JP6196972B2 - 5−メトキシ3’−oh非遮断高速光開裂性末端ヌクレオチドおよび核酸配列決定のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は概して、DNA配列決定および他の種類のDNA分析のための組成物および方法に関する。より詳しくは、本発明は部分的に、光化学開裂性基を有する高速3'-OH非遮断ヌクレオチドおよびヌクレオシド、ならびに、生物医学研究における用途を含むいくつかのDNA配列決定方法におけるそれらの使用のための方法に関する。
DNAを迅速に配列決定するための方法が、集団における疾患および変異を分析しかつ治療法を開発するために必要である(参照により本明細書に組み入れられるMetzker, 2010)。ヒト配列の変動の一般的に観察される形態は、ゲノム配列の塩基対約300個中1個〜1000個中1個において生じる一塩基多型(SNP)、ならびに遮断置換、挿入/欠失、反転、部分重複およびコピー数変異体を含む構造変異体(SV)である。構造変異体は、すべての可変性事象の22%、およびSNPが寄与する変異体塩基よりも多くの変異体塩基を占めうる(参照により本明細書に組み入れられるLevy et al., 2007)。この知見は、マイクロアレイに基づく方法を使用して個人270名を分析したScherer、Hurlesおよび共同研究者らの知見と一致している(参照により本明細書に組み入れられるRedon et al., 2006)。ヒトゲノムの全配列に基づく、SNPおよびSVのマッピングまたは直接的な結びつけによって一般的な疾患およびがんの根底にある遺伝的関連を同定するための試みが進行中である。応用医学において、迅速で高スループットかつ低コストのDNA配列決定に重点を置いた技術開発は、SNPおよびSVなどの遺伝情報の理解および使用を促進するであろう。
式中、
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり;
R4は
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
R5およびR6はそれぞれ独立して
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アルケニル(C≦6)、アルキニル(C≦6)、アリール(C≦6)、アラルキル(C≦8)、ヘテロアリール(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョン;
下記式の基:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である; あるいは
-リンカー-レポーターである。
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である。
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である。
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である。
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である。
。
。
(i) プライマーの5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、標的核酸と該固体表面に結合したプライマーとをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼおよび本明細書に記載の1つまたは複数の化合物を得る段階;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)段階(iii)において言及された本明細書に定義の変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、天然成分を有する伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を光源に曝露する段階:
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
(i) 核酸の5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、プライマーと固体表面に結合した核酸とをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼおよび本明細書に記載の1つまたは複数の化合物を得る段階;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)本明細書に定義の変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、天然成分を有する伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
(i) 本明細書に記載の化合物を取り込む段階;
(ii)本明細書に定義の変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を核酸から除去するために、得られた核酸を光源に曝露する段階。
(i) 標的核酸をサンガーまたはサンガー型配列決定装置に加える段階、
(ii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるフルオロフォアに結合するという条件で、本明細書に記載の1つまたは複数の化合物を配列決定装置に加える段階、
(iii) 相補的プライマーおよびポリメラーゼ酵素を加える段階、
(iv) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物を伸長する核酸鎖に取り込むポリメラーゼ反応を行う段階、ならびに
(v) 蛍光配列決定機器の使用またはパルスマルチライン励起蛍光によってサンガー配列決定反応の結果を分析する段階。
(i) 標的核酸を配列決定装置に加える段階;
(ii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるフルオロフォアに結合するという条件で、本明細書に記載の1つまたは複数の化合物を配列決定装置に加える段階;
(iii) ポリメラーゼ酵素を加える段階; および
(iv) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物を伸長する核酸鎖に取り込むポリメラーゼ反応を行う段階。
(v) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物の取り込みに関してポリメラーゼ連鎖反応の結果を分析する段階。
複数のビーズを含むフローセルであって、
本明細書に記載の化合物がポリメラーゼを使用して取り込まれたDNA分子に各ビーズが結合し;
フローセルが可視光線および紫外線に少なくとも部分的に透過性である、フローセル;
フローセルの画像を捕捉するように構成された撮像装置;
少なくとも4つのスペクトルフィルターを含んでおり、各フィルターの間で循環するように構成されたフィルターホイール;
フローセルからフィルターホイール中のフィルターを通じて撮像装置までの光路を作り出すように構成されたランプ; ならびに
フローセル上のDNA分子に紫外線を与えるように構成された紫外線源。
下記式の化合物またはその塩、互変異性体もしくは光学異性体:
式中、
R 1 はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R 2 は水素またはヒドロキシであり;
R 3 はアルキル (C≦8) または置換アルキル (C≦8) であり;
R 4 は
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル (C≦6) 、アシル (C≦6) 、アルコキシ (C≦6) 、アシルオキシ (C≦6) 、アルキルアミノ (C≦6) 、ジアルキルアミノ (C≦6) 、アミド (C≦6) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
R 5 およびR 6 はそれぞれ独立して
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル (C≦6) 、アルケニル (C≦6) 、アルキニル (C≦6) 、アリール (C≦6) 、アラルキル (C≦8) 、ヘテロアリール (C≦6) 、アシル (C≦6) 、アルコキシ (C≦6) 、アシルオキシ (C≦6) 、アルキルアミノ (C≦6) 、ジアルキルアミノ (C≦6) 、アミド (C≦6) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョン;
下記式の基:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アルキンジイル (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル (C≦12) または置換アルカンジイル (C≦12) であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である;あるいは
-リンカー-レポーターである。
[本発明1002]
式Iの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
式IIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
式IIIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
式IVの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1006]
式Vの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1007]
式VIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1008]
式VIIの化合物としてさらに定義される、本発明1001の化合物。
[本発明1009]
R 1 がヒドロキシである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1010]
R 1 がモノホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1011]
R 1 がジホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1012]
R 1 がトリホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1013]
R 1 がα-チオトリホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1014]
R 1 がポリホスフェートである、本発明1001〜1008のいずれかの化合物。
[本発明1015]
R 2 が水素である、本発明1001〜1014のいずれかの化合物。
[本発明1016]
R 2 がヒドロキシである、本発明1001〜1014のいずれかの化合物。
[本発明1017]
R 3 がアルキル (C≦8) である、本発明1001〜1016のいずれかの化合物。
[本発明1018]
R 3 がアルキル (C3〜4) である、本発明1017の化合物。
[本発明1019]
R 3 がイソプロピルである、本発明1018の化合物。
[本発明1020]
R 3 がtert-ブチルである、本発明1018の化合物。
[本発明1021]
R 4 が水素である、本発明1001〜1020のいずれかの化合物。
[本発明1022]
R 4 がニトロである、本発明1001〜1020のいずれかの化合物。
[本発明1023]
R 5 が水素である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1024]
R 5 がヨードである、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1025]
R 5 がアルコキシ (C≦6) である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1026]
R 5 がメトキシである、本発明1025の化合物。
[本発明1027]
