JP6195965B2

JP6195965B2 - 狂犬病糖タンパク質ウイルス様粒子（ｖｌｐ）

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Publication number: JP6195965B2
Application number: JP2016188777A
Authority: JP
Inventors: スミス，ゲイル; リウ，イエ
Original assignee: ノババックス，インコーポレイテッド
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2016-09-27
Publication date: 2017-09-13
Anticipated expiration: 2031-11-07
Also published as: LT2635257T; US20140178419A1; CN109157658A; JP2014500013A; ES2636965T3; AU2011323090A1; RS56157B1; EP2635257A2; BR112013011194B1; PT2635257T; MX354750B; US20180021428A1; CY1119284T1; MX2013005090A; US10086065B2; US20190224307A1; JP6158088B2; SG190140A1; EP3246019B1; WO2012061815A2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月５日に出願された米国仮出願第６１／４１０，７６７号の優先権を主張し、その仮出願の開示は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。

電子的に提出されたテキストファイルの説明
これに添えて電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＮＯＶＶ＿０４７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１１年１１月７日、ファイルサイズ：７キロバイト）。

本発明は、概ね、狂犬病ウイルス（ＲＶ）糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびに狂犬病ウイルス感染の処置および／または防止のためのワクチンなどの免疫原性組成物を含め、それらを作製し、用いるための方法に関する。

狂犬病ウイルス（ＲＶ）は、ラブドウイルス科の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、ヒトおよび動物において致死的な神経疾患を引き起こす。７０，０００人を超えるヒト死亡者数が毎年報告されており、他に何百万人という人々が曝露後の処置を必要としている。狂犬病の防止および制御においてかなり進歩してきたが、その疾患は依然として、公衆衛生にとっての大きな脅威であり、世界中で多数のヒトの死亡の原因となり続けている。イヌは依然として、たいていのヒト狂犬病症例が生じているアジア、アフリカ、およびラテンアメリカにおいて最も重要な保有宿主である。先進国において、ヒト狂犬病は、主にペット動物の定期的なワクチン接種の結果として、過去５０年間の間にかなり衰退している。しかしながら、野生生物への曝露を介する狂犬病伝染が、その疾患の主な原因として浮上している。米国において、動物狂犬病症例の９０％超が、野生生物において報告されており、公衆衛生上の持続的な脅威を表している。過去１０年間におけるほとんどのヒト症例は、コウモリ、特に銀髪コウモリに見出されるＲＶに関連している。

ラブドウイルスは、２つの主要な構造コンポーネント：らせん状のリボ核タンパク質コア（ＲＮＰ）と、それを包むエンベロープとを有する。狂犬病ゲノムは、以下の５つのタンパク質をコードする：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）、およびポリメラーゼ（ラージタンパク質）（Ｌ）。野生型狂犬病における遺伝子の順序は、３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’である。Ｎタンパク質、Ｌタンパク質、およびＰタンパク質がコアＲＮＰ複合体に付随している。ＲＮＰ複合体は、Ｎが、ポリメラーゼＬおよびＰタンパク質と共にＲＮＡゲノムをキャプシド化したものからなる。この複合体は、ウイルス転写および複製のための鋳型としての役割を果たす。ＲＶのウイルスエンベロープコンポーネントは、膜貫通糖タンパク質（Ｇ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質で構成される。糖タンパク質は、ウイルスの表面上で密に整列する約４００個の三量体スパイクを形成する。Ｍタンパク質は、エンベロープとＲＮＰの両方と会合しており、ラブドウイルスアセンブリの中心的タンパク質となることができる。

上記で述べたように、狂犬病は依然として、世界中で公衆衛生上の大きな脅威である。狂犬病を制御し、かつ狂犬病からヒトを防御することは、ペット動物および野生生物保菌者の定期的な免疫化、リスクのある人々の曝露前の免疫化、狂犬病の動物に噛まれた人々の曝露後の処置などのいくつかの制御ストラテジーを必要とする。細胞培養物から調製された不活性化狂犬病ウイルス（ＲＶ）ワクチンは安全で、耐容性がよいが、多数の欠点をもつ。それらは、製造するのが困難であり、貯蔵が困難であり、免疫原性が低く、複数回の注射を必要とする。さらに、それらは、高価であり、したがって、発展途上国においてワクチンを必要とするたいていの人々にとっては手が届かない。加えて、これらの不活性化ワクチンは、典型的には、望ましくない副作用を引き起こす可能性があるアジュバントを含む。それゆえ、より安全で、より安く、より効果的なＲＶワクチンが必要とされている。

本出願は、狂犬病糖タンパク質（Ｇ）を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の作製のための新規な方法を開発することで上記の要求に取り組むものである。

本発明は、狂犬病ウイルス感染の処置および防止のためのワクチンに用いる狂犬病ウイルス（ＲＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明のＲＶＶＬＰは、哺乳類対象において狂犬病ウイルスに対する強力な免疫応答を誘導する能力を有する。

第１の態様において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを提供する。ＲＶＧタンパク質は、任意の適切なＲＶ株由来であってもよく、そのＲＶ株には、ヒト、イヌ、コウモリ、アライグマ、スカンク、およびキツネのＲＶ株が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態において、１つまたは複数のＲＶＧタンパク質を含むＲＶＶＬＰは、ミセルの形をとり得る。いくつかの実施形態において、ＲＶＶＬＰは、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、およびポリメラーゼ（ラージタンパク質）（Ｌ）から選択される、１つまたは複数の追加のＲＶタンパク質を含んでもよい。特定の実施形態において、本発明のＲＶＶＬＰは、ＲＶマトリックスタンパク質（Ｍ）を含んでもよい。一実施形態において、Ｍタンパク質は、ヒトＲＶ株由来である。別の実施形態において、Ｍタンパク質は、イヌＲＶ株由来である。さらに別の実施形態において、Ｍタンパク質は、コウモリＲＶ株由来である。他の実施形態において、マトリックスタンパク質は、インフルエンザウイルス株由来のＭ１タンパク質であってもよい。一実施形態において、インフルエンザウイルス株は、トリインフルエンザウイルス株である。他の実施形態において、Ｍタンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）株由来であってもよい。

一実施形態において、ＲＶＧタンパク質のコード配列は、適切な宿主細胞においてそれの発現を増強するようにさらに最適化される。一実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。例示的な実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。

本発明のＲＶＶＬＰは、ＲＶ感染の防止および／または処置に用いられてもよい。したがって、別の態様において、本発明は、ＲＶに対する免疫応答を誘発するための方法を提供する。方法は、ヒトまたは動物の対象などの対象に、ＲＶＶＬＰを含有する組成物の免疫学的有効量を投与することを含む。

別の態様において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を提供する。

一実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。別の実施形態において、本発明は、本発明のワクチン製剤の成分の１つまたは複数で満たされた１つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。

別の実施形態において、本発明は、感染または少なくとも１つのその疾患症状に対する免疫を哺乳類に誘導するワクチンまたは抗原性組成物を製剤化する方法であって、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの有効用量を製剤に加えることを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、感染は、ＲＶ感染である。

本発明のＲＶＶＬＰは、感染病原体に対する免疫または実質的免疫を与える免疫応答を刺激する組成物を調製するのに有用である。したがって、一実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象において感染または少なくとも１つのその疾患症状に対する免疫を誘導する方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象においてＲＶ感染または少なくとも１つの疾患症状に対する実質的免疫を誘導する方法を提供する。

本発明の組成物は、脊椎動物（例えば、ヒトまたはイヌ）に投与された場合、脊椎動物において実質的免疫を誘導することができる。したがって、一実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象においてＲＶ感染または少なくとも１つの疾患症状に対する実質的免疫を誘導する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの防御誘導量を哺乳類に投与することを含む、哺乳類にＲＶのワクチン接種をする方法を提供する。予防ワクチン製剤は、例えば、針とシリンジ、または無針注射器を用いる皮下注射または筋肉内注射によって、全身性に投与される。例示的な実施形態において、ワクチン製剤は、筋肉内に投与される。

別の実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象において感染または少なくとも１つのその症状に対する防御抗体応答を誘導する方法を含む。

別の実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象においてＲＶ感染または少なくとも１つの疾患症状に対する防御細胞応答を誘導する方法を含む。

さらに別の態様において、本発明は、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）をコードする単離された核酸を提供する。例示的な実施形態において、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）のタンパク質をコードする単離された核酸は配列番号１である。

さらに別の態様において、本発明は、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）をコードする核酸を含む単離された細胞を提供する。例示的な実施形態において、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）のタンパク質をコードする単離された核酸は配列番号１である。

さらに別の態様において、本発明は、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）をコードする核酸を含むベクターを提供する。例示的な実施形態において、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）のタンパク質をコードする単離された核酸は配列番号１である。一実施形態において、ベクターはバキュロウイルスベクターである。

さらに別の態様において、本発明は、１つまたは複数の狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを作製する方法であって、（ａ）狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）をコードする核酸を発現するように宿主細胞を形質転換する工程と、（ｂ）上記ＲＶＶＬＰの産生を促す条件下で上記宿主細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。一実施形態において、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）をコードする核酸は配列番号１である。別の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。さらなる実施形態において、宿主細胞は、狂犬病糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むバキュロウイルスベクターをトランスフェクションされた昆虫細胞である。

