーク領域保持は[0.7MのDMGとマンニトール]を含有する条件で生じた。他の2つの条件は、ほぼ等しいピーク領域保持を示した。
本明細書で示し論じるデータは、マンニトール及びDMGとマンニトールは、凍結乾燥プロセス中mAbのクロマトグラフィープロファイルの一般的特徴を維持することができたが、一方PBSのみではできなかったことを示す。追加的加熱刺激後、DMGを含有するサンプルにおいてより良いピーク領域保持を観察した。プロファイルの完全性は、マンニトール単独条件又は低濃度DMG条件ではなく、最高2濃度のDMGを含有する条件で維持された。
方法
様々な濃度の賦形剤の存在下で一価断片抗原結合(Fab)を加熱刺激し、異なる地点でアッセイした。ELISAアッセイを使用して残留Fab活性を評価した。これは、持続した損傷度の測定値として使用した。
固体設定でのセクション4.1中に記載した賦形剤の防御性を決定するため、6.7μg/mlの抗体濃度で300μlの各製剤をガラス製フリーズドライバイアルに等分し、実施例2中に記載したようにVirtis凍結乾燥機でプログラム1を使用して凍結乾燥させた。各製剤の詳細は表9中に述べる。
一価Fabの活性をELISAによりアッセイした。抗原(ラットIgG2b-kappa)はPBS中に2.5μg/mlに希釈し、ELISAプレートウエルは100μlでコーティングした。1:400000希釈の正常マウス血清の2対照ウエルも含めた。これらは一貫した結果を与えることが分かり、これらを使用してデータを標準化した。プレートを+4℃で18時間インキュベートし、次いで0.05%のTween20を含有するPBS(洗浄バッファー)で三回洗浄した。ペーパータオル上へのブロッティングにより、プレートを乾燥させた。このブロッティング法は各洗浄ステップで使用した。5%のスキムミルクパウダー及び0.05%のTween20を含有するPBS(ブロッキングバッファー)を用いて、プレートを1.5時間ブロッキングした。
平均及び標準誤差をそれぞれ二連で得て、指定Fab濃度での棒グラフとしてデータポイントをプロットした。結果は4℃ストック抗体対照に標準化した。プレートの2陽性対照ウエルの平均で各々の結果を割った(各プレートは別々の陽性対照を有していた)。
液体設定における24時間+56℃での加熱処理後の一価Fab断片の活性。
一価Fab断片が非常に熱不安定であることは図8において見ることができる。凍結乾燥は、糖のみの基本製剤でさえ+4℃において最大6カ月、抗体結合活性を保つのを手助けする。糖、MSM及びDMGを組合せた使用は相乗効果をもたらすことができる。
方法
実験の設計
MODDE9.0を使用してDoehlert設計を作製した(以下の表10参照)。Doehlert設計は、レギュラーシンプレックス及びサポート二次モデルから構築された、表面反応モデリング(RSM)設計の型である。Doehlert設計は異なる方向に延長可能であり、新たな因子を既存の設計に加えることができる。通常の製剤化設計と異なり、非有意性因子は分析から排除することができ、したがって混同因子とはならない。
通常のM-NFS-60の細胞培養中、ATCCの奨励に従い精製組換えマウスマクロファージ-コロニー刺激因子(マウスM-CSF)を使用して細胞を刺激した。マウスM-CSFはMilteny Biotecから得て(製品番号130-094-129)、非製剤化状態で提供された。
M-NFS-60細胞は液体窒素貯蔵物から回収した。これらの細胞の一回継代を使用して貯蔵細胞バンクを作製した。1回継代細胞の1mlアリコートを、RPMI増殖培地、及び5%DMSO、及び10%ウシ胎児血清(FBS)で、6.43×105個細胞/mlにおいて細胞で作製した。液体窒素貯蔵物に後に移すまで、アリコートは-80℃で凍結させた。この細胞バンクを使用して、この試験用のさらなる培養を確定させた。
細胞はATCCのガイドラインに従い維持した。簡単に言うと、0.05mMのβ-メルカプトエタノール、10%のFBS、1%のペニシリンストレプトマイシン、及び62ng/mlのM-CSFを含むRPMI-1640培地中で細胞を増殖させた。細胞は+37℃、+5%CO2で培養した。細胞は2.5×104個生存細胞/mlで接種した。