R 5 が下記式の基である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アルキンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、ヘテロアレーンジイル (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である。
[本発明1028]
Xがアルキンジイル (C2〜8) である、本発明1027の化合物。
[本発明1029]
Xが-C≡C-である、本発明1028の化合物。
[本発明1030]
nがゼロである、本発明1027〜1029のいずれかの化合物。
[本発明1031]
R 5 が下記式の基である、本発明1001〜1022のいずれかの化合物:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アルキンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、ヘテロアレーンジイル (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル (C≦12) または置換アルカンジイル (C≦12) であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である。
[本発明1032]
Xがアルキンジイル (C2〜8) である、本発明1031の化合物。
[本発明1033]
Xが-C≡C-である、本発明1032の化合物。
[本発明1034]
Yが-CH 2 -である、本発明1031〜1033のいずれかの化合物。
[本発明1035]
nがゼロである、本発明1031〜1034のいずれかの化合物。
[本発明1036]
mがゼロである、本発明1031〜1035のいずれかの化合物。
[本発明1037]
R 5 が-リンカー-レポーターである、本発明1001〜1022のいずれかの化合物。
[本発明1038]
リンカーが下記式である、本発明1037の化合物:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アルキンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、ヘテロアレーンジイル (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
nは0〜6の整数である。
[本発明1039]
Xがアルキンジイル (C2〜8) である、本発明1038の化合物。
[本発明1040]
Xが-C≡C-である、本発明1039の化合物。
[本発明1041]
nがゼロである、本発明1038〜1040のいずれかの化合物。
[本発明1042]
リンカーが下記式である、本発明1037の化合物:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル (C≦12) 、アルケンジイル (C≦12) 、アルキンジイル (C≦12) 、アレーンジイル (C≦12) 、ヘテロアレーンジイル (C≦12) 、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル (C≦12) または置換アルカンジイル (C≦12) であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である。
[本発明1043]
Xがアルキンジイル (C2〜8) である、本発明1042の化合物。
[本発明1044]
Xが-C≡C-である、本発明1043の化合物。
[本発明1045]
Yが-CH 2 -である、本発明1042〜1044のいずれかの化合物。
[本発明1046]
nがゼロである、本発明1042〜1045のいずれかの化合物。
[本発明1047]
mがゼロである、本発明1042〜1046のいずれかの化合物。
[本発明1048]
レポーターが色素に基づき、該色素がキサンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、またはスクアライン色素である、本発明1037〜1047のいずれかの化合物。
[本発明1049]
レポーターが下記式である、本発明1037〜1047のいずれかの化合物:
。
[本発明1050]
R 6 が水素である、本発明1001〜1049のいずれかの化合物。
[本発明1051]
星付きの炭素原子がS配置である、本発明1001〜1050のいずれかの化合物。
[本発明1052]
星付きの炭素原子がR配置である、本発明1001〜1050のいずれかの化合物。
[本発明1053]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物:
。
[本発明1054]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物:
式中、Rは=Oまたは=Sである。
[本発明1055]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物:
式中、Rは=Oまたは=Sである。
[本発明1056]
下記式、またはこれらの式のいずれかの塩および/もしくはプロトン化形態としてさらに定義される、本発明1001の化合物:
。
[本発明1057]
以下の段階を含む、標的核酸を配列決定する方法:
(i) プライマーの5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、標的核酸と該固体表面に結合したプライマーとをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼおよび本発明1001〜1056のいずれかの1つまたは複数の化合物を得る段階;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)段階(iii)において言及された本発明で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、天然成分を有する伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
[本発明1058]
段階(vi)がアジ化ナトリウムの存在下で行われる、本発明1057の方法。
[本発明1059]
アジ化ナトリウム濃度が0.1mM〜10mMである、本発明1058の方法。
[本発明1060]
アジ化ナトリウム濃度が約1mMである、本発明1059の方法。
[本発明1061]
段階(vi)が酢酸ナトリウムの存在下で行われる、本発明1057の方法。
[本発明1062]
酢酸ナトリウム濃度が0.1mM〜10mMである、本発明1061の方法。
[本発明1063]
酢酸ナトリウム濃度が約1mMである、本発明1061の方法。
[本発明1064]
段階(v)または(vi)がチオ尿素の存在下で行われる、本発明1057〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
チオ尿素濃度が10mM〜500mMである、本発明1064の方法。
[本発明1066]
チオ尿素濃度が約100mMである、本発明1064の方法。
[本発明1067]
段階(vi)がジチオスレイトール(DTT)の存在下で行われる、本発明1058の方法。
[本発明1068]
以下の段階を含む、標的核酸を配列決定する方法:
(i) 核酸の5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、プライマーと該固体表面に結合した核酸とをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼおよび本発明1001〜1056のいずれかの1つまたは複数の化合物を得る段階;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi)段階(iii)において言及された本発明で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、天然成分を有する伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。
[本発明1069]
段階(vi)がアジ化ナトリウムの存在下で行われる、本発明1068の方法。
[本発明1070]
段階(vi)がジチオスレイトール(DTT)の存在下で行われる、本発明1069の方法。
[本発明1071]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みがその天然ヌクレオチド対応物の取り込み効率の約70%〜約100%で生じる、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1072]
取り込み効率が約85%〜約100%で生じる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
ポリメラーゼが逆転写酵素、末端転移酵素およびDNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1074]
段階(vi)において光開裂性末端部分の約85%〜約100%が光源に対する曝露によって除去される、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1075]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1076]
パルスマルチライン励起検出器が段階(v)における撮像に使用される、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1077]
段階(iv)の後に伸長するプライマー鎖を洗浄する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1078]
段階(vi)の後に伸長プライマーを洗浄する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1079]
段階(iv)の前に、段階(iv)において反応しなかった任意のプライマーまたは伸長するプライマー鎖を封止する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1080]
複数の標的核酸を同時に配列決定する段階をさらに含む、本発明1057および1068のいずれかの方法。
[本発明1081]
以下の段階を含む、核酸分子中の非天然成分を天然成分に変換する方法:
(i) 本発明1001〜1056のいずれかの化合物を取り込む段階;
(ii)段階(iii)において言及された本発明で定義される変動要素を有する下記式の光開裂性末端部分を核酸から除去するために、得られた核酸を光源に曝露する段階:
。
[本発明1082]
複数の核酸分子中の非天然成分を天然成分に同時に変換する段階をさらに含む、本発明1081の方法。
[本発明1083]
複数の核酸合成を同時に終結させる段階をさらに含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
ポリメラーゼの環境中に本発明1001の3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドを配置し、核酸分子中への3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込みを可能にする段階を含む、核酸合成を終結させる方法。
[本発明1085]
3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込み時のDNA合成の終結効率が約90%〜約100%の範囲である、本発明1084の方法。
[本発明1086]
3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込み効率が、3'-OH非遮断ヌクレオチドまたはヌクレオシドと同じ塩基を有する天然ヌクレオチドまたはヌクレオシドの取り込み効率に比べて約70%〜約100%の範囲である、本発明1084の方法。
[本発明1087]
本発明1001〜1056のいずれかの化合物を末端ヌクレオチド類似体として使用する段階を含む、サンガーまたはサンガー型配列決定を行う方法。
[本発明1088]
化合物が式(I)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
化合物が式(II)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1090]