狂犬病ウイルスＧ核酸配列（配列番号１）を含むｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターについてのプラスミドマップを示す図である。還元条件下（図２Ａ）および非還元条件下（図２Ｂ）における、抗ＲＶウサギ血清を用いるＲＶＧタンパク質についてのウェスタンブロッティングの結果を示す図である。１５０，０００×の倍率でのネガティブ染色電子顕微鏡法を用いて撮影された、ミセルの形をとる精製された組換えＲＶＧタンパク質粒子の画像を示す図である。漸増希釈度のＲＶＧ粒子を投与されたウサギにおける抗体誘導アッセイの結果を示す図である。狂犬病ウイルスＧ核酸配列（配列番号１）（上部）を含むｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターについてのタンパク質配列およびＲＶＧタンパク質配列（配列番号２）（下部）を示す図である。各免疫化投与計画（各免疫化群についてｎ＝５）についての幾何平均としてプロットされた、異なる日における抗狂犬病ウイルス抗体力価を示すグラフである。

定義
本明細書で用いられる場合、用語「アジュバント」は、製剤中、特定の免疫原（例えば、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰ）と組み合わせて用いられる場合、結果として生じる免疫応答を増大させ、または別の形で、変化させ、もしくは改変する化合物を指す。免疫応答の改変には、抗体免疫応答および細胞免疫応答の一方または両方の強化、またはその特異性を広げることが挙げられる。免疫応答の改変はまた、特定の抗原特異性免疫応答を減少させること、または抑制することも意味し得る。

本明細書で用いられる場合、用語「抗原性製剤」または「抗原性組成物」は、脊椎動物、特に鳥類または哺乳類に投与された場合、免疫応答を誘導する調製物を指す。

本明細書で用いられる場合、用語「トリインフルエンザウイルス」は、主に鳥類に見出されるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、トリインフルエンザウイルスは、あるヒトから別のヒトへ伝染し、または広がる可能性がある。ヒトを感染させるトリインフルエンザウイルスは、ヒトにおいてインフルエンザパンデミック、すなわち、病的状態および／または死亡を引き起こす可能性を有する。パンデミックは、新しいインフルエンザウイルス株（ヒトが自然免疫をもたないウイルス）が出現した場合に生じ、個々の地域を越えて、あるいは世界中に、広がり、一度に多数のヒトを感染させる。

本明細書で用いられる場合、「有効用量」とは、一般的に、免疫を誘導するのに、感染を防止および／もしくは寛解させるのに十分な、感染もしくは疾患の少なくとも１つの症状を低下させるのに十分な、ならびに／または１つ以上のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの別の用量の効力を増強するのに十分な、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰのその量を指す。有効用量は、感染または疾患の発症を遅らせ、または最小化するのに十分な、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの量を指す場合がある。有効用量はまた、感染または疾患の処置または管理において治療的恩恵を提供する、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの量を指す場合もある。さらに、有効用量は、感染または疾患の処置または管理において治療的恩恵を提供する、単独での、または他の治療と組み合わせての、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰに関する量である。有効用量はまた、感染病原体または感染疾患へのその後の曝露に対する対象（例えば、ヒト）自身の免疫応答を増強するのに十分な量の場合もある。免疫のレベルは、例えば、中和分泌型および／または血清抗体の量を、例えば、プラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイもしくはミクロ中和アッセイによって測定することにより、または限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞応答、抗原提示細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、樹状細胞応答、および／もしくは他の細胞の応答などの細胞応答を測定することにより、モニターすることができる。Ｔ細胞応答は、例えば、蛍光フローサイトメトリーにより特異的マーカーを用いて、存在する、例えば、ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞の量を測定することにより、または限定されないがＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞傷害性アッセイ、ＴＥＴＲＡＭＥＲアッセイ、および／もしくはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどのＴ細胞アッセイにより、モニターすることができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を防止し、および／または症状の重症度を低下させる用量である。

本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、望ましい生物学的効果を実現化するのに必要な、または十分な、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの量を指す。組成物の有効量は、選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当業者による日常的な実験の事項として決定することができる。例えば、感染を防止し、処置し、および／または寛解させるための有効量は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰへの曝露により、免疫系の活性化を引き起こし、結果として、抗原特異的免疫応答の発生をもたらすのに必要な量であり得る。その用語はまた、「十分量」の同義語でもある。別の実施形態において、有効量は、関連した動物モデル、動物、またはヒト患者において、望ましい日数の間、例えば、７日間、１０日間、１４日間、またはそれ以上において血清抗体保有（seroprotection）を誘導するＲＶＧミセルの重量による量である。

本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリ核酸がゲノムＤＮＡ由来である場合には、発現は、適切な真核生物の宿主細胞または宿主生物が選択されているならば、ｍＲＮＡのスプライシングを含む場合がある。本発明の関連において、その用語はまた、ＲＶＧ遺伝子ｍＲＮＡの収量、およびその発現後に達成されるＲＶＧタンパク質の収量も包含する。

本明細書で用いられる場合、用語「Ｇタンパク質」または「Ｇ糖タンパク質」または「Ｇタンパク質ポリペプチド」は、ＲＶＧタンパク質ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。

本明細書で用いられる場合、「免疫原」または「抗原」との用語は、免疫応答を誘発する能力があるタンパク質、ペプチド、ペプチド、核酸などの物質を指す。両方の用語はまた、エピトープを包含し、交換可能に用いられる。

本明細書で用いられる場合、用語「免疫刺激物質」は、身体に備わっている化学的メッセンジャー（サイトカイン）を介して免疫応答を増強する化合物を指す。これらの分子は、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；およびマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などの他の免疫刺激分子などの、免疫刺激活性、免疫強化活性、および炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインを含む。免疫刺激分子は、本発明のＶＬＰと同じ製剤中で投与することができ、または別々に投与することができる。そのタンパク質またはそのタンパク質をコードする発現ベクターを、免疫刺激効果を生じるように投与することができる。

本明細書で用いられる場合、用語「免疫原性製剤」は、脊椎動物、例えば、哺乳類に投与された場合、免疫応答を誘導する調製物を指す。

本明細書で用いられる場合、用語「感染病原体」は、脊椎動物において感染を引き起こす微生物を指す。通常、その生物体は、ウイルス、細菌、寄生生物、原生動物、および／または真菌である。

本明細書で用いられる場合、用語「多価の」は、複数の型または株の感染病原体または疾患に対する１つまたは複数の抗原性タンパク質／ペプチドまたは免疫原、例えば、１つより多い、ＲＶＧタンパク質型、株、配列などを有する組成物を指す。

本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容されるワクチン」は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含有する製剤を指し、それは、脊椎動物に投与することができる形をとり、かつ免疫を誘導するのに十分な、感染もしくは疾患を防止し、および／もしくは寛解させるのに十分な、ならびに／または感染もしくは疾患の少なくとも１つの症状を低下させるのに十分な、ならびに／または１つもしくは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの別の用量の効力を増強するのに十分な防御免疫応答を誘導する。典型的には、ワクチンは、本発明の組成物が懸濁し、または溶解する通常の食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形において、本発明の組成物は、感染を防止し、寛解させ、または別のやり方で処置するために便利に用いることができる。宿主へ導入されたとき、ワクチンは、限定されるわけではないが、抗体および／もしくはサイトカインの産生、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞応答、抗原提示細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答、樹状細胞応答、および／もしくは他の細胞応答の活性化を含む免疫応答を誘発することができる。

本明細書で用いられる場合、「防御免疫応答」または「防御応答」との句は、脊椎動物（例えば、ヒト）によって示される、感染病原体または疾患に対する抗体によって媒介される免疫応答を指し、それは、感染を防止し、もしくは寛解させ、または少なくとも１つのその疾患症状を低下させる。１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含む本発明のＲＶＶＬＰは、例えば、感染病原体を中和し、感染病原体が細胞に侵入するのを阻止し、感染病原体の複製を阻止し、および／または宿主細胞を感染と破壊から防御する、抗体の産生を刺激することができる。その用語はまた、脊椎動物（例えば、ヒト）によって示される、感染病原体または疾患に対するＴリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答を指し、それは、感染または疾患を防止し、もしくは寛解させ、または少なくとも１つのその症状を低下させる。

本明細書で用いられる場合、「脊椎動物」、「対象」または「患者」との用語は、脊索動物亜門の任意のメンバーを指し、それには、限定されないが、ヒト、ならびにチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類を含む他の霊長類が挙げられる。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家庭内で飼育される哺乳類（domestic mammals）；マウス、ラット（コットンラットを含む）、およびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類のトリ、カモ、ガンなどの飼育される鳥類、野鳥、および猟鳥を含む鳥類もまた限定されない例である。用語「哺乳類」および「動物」はこの定義に含まれる。成体と新生児の両方の個体が網羅されるものとする。特に、ヒト、家庭内で飼育される哺乳類、および家畜は、ＲＶワクチンまたは治療用物質の適切なレシピエントである。

