JP6192177B2 - Use of S100A9 as a biomarker for inflammatory bowel disease - Google Patents

Description

本発明は、炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのＳ１００Ａ９の使用に関するものである。   The present invention relates to the use of S100A9 as a biomarker for inflammatory bowel disease.

Ｓ１００ファミリーに属するＳ１００Ａ８およびＡ９の複合体であるカルプロテクチンは、分子量３６，０００のタンパク質である。糞便中のカルプロテクチンを測定することにより、炎症性腸炎疾患（ＩＢＤ）の診断に利用できることから（非特許文献１）、既に糞便中のカルプロテクチン測定キットが海外で製造発売されている（Ｅｕｒｏｓｐｉｔａｌ社、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ社など）。   Calprotectin, which is a complex of S100A8 and A9 belonging to the S100 family, is a protein having a molecular weight of 36,000. Since fecal calprotectin can be used for diagnosis of inflammatory enteritis disease (IBD) by measuring fecal calprotectin (Non-patent Document 1), fecal calprotectin measurement kits have already been manufactured and released overseas ( Eurospital, Immundiagnostik AG, etc.).

しかしながら、カルプロテクチンは、ＩＢＤの診断に利用できるものの、必ずしも臨床状態を反映しているとは言い難い面があった。たとえば、実施例に示すように、ＩＢＤの１つである潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のモデルラット糞便中のカルプロテクチンは炎症状態を反映していない。 However, although calprotectin can be used for the diagnosis of IBD, it has been difficult to say that it necessarily reflects the clinical state. For example, as shown in the Examples, calprotectin in model rat feces of ulcerative colitis (UC), one of the IBDs, does not reflect an inflammatory condition.

Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１０；３４１：ｃ３３６９British Medical Journal, 2010; 341: c3369 第４１回日本毒性学会学術年会 セッションＩＤ：Ｐ−１３６ ２０１４年７月２日〜４日（木村恵人 日精バイリス株式会社）で報告された「デキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス潰瘍性大腸炎モデルの検討」The 41th Annual Meeting of the Japanese Society of Toxicology Session ID: P-136 “Examination of Dextran Sulfate Sodium-Induced Mouse Ulcerative Colitis Model Reported July 2-4, 2014 (Keto Kimura Nissei Baylis Co., Ltd.) "

一般に、ＩＢＤを研究するモデル系においては、主に便の状態を観察してスコア化するＤｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）によって病態の程度が評価されており（非特許文献２）、この手法は生体内の炎症状態を反映する良い方法ではあるものの、便状態を主観的に判断するため、判定する人によりＤＡＩスコアに差が生じやすいことが問題とされていた。 In general, in a model system for studying IBD, the degree of pathological condition is evaluated mainly by a disease activity index (DAI) that observes and scores the state of stool (Non-Patent Document 2). Although it is a good method to reflect the inflammatory state, it has been a problem that the DAI score tends to be different depending on the person making the judgment because the stool state is subjectively judged.

一方、従来、上述したように、カルプロテクチンとＩＢＤとの関係に関しては明示されているものの、カルプロテクチンの構成成分であるＳ１００Ａ９タンパク質とＩＢＤとの関連性は十分に検討されていない。 On the other hand, conventionally, as described above, although the relationship between calprotectin and IBD has been clarified, the relationship between S100A9 protein, which is a component of calprotectin, and IBD has not been sufficiently studied.

本発明者は、ＩＢＤを研究するモデル系において、ＤＡＩスコアに代わり得るバイオマーカーを見いだすべく鋭意検討を重ねた結果、Ｓ１００Ａ９タンパク質が、病態をスコア化したＤＡＩスコアよりも早期に、かつ客観的に腸の状態を反映することを見いだし、本発明を完成させた。   As a result of intensive studies to find a biomarker that can replace the DAI score in a model system for studying IBD, the present inventor has objectively and objectively found that the S100A9 protein is earlier than the DAI score scored for the disease state. The present invention has been completed by finding that it reflects the state of the intestines.