化合物が式(III)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1091]
化合物が式(IV)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1092]
化合物が式(V)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1093]
化合物が式(VI)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1094]
化合物が式(VII)の化合物としてさらに定義される、本発明1057、1068、1081、1084および1087のいずれかの方法。
[本発明1095]
以下の段階を含み、段階(i)〜(iii)が任意の順序で行われうる、標的核酸の配列を決定する方法:
(i) 標的核酸をサンガーまたはサンガー型配列決定装置に加える段階、
(ii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるフルオロフォアに結合するという条件で、本発明1001〜1056のいずれかの1つまたは複数の化合物を配列決定装置に加える段階、
(iii) 相補的プライマーおよびポリメラーゼ酵素を加える段階、
(iv) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物を伸長する核酸鎖に取り込むポリメラーゼ反応を行う段階、ならびに
(v) 蛍光配列決定機器の使用またはパルスマルチライン励起蛍光によってサンガー配列決定反応の結果を分析する段階。
[本発明1096]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、本発明1095の方法。
[本発明1097]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みがポリメラーゼ反応における同じ塩基を有する天然基質の取り込み効率の約70%〜約100%で生じる、本発明1095の方法。
[本発明1098]
取り込み効率が約85%〜約100%で生じる、本発明1097の方法。
[本発明1099]
ポリメラーゼが逆転写酵素、末端転移酵素およびDNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1095の方法。
[本発明1100]
以下の段階を含み、段階(i)〜(iii)が任意の順序で行われうる、非天然成分を核酸に取り込む方法:
(i) 標的核酸を配列決定装置に加える段階;
(ii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるフルオロフォアに結合するという条件で、本発明1001の1つまたは複数の化合物を配列決定装置に加える段階;
(iii) ポリメラーゼ酵素を加える段階; および
(iv) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物を伸長する核酸鎖に取り込むポリメラーゼ反応を行う段階。
[本発明1101]
(v) 段階(ii)の少なくとも1つの化合物の取り込みに関してポリメラーゼ連鎖反応の結果を分析する段階
をさらに含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが約90%〜約100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、本発明1100の方法。
[本発明1103]
段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みがポリメラーゼ反応における同じ塩基を有する天然基質の取り込み効率の約70%〜約100%で生じる、本発明1100の方法。
[本発明1104]
本発明1001の化合物をミニ配列決定またはミニ配列決定型配列決定方法に加える段階を含む、ミニ配列決定またはミニ配列決定型配列決定を行う方法。
[本発明1105]
化合物が式(I)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
化合物が式(II)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1107]
化合物が式(III)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1108]
化合物が式(IV)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1109]
化合物が式(V)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1110]
化合物が式(VI)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1111]
化合物が式(VII)の化合物としてさらに定義される、本発明1095、1100および1104のいずれかの方法。
[本発明1112]
以下を含むシステム:
複数のビーズを含むフローセルであって、
本発明1001〜1056のいずれかの化合物がポリメラーゼを使用して取り込まれたDNA分子に各ビーズが結合し;
フローセルが可視光線および紫外線に少なくとも部分的に透過性である、フローセル;
フローセルの画像を捕捉するように構成された撮像装置;
少なくとも4つのスペクトルフィルターを含み、各フィルターの間で循環するように構成されたフィルターホイール;
フローセルからフィルターホイール中のフィルターを通じて撮像装置までの光路を作り出すように構成されたランプ; ならびに
フローセル上のDNA分子に紫外線を与えるように構成された紫外線源。
[本発明1113]
フローセルが微小流体フローセルである、本発明1112のシステム。
[本発明1114]
フィルターホイールとフローセルとの間の対物レンズをさらに含む、本発明1112のシステム。
[本発明1115]
光路を撮像装置に向けるように構成された鏡をさらに含む、本発明1112のシステム。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の真意および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになることから、本発明の具体的な態様を示す詳細な説明および具体例が例示のみを目的として示されると理解すべきである。単に特定の化合物が1つの特定の一般式に帰することをもって、それが別の一般式にも属することができないことを意味するわけではないことに留意されたい。
I. 可逆的ターミネーターおよびその合成方法
一局面では、本開示は、種々の異なるDNA配列決定用途において可逆的ターミネーターとして機能するように使用可能な新規化合物を提供する。本開示によって提供される化合物は可逆的ターミネーター、3'-OH非遮断可逆的ターミネーター、およびLightning Terminators(商標)とも呼ばれる。いくつかの態様では、下記式の化合物またはその塩、互変異性体もしくは光学異性体が提供される:
式中、
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり;
R4は
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
R5およびR6はそれぞれ独立して
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アルケニル(C≦6)、アルキニル(C≦6)、アリール(C≦6)、アラルキル(C≦8)、ヘテロアリール(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョン;
下記式の基:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である; あるいは
-リンカー-レポーターである。
スキーム2a 色素標識7-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (ii) n-Bu4NF、THF、室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃; (iv) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF; (v) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキーム3a 色素標識5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (ii) NH4F、MeOH、50℃; (iii) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF; (iv) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキーム4a 色素標識7-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) (S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、1,4-ジオキサン/DMF、70℃; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF; (vi) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキーム5a 色素標識5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) TBSCl、イミダゾール、DMF、室温; (ii) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、DMAP、Et3N、CH2Cl2、室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン、90℃; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、82%; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF; (vi) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
上記で論じたように、一局面では、循環可逆的ターミネーター(CRT)配列決定用途において、改善された可逆的ターミネーターとして使用可能な、高速光化学開裂特性を有する新規アルキル化2-ニトロベンジルヌクレオチドが提供される。そのような用途は、いずれも参照により本明細書に組み入れられるMetzker (2005, 2010)に記載されている。いくつかの態様では、種々の置換2-ニトロベンジル基を有する、修飾7-デアザ-7-ヒドロキシメチル-2'-デオキシアデノシン(C7-HOMedA)(Rockhill et al., 1997)および7-デアザ-7-ヒドロキシメチル-2'-デオキシグアノシン(C7-HOMedG)(McDougall et al., 2001)ならびにHOMedCおよびHOMedUが提供される。図1参照。いくつかの態様では、本明細書に開示される可逆的ターミネーターは、ヌクレオチド取り込みの高速な動態、一塩基終結、高いヌクレオチド選択性、および/または末端基の迅速な開裂を含むいくつかの好適な特性を示す。
本発明の可逆的ターミネーターは、以下を含む種々のアプローチに基づくDNA配列決定方法において使用することができる。
・DNAポリメラーゼを使用する2',3'-ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)の取り込みによるDNA合成の連鎖終結を包含する「サンガー法」または「ジデオキシ法」。参照により本明細書に組み入れられるMetzker et al., 2005を参照。
・DNAを配列決定する異なる機構を通常は明確に記述するものではない、合成による配列決定法(SBS)。参照により本明細書に組み入れられるMetzker, 2010; Metzker 2005を参照。
・循環可逆的ターミネーター法(CRT)、一塩基付加法(SNA、例えばピロシーケンス法)、およびリアルタイム配列決定法に分類されることもある、DNAポリメラーゼ依存性戦略。参照により本明細書に組み入れられるMetzker, 2010を参照。