本明細書で用いられる場合、用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの特質においてウイルスに似ているが、感染性であることを実証されたことがない構造を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を有しない。一般的に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムを欠き、それゆえに、非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は、多くの場合、異種発現によって大量に産生することができ、容易に精製することができる。

本明細書で用いられる場合、用語「キメラＶＬＰ」は、少なくとも２つの異なる感染病原体由来のタンパク質またはその部分（異種タンパク質）を含有するＶＬＰを指す。通常、そのタンパク質の１つは、宿主細胞からＶＬＰの形成を作動させることができるウイルス由来である。例示を目的として例を挙げれば、トリインフルエンザＭタンパク質および／またはＲＶＧタンパク質である。ＲＶＶＬＰおよびキメラＶＬＰという用語は、適切な場合、交換可能に用いることができる。

本明細書で用いられる場合、用語「ワクチン」は、病原体に対する抗体の形成または免疫を誘導するために用いられる、死んだ、もしくは弱められた病原体の調製物、または由来する抗原決定基の調製物を指す。ワクチンは、疾患、例えば、インフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザに対する免疫を供給するために与えられる。加えて、用語「ワクチン」はまた、脊椎動物に投与されて、防御免疫、すなわち、感染に関連した疾患を防止し、またはその重症度を低下させる免疫を生じさせる、免疫原（例えば、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰ）の懸濁液または溶液を指す。本発明は、免疫原性であり、かつ感染に関連した疾患に対する防御を供給し得るワクチン組成物を提供する。

狂犬病ウイルス（ＲＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）
一態様において、本発明は、ＲＶ感染または少なくとも１つのその疾患症状に対して脊椎動物（例えば、ヒトおよび家庭内で飼育される動物）を防御するためのワクチンまたは抗原性製剤へ製剤化することができる、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＶＬＰは、Ｎ、Ｐ、Ｍ、およびＬなどの追加のＲＶタンパク質をさらに含む。他の実施形態において、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＶＬＰは、インフルエンザウイルスタンパク質ＨＡ、ＮＡ、およびＭ１などの異種ウイルス株由来のタンパク質をさらに含む。一実施形態において、インフルエンザウイルスタンパク質Ｍ１は、トリインフルエンザウイルス株由来である（全体として参照により本明細書に組み入れられている米国特許出願第１３／２８０，０４３号参照）。

ＲＶワクチン
ＲＶ感染は、脊椎動物に中和抗体を供給することによって防止することができるため、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含むワクチンは、脊椎動物に投与された場合、インビボで中和抗体を誘導し得る。１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰは、有利には、ＲＶ感染の防止および／または処置に用いられる。したがって、本開示の別の態様は、ＲＶに対する免疫応答を誘発するための方法に関する。方法は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含有する組成物の免疫学的有効量を対象（ヒトまたは動物の対象など）に投与することを含む。その組成物の免疫学的有効量の投与は、ＲＶＧタンパク質に存在するエピトープに特異的な免疫応答を誘発する。そのような免疫応答は、Ｂ細胞応答（例えば、中和抗体の産生）および／またはＴ細胞応答（例えば、サイトカインの産生）を含み得る。好ましくは、ＲＶＧタンパク質によって誘発される免疫応答は、ＲＶＧタンパク質上に存在する少なくとも１つのエピトープが立体構造的に特異であるという要素を含む。一実施形態において、免疫応答は、ミセル立体構造に見出される、ＲＶＧタンパク質上に存在するエピトープに特異的である。ＲＶＧタンパク質および組成物は、ＲＶとの接触後に、ウイルス疾患を増強することなく対象に投与することができる。好ましくは、本明細書に開示されたＲＶＧタンパク質および適切に製剤化された免疫原性組成物は、ＲＶの感染を低下もしくは防止し、および／またはＲＶの感染後の病理学的応答を低下もしくは防止する、Ｔｈ１偏向性免疫応答を誘発する。

一実施形態において、本発明のＲＶＧタンパク質は、ミセル（例えば、ロゼット）の形で見出される。実施例２を参照されたい。一実施形態において、ミセルは、宿主細胞内での発現後、精製される。対象に投与された場合、本発明のミセルは、好ましくは、中和抗体を誘導する。いくつかの実施形態において、ミセルは、アジュバントと共に投与されてもよい。他の実施形態において、ミセルは、アジュバントなしで投与されてもよい。

別の実施形態において、本発明は、ＲＶ感染または少なくとも１つのその疾患症状に対して脊椎動物（例えば、ヒト）を防御するためのワクチンまたは抗原性製剤へ製剤化することができる、ＲＶＧタンパク質を含むＲＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。本発明はまた、ＲＶＶＬＰ、ならびに異なるＲＶウイルス株由来の野生型および突然変異型ＲＶ遺伝子またはその組み合わせを含むベクターに関し、そのベクターは、宿主細胞へトランスフェクションされた場合、ＲＶタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する。

いくつかの実施形態において、ＲＶウイルス様粒子は、少なくとも１つのウイルスマトリックスタンパク質（例えば、ＲＶＭタンパク質）をさらに含んでもよい。一実施形態において、Ｍタンパク質は、ヒトＲＶ株由来である。別の実施形態において、Ｍタンパク質は、イヌ、コウモリ、アライグマ、またはスカンクのＲＶ株などの代替のＲＶ株由来である。他の実施形態において、マトリックスタンパク質は、インフルエンザウイルス株由来のＭ１タンパク質であってもよい。一実施形態において、インフルエンザウイルス株はトリインフルエンザ株である。例示的な実施形態において、トリインフルエンザ株は、Ｈ５Ｎ１株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５である。他の実施形態において、マトリックスタンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来であってもよい。

さらなる実施形態において、本発明のＶＬＰは、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）などの１つまたは複数の異種免疫原を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、本発明はまた、１つまたは複数のＶＬＰ中に同じ株および／または異なる株由来の異なるＲＶＧ、Ｎ、Ｐ、Ｍ、およびＬタンパク質の組み合わせを含む。加えて、ＶＬＰは、免疫応答の増強のための１つまたは複数の追加の分子を含むことができる。

本発明の別の実施形態において、ＲＶＶＬＰは、核酸、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、化学療法剤、造影剤、および／または患者に送達されるのに必要とする他の作用物質などの作用物質を有することができる。

本発明のＶＬＰは、ワクチンおよび免疫原性組成物を調製するために有用である。ＶＬＰの１つの重要な特徴は、脊椎動物の免疫系が関心対象となるタンパク質に対する免疫応答を誘導するように、関心対象となる表面タンパク質を発現する能力である。しかしながら、全てのタンパク質がＶＬＰの表面上に発現できるとは限らない。なぜある特定のタンパク質がＶＬＰの表面上に発現しないのか、またはあまり発現しないのかという多数の理由があり得る。１つの理由は、そのタンパク質が宿主細胞の膜に方向づけられていないこと、またはそのタンパク質が膜貫通ドメインを有しないことである。例として、インフルエンザ血球凝集素のカルボキシル末端近くの配列は、成熟インフルエンザエンベロープ化ヌクレオキャプシドの脂質二重層へのＨＡの組込み、およびＨＡ三量体のインフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ１との相互作用の構築に重要であり得る（Ａｌｉら、（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、８７０９−１９）。

したがって、本発明の一実施形態は、ＲＶ由来のＧタンパク質、およびその細胞表面上に通常には効率的に発現せず、または通常のＲＶタンパク質ではない少なくとも１つの免疫原を含むキメラＶＬＰを含む。一実施形態において、ＲＶＧタンパク質は、関心対象となる免疫原と融合してもよい。別の実施形態において、ＲＶＧタンパク質は、異種ウイルス表面膜タンパク質、例えば、ＭＭＴＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質側末端を介して免疫原と会合する。

本発明の他のキメラＶＬＰは、ＲＶＧタンパク質、および異種感染病原体由来の少なくとも１つのタンパク質を含むＶＬＰを含む。異種感染病原体の例には、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、および／または寄生生物が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態において、別の感染病原体由来の免疫原は異種ウイルスタンパク質である。別の実施形態において、異種感染病原体由来のタンパク質は、エンベロープ関連タンパク質である。別の実施形態において、別の異種感染病原体由来タンパク質は、ＶＬＰの表面上に発現する。別の実施形態において、感染病原体由来タンパク質は、脊椎動物において防御免疫応答を生じさせるエピトープを含む。一実施形態において、別の感染病原体由来タンパク質は、ＲＶＧタンパク質と共発現する。別の実施形態において、別の感染病原体由来タンパク質は、ＲＶＧタンパク質と融合する。別の実施形態において、別の感染病原体由来タンパク質の一部だけがＲＶＧタンパク質と融合する。別の実施形態において、別の感染病原体由来タンパク質の一部だけが、ＲＶＧタンパク質の一部と融合する。別の実施形態において、ＲＶＧタンパク質と融合した、別の感染病原体由来タンパク質の一部は、ＶＬＰの表面上に発現する。