従来、ＩＢＤモデルを用いた評価は、ＤＡＩスコアを中心とした主観的な方法が採用されていたが、糞便中Ｓ１００Ａ９を測定することによって、ＤＡＩスコアよりも客観的、かつ早期に腸の炎症状態を反映する結果を得ることができる。   Conventionally, the subjective method centered on the DAI score has been adopted for the evaluation using the IBD model. By measuring S100A9 in the stool, the inflamed state of the intestine is objective and earlier than the DAI score. Can be obtained.

また、すでにカルプロテクチンとＩＢＤの関係は報告されているが、実施例に示すように必ずしも糞便中カルプロテクチンが病態を反映していない。一方で糞便中Ｓ１００Ａ９をマーカーとして用いた場合には、より病態に即した結果を得ることができる。 Moreover, although the relationship between calprotectin and IBD has already been reported, as shown in the Examples, fecal calprotectin does not necessarily reflect the disease state. On the other hand, when S100A9 in stool is used as a marker, a result more suited to the disease state can be obtained.

以上より、糞便中Ｓ１００Ａ９は従来法よりも、客観的で早期に病態に合った結果を得ることのできる有用なマーカーである。さらに、ＩＢＤの寛解状態の判断は、医師により異なるが、多くは内視鏡検査によるため患者への負担が大きい。しかしながら、代替法として糞便中Ｓ１００Ａ９を測定することにより、非侵襲的かつ簡易に腸の状態を調べることが可能となる。 As described above, fecal S100A9 is a useful marker that can obtain a result that is more objective and suits the disease state earlier than the conventional method. Furthermore, although the judgment of the remission state of IBD differs depending on the doctor, many are based on endoscopy, so the burden on the patient is large. However, by measuring stool S100A9 as an alternative method, it becomes possible to examine the state of the intestine non-invasively and easily.

図１は、ラットの体重変化を示したものである。表の縦軸が体重（ｇ）、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群、四角印がコントロール群の平均値を表している。FIG. 1 shows changes in body weight of rats. The vertical axis of the table is body weight (g), and the horizontal axis is Day. The diamond mark represents the average value of the DSS administration group, and the square mark represents the average value of the control group. 図２は、ＤＡＩスコアの変化を示したものである。表の縦軸がＤＡＩスコア、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群、四角印がコントロール群の平均値を示す。＊Ｐ＜０．０５ ＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ）FIG. 2 shows changes in the DAI score. The vertical axis of the table is the DAI score, and the horizontal axis is Day. A diamond mark shows the average value of the DSS administration group, and a square mark shows the average value of the control group. * P <0.05 ** P <0.01 (Mann-Whitney Rank Sum Test) 図３は、腸の平均比重を比較したものである。縦軸が比重であり、左グラフがＤＳＳ投与群、右グラフがコントロール群の平均値を示した。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ）FIG. 3 compares the average specific gravity of the intestines. The vertical axis is specific gravity, the left graph shows the average value of the DSS administration group, and the right graph shows the average value of the control group. ** P <0.01 (Mann-Whitney Rank Sum Test) 図４は、便中のＳ１００Ａ９濃度の変化を示したものである。表の縦軸が便１ｍｇ中のＳ１００Ａ９量、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群、四角印がコントロール群の平均値を示す。＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ）FIG. 4 shows changes in the S100A9 concentration in the stool. The vertical axis of the table is the amount of S100A9 in 1 mg of stool, and the horizontal axis is Day. A diamond mark shows the average value of the DSS administration group, and a square mark shows the average value of the control group. ** P <0.01 (Mann-Whitney Rank Sum Test) 図５は、便中のカルプロテクチン濃度の変化を示したものである。縦軸が便中のカルプロテクチン濃度、横軸がＤａｙである。ダイヤ印がＤＳＳ投与群での平均値を示した。コントロール群は検出限界以下のため図中には示していない。FIG. 5 shows the change in calprotectin concentration in feces. The vertical axis is calprotectin concentration in feces, and the horizontal axis is Day. A diamond mark represents an average value in the DSS administration group. The control group is not shown in the figure because it is below the detection limit.