・ランダムニック配列決定(RNS)アプローチを使用する単一分子配列決定。
(i) プライマーの5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) 標的核酸と該固体表面に結合したプライマーとをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるレポーター基に結合するという条件で、本明細書に記載の構造のいずれかに係る化合物を加える段階;
(iv) 核酸複製酵素をハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体に加えることで段階(iii)の組成物を伸長するプライマー鎖に取り込む段階であって、段階(iii)の取り込まれた組成物がポリメラーゼ反応を約70%〜約100%の効率で終結させる段階;
(v) 固体表面を洗浄することで、取り込まれていない成分を除去する段階;
(vi) 取り込まれたレポーター基を検出することで、段階(iii)の取り込まれた組成物を同定する段階;
(vii) 任意で1つまたは複数の化合物を加えることで非伸長プライマーを持続的に封止する段階;
(viii) 末端部分の光化学開裂除去を含む末端部分の除去によって、5-ヒドロキシメチルピリミジンまたは7-ヒドロキシメチル-7-デアザプリン塩基を有する伸長プライマーを得る段階;
(ix) 固体表面を洗浄することで、開裂した末端基を除去する段階; および
(x) 段階(iii)〜(viii)を1回または複数回繰り返すことで標的核酸中の複数の塩基を同定する段階。
(i) 標的核酸の5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) プライマーと固体表面に結合した標的核酸とをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 2種以上の塩基が存在する場合に各塩基が異なるレポーター基に結合するという条件で、本明細書に記載の構造のいずれかに係る化合物を加える段階;
(iv) 核酸複製酵素をハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体に加えることで段階(iii)の組成物を伸長するプライマー鎖に取り込む段階であって、段階(iii)の取り込まれた組成物がポリメラーゼ反応を約70%〜約100%の効率で終結させる段階;
(v) 固体表面を洗浄することで、取り込まれていない成分を除去する段階;
(vi) 取り込まれたレポーター基を検出することで、段階(iii)の取り込まれた組成物を同定する段階;
(vii) 任意で1つまたは複数の化合物を加えることで非伸長プライマーを持続的に封止する段階;
(viii) 末端部分の光化学開裂除去を含む末端部分の除去によって、5-ヒドロキシメチルピリミジンまたは7-ヒドロキシメチル-7-デアザプリン塩基を有する伸長プライマーを得る段階;
(ix) 固体表面を洗浄することで、開裂した末端基を除去する段階; および
(x) 段階(iii)〜(ix)を1回または複数回繰り返すことで標的核酸中の複数の塩基を同定する段階。
本発明のいくつかの局面では、本明細書において提供されるヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物(可逆的ターミネーター)を、循環可逆的終結法(CRT)に基づくDNA配列決定技術において使用することができる。CRTは、複数の鋳型の同時的な一塩基付加を検出する循環的方法である。このアプローチは、この分野を進歩させる上での大きなボトルネックであるゲル電気泳動を必要とせずに行うことができるという点で、サンガー法(参照により本明細書に組み入れられるMetzker, 2005)と区別される。しかし、サンガー配列決定と同様に、リード長が長くなるに従って、ゲノム全体を網羅するために必要な配列決定アッセイの数が少なくなる。CRTサイクルは通常、取り込み、撮像および脱保護という3つの段階を含む。「脱保護」という用語は「開裂」と同義的に使用されることがあり、したがってこの3つの段階は取り込み、撮像および開裂と記述されることもある。この手順では、サイクル効率、サイクル時間、および感度が重要な因子である。サイクル効率は脱保護効率と取り込み効率との積であり、CRTリード長を決定する。CRTサイクル時間は取り込み時間、撮像時間および脱保護時間の和である。全ゲノム配列決定用の迅速なCRTでは、高速および効率的な脱保護特性を示しうる、本明細書に開示されるヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物を使用することができる。これらの化合物を、α-炭素上のアジド置換を有するベンジル基に直接結合した蛍光色素などのレポーター基で標識することで、同様の脱保護特性を有する可逆的蛍光ターミネーターを例えば得ることができる。可逆的ターミネーターは通常、市販のDNAポリメラーゼに対しては不良な基質として働くことから、長いCRTリードという目標を達成することは困難なままである。本発明の修飾ヌクレオチド類似体は、市販のDNAポリメラーゼによって天然ヌクレオチドと同等以上に取り込まれる基質を与えることで、この技術を改善するために使用することができる。
本発明の別の局面は、ポリメラーゼアッセイの使用に関する。「ポリメラーゼエンドポイントアッセイ」(参照により本明細書に組み入れられるWu et al., 2007)を使用して、天然および修飾ヌクレオチドについて取り込み効率を試験した。このアッセイでは、マッチおよびミスマッチ鋳型塩基に関して取り込み効率が調査される。取り込み効率は、化合物がプライマー鋳型複合体の半分を取り込む濃度(IC50)を決定することで測定される。IC50を決定することが可能な曲線を作成するために、化合物濃度を増大させる滴定を行った。
本発明の別の局面は、本明細書に記載の可逆的ターミネーターの使用を例えば通じた、ミスマッチ取り込みに対する識別の改善に関する。2-ニトロベンジル基のα-炭素における置換が開裂反応の速度を増大させうることが報告されている(Reichmanis et al., 1985; Cameron and Frechet, 1991; Hasan et al., 1997は3つすべて参照により本明細書に組み入れられる)。理論によって拘束されるものではないが、本明細書において提示される結果は、2-ニトロベンジル基のα-炭素における置換が、3'-OH非遮断ヌクレオチド三リン酸のDNA合成の終結に影響を与え、ミスマッチ取り込みに対する識別を改善することもあることを示唆している。さらに、以下でさらに詳細に論じる結果に基づいて、2-ニトロベンジル基のα-炭素の置換の立体化学配置が、ミスマッチ識別の程度および開裂反応の速度に著しい影響を示しうることがわかった。理論によって拘束されるものではないが、a) 2-ニトロベンジル基のα-炭素における置換、およびb) ベンジル環の2位における置換という少なくとも2つの因子が、1回の取り込み後のDNA合成の終結に通常は影響を与えることがわかった。
本発明の別の局面は、改善された紫外線開裂速度を有する可逆的ターミネーターを提供することに関する。類似体をプライマー鎖に取り込む際の、365nmの紫外線での末端置換2-ニトロベンジル基の開裂は、次の取り込みサイクルを再開することを可能にする。理論によって拘束されるものではないが、a) 2-ニトロベンジル基のα-炭素置換の立体化学配置、およびb) ベンジル環上の置換という少なくとも2つの因子が、取り込まれたヌクレオチド類似体の紫外線開裂速度に通常は影響を与えることがわかった。
本発明の別の局面は、本明細書において提供される可逆的ターミネーターおよび方法を次世代配列決定方法に適用することに関する。配列決定技術としては、(a) 鋳型調製、(b) 配列決定および撮像、ならびに(c) データ解析に広く分類されるいくつかの方法が挙げられる。特定のプロトコールの独自の組み合わせは、1つの技術を別の技術と区別するものであり、各プラットフォームから生成されるデータの種類を決定する。データ出力のこれらの差は、データ品質およびコストに基づいてプラットフォームを比較する際の課題となる。品質スコアおよび精度推定値は各製造業者によって与えられるが、1つのプラットフォームによる「品質ベース」が別のプラットフォームによるそれと同等であるという合意は存在しない。本明細書に記載の化合物および方法は、以下に記載の1つまたは複数の鋳型フォーマットとの組み合わせで使用し、かつ/あるいはこの鋳型フォーマットに適用することができる。
いくつかの態様では、本発明は、可逆的ターミネーターおよび配列決定方法を、1つまたは複数の鋳型または鋳型調製方法に適用し、かつ/あるいはそれらと組み合わせることに関する。例えば、いくつかの態様では、堅牢な鋳型調製方法を使用する。これらは、調査中のゲノムから代表的で偏りのない核酸材料源を生成する。いくつかの態様では、本方法は、ゲノムDNAを比較的小さなサイズにランダムに破壊し、そこから断片鋳型またはメイトペア鋳型を作り出すことを包含する。いくつかの態様、例えばNGS技術に関連する態様では、鋳型を固体表面または固体支持体に結合させるかまたは固定化する。空間的に隔てられた鋳型部位の固定化は、数千回〜数十億回の配列決定反応を同時に行うことを可能にするために使用することができる。
いくつかの態様では、本発明は、クローン的に増幅された鋳型、またはクローン的に増幅された鋳型の調製方法の使用を含む。例えば、そのような鋳型は、単一の蛍光事象を検出するように設計されていない撮像システムと共に使用することができる。例えば、2つの一般的な増幅方法はエマルジョンPCR(emPCRとも呼ばれる)および固相増幅である。いずれも参照により本明細書に組み入れられるDressman et al., 2003およびFedurco et al., 2006を参照。いくつかの態様では、無細胞系中で配列決定用鋳型を調製するためにemPCRを使用することができ、これには、細胞クローン化方法に通常固有の問題であるゲノム配列の恣意的な損失が回避されるという利点がある。いくつかの態様では、断片標的またはメイトペア標的のライブラリーを作り出し、普遍的プライミング部位を含むアダプターを標的末端に連結することで、複雑なゲノムが、共通PCRプライマーと共に増幅されるようにする。例えば、連結後に、DNAを一本鎖に分離し、ビーズ1個当たりDNA分子1個を指向する条件下でビーズ上に捕捉する。参照により本明細書に組み入れられるMetzker 2010の図1aを参照。例えば、emPCRビーズの増幅および濃縮の成功後に、数百万個を、標準的スライドガラス(Polonator機器と共に使用; 例えば参照により本明細書に組み入れられるShendure et al., 2005を参照)上のポリアクリルアミドゲル中に固定化するか、アミノコーティングガラス表面(Life/APG SOLiDおよびPolonator機器と共に使用; 例えば参照により本明細書に組み入れられるKim et al., 2007を参照)に化学的に架橋させるか、または、NGS化学反応を実行可能な、個々のPicoTiterPlate(PTP)ウェル(Roche/454機器と共に使用; 参照により本明細書に組み入れられるMargulies et al., 2005)、もしくはIonChipウェル(Ion Torrent機器と共に使用; 参照により本明細書に組み入れられるRothberg et al., 2011)の中に沈着させることができる。いくつかの態様では、ランダムに分布してクローン的に増幅されたクラスターをスライドガラス上の断片鋳型またはメイトペア鋳型から生成するために、固相増幅を使用することができる。参照により本明細書に組み入れられるMetzker 2010の図1bを参照。いくつかの態様では、高密度の順方向および逆方向プライマーをスライドに共有結合させ、支持体上のプライマー対鋳型の比によって増幅クラスターの表面密度を画定する。いくつかの態様では、固相増幅を使用することで空間的に隔てられた1億〜2億個の鋳型クラスター(Illumina/Solexa)を生成することができ、鋳型クラスターには遊離末端が設けられ、遊離末端と普遍的配列決定用プライマーとをハイブリダイズさせることでNGS反応を開始することができる。参照により本明細書に組み入れられるBentley et al., 2008を参照。