本発明はまた、本発明のＶＬＰ上またはＶＬＰ内に発現したタンパク質の変種を包含する。変種は、構成タンパク質のアミノ酸配列中に変化を含み得る。タンパク質に関する用語「変種」は、参照配列に対して１つまたは複数のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を指す。変種は、置換アミノ酸が類似した構造的または化学的性質を有する、「保存的」変化（例えば、ロイシンのイソロイシンとの置き換え）を有することができる。あるいは、変種は、「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンとの置き換え）を有することができる。類似の軽微なバリエーションはまた、アミノ酸欠失もしくは挿入、または両方を含むことができる。どのアミノ酸残基が、生物学的または免疫学的活性を除去することなく、置換、挿入、または欠失することができるかを決定するガイダンスは、当技術分野においてよく知られたコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。

天然の変種は、タンパク質における突然変異により生じ得る。これらの突然変異は、感染病原体、例えば、インフルエンザの個々の群内に抗原多様性をもたらす可能性がある。したがって、例えば、インフルエンザ株に感染した人がそのウイルスに対する抗体を産生し、より新しいウイルス株が出現した場合、より古い株に対するその抗体はもはや、そのより新しいウイルスを認識せず、再感染が起き得る。本発明は、ＶＬＰを作製するための感染病原体由来のタンパク質の全ての抗原多様性および遺伝的多様性を包含する。

クローニング、突然変異、細胞培養などの本発明に適用できる分子生物学的技術を記載する一般的テキストには、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｒｎｅｌ、ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５２巻ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ − ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版）、１−３巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）、ならびにＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらのテキストは、突然変異誘発、ベクター、プロモーターの使用、および例えば、ＲＶＧ分子のクローニングおよび突然変異導入に関しての多数の他の関連トピックスなどを記載する。したがって、本発明はまた、本発明のＶＬＰ上またはＶＬＰ内に発現したタンパク質の特性を向上させ、または変化させるためにタンパク質工学および組換えＤＮＡテクノロジーの公知の方法を用いることも包含する。様々な型の突然変異誘発を用いて、タンパク質分子をコードする変種核酸を産生および／もしくは単離し、ならびに／または本発明のＶＬＰ内もしくはＶＬＰ上のそのタンパク質をさらに改変／突然変異することができる。それらには、部位特異的突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップド二重鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発などが挙げられるが、それらに限定されない。追加の適切な方法には、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。例えば、キメラ構築物に関わる、突然変異誘発もまた、本発明に含まれる。一実施形態において、突然変異誘発は、天然の分子、または変化した、もしくは突然変異した天然の分子の既知の情報、例えば、配列、配列比較、物理的性質、結晶構造などによって導くことができる。

本発明は、実質的な生物学的活性、例えば、本発明のＶＬＰ上またはＶＬＰ内に発現した場合、効果的な抗体応答を誘発する能力を示すタンパク質変種をさらに含む。そのような変種は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当技術分野において知られた一般的なルールに従って選択された欠失、挿入、反転、反復、および置換されたものを含む。

タンパク質をクローン化する方法は当技術分野において知られている。例えば、特定のＲＶタンパク質をコードする遺伝子は、狂犬病ウイルスに感染した細胞から抽出されるポリアデニル化ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離することができる。生じた結果物たる遺伝子は、ＤＮＡ挿入断片としてベクターへクローン化することができる。用語「ベクター」は、核酸の、生物体、細胞、または細胞コンポーネント間の伝播および／または移動を可能にする手段を指す。ベクターには、自律的に複製し、または宿主細胞の染色体に統合されることができる、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられる。ベクターはまた、自律的に複製しない、未修飾の(naked)ＲＮＡポリヌクレオチド、未修飾のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内にＤＮＡとＲＮＡの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲート化ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲート化ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲート化ＤＮＡなどであり得る。全部ではないが、多くの一般的な実施形態において、本発明のベクターはプラスミドまたはバクミドである。

したがって、本発明は、本発明のＶＬＰの形成を誘導する細胞において発現することができる発現ベクターへクローン化される、キメラ分子を含む、タンパク質をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、発現を促進する能力、およびその中に組み込まれた核酸を複製する能力があるプラスミドなどのベクターである。典型的には、発現する核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーへ「作動可能に連結され」、そのプロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写制御管理を受ける。一実施形態において、ヌクレオチドは、（上記で論じられているような）ＲＶＧタンパク質をコードする。別の実施形態において、ベクターは、ＲＶＭタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ＭＲＶタンパク質および／またはＮＲＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ＭＲＶタンパク質、ＬＲＶタンパク質、および／またはＮＲＶタンパク質をコードするヌクレオチドをさらに含む。例示的な実施形態において、発現ベクターは、バキュロウイルスベクターである。

本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は、サイレント置換、サイレント付加、またはサイレント欠失を生じるが、コードされたタンパク質の性質もしくは活性、またはそのタンパク質がどのように生成されるかを変化させない変化を含有する突然変異を含んでもよい。ヌクレオチド変種は、様々な理由のために、例えば、コドン発現を特定の宿主について最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞によって好ましいコドンに変化させる）ために、作製することができる。全ての目的のために本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００５／０１１８１９１号を参照されたい。

加えて、正しいコード領域がクローン化され、かついかなる望ましくない突然変異も含有しないことを保証するために、ヌクレオチドをシークエンシングすることができる。ヌクレオチドは、任意の細胞における発現のために発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）へサブクローニングすることができる。上記は、ＲＶウイルスタンパク質がどのようにしてクローン化できるかの１つの例にすぎない。当業者は、追加の方法が利用可能であり、実行できることを理解している。

本発明はまた、Ｇ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分を含むＲＶ構造遺伝子をコードするＲＶヌクレオチド、および／または任意の上記のキメラ分子を含む構築物および／またはベクターを提供する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスのベクターであってもよい。Ｇ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分を含むＲＶ構造遺伝子、および／または任意の上記のキメラ分子を含む構築物および／またはベクターは、限定されないが、例えば、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーター（または他のバキュロウイルス）、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。所望の宿主細胞および／または発現速度に依存する、他の適切なプロモーターは、当業者に知られているであろう。発現構築物は、転写開始点、転写終結点、および転写領域においては、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。構築物によって発現した転写物のコード部分は、好ましくは、適切に位置する、翻訳されることになっているポリペプチドの始めに翻訳開始コドン、および終わりに終結コドンを含む。

発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核細胞培養についてのＧ４１８またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌における培養についてのテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。ベクターの中でも好ましいのは、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスベクターである。本発明と共に用いることができる他のベクターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む、細菌に用いるベクターを含む。好ましい真核生物のベクターの中では、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ならびにｐＳＶＬである。他の適切なベクターは、当業者にとって容易に明らかであろう。一実施形態において、ＲＶＧ遺伝子、加えてＭ、Ｎ、Ｌ、Ｐについての遺伝子もしくはその部分を含むＲＶ遺伝子、および／または任意の上記のキメラ分子をコードするヌクレオチドを含むベクターはｐＦａｓｔＢａｃである。

上記で述べた組換え構築物は、トランスフェクションし、感染させ、または形質転換するために用いることができ、ＲＶＧタンパク質および少なくとも１つの免疫原を含むＲＶタンパク質を発現することができる。一実施形態において、真核細胞および／または原核細胞への組換え構築物は、ＲＶＧ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分、および／または任意の上記の分子を含む。したがって、本発明は、ＲＶＧと、限定されないがＲＶＮ、Ｌ、およびＰ、もしくはその部分などの少なくとも１つの免疫原を含むＲＶ構造遺伝子、ならびに／または任意の上記の分子をコードする核酸を含有し、かつ、ＶＬＰの形成を可能にする条件下で宿主細胞においてＲＶＧ、Ｎ、Ｌ、もしくはＰ、もしくはその部分、および／または任意の上記の分子を含む遺伝子の発現を可能にするベクター（複数可）を含む宿主細胞を提供する。

真核生物の宿主細胞の中では、酵母、昆虫、鳥類、植物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（または線虫）、および哺乳類の宿主細胞である。昆虫細胞の例は、限定されないが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ細胞、例えば、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２細胞である。（酵母を含む）真菌宿主細胞の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｇｌａｂｒａｔａを含むカンジダ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。哺乳類細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、およびアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＨｅｐ−２細胞である。アフリカツメガエル卵母細胞または両生類由来の他の細胞もまた用いられてもよい。原核生物の宿主細胞には、細菌細胞、例えば、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、およびマイコバクテリアが挙げられる。

ベクター、例えば、ＲＶＧタンパク質；および限定されないが、ＲＶＮ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分が挙げられる少なくとも１つの免疫原、および／または任意の上記のキメラ分子のポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野においてよく知られた方法に従って、宿主細胞へトランスフェクションすることができる。例えば、核酸を真核細胞へ導入することは、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによることができる。一実施形態において、ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態において、組換えバキュロウイルスは、真核細胞へトランスフェクションされる。好ましい実施形態において、細胞は昆虫細胞である。別の実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。