本発明は、炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのＳ１００Ａ９の使用に関するものである。   The present invention relates to the use of S100A9 as a biomarker for inflammatory bowel disease.

Ｓ１００Ａ９を測定する試料としては、ヒトを含む動物の糞便試料を用いることができる。糞便試料は、便中のヘモグロビン測定時と同様の処理に付せばよく、たとえば、市販の便潜血検査用の採便容器を用いて糞便試料を採取し、適当な緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液に懸濁後、遠心分離等によって固液分離し、上清を試料として使用する。   As a sample for measuring S100A9, a fecal sample of an animal including a human can be used. The stool sample may be subjected to the same treatment as when measuring hemoglobin in the stool. For example, a stool sample is collected using a commercially available stool sample for occult blood test, and an appropriate buffer solution such as phosphate is used. After suspending in a buffer solution, solid-liquid separation is performed by centrifugation or the like, and the supernatant is used as a sample.

試料を採取する対象の炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎、クローン病などの大腸、小腸、直腸などの腸に関連した炎症性疾患であれば、すべて対象とすることができる。 The target inflammatory bowel disease from which a sample is collected may be any inflammatory disease related to the intestine such as ulcerative colitis, Crohn's disease, etc., such as the large intestine, small intestine, and rectum.

Ｓ１００Ａ９を測定するには、既にＳ１００Ａ９に対する抗体が市販（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ， ＳＡＢ１４０４３４８， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ｓ１００Ａ９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ）されていることから、それらを利用して、又は常法によりＳ１００Ａ９に対する抗体を取得し、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法（ＣｉｒｃｕＬｅｘ， ＣＹ−８０６２， ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｓ１００Ａ９／ＭＲＰ１４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１２；６：１７０−８１）により測定することが可能である。 In order to measure S100A9, since antibodies against S100A9 are already commercially available (SIGMA-ALDRICH, SAB1404348, Monoclonal Anti-S100A9 antibody produced in mouse), an antibody against S100A9 is obtained by using them or by a conventional method. In addition, it can be measured by a known method such as ELISA (CircuLex, CY-8062, CircuLex S100A9 / MRP14 ELISA kit, Proteomics Clinical Applications. 2012; 6: 170-81).

以下、実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。   Hereinafter, although an example is given and explained concretely, the present invention is not limited at all by these.

（実施例）
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発ラットＵＣ潰瘍性大腸炎モデルにおいて、便中のＳ１００Ａ９を測定することにより、既存のＤＡＩスコアよりも客観的かつ早期に大腸の炎症を検出することが可能か検討した。 (Example)
In the dextran sodium sulfate (DSS) -induced rat UC ulcerative colitis model, it was investigated whether the inflammation of the large intestine could be detected objectively and earlier than the existing DAI score by measuring S100A9 in the stool.

（１）手順：
（モデル作製）
薬物はＤＳＳ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ ＣＡＴ ＮＯ．１６０１１０ Ｍ．Ｗ．＝３６，０００−５０，０００）を使用した。実験には、６週齢のＳＤラット（オス）を用い、ＤＳＳ投与群７匹、コントロール群６匹に分けた。ラットは、一週間馴化後、投与群（Ｄ群）には３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳ水溶液、コントロール群（Ｃ群）には純水を１１日間自由飲水させた。 (1) Procedure:
(Model creation)
The drug used was DSS (MP Biomedicals, LLC CAT NO. 160110 MW = 36,000-50,000). In the experiment, 6-week-old SD rats (male) were used and divided into 7 DSS administration groups and 6 control groups. After acclimation for one week, the rats were allowed to drink freely for 3 days with 3% (w / v) DSS aqueous solution in the administration group (Group D) and pure water in the control group (Group C).

（便の回収）
毎朝Ｄ群、Ｃ群の便を回収した。回収方法は、飼育カゴの大きさに合うバットにネット（穴の大きさ４×５ｍｍ）をはり、便と尿を分けた。便は、Ｄａｙ０からＤａｙ１０の期間で回収した。回収時間は、午前８時から１２時までとした。 (Collection of stool)
Every morning, stool from Group D and Group C was collected. The collection method was to separate the stool and urine by applying a net (hole size 4 × 5 mm) to a bat that fits the size of the cage. The stool was collected during the period from Day 0 to Day 10. The collection time was from 8:00 am to 12:00.