いくつかの態様では、本発明は、単一分子鋳型、または単一分子鋳型の調製方法の使用を含む。クローン的に増幅する方法は、細胞のクローン化に比べて特定の利点を示すが、いくつかのプロトコールは実行が面倒であり、大量のゲノムDNA材料(3〜20μg)を必要とする。単一分子鋳型の調製は、通常はより簡単であり、必要とする出発原料がより少ない(1μg未満)。いくつかの態様では、これらの方法はPCRを必要としない。PCRは、クローン的に増幅された鋳型中に、配列変異体に見せかけるような変異を、通常は作り出してしまう。また、ATリッチおよびGCリッチな標的配列は産物産生における増幅の偏りを示すことがあり、その結果、ゲノムアラインメントおよびゲノムアセンブリにおいてこれらの配列が提示不足になる。いくつかの態様では、RNA-seqなどの定量的適用を使用することができる。参照により本明細書に組み入れられるWang et al., 2009を参照。そのような適用は通常、mRNA分子の提示される存在量を改変することがない非増幅鋳型源でより効果的に機能する。いくつかの態様では、NGS反応を行う前に、単一分子鋳型を通常、少なくとも3つの異なるアプローチのうち1つを使用して固体支持体上に固定化する。いくつかの態様において使用可能な第1のアプローチでは、空間的に分布する個々のプライマー分子を固体支持体に共有結合させる(Harris et al., 2008参照)。次に、出発原料を小さなサイズ(例えば約200〜250bp)にランダムに断片化して共通アダプターを断片末端に加えることで例えば調製可能な鋳型と、固定化プライマーとをハイブリダイズさせる。参照により本明細書に組み入れられるMetzker 2010の図1cを参照。いくつかの態様において使用可能な第2のアプローチでは、固定化プライマーから一本鎖の単一分子鋳型をプライミングし、伸長させることで、空間的に分布する単一分子鋳型を固体支持体に共有結合させる(Harris et al., 2008参照)。参照により本明細書に組み入れられるMetzker 2010の図1cを参照。いくつかの態様では、次に共通プライマーと鋳型とをハイブリダイズさせる。参照により組み入れられるMetzker 2010の図1dを参照。いずれのアプローチにおいても、例えば固定化プライミング鋳型構成に結合することでNGS反応を開始させるために、DNAポリメラーゼを使用することができる。いくつかの態様において使用可能な第3のアプローチでは、空間的に分布する単一ポリメラーゼ分子を固体支持体に結合させ(参照により本明細書に組み入れられるEid et al., 2009を参照)、ポリメラーゼ分子にプライミング鋳型分子を結合させる(参照により本明細書に組み入れられるMetzker 2010の図1eを参照)。一般に、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,329,492号および第6,255,083号を参照。この技術では例えば比較的大きなDNA分子(最大数万個の塩基対)を使用することができ、最初の2つのアプローチとは異なって、第3のアプローチはリアルタイム法と共に使用することができ、これにより潜在的に比較的長いリード長が得られる。
クローン的に増幅された鋳型と単一分子鋳型とでは配列決定する上で根本的な差が存在する。いくつかの態様では、配列決定反応をそれぞれ経た同一の鋳型の集団を得るためにクローン的増幅を使用することができる。撮像時に観察されるシグナルは、所与のサイクルで同一の鋳型に加えられるヌクレオチドまたはプローブと一致する。通常、これにより付加プロセスの効率に対する要求が大きくなる。というのも、鋳型集合の不完全な伸長によりラギング鎖のシーケンス反応のタイミングのずれ(dephasing)(2型のずれとも呼ばれる)が生じるためである。また、複数のヌクレオチドまたはプローブの付加が所与のサイクル中に生じることで、リーディング鎖のタイミングのずれ(1型のずれとも呼ばれる)が生じることがある。タイミングのずれの概念はCheesemanによって記載された(参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,302,509号を参照)。シグナルのずれによって蛍光ノイズが増大し、塩基呼び出しの誤差およびリード長の短縮が引き起こされる(Erlich et al., 2008参照)。タイミングのずれは単一分子鋳型で問題にならないことから、サイクル効率の要件が緩和される。しかし、単一分子は任意の所与のサイクル中で複数のヌクレオチドまたはプローブの付加を受けやすい。ここで、隣接する色素分子間の消光効果が理由でいくつかの態様において欠失型の誤差の発生が観察されることがあり、あるいは、暗いヌクレオチドまたはプローブの取り込みが理由でシグナルが検出されない。以下の節では、クローン的に増幅された鋳型および単一分子鋳型の両方を使用する配列決定および撮像戦略を論じる。本発明のいくつかの局面では、本明細書において提供される可逆的ターミネーターおよびそれらの使用方法を、CRT、SNAおよびリアルタイム配列決定を例えば含む任意の1つまたは複数のDNAポリメラーゼ依存性戦略に適用し、かつ/あるいはそれらとの組み合わせで使用することができる。いくつかの態様では、本発明の化合物およびそれらの使用方法をCRT法に適用しかつ/またはそれとの組み合わせで使用することができる。
図8は、クローン的に増幅された鋳型に由来する蛍光シグナルを撮像するための撮像システム100の一態様を示す。システム100は、関心対象のDNAを含むミクロンビーズと共に調製された微小流体フローセル50を撮像するように構成されている。
別の局面では、本発明は、オゾン汚染の効果を最小化する配列決定方法を提供する。オゾン(O3)は酸素の同素体であり、地球上の生命に対して有益な性質および有害な性質の両方を有する。例えば、オゾンは太陽からの高エネルギー放射線によって成層圏中に作り出されるものであり、高エネルギー放射線は分子酸素(O2)を2個の原子に分割し、これが次に異なるO2分子と組み合わせられることでO3が形成される。この成層圏層は、太陽によって生成される有害な紫外線から、この惑星上の生物を保護する。しかし、地上レベルまたは対流圏では、オゾンは大気汚染物質と考えられている。オゾンは、工業施設、電力事業者、自動車排ガス、ガソリン蒸気および化学溶剤によって生成される窒素酸化物と揮発性有機化合物との組み合わせに対して太陽光が作用するスモッグ条件下でも作り出される(EPA, 2011参照)。オゾンレベルは暑夏の数ヶ月中に増大し、オゾン障害の影響は相対湿度レベルの増大に伴って増大する。対流圏オゾンは、農作物および森林に対する激しいダメージ(Hewitt et al., 1990参照)、動物およびヒトにおける数多くの呼吸器の問題(Fairchild et al., 1959; Bhalla, 1994参照)、ならびに、自動車タイヤを含む多くの民生品(Crabtree and Kemp, 1946参照)、生地材料に見られる染料(Salvin and Walker, 1955参照)および分子生物学において使用される蛍光色素による有害効果を引き起こす。
NGS分析用に関心対象のDNAを調製する方法としては例えば、クローン的に増幅された鋳型、および非増幅(すなわち単一分子)鋳型が挙げられる。いくつかの態様では、エマルジョンPCR(emPCR)を使用することができる。図9に示すように、試料を以下のように調製することができる。第一に、ゲノムDNAを単離する。次にDNAをより小さなピースに断片化する。次に共通アダプターをそれら断片の末端に連結させる。次にアダプター連結DNA分子を一本鎖に分離し、ビーズ1個当たりDNA分子1個を指向する条件下で1μmサイズのビーズ上に捕捉する。水中油エマルジョンは、これらビーズ-DNA複合体を封入する個々の水滴を作り出す。同一鋳型配列の104〜106個のコピーを含むビーズを作り出すために、これら液滴内でPCR増幅を行う。増幅および濃縮の成功後、数千万個〜数億個のemPCRビーズを微小流体フローセル50に化学的に固定する。いくつかの態様では、フローセル50は8つのチャネルを含み得、ガラスで作製されうる。
フローセル50がビーズと共に調製された時点で、フローセル50を配列決定システム100に配置することができる。図10は、1回のCRTサイクル中の通常の段階を示す。単一のDNA分子を例示目的で示すが、当業者は、このプロセスが多くのDNA分子に対して行われることを理解するであろう。
化学基の文脈で使用する場合、「水素」は-Hを意味し、「ヒドロキシ」は-OHを意味し、「オキソ」は=Oを意味し、「ハロ」は独立して-F、-Cl、-Brまたは-Iを意味し、「アミノ」は-NH2を意味し、「ヒドロキシアミノ」は-NHOHを意味し、「ニトロ」は-NO2を意味し、イミノは=NHを意味し、「シアノ」は-CNを意味し、「イソシアネート」は-N=C=Oを意味し、「アジド」は-N3を意味し、一価の文脈で「ホスフェート」は-OP(O)(OH)2またはその脱プロトン化体を意味し、二価の文脈で「ホスフェート」は-OP(O)(OH)O-またはその脱プロトン化体を意味し、「メルカプト」は-SHを意味し、「チオ」は=Sを意味し、「スルホニル」は-S(O)2-を意味し、「スルフィニル」は-S(O)-を意味する。
という記号は、存在する場合は単結合または二重結合のいずれかである任意の結合を表す。
という記号は単結合または二重結合を意味する。したがって、例えば
という構造は
という構造を含む。当業者が理解するように、そのような1個の環原子が2個以上の二重結合の一部を形成することはない。結合を垂直に横切って描かれる際の
という記号は、基の結合点を示す。読者が結合点を迅速かつ明確に同定することを支援するために、通常は比較的大きな基についてのみ結合点がこのように同定されることに留意されたい。
という記号は、楔形の太い端部に結合した基が「頁の外側に向かう」単結合を意味する。
という記号は、楔形の太い端部に結合した基が「頁の内側に向かう」単結合を意味する。
という記号は、立体配座(例えばRもしくはSのいずれか)または幾何学的配置(例えばEもしくはZのいずれか)が未確定である単結合を意味する。
Rは、安定な構造が形成される限り、図示され、暗示され、または明示的に規定される水素を含む、任意の環原子に結合した任意の水素原子を置き換えることができる。「R」基が例えば下記式中の縮合環系上の「浮遊している基」として図示される場合、
Rは、別途指定されない限り、いずれかの縮合環の任意の環原子に結合した任意の水素を置き換えることができる。安定な構造が形成される限り置き換え可能な水素としては、図示される水素(例えば、上記式中の窒素に結合した水素)、暗示される水素(例えば、図示されていないが存在していると理解される上記式の水素)、明示的に規定される水素、および、その存在が環原子の独自性に依存する任意的な水素(例えば、Xが-CH-と等しい場合の、X基に結合した水素)が挙げられる。図示される例では、Rは、縮合環系の5員環または6員環のいずれかに存在しうる。上記式中の括弧に囲まれる「R」基に直ちに続く「y」という添字は変数を表す。別途指定されない限り、この変数は0、1、2、または2を超える任意の整数でありうるものであり、環または環系の置き換え可能な水素原子の最大数によってのみ限定される。
といった基がアルカンジイル基の非限定的な例である。「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキリデン」という用語は、二価の基=CRR'を意味し、ここでRおよびR'は独立して水素、アルキルであるか、またはRおよびR'は一緒になって、少なくとも2個の炭素原子を有するアルカンジイルを表す。アルキリデン基の非限定的な例としては=CH2、=CH(CH2CH3)および=C(CH3)2が挙げられる。これらの用語のいずれかを「置換」という修飾語付きで使用する場合、1個または複数の水素原子が独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3または-S(O)2NH2で置き換えられている。以下の基が置換アルキル基の非限定的な例である: -CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2および-CH2CH2Cl。「ハロアルキル」という用語は置換アルキルのサブセットであり、ここで1個または複数の水素原子はハロ基で置換されており、炭素、水素およびハロゲン以外の原子は存在しない。-CH2Clといった基がハロアルキルの非限定的な例である。「アルカン」とは化合物H-Rを意味し、ここでRはアルキルである。「フルオロアルキル」という用語は置換アルキルのサブセットであり、ここで1個または複数の水素はフルオロ基で置換されており、炭素、水素およびフッ素以外の原子は存在しない。-CH2F、-CF3および-CH2CF3といった基がフルオロアルキル基の非限定的な例である。「アルカン」とは化合物H-Rを意味し、ここでRはアルキルである。