本発明はまた、ＶＬＰ産生の効率を増加させる構築物および方法を提供する。例えば、ＲＶＧ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分、および／または任意の上記のキメラもしくは異種分子へのリーダー配列の付加は、細胞内に輸送するタンパク質の効率を向上させることができる。例えば、異種シグナル配列を、ＲＶＧ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分、および／または任意の上記のキメラもしくは異種分子に融合させることができる。一実施形態において、シグナル配列は、昆虫細胞の遺伝子に由来することができ、かつＲＶＧ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分、および／または任意の上記のキメラもしくは異種分子に融合することができる。別の実施形態において、シグナルペプチドは、バキュロウイルス発現系において効率的に働くキチナーゼシグナル配列である。

ＶＬＰ産生の効率を増加させるための別の方法は、ＲＶＧタンパク質、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、もしくはその部分を含むＲＶ、および／または任意の上記のキメラもしくは異種分子をコードするヌクレオチドを特定の細胞型についてコドン最適化することである。一実施形態において、核酸は、昆虫細胞における発現についてコドン最適化される。例示的な実施形態において、昆虫細胞はＳｆ９昆虫細胞である。

本発明はまた、ＶＬＰ形成を可能にする条件下で、ＲＶＧタンパク質を含むＲＶ遺伝子を発現することを含む、ＶＬＰを産生する方法を提供する。選択された発現系および宿主細胞に依存して、ＶＬＰは、組換えタンパク質が発現し、かつＶＬＰが形成される条件下で、発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。一実施形態において、本発明は、少なくともＲＶＧタンパク質をコードするベクターを適切な宿主細胞へトランスフェクションする工程、およびＶＬＰ形成を可能にする条件下でＲＶＧタンパク質を発現する工程を含む、ＶＬＰを産生する方法を含む。別の実施形態において、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、または哺乳類の細胞からなる群から選択される。適切な成長条件の選択は、当業者の技能の範囲内である。

本発明のＶＬＰを産生するように操作された細胞を成長させるための方法には、バッチ細胞培養、流加細胞培養、連続細胞培養、および灌流細胞培養の技術が挙げられるが、それらに限定されない。細胞培養は、バイオリアクター（発酵チャンバー）中での細胞の成長および増殖を意味し、精製および単離のために、細胞は増殖し、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現する。典型的には、細胞培養は、バイオリクター中、無菌で、制御された温度および気圧の条件下で実施される。バイオリクターは、温度、気圧、撹拌、および／またはｐＨなどの環境条件をモニターすることができる、細胞を培養するために用いられるチャンバーである。一実施形態において、バイオリクターは、ステンレススチールのチャンバーである。別の実施形態において、バイオリクターは、滅菌済みプラスチックバッグ（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ（登録商標）、ＷａｖｅＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）である。他の実施形態において、滅菌済みプラスチックバッグは、約５０Ｌ〜１０００Ｌのバッグである。

その後、ＶＬＰは、例えば塩化セシウム、ショ糖、およびイオジキサノールの勾配遠心分離、加えて、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む標準精製技術によるなどの、ＶＬＰの完全性を保存する方法を用いて単離される。

以下は、本発明のＶＬＰをどのようにして作製し、単離し、精製することができるかの例である。通常、ＶＬＰは、細胞が細胞培養において成長した場合にＶＬＰを生じるように操作された組換え細胞系から産生される（上記参照）。当業者は、本発明のＶＬＰを作製および精製するために利用することができる追加の方法があることを理解しているだろう。したがって、本発明は、記載された方法に限定されない。

本発明のＶＬＰの産生は、Ｓｆ９細胞（非感染）を振盪フラスコ中へ播種し、細胞を増殖させておき、細胞が成長し、増加するにつれてスケールアップする（例えば、１２５ｍｌのフラスコから５０ＬのＷａｖｅバッグへ）ことから始めることができる。細胞を成長させるために用いられる培地は、適切な細胞系用に配合される（好ましくは、無血清培地、例えば、昆虫培地ＥｘＣｅｌｌ−４２０、ＪＲＨ）。次に、細胞を、最も高い感染多重度（例えば、細胞あたり約１〜約３のプラーク形成単位）で組換えバキュロウイルスに感染させる。いったん感染が起きたならば、ＲＶＧタンパク質および／または任意の上記のキメラもしくは異種分子が、ウイルスゲノムから発現し、ＶＬＰへ自己組織化し、感染から約２４〜７２時間後、細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が成長の対数期の中間部（４〜８×１０^６細胞／ｍｌ）にある場合、最も効率的であり、少なくとも約９０％生存可能である。

ＶＬＰは、細胞培地中のＶＬＰのレベルが最大値に近いが、広範な細胞溶解の前である、感染から約４８〜９６時間後に、収集することができる。収集時点におけるＳｆ９細胞密度および生存率は、約０．５×１０^６細胞／ｍｌ〜約１．５×１０^６細胞／ｍｌで、色素排除アッセイによって示される場合、少なくとも２０％生存率を有する。次に、培地を取り出し、清澄化する。ＶＬＰ凝集を避けるために、ＮａＣｌを、約０．４〜約１．０Ｍの濃度まで、好ましくは約０．５Ｍまで培地に加えることができる。本発明のＶＬＰを含有する細胞培地からの細胞および細胞片の除去は、使い捨ての滅菌済み中空繊維０．５μｍまたは１．００μｍのフィルターカートリッジまたは類似した装置を用いる接線流濾過（ＴＦＦ）により達成することができる。

次に、清澄化された培地中のＶＬＰを、使い捨ての滅菌済み５００，０００分子量カットオフ中空繊維カートリッジを用いる限外濾過によって濃縮することができる。濃縮されたＶＬＰを、残留培地成分を除去するために、０．５ＭＮａＣｌを含有するｐＨ７．０〜８．０リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０体積に対してダイアフィルトレーションすることができる。

濃縮され、ダイアフィルトレーションされたＶＬＰを、約４℃〜約１０℃で、６，５００ｘｇでの遠心分離により、２０％〜６０％の不連続なショ糖濃度勾配を有し、０．５ＭＮａＣｌを含むｐＨ７．２ＰＢＳ緩衝液を用いてさらに精製することができる。通常、ＶＬＰは、約３０％〜約４０％のショ糖の間に、または界面（２０％と６０％の段階勾配中）に、特有の目に見えるバンドを形成し、それは勾配から回収して貯蔵することができる。この産物を、精製過程における次の工程のための調製において２００ｍＭのＮａＣｌを含むように希釈することができる。

ＶＬＰのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは４４％等密度ショ糖クッション遠心分離により達成することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ショ糖勾配からの試料（上記参照）を、陰イオンを有する媒体を含有するカラム（例えば、ＭａｔｒｉｘＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＴＭＡＥ）へ負荷し、ＶＬＰを他の混入物（例えば、バキュロウイルスおよびＤＮＡ／ＲＮＡ）から分離することができる塩勾配（ＮａＣｌの約０．２Ｍ〜約１．０Ｍ）によって溶出する。ショ糖クッション方法において、ＶＬＰを含む試料を、４４％ショ糖クッションに加え、３０，０００ｇで約１８時間、遠心分離する。ＶＬＰは４４％ショ糖の上面にバンドを形成するが、バキュロウイルスは底部で沈殿し、他の混入タンパク質は、０％ショ糖層の上面に留まる。ＶＬＰピークまたはバンドを回収する。

無傷バキュロウイルスは、必要に応じて、不活性化することができる。不活性化は、化学的方法、例えば、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）によって達成することができる。無傷バキュロウイルスの除去および／または不活性化はまた、上記で例示されているような、当技術分野において知られた、選択的沈殿およびクロマトグラフィー方法を用いることにより、大部分は達成することができる。不活性化の方法は、ＶＬＰを含有する試料を０．２％のＢＰＬ中、約２５℃〜約２７℃で３時間、インキュベートすることを含む。バキュロウイルスはまた、ＶＬＰを含有する試料を、０．０５％ＢＰＬにおいて、４℃で３日間、その後、３７℃で１時間、インキュベートすることによって不活性化することもできる。

不活性化／除去工程後、ＶＬＰを含む産物を、不活性化工程からのいかなる試薬もおよび／またはいかなる残留ショ糖も除去するために、ならびにＶＬＰを望ましい緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中へ置くために、別のダイアフィルトレーション工程に流すことができる。ＶＬＰを含む溶液は、当技術分野において知られた方法（例えば、濾過滅菌法）によって滅菌し、冷蔵庫または冷凍庫内で貯蔵することができる。

上記技術は、様々なスケールにわたって実行することができる。例えば、Ｔフラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリクターまで。バイオリクターは、ステンレススチールタンクまたは滅菌済みプラスチックバッグ（例えば、ＷａｖｅＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪによって販売されているシステム）のどちらでも含むことができる。当業者は、何が彼らの目的にとって最も望ましいかを知っているだろう。

組換えＲＶＶＬＰを産生するための、バキュロウイルス発現ベクターの増殖および産生、ならびに組換えバキュロウイルスでの細胞の感染は、前に記載されているように、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９昆虫細胞において達成することができる。一実施形態において、細胞は、ＲＶＶＬＰを産生するように操作された組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９である。