10%のFBS、1%のペニシリンストレプトマイシン、及び0.05mMのβ-メルカプトエタノールを含有するが、サイトカインは含まないRPMI-1640培地中に細胞を縣濁させた。細胞は96ウエルプレートに、ウエル当たり20000細胞、190μl/ウエルで接種した。
各サンプルに関して、450nmでの吸光度から690nmでの吸光度を引いた。既知濃度の標準を標準化した吸光度に対してプロットし、指数関数的増加を示す曲線の一部を確認した。この濃度範囲内のデータポイントは、濃度の自然対数対標準化吸光度としてプロットした。
この試験において生じたケークの質は、凍結乾燥直後のケークの撮影及び0(非常に悪い)〜5(非常に良い)の後のスコアリングによって評価した。この評価は非常に主観的であり、スケールは厳密に直線的である必要はなく、さらにこの一評価は、多数の影響、例えばケーク崩壊、再溶解、縮小などを得るために行われる。しかしながら、スコアは依然有用であり表11中に示す。
方法
実験の設計
MODDE9.0を使用してDoehlert設計を作製した(以下の表12参照)。Doehlert設計は実施例6中に記載する。
M-NFS-60細胞を、実施例6中に記載したように入手、調製及び維持した。G-CSFも実施例6中に記載したのと同様であった。
実施例6中に記載したように、G-CSFをアッセイし回収活性を決定した。
有意性モデルは両反応に適合した。図16中に示すように、主な読み取り値である回収活性は、モデルの評価パラメータ(R2=0.87、Q2=0.58、モデルの妥当性=0.60、再現性=0.93)により判断して強力なモデルをもたらした。ケーク質に適合させたこのモデルは、おそらくケーク質の主観的な性質のため、図16中にも述べるようにそれほど強力ではなかった。
モデルにおける重要因子を図17中に述べる。回収活性に関して、観察した唯一の線形効果は、プラスの効果がある、即ちスクロースが増大すると回収活性が増大する、スクロースの効果であった。これに加えて、TMGには二次非線形効果があることが分かり(即ち、最適濃度を観察し)、スクロースとラフィノースの両方と相互作用することも分かった。
モンテカルロシミュレーションを適合モデルと共に使用して、最適製剤を予想した。あまり重要でないケーク質の反応は無視しながら回収活性を最大にする具体的な目的で、最適製剤を作製した。最適製剤は1.4Mのスクロース、0.3MのTMG及び150.5mMのラフィノースであることが分かり、78.4%の回収活性をもたらすと予想した。
図18は、予想最適製剤周辺の製剤範囲のコンタープロットを示す。このグラフでプロットした反応は、開始活性の割合としての回収活性である。高レベルのスクロースにより、有意な防御が得られることが分かる。ラフィノースとTMGの両方が、必要とされるスクロースの量を減らす。回収活性とケーク質の間の折衷が必要とされ得る。150.5mMのラフィノース、0.33MのTMG、1.14Mのスクロースの製剤が、十分な回収活性(81.1%)とケーク質(ケーク質スコア=4)の両方をもたらした。
方法
マンニトール製剤のフリーズドライサンプルを示差走査熱量測定(DSC)により調べて、マンニトールが非晶質又は結晶であるかどうか決定した。マンニトールはフリーズドライ製剤においてしばしば使用されるが、経時的な非晶質形の不安定性が原因で、サイクル中それは通常結晶化される。
Perkin Elmer DSC 4000を使用した。最初に、インジウムのサンプルを以下に記載するように施して、機器のキャリブレーションを調べた。これは、一分当たり20℃の割合で20℃から200℃への、インジウムサンプルの加熱を含んでいた。DSCを適切に施した場合、結晶溶解による吸熱は通常156.6℃で見られる。
インジウムを参照物質として使用し、DSC機器が予想される結果をもたらすことを確実にした。インジウムは156.6℃というよく知られている溶解温度を有する。この試験で得た値は、許容限度内にある157.02℃であった(図20参照)。
標準解析等級マンニトール(Sigma)を、結晶物質の陽性対照としてDSCにおいて施用した。結果は図21中に示す。粉末状マンニトールは166.9℃で明らかな結晶溶解を示し、これは公開済みのデータと一致する。冷却段階中、115℃で明らかな結晶化による発熱がある。この実験は、マンニトールの溶解と再結晶化の両方を示した。