といった基がアルケンジイル基の非限定的な例である。これらの用語を「置換」という修飾語付きで使用する場合、1個または複数の水素原子が独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3または-S(O)2NH2で置き換えられている。-CH=CHF、-CH=CHClおよび-CH=CHBrといった基が置換アルケニル基の非限定的な例である。「アルケン」とは化合物H-Rを意味し、ここでRはアルケニルである。
これらの用語を「置換」という修飾語付きで使用する場合、1個または複数の水素原子が独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3または-S(O)2NH2で置き換えられている。「アレーン」とは化合物H-Rを意味し、ここでRはアリールである。
これらの用語を「置換」という修飾語付きで使用する場合、1個または複数の水素原子が独立して-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-OC(O)CH3または-S(O)2NH2で置き換えられている。
2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、アデニン(A)、エテノアデニン、N6-Δ2-イソペンテニルアデニン(6iA)、N6-Δ2-イソペンテニル-2-メチルチオアデニン(2ms6iA)、N6-メチルアデニン、グアニン(G)、イソグアニン、N2-ジメチルグアニン(dmG)、7-メチルグアニン(7mG)、2-チオピリミジン、6-チオグアニン(6sG)、ヒポキサンチンおよびO6-メチルグアニンなどのプリン;
7-デアザアデニン(7-デアザ-A)、7-デアザグアニン(7-デアザ-G)、7-デアザ-7-ヒドロキシメチルアデニン、7-デアザ-7-アミノメチルアデニンおよび7-デアザ-7-ヒドロキシメチルグアニンなどの7-デアザ-プリン;
シトシン(C)、5-プロピニルシトシン、イソシトシン、5-ヒドロキシルメチルシトシン(HOMeC)、5-アミノメチル-シトシン、チミン(T)、4-チオチミン(4sT)、5,6-ジヒドロチミン、O4-メチルチミン、ウラシル(U)、4-チオウラシル(4sU)、5-ヒドロキシルメチルウラシル(HOMeU)、5-アミノメチル-ウラシルおよび5,6-ジヒドロウラシル(ジヒドロウラシル; D)などのピリミジン;
ニトロインドールおよび4-メチルインドールなどのインドール; ニトロピロールなどのピロール; ネブラリン; 塩基(Y); など。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれる。当業者は、以下の実施例で開示される技術が、本発明の実行において十分に機能することを本発明者が発見した技術を代表するものであり、したがってその実行の好ましい様式を構成すると考えられうることを認識すべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の真意および範囲を逸脱することなく、開示されている具体的な態様に多くの変更を行い、なお類似または同様の結果を得ることができることを認識すべきである。
方法および材料
試薬および材料
別途記述がない限り、すべての試薬は商業的供給源から購入し、受け取ったまま使用した。
参照により本明細書に組み入れられるWu et al. (2007)に既に記載のように、1H NMR、13C NMRおよび31P NMRスペクトルをBruker DPX 400分光計上で記録した。質量スペクトル分析をMD Anderson Cancer Center(テキサス州ヒューストン)のMass Spectrometry LaboratoryおよびRice University(テキサス州ヒューストン)のCore Mass Spectrometry Facilityが行った。X線結晶構造解析をTexas A&M University(テキサス州カレッジステーション)のX-ray Diffraction Laboratoryが行った。紫外可視測定値を、Beckman DU-800分光光度計を使用して取得した。アニオン交換クロマトグラフィーを、Q Sepharose FFカラム(2.5x20cm)を使用して、25%アセトニトリル中75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)→25%アセトニトリル中75% TEAB(1.5M)の直線勾配によって、流量4.5mL/分で240分にわたって行った。逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を、128溶媒モジュール、および166紫外線検出器または168フォトダイオードアレイ紫外可視検出器を備えたBeckman System Goldを使用して行った。ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体のRP-HPLCを、4.6mm x 250mm Aquapore OD-300 C18カラムを使用して、100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0)を含有する緩衝液A、および100mM TEAA(pH 7.0)、70%アセトニトリル(v/v)を含有する緩衝液Bによって行った。
α-置換2-ニトロベンジルアルコールの合成
(R/S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール
(R/S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成は既に報告された。参照により本明細書に組み入れられるLitosh et al. (2011)を参照。
(R/S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成は既に報告された。参照により本明細書に組み入れられるLitosh et al. (2011)を参照。
スキームS1 (R/S)-1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。試薬および条件: (i) PhMgBr、THF、-50℃; i-PrCHO、-50℃〜室温、30%。
スキームS2 (R/S)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。試薬および条件: (i) PhMgCl、THF、-40℃; i-PrCHO、-40℃〜室温、67%。
スキームS3 (R/S)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。試薬および条件: (i) PhMgCl、THF、-40℃; (CH3)3CCHO、-40℃〜室温、74%。
スキームS4 (R/S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。試薬および条件: (i) PhMgCl、無水THF、-40℃; (CH3)3CCHO、-40℃〜室温、88%; (ii) (1S)-カンファン酸クロリド、DMAP、CH2Cl2、室温; (iii) 酢酸エチル/ヘキサンからの分別晶出、43%; (iv) K2CO3、MeOH、還流、99%。
参照により本明細書に組み入れられるLitosh et al. (2011)に記載のように、寸法0.50mm x 0.05mm x 0.05mmを有する(1S)-カンファン酸(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルの結晶について結晶学的測定を行った。図3参照。
CuKα線、λ=1.54178Å、T=110±2°K、2θmax=120.0°、収集反射数32,513、独立反射数2,913(Rint=0.0517)。最終GooF=1.091、R1=0.0681、wR2=0.1695、R指数は反射数2,913とI>2σ(I)(F2に対する精密化)に基づく、パラメータ数290、制限数43。適用されるLpおよび吸収補正μ=0.819mm-1。絶対構造パラメータ: 0.05±0.09。
C22H29NO7、M=419.46。斜方晶、a=6.29、b=15.00、c=22.27Å(α、β、γ=90°)、V=2,099.29Å3、空間群P212121、Z=4、Dc=1.327g/cm-3、F(000)=896。
スキームS5 (R/S)-1-(4,5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。試薬および条件: (i) ICl、CH3COOH、100℃、62%; (ii) HNO3、CH3COOH、室温、75%; (iii) PhMgCl、THF、-40℃; (CH3)3CCHO、-40℃〜室温、20%。
7-HOMe-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン三リン酸類似体の合成
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸
スキームS6 7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) TBSCl、イミダゾール、DMF、室温、87%; (ii) CO、PdCl2[PhCN]2、MeOH/1,4-ジオキサン、50℃、98%; (iii) LiBH4、MeOH、THF、還流、45%; (iv) 2-ニトロベンジルブロミド、n-Bu4NBr、CH2Cl2/NaOH水溶液、室温、50%; (v) n-Bu4NF、THF、0℃〜室温; (vi) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、2工程で91%; (vii) POCl3、(MeO)3PO、-40℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS7 7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) TsCl、DMAP、CH2Cl2、室温、39%; (ii) ラセミ(R/S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール、未希釈、105℃、54%; (iii) n-Bu4NF、THF、0℃〜室温; (iv) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、2工程で76%; (v) POCl3、(MeO)3PO、-40℃〜0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS8 7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) ラセミ(R/S)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール、108℃; (ii) n-Bu4NF、THF、0℃〜室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、3工程で32%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS9 7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシ-アデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) ラセミ(R/S)-1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール、108℃; (ii) n-Bu4NF、THF、0℃〜室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、3工程で38%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
ToF-MS(ESI):分子イオンC22H27N6O8[M-H]+について、計算質量は503.1890、実測質量は503.2029であった。