薬学的製剤またはワクチン製剤、および投与
本明細書において有用な薬学的組成物は、その組成物を受ける脊椎動物に有害な免疫応答の発生をそれ自体、誘導しない任意の薬学的作用物質を含み、かつ、過度の毒性なしに投与され得る、任意の適切な希釈剤または賦形剤を含む薬学的に許容される担体、および１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含有する。本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される」は、哺乳類用、より具体的には、ヒト用として、連邦政府もしくは州政府の管理機関によって承認されていること、または米国薬局方、ヨーロッパ薬局方、もしくは他の一般的に認識された薬局方に掲載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン組成物および／または抗原性組成物として有用であり得る。

本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含む薬学的に許容されるワクチン組成物を包含する。一実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＶＧタンパク質および少なくとも１つの追加の免疫原を含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＶＧタンパク質および少なくとも１つのＲＶＭタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＶＧタンパク質および少なくとも１つのインフルエンザＭタンパク質を含むＶＬＰを含む。別の実施形態において、薬学的に許容されるワクチン組成物は、少なくとも１つのＲＶＧタンパク質および少なくとも１つのトリインフルエンザＭ１タンパク質を含むＶＬＰを含む。

本発明はまた、少なくとも１つのＲＶＧタンパク質を含むＶＬＰを含む、ヒト対象などの脊椎動物を免疫化するためのキットを包含する。

一実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を含む免疫原性製剤を含む。

本発明の免疫原性製剤は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰ、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。薬学的に許容される担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張性水性緩衝液、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。薬学的に許容される担体、希釈剤、および他の賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．最新版）に示されている。製剤は、投与様式に適合しているべきである。好ましい実施形態において、製剤は、ヒトへの投与に適しており、好ましくは、無菌の、非粒子性および／または非発熱性である。

組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。組成物は、再構成に適した凍結乾燥粉末などの固形、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、または粉末であり得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含むことができる。

本発明はまた、本発明のワクチン製剤の成分の１つまたは複数で満たされた１つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。一実施形態において、キットは２つの容器を含み、一方が１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含有し、他方がアジュバントを含有する。そのような容器（複数可）に添付することができるものは、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって規定された形での通告であり、その通告は、製造、使用、または販売の機関によるヒト投与についての承認を反映する。

本発明はまた、製剤が、組成物の量を表示するアンプルまたはサッシェなどの密封容器内にパッケージングされていることを提供する。一実施形態において、組成物は、液体として供給され、別の実施形態においては、密封容器内に乾燥滅菌された凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給されて、対象への投与のために、例えば、水または食塩水で適切な濃度へ再構成することができる。

代替の実施形態において、組成物は、組成物の量および濃度を表示する密封容器内に液体の形で供給される。好ましくは、組成物の液体型は、密封容器内に、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌで供給される。

例として、１つまたは複数のＲＶＧタンパク質を含むＲＶＶＬＰは、免疫応答を刺激するのに十分な（上記で定義されているような）有効量または有効数量で投与され、それぞれが１つまたは複数のＲＶ株に対して応答する。１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの投与は、ＲＶに対する免疫を誘発する。典型的には、用量は、例えば、年齢、体調、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床的因子に基づいてこの範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば、針とシリンジ、または無針注射器を用いる皮下注射または筋肉内注射によって、全身性に投与される。例示的な実施形態において、ワクチン製剤は、筋肉内に投与される。

したがって、本発明はまた、感染または少なくとも１つのその疾患症状に対する免疫を哺乳類に誘導するワクチン組成物または抗原性組成物を製剤化する方法であって、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの有効用量をその製剤に加えることを含む方法を含む。一実施形態において、感染はＲＶ感染である。

単一用量での免疫の刺激は可能であるが、望ましい効果に達するために追加の投薬量を、同じまたは異なる経路で投与することができる。例えば、新生児および乳児において、十分なレベルの免疫を誘発するのに、複数回の投与が必要とされる場合がある。感染、例えば、ＲＶ感染に対する十分なレベルの防御を維持するために、必要に応じて、小児期を通じて折々に、投与を継続することができる。同様に、例えば、ヘルスケアワーカー、デイケアワーカー、幼児の家族、高齢者、および心肺機能障害をもつ個体などの反復性または重篤性感染に特に罹りやすい成人は、防御免疫応答を確立および／または維持するために複数回の免疫化を必要とする場合がある。誘導された免疫のレベルは、例えば、中和分泌型抗体および血清抗体の量を測定することによって、モニターすることができ、望ましいレベルの防御を誘発し、かつ維持するために、必要に応じて、投薬量を調整し、またはワクチン接種を繰り返すことができる。

１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを含む組成物（例えば、ワクチン製剤および／または抗原性製剤）を投与する方法には、非経口（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、および皮下）投与、硬膜外投与、および粘膜投与（例えば、鼻腔内および口腔内、または肺経路、または座剤による）が挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、または皮内に投与される。組成物は、任意の便利な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮層または皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、上咽頭、中咽頭、膣、尿道、膀胱、および腸管粘膜など）を通しての吸収により投与されてもよく、他の生物活性物質と共に投与されてもよい。

本発明のワクチン製剤および／または免疫原性製剤はまた、投薬スケジュール、例えば、ワクチン組成物の初回投与、その後のブースター投与で投与されてもよい。特定の実施形態において、組成物の２回目の投薬は、初回の投与から、おおよそ２週間後から１年後まで、好ましくは、約１カ月後から、約２カ月後、約３カ月後、約４カ月後、約５カ月後、約６カ月後までに投与される。追加として、３回目の投薬は、２回目の投薬後で、初回の投与から約３カ月後から約２年後まで、またはさらに長い期間後、好ましくは、約４カ月後、約５カ月後、または約６カ月後、または約７カ月後、約１年後までに、投与されてもよい。２回目の投薬後、対象の血清および／または尿または粘膜の分泌物中に特定の免疫グロブリンが検出されない、または低いレベルで検出される場合、３回目の投薬が任意選択により実施されてもよい。好ましい実施形態において、２回目の投薬は、１回目の投与から約１カ月後に実施され、３回目の投薬は、１回目の投与から約６カ月後に実施される。別の実施形態において、２回目の投薬は、１回目の投与から約６カ月後に実施される。別の実施形態において、本発明の組成物は、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明の組成物は、他の免疫原性組成物、抗ウイルス剤、および／または抗生物質と共に処方することができる。

薬学的組成物の投薬量は、当業者によって、例えば、まず、予防的または治療的免疫応答を誘発するのに有効な用量を、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することにより、または血清試料、もしくは尿試料、もしくは粘膜分泌物中の抗体の阻害比率を測定することにより、同定することによって、容易に決定することができる。投薬量は、動物研究から決定することができる。ワクチンの効力を研究するために用いられる動物のリストとしては、限定されないが、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス、およびコトンラットが含まれる。たいていの動物は、感染病原体の天然の宿主ではないが、それでもなお、その疾患の様々な態様の研究において役割を果たすことができる。例えば、上記の動物のいずれかは、ワクチン候補、例えば、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰを、誘導される免疫応答を部分的に特徴づけるために、および／またはいくらかの中和抗体が産生されているかどうかを決定するために、投薬することができる。例えば、マウスは小さいサイズであり、かつそれらの低コストによって、研究者がよりラージスケールで研究を行うことが可能になるため、マウスモデルにおいて多くの研究が行われている。

加えて、ヒト臨床研究は、当業者により、ヒトについての好ましい有効用量を決定するために実施することができる。そのような臨床研究は、当技術分野において日常的であり、よく知られている。用いられるべき正確な用量はまた、投与経路に依存する。有効用量は、インビトロまたは動物試験系から導かれた用量反応曲線から推定されてもよい。

当技術分野においてもよく知られているように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られている、免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって増強することができる。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫の汎用性(generalized)増加を促進するために、実験的に用いられている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。免疫化プロトコールは、長年、応答を刺激するためにアジュバントを用いており、それとして、アジュバントは当業者にとってよく知られている。いくつかのアジュバントは、抗原が提示される様式に影響を及ぼす。例えば、タンパク質抗原がアルミニウムによって沈殿する場合、免疫応答が増加する。抗原の乳化もまた、抗原提示の持続期間を延ばす。全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている、Ｖｏｇｅｌら、「ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＶａｃｃｉｎｅＡｄｊｕｖａｎｔｓａｎｄＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版）」に記載された任意のアジュバントの含有は、本発明の範囲内で想定される。

例示的なアジュバントには、フロイント完全アジュバント（死滅した結核菌を含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、フロイント不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントは、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含む。細菌から抽出された３つの成分のＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に含有するＲＩＢＩもまた企図される。ＭＦ−５９、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＭＨＣ抗原もまた用いられてもよい。