（ＤＡＩスコア判定）
便の状態を観察して下痢、血便の状態をスコア化し、足し合わせた値をＤＡＩスコアとした。判定基準は、下痢スコアが正常便で０、軟便で１、下痢便で２、水様便で３とし、血便スコアは正常便で０、茶色の便で１、赤茶けた色の便で２、血便で３とした。有意差検定は、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １２を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。 (DAI score determination)
The state of stool was observed to score the state of diarrhea and bloody stool, and the combined value was taken as the DAI score. The criteria are 0 for normal stool, 1 for soft stool, 2 for diarrheal stool, 3 for watery stool, 0 for normal stool, 1 for brown stool, 2 for reddish stool, It was set to 3 by bloody stool. The significance test was performed using Mann-Whitney Rank Sum Test using Sigma Plot 12, and it was determined that there was a significant difference when the P value was less than 0.05.

（サンプル処理）
回収した便は、あらかじめ重量を測定した１．５ｍＬチューブに入れ、再度重量を測定し、便のみの重さを記録した。５００μＬの検体希釈液を加えて、氷上で１５分間静置した。ホモジナイザーペッスルを使用して、便を懸濁した。その際にペッスルを５００μＬの検体希釈液で洗い、液量を計１，０００μＬとした。次に１２，０００ｇ ４℃ ５分間遠心し、上清を回収した。得られた上清は、測定まで−８０℃で保存した。 (Sample processing)
The collected stool was placed in a 1.5 mL tube that had been weighed in advance, the weight was measured again, and the weight of only the stool was recorded. 500 μL of the sample diluent was added and allowed to stand on ice for 15 minutes. The stool was suspended using a homogenizer pestle. At that time, the pestle was washed with 500 μL of the sample diluent, and the total volume was 1,000 μL. Next, the supernatant was collected by centrifugation at 12,000 g at 4 ° C. for 5 minutes. The obtained supernatant was stored at −80 ° C. until measurement.

（便中Ｓ１００Ａ９濃度の測定 ＥＬＩＳＡ）
ラットＳ１００Ａ９測定ＥＬＩＳＡキットを用いて便中のＳ１００Ａ９量を測定した。凍結していた便から抽出した上清を解凍し、適宜検体希釈液で希釈した。スタンダードと希釈したサンプルを抗体固相プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温２時間静置した。洗浄液を用いてウェルを洗い、酵素標識抗体を１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温１時間静置した。再び洗浄操作を行い、発色液を１００μｌ／ｗｅｌｌでアプライし、室温２０分間反応後、反応停止液を１００μｌ／ｗｅｌｌを加えた。操作終了後、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプルの濃度計算は、ＰＬＡＴＥ ｍａｎａｇｅｒ Ｖ４を用いた。 (Measurement ELISA of S100A9 concentration in stool )
The amount of S100A9 in stool was measured using a rat S100A9 measurement ELISA kit. The supernatant extracted from the frozen stool was thawed and appropriately diluted with a sample diluent. Standards and diluted samples were applied to an antibody solid phase plate at 100 μl / well and allowed to stand at room temperature for 2 hours. The wells were washed with a washing solution, enzyme-labeled antibody was applied at 100 μl / well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The washing operation was performed again, and the coloring solution was applied at 100 μl / well. After reacting for 20 minutes at room temperature, 100 μl / well of the reaction stop solution was added. After completion of the operation, absorbance at 450 nm was measured using a plate reader. For the concentration calculation of the sample, PLATE manager V4 was used.

（便中Ｓ１００Ａ９量の計算）
便１ｍｇに含まれるＳ１００Ａ９量（ｎｇ）を求めるために、以下の計算式を用いた。有意差検定は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １２を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。 (Calculation of S100A9 amount in flight)
In order to obtain the amount (ng) of S100A9 contained in 1 mg of stool, the following calculation formula was used. The significance test was conducted using Mann-Whitney Rank Sum Test using SigmaPlot 12, and it was determined that there was a significant difference when the P value was less than 0.05.