スキームS10 7-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (ii) n-Bu4NF、THF、室温; 2工程で75%; (iii) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、93%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS11 7-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (ii) n-Bu4NF、THF、室温; 2工程で78%; (iii) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、74%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
7-HOMe-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン三リン酸類似体の合成
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸
スキームS12 7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) TBSCl、イミダゾール、DMF、室温、60%; (ii) CO、PdCl2[PhCN]2、MeOH/1,4-ジオキサン、50℃、91%; (iii) LiBH4、MeOH、THF、還流、54%; (iv) 2-ニトロベンジルブロミド、n-Bu4NBr、CH2Cl2/NaOH水溶液、室温、48%; (v) n-Bu4NF、THF、0℃〜室温、95%; (vi) DABCO、H2O、還流、30%; (vii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS13 7-[1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) ラセミ(R/S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で26%; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、1,4-ジオキサン/DMF、70℃、70%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS14 7-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシ-グアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で35%; (iv) NaOMe、MeOH、還流、74%; (v) 1,4-ジオキサン、2M NaOH、還流、33%; (vi) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS15 7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) ラセミ(R/S)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で21%; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、1,4-ジオキサン/DMF、70℃、59%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS16 7-[1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) ラセミ(R/S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で24%; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、1,4-ジオキサン/DMF、70℃、57%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS17 7-[1-(4,5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) ラセミ(R/S)-1-(4,5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で23%; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、ジオキサン/DMF、70℃、68%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS18 7-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) (S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で27%; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、1,4-ジオキサン/DMF、70℃、76%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-HOMe-2'-デオキシウリジン三リン酸類似体の合成
5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸
スキームS19 5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (ii) NH4F、MeOH、50℃、2工程で56%; (iii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-HOMe-2'-デオキシシチジン三リン酸類似体の合成
5-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸
スキームS20 5-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) 2-ニトロベンジルアルコール、110℃; (ii) n-Bu4NF、THF、室温、2工程で53%; (iii) TBSCl、イミダゾール、DMF、室温、80%; (iv) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、DMAP、Et3N、CH2Cl2、室温; (v) NH3、1,4-ジオキサン、90℃、2工程で69%; (vi) n-Bu4NF、THF、室温、96%; (vii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS21 5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃、21%; (ii) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、DMAP、Et3N、CH2Cl2、室温、31%; (iii) NH3、1,4-ジオキサン、90℃、91%; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、82%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
スキームS22 5-[(S)-1-(5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) TBSCl、イミダゾール、DMF、室温、70%; (ii) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、DMAP、Et3N、CH2Cl2、室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン、90℃、2工程で65%; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、82%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
(R/S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成
スキームS23 (R/S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。(i) NaNO2、CH3COOH、HNO3、室温; I2、60℃、2工程で25%(純度80%); (ii) PhMgCl、(CH3)3CCHO、THF、-40℃〜室温、72%; (iii) (1S)-カンファン酸クロリド、DMAP、CH2Cl2、室温、80%; (iii) エタノールからの分別晶出、63%; (iv) K2CO3、MeOH、還流。
色素標識tBu-5-OMe-2-ニトロベンジルアルキル化ヒドロキシメチルヌクレオチドの合成
(R/S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成
スキームS24 (R/S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。(i) NaNO2、CH3COOH、HNO3、室温; I2、60℃、2工程で25%(純度80%); (ii) PhMgCl、(CH3)3CCHO、THF、-40℃〜室温、72%; (iii) (1S)-カンファン酸クロリド、DMAP、CH2Cl2、室温、80%; (iii) エタノールからの分別晶出、63%; (iv) K2CO3、MeOH、還流、98%。
スキームS25a 色素標識7-{(S)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-5-メトキシ-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-三リン酸および5'-α-チオ三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、(ii) (S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温; 3工程で29%; (iv) NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、100℃、80%; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF、98%; (vi) 54a: POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。54b: PSCl3、2,4,6-コリジン、(EtO)3PO、0℃〜室温; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。
スキームS26a 色素標識7-{(S)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-5-メトキシ-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-三リン酸および5'-α-チオ三リン酸の合成。試薬および条件: (i) MsCl、DMAP、CH2Cl2、0℃; (ii) (S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、115℃; (iii) n-Bu4NF、THF、室温; 3工程で18%; (iv) syn-ピリジン-2-アルドキシム、1,1,3,3-テトラメチルグアニジン、1,4-ジオキサン/DMF、70℃、72%; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF、96%; (vi) 59a: POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。59b: PSCl3、2,4,6-コリジン、(EtO)3PO、0℃〜室温; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。
スキームS27a 色素標識5-{(S)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-5-メトキシ-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) (S)-1-(4-ヨード-5-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、110℃; (ii) NH4F、MeOH、50℃、2工程で28%; (iii) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF、90%; (iv) 63a: POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。63b: PSCl3、2,6-ルチジン、(EtO)3PO、0℃〜室温; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。