本発明の一実施形態において、アジュバントは、脂質二重層をもたない大きな無定形中心腔を囲む、水層によって分離された、実質的に球殻の形をとって配置された約２〜１０個の二重層を有する少数層状（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）脂質小胞である。少数層状脂質小胞は、非特異的刺激物質として、抗原の担体として、追加のアジュバントの担体として、およびそれらの組み合わせとして、いくつかの方法で免疫応答を刺激するように働き得る。例えば、ワクチンが、抗原が小胞の細胞外に留まるように、あらかじめ形成された小胞と抗原を混合することにより調製される場合、少数層状脂質小胞は、非特異的免疫刺激物質として働く。小胞の中心腔内に抗原をカプセル化することにより、小胞は、免疫刺激物質と、抗原の担体の両方として働く。別の実施形態において、小胞は、主として、非リン脂質小胞でできている。他の実施形態において、小胞は、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）である。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲である少数層状非リン脂質小胞である。それらは、Ｂｒｉｊ７２、コレステロール、オレイン酸、およびスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは、インフルエンザ抗原についての有効なアジュバントであることが示されている（全ての目的のために本明細書に援用される米国特許第５，６２９，０２１号、第６，３８７，３７３号、および第４，９１１，９２８号参照）。

本発明の組成物は、「免疫刺激物質」と共に処方することができる。免疫系の応答を増加させるための身体自身の化学的メッセンジャー（サイトカイン）がある。免疫刺激物質には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；およびマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１、Ｂ７．２などの他の免疫刺激性分子などの免疫刺激活性、免疫強化活性、および炎症促進活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインが挙げられるが、それらに限定されない。免疫刺激性分子は、本発明の組成物と同じ製剤中で投与することができ、または別々に投与することができる。そのタンパク質かまたはそのタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかが、免疫刺激効果を生じるように投与することができる。したがって、一実施形態において、本発明は、アジュバントおよび／または免疫刺激物質を含む抗原性製剤ならびにワクチン製剤を含む。

免疫応答を刺激する方法
１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰは、感染病原体に対する免疫または実質的な免疫を与える免疫応答を刺激する組成物を調製するのに有用である。本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象において、感染または少なくとも１つのその疾患症状に対する免疫を誘導する方法を包含する。

一態様において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象において、ＲＶ感染または少なくとも１つのその疾患症状に対する免疫を誘導するための方法を含む。一実施形態において、対象は脊椎動物である。別の実施形態において、脊椎動物は哺乳類である。さらに別の実施形態において、哺乳類はヒトである。さらに別の実施形態において、哺乳類は、飼いならされた動物である。別の実施形態において、方法は、製剤を１回、投与することにより、ＲＶ感染または少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導することを含む。別の実施形態において、方法は、製剤を複数回、投与することにより、ＲＶ感染または少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導することを含む。

本発明の組成物は、脊椎動物（例えば、ヒト）に投与された場合、脊椎動物において実質的な免疫を誘導することができる。実質的な免疫は、脊椎動物において、感染を防御し、もしくは寛解させ、または少なくとも感染の症状を低下させる、本発明の組成物に対する免疫応答に起因する。場合によっては、脊椎動物が感染したとしても、感染は無症状であろう。応答が、完全な防御応答ではない場合がある。この場合、脊椎動物が感染病原体に感染したならば、脊椎動物は、非免疫化脊椎動物と比較して、症状の低下、または症状のより短い持続期間を経験するだろう。

別の実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象において、感染または少なくとも１つのその症状に対する防御抗体応答を誘導する方法を含む。

本明細書で用いられる場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的に、または部分的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、加えて、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κかまたはλかのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらが、次には、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ、定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖ペアで構成され、各ペアは、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う、約１００〜１１０個、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化により生じた、いくつかの十分特徴づけられた断片として存在する。

一実施形態において、本発明は、１つまたは複数のＲＶ糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むＲＶＶＬＰの少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象において、ＲＶ感染または少なくとも１つの疾患症状に対する防御細胞応答を誘導する方法を含む。

上記で述べられているように、本発明の免疫原性組成物は、対象においてＲＶ感染の少なくとも１つの症状を防止し、または低下させる。ＲＶの症状は、当技術分野においてよく知られている。それらには、発熱、頭痛、および全身の脱力感または不快感が挙げられる。疾患が進行するにつれて、より特異的な症状が現れ、それらには、不眠、不安、精神錯乱、軽度または部分的な麻痺、興奮、幻覚、動揺、過流涎（唾液の増加）、嚥下困難、および恐水病（水への恐怖心）が挙げられ得る。したがって、本発明の方法は、ＲＶに伴う少なくとも１つの症状の防止または低下を含む。症状の低下は、主観的に、または客観的に、例えば、対象による自己評価により、臨床医の評価により、または、例えば、生活の質の評価、ＲＶ感染または追加の症状の進行の遅延、ＲＶ症状の重症度の低下を含む適切なアッセイもしくは測定（例えば、体温）もしくは適したアッセイ（例えば、抗体力価および／またはＴ細胞活性化アッセイ）を行うことにより、決定されてもよい。客観的評価は、動物評価とヒト評価の両方を含む。

本発明はさらに、以下の実施例によって例証され、その実施例は、限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許、および公開特許出願の内容、加えて図面および配列表は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。

（実施例１）
動物研究のための狂犬病Ｇ粒子の精製
この実施例の目的は、どのようにしてＲＶＧウイルス様粒子が、Ｓｆ９昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターからの発現後に精製されたかを示すことである。

ＲＶＶＬＰを構築するために、ＲＶＧタンパク質（配列番号２）をコードする核酸配列を、図１に示されたバキュロウイルスベクター（ｐＦａｓｔＢａｃ１ＲａｂｉｅｓＧ）から発現した。

Ｓｆ９昆虫細胞を、０．２のＭＯＩで２．５×１０^６細胞／ｍｌにおいて感染させた。感染後６９時間目に、４０００ｇで１５分間の遠心分離により細胞を収集した。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、再び回転させ、−７０℃で凍結した。

およそ２Ｌの細胞培養物から得られた２３グラムの細胞ペレットを用いた。細胞ペレットを、２５ｍＭＴｒｉｓＣＬｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ９、４ｕｇ／ｍＬロイペプチンの２００ｍｌで再懸濁した。それを室温で１時間、撹拌し、４℃において７０００ｇで６０分間、回転させ、クロマトグラフィーのために上清２００ｍｌを取っておいた。

細胞ペレットからの狂犬病Ｇ８３９抽出の終了後、可溶性タンパク質を、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＴＭＡＥＨｉｃａｐ（Ｍ）クロマトグラフィーカラム上に負荷した。カラムの仕様は以下の通りであった：カラム製造会社：ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ；カラムの型：ＸＫ５０ｆ２０；樹脂製造会社：ＥＭＤＣｈｅｍｉｃａｌｓ；樹脂の型：ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＴＭＡＥＨｉｃａｐ（Ｍ）；充填カラム寸法：約１０ｃｍ高さ×５．０ｃｍ直径；充填カラム体積：２００ｍｌ；充填流速：３０ｍｌ／分；充填緩衝液：２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０／３００ｍＭＮａＣｌ。

陰イオン交換工程の仕様は以下の通りであった：ランニング流速：２０ｍｌ／分；カラム平衡緩衝液：２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ａ：２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ｂ１：２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１８０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ｂ２：２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５００ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ｂ３：２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１５００ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；カラム負荷：狂犬病ＧＶＬＰ抽出上清２００ｍｌ；負荷後のカラム洗浄：２ＣＶ溶離液Ａ；カラム溶出：２ＣＶ溶離液Ｂ１、２ＣＶ溶離液Ｂ２、２ＣＶ溶離液Ｂ３。

主な画分回収および体積は以下の通りであった：通過画分：２５０ｍＬ；Ｂ１１８０ｍＭＮａＣｌ溶出：１７５ｍｌ（産物）；Ｂ２５００ｍＭＮａＣｌ溶出：１００ｍｌ；Ｂ３１５００ｍＭＮａＣｌ溶出：１００ｍｌ。

ＴＭＡＥカラムの１８０ｍＭＮａＣｌ溶出画分をレンチルレクチンカラム上に負荷した。カラムの仕様は以下の通りであった：カラム製造会社：ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ；カラムの型：ＸＫＩ６／２０；樹脂製造会社：ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ；樹脂の型：レンチルレクチンセファロース４Ｂ；樹脂カタログ＃：１７−０４４４−０１；充填カラム寸法：２．５ｃｍ高さ×１．６ｃｍ直径；充填カラム体積：約５ｍｌ；充填流速：２．５ｍｌ／分；充填緩衝液：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；ランニング流速：２ｍＬ／分；カラム平衡緩衝液：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ａ：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９、溶離液Ｂ：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９、５００ｍＭメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；カラム負荷：狂犬病Ｇ８３９ＴＭＡＥ１８０ｍＭＮａＣｌ溶出の１７５ｍｌ；負荷後のカラム洗浄：溶離液Ａでの５ＣＶ；カラム溶出：溶離液Ｂでの１０ＣＶ。