（便中カルプロテクチン濃度の測定 ＥＬＩＳＡ）
便中のカルプロテクチンは、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ社のＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを使用し、添付文書に従い測定した。有意差検定は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １２を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。 (Measurement of fecal calprotectin concentration ELISA)
Calprotectin in the stool was measured according to the package insert using S100A8 / S100A9 ELISA Kit of Immunodiagnostic AG. The significance test was conducted using Mann-Whitney Rank Sum Test using SigmaPlot 12, and it was determined that there was a significant difference when the P value was less than 0.05.

（ラットの解剖、腸の比重計算）
ラットを麻酔下で開腹後、腹部大静脈から全採血した。直腸から結腸まで摘出し、直腸側から走行方向に切り進めた。０．９（ｗ／ｖ）％食塩水で腸表面の内容物を洗い落とし、ペーパータオルの上に３回置き水分を軽く除いた後、腸の長さを測定後、湿重量を測定した。腸の比重は、湿重量（ｇ）を摘出した大腸の長さ（ｃｍ）で割り、計算した。有意差検定は、ＳｔａｔＶｉｅｗ ｖｅｒ５．０を用いてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施し、Ｐ値が０．０５より小さいとき、有意差があるとした。 (Anatomy of rat, calculation of specific gravity of intestine)
Rats were laparotomized under anesthesia and then whole blood was collected from the abdominal vena cava. It was removed from the rectum to the colon and cut from the rectum side in the direction of travel. The contents of the intestinal surface were washed off with 0.9 (w / v)% saline, placed on a paper towel three times to lightly remove moisture, and after measuring the length of the intestine, the wet weight was measured. The specific gravity of the intestine was calculated by dividing the wet weight (g) by the length of the excised large intestine (cm). The significance test was performed using Mann-Whitney Rank Sum Test using StatView ver5.0, and when the P value was less than 0.05, it was determined that there was a significant difference.

（２）結果
（体重変化）
ＳｔａｔＶｉｅｗ ｖｅｒ５．０のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを実施したところ、図１に示すように、Ｄａｙ０〜Ｄａｙ１０まで有意差は認められなかった。 (2) Results (weight change)
When Mann-Whitney Rank Sum Test of StatView ver5.0 was performed, no significant difference was observed from Day 0 to Day 10, as shown in FIG.

（ＤＡＩスコア）
毎朝便を回収する際に便状を観察し、ＤＡＩスコア評価を実施した。Ｄ群、Ｃ群のスコアの平均値を図２に示す。ＤＡＩスコアは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ ＴｅｓｔでＤａｙ６からＤ群がＣ群より有意に高値を示した。Ｄ群とＣ群で有意な差が現われたのはＤａｙ６であった。また、Ｄ群において便に血が付着し始めた日（血便）の平均はＤａｙ６であった。 (DAI score)
When collecting the stool every morning, the feces were observed and the DAI score was evaluated. The average score of the D group and the C group is shown in FIG. The DAI score was significantly higher in Day 6 to Group D than in Group C at Mann-Whitney Rank Sum Test. Day 6 showed a significant difference between Group D and Group C. Moreover, the average of the day (blood stool) on which blood began to adhere to stool in Group D was Day 6.

（腸の比重結果）
図３に示すように、ＤＳＳ投与群の平均値は０．１４ｇ／ｃｍ、コントロール群の平均値は０．０９５ｇ／ｃｍでありＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔを行った結果有意な差が認められた。 (Intestinal specific gravity result)
As shown in FIG. 3, the average value of the DSS administration group was 0.14 g / cm, the average value of the control group was 0.095 g / cm, and a significant difference was observed as a result of the Mann-Whitney Rank Sum Test. .

（便中Ｓ１００Ａ９量の測定）
便１ｍｇ中のＳ１００Ａ９量を算出した結果を図４に示す。図４から明らかなように、Ｄ群は経時的に便中のＳ１００Ａ９量が増加しており、Ｃ群と比較してＤａｙ２において有意に高値を示した。 (Measurement of the amount of S100A9 in the stool)
The result of calculating the amount of S100A9 in 1 mg of stool is shown in FIG. As is apparent from FIG. 4, the amount of S100A9 in the stool increased with time in Group D, and the value was significantly higher in Day 2 than in Group C.