スキームS28a 色素標識5-{(S)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-5-メトキシ-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸の合成。試薬および条件: (i) TBSCl、イミダゾール、DMF、室温、96%; (ii) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、DMAP、Et3N、CH2Cl2、室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン、90℃; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、3工程で83%; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4(0)、CuI、Et3N、DMF、91%; (vi) 68a: POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。68b: PSCl3、2,6-ルチジン、(EtO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH。
紫外線光開裂試験
紫外線光開裂速度は、光強度を含むいくつかの実験因子に依存することがわかった。いずれも参照により本明細書に組み入れられるMcCray et al. (1980)およびMcGall et al. (1997)を参照。本明細書に記載のヌクレオチド類似体間の光化学開裂速度を比較するために、1日の光強度出力0.70±0.01W/cm2を試料に送達するプロトコールを開発した。以下参照。これらの試験において使用したカスタム設計の紫外線脱保護装置は、参照により本明細書に組み入れられるWu et al. (2007)に既に記載されており、実行したプロトコールは以下に記載の通りである。
製造業者によって記載される通り、電源を約30分間作動させた後、ランプおよび再循環浴を作動させた。赤外線液体フィルターを9℃に冷却した。モデルPM100電力計(Thorlabs)、1000μmピンホール(Edmund Optics)、半分に切断された修正0.5mLエッペンチューブ、および3軸手動並進ステージ(Newport)を使用して光強度を決定した。図5参照。半分に切断されたエッペンチューブがピンホールおよび電力計検出ヘッドの前に配置され、このことが、反応溶液を通過する光の幾何学的形状の歪みの原因となった。そこで並進ステージを使用し、アークビームからの最高強度を用いて、チューブ/ピンホール/検出器の装置を整列させた。
ランプの出力を安定化させるために、強度測定前に1時間点灯したままにした。その後、測定電力を、電源からの電流を増大させることで調整した。強度(I)0.70W/cm2を実現するために、下記式に従って測定電力(P)を約5.5mWに調整した:
式中、rはピンホールの半径である。電力読取値を5分間(1秒間隔)にわたって記録し、6週間にわたる0.68±0.01〜0.72±0.02W/cm2の範囲の強度読取値に変換した。
次に修正エッペンチューブ、ピンホールおよび電力計を紫外線脱保護装置から取り外し、回転式試料ホルダーを高さ67.18±0.25mmで設置した。次に0.5mLエッペンチューブを試料ホルダー中に配置することでビームを集束させた。このチューブは、10μLおよび20μLの体積に相当する高さに基準線を設けるように内部整列カードで修正された。図5参照。基準線によって、ビームを所与の反応体積の中心に当てることが可能になった。後部反射器が生成するランプの水銀アーク像を観察することでビームの整列をさらに確認した。画像を見るために第2の整列カードを回転式試料ホルダー中に配置した。この画像は、反射器を使用して適切に整列される際に、アークギャップそれ自体の上に倒立したアーク像を生成する。この段階によって、電力出力約5.5mWを維持しながら、過熱を引き起こすことがあるアークホットスポットが重ね合わせられないことを確実にした。回転式試料ホルダーの速度を、Nova-Strobe DA Plusストロボスコープ(Monarch Instrument)を使用して、モーターのトルクを調整ねじによって調整することで、1,200〜1,350rpmの範囲内に調整した。
ヌクレオチド類似体を、PEPアッセイについて記載のように10μL反応液を使用して、最終濃度100nMで取り込んだ。参照により本明細書に組み入れられるLitosh et al. (2011)を参照。BODIPY-FL標識プライマー1とそれぞれハイブリダイズしたoligoTemplate-2、oligoTemplate-5およびoligoTemplate-4をそれぞれC7-HOMedA、C7-HOMedGおよびHOMedU類似体に使用した。BODIPY-FL標識プライマー3とハイブリダイズしたoligoTemplate-8を、HOMedC類似体をアッセイするために使用した。取り込まれた反応液を1mMアジ化ナトリウム溶液; 1mMアジ化ナトリウム、50mM DTT溶液; または試薬C〜G(図4の一覧を参照)で反応停止させ、本発明者らの紫外線脱保護装置を使用して様々な時点で365nm紫外線(UV)に曝露させた後、氷上に配置した。停止溶液(98%脱イオン化ホルムアミド; 10mM Na2EDTA、pH 8.0; 25mg/mLブルーデキストラン、分子量2,000,000)10μLを加え、試料をABモデル377 DNA配列決定装置を使用して分析した。参照により本明細書に組み入れられるLitosh et al. (2011)に記載のように、開裂アッセイを三つ組で行って平均DT50値±1SDを計算した。
Claims (24)
- 下記式の化合物またはその塩、互変異性体もしくは光学異性体:
式中、
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり;
R4は
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
R5およびR6はそれぞれ独立して
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、アジドまたはメルカプト;
アルキル(C≦6)、アルケニル(C≦6)、アルキニル(C≦6)、アリール(C≦6)、アラルキル(C≦8)、ヘテロアリール(C≦6)、アシル(C≦6)、アルコキシ(C≦6)、アシルオキシ(C≦6)、アルキルアミノ(C≦6)、ジアルキルアミノ(C≦6)、アミド(C≦6)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョン;
下記式の基:
式中、
Xは
-O-、-S-または-NH-; あるいは
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、またはこれらの基のいずれかの置換バージョンであり;
Yは-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nは0〜6の整数であり;
mは0〜6の整数である;あるいは
-リンカー-レポーターである。 - 式Iの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- 式IIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- 式IIIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- 式IVの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- 式Vの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- 式VIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- 式VIIの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
- R3がイソプロピルまたはtert-ブチルである、請求項1記載の化合物。
- R5が水素、ヨード、またはアルコキシ(C≦6)である、請求項1〜9のいずれか一項記載の化合物。
- R5がメトキシである、請求項10記載の化合物。
- i)Xがアルキンジイル(C2〜8)または-C≡C-であり;ii)Yが-CH2-であり;iii)nがゼロであり;および/またはiv)mがゼロである、請求項12または13記載の化合物。
- R6が水素である、請求項1〜15のいずれか一項記載の化合物。
- 星付きの炭素原子がS配置である、請求項1〜16のいずれか一項記載の化合物。
- 星付きの炭素原子がR配置である、請求項1〜16のいずれか一項記載の化合物。
- 以下の段階を含む、標的核酸を配列決定する方法:
(i) プライマーまたは核酸の5'-末端を固体表面に結合させる段階;
(ii) それぞれハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体を形成するために、標的核酸と該固体表面に結合したプライマーとをハイブリダイズさせる段階、またはプライマーと該固体表面に結合した核酸とをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 異なる式I〜VIIの化合物が異なるフルオロフォアを有するという条件で、ポリメラーゼ、および下記式およびその塩からなる群より選択される1つまたは複数の化合物を得る段階:
式中
R1は、トリホスフェート、α-チオトリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2 は水素、またはヒドロキシであり;
R3はアルキル(C≦8)または置換アルキル(C≦8)であり;
R4は水素であり;
R5は-リンカー-レポーターであり、該レポーターはフルオロフォアに基づき;
R6は水素である;
(iv) ポリメラーゼ反応を経由して伸長するプライマー鎖を形成するために、ハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体と段階(iii)のポリメラーゼおよび1つまたは複数の化合物とを反応させる段階;
(v) 段階(iv)の取り込まれた化合物をそのフルオロフォアによって同定するために、伸長するプライマー鎖を撮像する段階;
(vi) R3、R4、R5、およびR6は段階(iii)において定義される通りである下記式の光開裂性末端部分を除去することによって、伸長プライマーを得るために、伸長するプライマー鎖を有する固体表面を、光源に曝露する段階:
; ならびに
(vii)標的核酸中の複数の塩基を同定するために、段階(iv)〜(vi)を1回または複数回繰り返す段階であって、前回のサイクルの段階(vi)の伸長プライマーが後続のサイクルの段階(iv)においてハイブリダイズしたプライマー/標的核酸複合体の代わりに反応する、段階。 - 段階(vi)がジチオスレイトール(DTT)の存在下で行われる、請求項20記載の方法。
- 段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが、対応する天然ヌクレオチドの取り込み効率の70%〜100%で生じ、式Iの化合物に対応する天然ヌクレオチドがデオキシチミジン5'-三リン酸、式IIおよびVIIの化合物に対応する天然ヌクレオチドがデオキシシチジン5'-三リン酸であり、式IIIおよびVの化合物に対応する天然ヌクレオチドがデオキシアデノシン5'-三リン酸であり、式IVおよびVIの化合物に対応する天然ヌクレオチドが、デオキシグアノシン5'-三リン酸である、請求項20記載の方法。
- 段階(vi)において光開裂性末端部分の85%〜100%が光源に対する曝露によって除去される、請求項20記載の方法。
- 段階(iv)に係る少なくとも1つの化合物の取り込みが90%〜100%の効率で生じた後、鎖伸長の終結が行われる、請求項20記載の方法。
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