主な画分回収および体積は以下の通りであった：通過画分：１８０ｍｌ：溶出画分：３０ｍｌ（産物）。

レンチルレクチン溶出をＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＳＯ３−Ｈｉｃａｐ（Ｍ）クロマトグラフィーカラム上に負荷した。カラムの仕様は以下の通りであった：カラム製造会社：ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ；カラムの型：ＸＫ１６／２０；樹脂製造会社：ＥＭＤＣｈｅｍｉｃａｌｓ；樹脂の型：ＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＳＯ３−Ｈｉｃａｐ（Ｍ）；充填カラム寸法：５ｃｍ高さ×１．６ｃｍ直径；充填カラム体積：１０ｍｌ；充填流速：７．５ｍｌ／分；充填緩衝液：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９。

陽イオン交換工程の仕様は以下の通りであった：ランニング流速：５ｍＬ／分；カラム平衡緩衝液：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ａ：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；溶離液Ｂ：２５ｍＭＮａＨＰ０_４ｐＨ６．８、３００ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮＰ９；カラム負荷：狂犬病Ｇ８３９レクチンレクチン溶出３０ｍＬ；負荷後のカラム洗浄：溶離液Ａで３ＣＶ；カラム溶出：４ＣＶ段階溶出溶離液Ｂ；主な画分回収および体積：溶出画分：９ｍｌ（最終産物）；ＳＯ３−カラム３００ｍＭＮａＣｌ溶出産物の９ｍｌを０．２μｍフィルターで濾過する：フィルター製造会社（０．２μｍ）：Ｃｏｒｎｉｎｇ；フィルターの型：０．２ミクロンＳＦＣＡ膜を有する２８ｍｍシリンジフィルター。

抗ＲＶＧウサギ血清を用いるウェスタンブロッティングを行った（図２）。上記条件を用いたＲＶＧ粒子の純度は８６％であった。総タンパク質量は０．３９ｍｇ／ｍｌであり、ＲＶＧ粒子の濃度は０．３３ｍｇ／ｍｌであり、２Ｌ細胞培養物から合計２．９７ｍｇのＲＶＧ粒子であり、約１．５ｍｇ／Ｌ細胞培養物の収率であった。重要なことには、ＲＶＧ粒子は、４℃で少なくとも１カ月間、安定であった（データ未提示）。

（実施例２）
ＲＶＧタンパク質立体構造の分析のための電子顕微鏡法
精製されたＲＶＧタンパク質を、ネガティブ染色電子顕微鏡法によって分析した（図３）。０．０２％ＮＰ９でのＲＶＧ粒子の平均分子量は、１．０４×１０^−６であった。タンパク質三量体は、１７５．５ｋＤａの分子量を示し、粒子中の三量体の平均数は、５．９個であった。ＲＶＧタンパク質はミセル（ロゼット）の形をとって凝集した。Ｇスパイクが電子顕微鏡法下でミセル形態を示すという事実は、Ｇタンパク質粒子が天然タンパク質の正しい３次元構造を有することを示唆する。

（実施例３）
ＲＶＧ粒子はウサギにおいて高い抗体レベルを誘導する
ＲＶＧ粒子の免疫応答を誘導する能力を試験するために、ウサギに、ＲＶＧ粒子を様々な濃度で投与した。これらの実験の結果は図４に示されている。ＲＶＧ粒子は、ウサギにおいて高レベルの抗体を誘導することができた。

（実施例４）
マウスにおけるＲＶ中和アッセイおよびＲＶ誘発研究
１つまたは複数のＧタンパク質を含むＲＶＶＬＰを含むワクチンの、ＲＶ感染に対する防御における効率を試験するために、中和アッセイをマウスにおいて行う。簡単に述べれば、マウスの群に、ＲＶＶＬＰまたはＲＶＶＬＰ＋アルミニウムなどのアジュバントを筋肉内に注射する。加えて、マウスに、比較ワクチン剤として用いられるＲａｂｉｐｕｒ（登録商標）（市販の不活性化狂犬病ウイルスワクチン）を注射する。１つまたは複数のＧタンパク質を含むＲＶＶＬＰ（すなわち、ＲＶＧミセル）は、一般的に、Ｒａｂｉｐｕｒ（登録商標）と比較して、中和抗体のより高い力価を誘導することが予想される。

（実施例５）
ＲＶＧ粒子かまたは市販の狂犬病ワクチンＲａｂｉｐｕｒ（登録商標）のいずれかを注射されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗狂犬病力価の比較
本発明のＶＬＰの免疫原性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおいて市販の狂犬病ワクチンＲａｂｉｐｕｒ（登録商標）と比較した。実施例１に記載されているように、ＲＶＧＶＬＰ粒子を構築し、精製した。ＶＬＰはミセルの形に凝集した（図３）。

研究は４つの群（各群についてｎ＝５）を含んだ：
群Ｉ：陽性対照（市販の狂犬病ワクチンＲａｂｉｐｕｒ（登録商標））
群ＩＩ：ＲＶＧＶＬＰ（５μｇ）
群ＩＩＩ：ＲＶＧＶＬＰ（２μｇ）
群ＩＶ：ＲＶＧＶＬＰ（１μｇ）

マウスに、０日目、３日目、および７日目に、０．１ｍＬにおけるそれぞれの免疫原を投与した。０日目、４日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目に、マウスから血清試料を採取した。血清を、ＥＬＩＳＡにより中和抗狂犬病抗体について試験した。

研究設計の概要は下記の表１に示されている。

上記で論じられているように、抗狂犬病中和抗体を、マウス血清において、上記で示された時点で測定した。力価を、各測定値の幾何平均としてプロットした（図６）。図６に示されているように、各用量における本発明のＶＬＰミセルは、市販のワクチンＲａｂｉｐｕｒ（登録商標）より迅速かつ高い抗体力価を提供する。具体的には、ＲＶＧＶＬＰは、Ｒａｂｉｐｕｒ（登録商標）ワクチンより数日早く、血清防御力価（０．５ＥＵ／ｍＬ）を提供した（図６、表２）。

表２はまた、各免疫化群についてのパーセント血清抗体保有率（すなわち、中和抗体力価≧０．５ＥＵ／ｍＬ）を示す。表は、血清抗体保有が、Ｒａｂｉｐｕｒ（登録商標）ワクチンを投与された動物と比較して、（全ての３つの用量における）本発明のＲＶＧＶＬＰで処置された動物においてより迅速に生じる。

前述の詳細な記載は、明瞭な理解のためにのみ与えられたものであり、これらの改変は当業者にとって容易なものであろうから、それらから不必要な限定が理解されるべきではない。本明細書に提供される情報のいずれも、現在主張されている本発明の先行技術であり、または関連しているものと認めるわけではなく、具体的に、もしくは暗に参照されたいかなる刊行物も先行技術であるものと認めるわけでもない。

他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

本出願は、読者の注意を特定の実施形態に向けるためにセクションに分かれているが、そのようなセクションは、実施態様の間での区分として解釈されるべきではない。各セクションの教示および本明細書に記載された実施形態は、他のセクションに適用できる。

本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、それはさらに改変することができ、本出願は、一般的には本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野内での公知または慣習的な実施内に入るような、および上文で示された本質的な特徴に当てはまり得るような、および添付された特許請求の範囲の範囲内で従うような本開示からの逸脱を含め、本発明のいかなるバリエーション、使用、または適応も網羅することを意図されることは理解されているであろう。

Claims

狂犬病ウイルス（ＲＶ）糖タンパク質（Ｇタンパク質）を含むミセルの製造方法であって、前記Ｇタンパク質が三量体を形成し、
（ａ）ＲＶＧタンパク質をコードする核酸を含むバキュロウイルスベクターでＳｆ９昆虫宿主細胞を形質転換する工程と、
（ｂ）前記核酸を発現するように、前記宿主細胞を培養する工程と、
（ｃ）ＮＰ−９洗浄剤の存在下、前記ＲＶＧタンパク質をミセルの形態で精製する工程と、
を含む、方法。
前記核酸が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１に記載の方法。
前記ＲＶＧタンパク質が配列番号２の配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
前記ＲＶＧタンパク質がヒト、イヌ、コウモリ、アライグマ、スカンク、およびキツネから選択されるＲＶ株由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
ワクチンまたは抗原性組成物の製造方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって、狂犬病ウイルス糖タンパク質を含むミセルを製造する工程と、さらに前記ミセルの有効用量を組成物に添加することによって、前記ミセルをワクチンまたは抗原性組成物に製剤化する工程と、を含む方法。
前記組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、請求項５に記載の方法。
前記組成物がアジュバントを含む、請求項５または６に記載の方法。
前記アジュバントがアルミニウムアジュバントである、請求項７に記載の方法。
前記ミセルが、宿主において抗Ｇタンパク質抗体の産生を増加することができる、請求項１に記載の方法。
前記抗Ｇタンパク質抗体が中和抗体である、請求項９に記載の方法。
前記抗Ｇタンパク質抗体が防御抗体である、請求項９に記載の方法。
単一用量の投与後に、前記ミセルが、宿主において抗Ｇタンパク質抗体の産生を誘導することができる、請求項９に記載の方法。
前記ミセルが、７日間で、血清防御力価を提供することができる、請求項９に記載の方法。