非晶質マンニトールを得るための試みにおいて、274mMのマンニトールを約100μbar(Mechatec凍結乾燥機)で、-40℃で72時間フリーズドライさせた。後のDSC分析の加熱段階中、166.6℃での結晶溶解前に、わずかな再結晶化による発熱があった。これは、10℃の無水マンニトールの非常に低いTgが原因で、分析前に大部分のマンニトールが再結晶化していたことを示唆し得る。DSCの結果は図22中に示す。予想通り、強烈な再結晶化による発熱が約110℃で生じた。
PBS中のマンニトール(530mM)のサンプル(3.9mg)をフリーズドライさせた。生成したサンプルはDSCにより分析して、結果は図23中に示す。約160℃で強烈な結晶溶解による吸熱、及び約80℃で再結晶化による発熱があった。このことから、PBS単独製剤において、マンニトールが結晶化及び再結晶化し得ると結論付けることができる。
マンニトールとDMGを含有する2サンプルを、VirTis Advantageフリーズドライヤーを使用して、表14中に記載する方法を使用してフリーズドライさせた(550mMのマンニトール、1MのDMG、PBS中)。真空圧を最初に200ミリトールで施す前に、サンプルを-40℃で120分凍結させた。貯蔵温度と真空圧はプロセスを通じて調節した。
DSCからのデータは、DMGはフリーズドライ中、それが非晶質構造を保持するように、マンニトールが結晶化するのを妨げることを実証する。
この実験の目的は、TMG及び/又はマンニトールを含有する製剤において、組換え防御抗原(rPA)を凍結乾燥することであった。次いでrPAの活性を競合ELISAにより調べた。ELISAは凍結乾燥前、凍結乾燥後、及び+37℃で9日後にサンプルに実施した。
結果は図26(マンニトール+TMG)及び図27(マンニトールのみ)中に示す。TMGとマンニトールの組合せは、+37℃での凍結乾燥rPAの加熱刺激に、マンニトールのみより高い防御能力を示す。
この実験の目的は、DMG及び/又はTMG及び/又はマンニトールを含有する製剤において、組換え防御抗原(rPA)を凍結乾燥することであった。次いでrPAの活性を競合ELISAにより調べた。ELISAは凍結乾燥前、凍結乾燥後、及び+37℃で9日後にサンプルに実施した。
結果は図26〜32中に示す。図27及び33及び34中の対応するマンニトール単独濃度で観察した結果と、これらを比較することによって、(a)DMGとマンニトールの組合せはマンニトールのみより高い防御能力を示すこと、及び(b)TMG、DMG及びマンニトールの組合せは依然さらなる改善を示し、抗原活性の消失がほとんどないことを見ることができる。
この実験の目的は、マンニトールの再結晶化挙動に対する、様々な賦形剤の影響を調べることであった。
サンプル1〜5に関するDSCトレースを図35中に示す。比較用に、マンニトール単独に関するDSCトレースを図36中に示す。図36中の上部トレースは、初期加熱後の冷却によりマンニトールが容易に再結晶化し、再加熱により多形が変わらないことを示す(上部トレース)。
Claims (17)
- ポリペプチドを保存するための方法であって、
(a)(i)ポリペプチド、
(ii)1種以上の糖であって、該糖濃度、若しくは全体糖濃度が0.05M〜3Mである糖、及び (iii)0.001M〜2.5Mのジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステル
及び/又は
0.001M〜2.5Mのジメチルスルホン
の水溶液を用意するステップ、及び
(b)溶液をフリーズドライさせてポリペプチドを取り込んだ組成物を形成するステップを含む、前記方法。 - 水溶液が、ジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、又はジメチルスルホンを含む、請求項1に記載の方法。
- 水溶液が、ジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及びジメチルスルホンを含む、請求項1に記載の方法。