（便中カルプロテクチン濃度の測定）
図５に示すように、Ｄ群の便中カルプロテクチン濃度において経時的な変化を確認することはできなかった。もっとも炎症が酷くなっていると考えられたＤａｙ１０の便においても、便中カルプロテクチン濃度はＤａｙ５の濃度と差が認められなかった。また、コントロール群においては、大部分のサンプルにおいて検出限界以下となった。

(Measurement of fecal calprotectin concentration)
As shown in FIG. 5, it was not possible to confirm a change with time in the fecal calprotectin concentration in the D group. Even in Day 10 stool, which was considered to have the most severe inflammation, the fecal calprotectin concentration was not different from the Day 5 concentration. In the control group, most of the samples were below the detection limit.

（３）考察
（実験的潰瘍性大腸炎モデルラットの評価）
Ｄ群は、ＤＳＳを投与した結果ＤＡＩスコアが経時的に上昇することが確認でき、Ｄａｙ６でＣ群との間に有意な差が認められた。また、Ｄ群の血便初確認日の平均は、Ｄａｙ６であった。また、解剖結果よりＤ群においては腸の比重が大きくなっていることから肥厚を確認できた。以上の結果より、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）モデルとして適切であると判断した。 (3) Discussion (Evaluation of experimental ulcerative colitis model rats)
In Group D, it was confirmed that the DAI score increased with time as a result of administration of DSS, and a significant difference was observed between Day 6 and Group C. In addition, the average blood stool initial confirmation date of Group D was Day 6. Further, from the anatomical results, thickening could be confirmed because the specific gravity of the intestine was increased in group D. From the above result, it was judged that it was suitable as an ulcerative colitis (UC) model.

（Ｓ１００Ａ９測定キットの評価）
Ｓ１００Ａ９測定キットを使用した結果では、Ｄ群はＤａｙ２においてＣ群よりも有意な高値を示した。これは、ＤＡＩスコアで有意差が現われたＤａｙ６よりも早期に腸の炎症を捉えていることを示す。一方、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ社のカルプロテクチンキットを使用した結果では経時的変化、かつ炎症を反映した値が得られなかった。 (Evaluation of S100A9 measurement kit)
As a result of using the S100A9 measurement kit, Group D showed a significantly higher value in Day 2 than Group C. This indicates that intestinal inflammation was captured earlier than Day 6 where a significant difference appeared in the DAI score. On the other hand, as a result of using the Calprotectin kit of Immunodiagnostic AG, a value reflecting changes with time and inflammation was not obtained.

以上の結果を踏まえ、糞便中のＳ１００Ａ９を測定することで、潰瘍性大腸炎モデルラットにおける経時的な変化を捉えることができ、病態をスコア化したＤＡＩスコアよりも早期に腸の状態を反映し、炎症性腸疾患のバイオマーカーとして有用であることを確認できた。また、ＵＣモデルラットの評価においては、便中のカルプロテクチンよりＳ１００Ａ９を測定する方が、より病態を反映していることも明らかとなった。 Based on the above results, by measuring S100A9 in stool, changes over time in ulcerative colitis model rats can be captured, reflecting the state of the intestines earlier than the DAI score scored for the disease state. It was confirmed that it is useful as a biomarker for inflammatory bowel disease. Moreover, in the evaluation of UC model rats, it was also clarified that the measurement of S100A9 from calprotectin in stool reflects the pathological condition more.

Claims (1)

ＤＡＩスコアで判定されない早期段階の炎症性腸疾患を検出するため、糞便試料中のＳ１００Ａ９を測定することを特徴とする、Ｓ１００Ａ９のバイオマーカーとしての使用。Use of S100A9 as a biomarker, characterized by measuring S100A9 in a stool sample to detect early stage inflammatory bowel disease that is not determined by a DAI score.

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