- (a)ジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステルの濃度が0.01〜1.5Mであり、及び/又は(b)ジメチルスルホンの濃度が0.01〜1.5Mであり、及び/又は(c)糖濃度、若しくは全体糖濃度が0.05M〜2Mである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- (a)1種以上の糖が非還元糖若しくは糖アルコールを含み、及び/又は(b)2種以上の糖を使用し糖の1種がスクロースであり、及び/又は(c)2種以上の糖を使用し糖の1種がスクロースであり、スクロースと他の1又は複数の糖の濃度の比が1:1〜20:1である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 他の糖がラフィノースである、請求項5の(b)又は(c)に記載の方法。
- マンニトールである1種の糖が存在する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- (a)水溶液を、バイアル若しくはアンプル中で、フリーズドライさせ、次いで場合によっては密封する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドが、
(a)ホルモン、増殖因子、ペプチド若しくはサイトカイン、
(b)抗体、若しくはその抗原若しくはリガンド結合断片、
(c)オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ若しくはリガーゼ、又は
(d)ワクチン免疫原
である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - ポリペプチドが、
(i)タキキニンペプチド、血管作動性腸管ペプチド、膵臓ポリペプチド関連ペプチド、オピオイドペプチド若しくはカルシトニンペプチド、
(ii)モノクローナル抗体若しくはその断片、
(iii)キメラ、ヒト化若しくはヒト抗体、若しくはそれらの断片、
(iv)オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ若しくはリガーゼ、又は
(v)完全長ウイルス若しくは細菌タンパク質、糖タンパク質若しくはリポタンパク質、若しくはそれらの断片
である、請求項9に記載の方法。 - ジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又はジメチルスルホン、及び1種以上の糖を含み、請求項1、9又は10のいずれか1項に記載のポリペプチドを取り込み、固体であるフリーズドライ組成物。
- (a)非還元糖若しくは糖アルコールを含み、及び/又は(b)スクロース若しくはマンニトールである1種の糖又はスクロースとラフィノースである2種の糖を含む、請求項11に記載の組成物。
- ポリペプチドが請求項9又は10に記載のワクチン免疫原である、請求項11又は12に記載の組成物。
- 請求項13に記載の組成物及び場合によってはアジュバントを含むワクチン。
- ワクチンとして使用するための請求項13に記載の組成物。
- ワクチンを取り込んだワクチンを調製するための方法であって、
(a)(i)請求項9又は10に記載のワクチン免疫原、(ii)0.001M〜2.5Mのジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は0.001M〜2.5Mのジメチルスルホン、及び(iii)1種以上の糖であって、該糖濃度、若しくは全体糖濃度が0.05M〜3Mである糖の水溶液を用意するステップ、及び
(b)場合によっては、アジュバント、バッファー、抗生物質及び/又は添加剤を混合物に加えるステップ、及び
(c)溶液をフリーズドライさせて前記ワクチン免疫原を取り込んだ組成物又は固体組成物を形成するステップ
を含む、前記方法。 - フリーズドライ中の請求項1、9又は10のいずれか1項に記載のポリペプチドを保存するための、0.001M〜2.5Mの濃度のジメチルグリシン又はその生理的に許容される塩若しくはエステル、及び/又は0.001M〜2.5Mの濃度のジメチルスルホン、及び1種以上の糖であって、該糖濃度、若しくは全体糖濃度が0.05M〜3Mである糖の使用。
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