JP6189019B2 - 選定分子の導入方法、選定分子導入装置および細胞融合方法 - Google Patents
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Description
前記選定分子を含む液体である導入液と、前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、
荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、前記導入液、および、前記標的細胞または標的組織に接触させるステップとを含み、
前記導入液が収容される容器の開口部側に、前記導入液から離間してキャピラリー電極が設けられ、該キャピラリー電極は集合体前駆体の噴出口を有しており、
前記集合体前駆体は、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記導入液に向けて噴出され、前記液体に接触するときにはその少なくとも一部が前記集合体となっていることを特徴とする、選定分子の導入方法である。
前記キャピラリー電極と前記対向電極との間に所定の電圧が印加されることが好ましい。
前記集合体前駆体の噴出量が100sccm以下であることが好ましい。
前記導入液を収容するための容器と、
該容器の開口部側に、前記液体から離間して設けられた集合体前駆体の噴出口を有するキャピラリー電極と、
前記集合体前駆体を、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記液体に向けて噴出するための噴出機構と、
前記集合体前駆体が前記液体に接触するときには前記集合体を含むものとなるようにするための電圧印加機構とを備える、選定分子導入装置にも関する。
前記標的細胞を含む液体に、前記集合体を接触させるステップを含み、
前記標的細胞を含む液体が収容される容器の開口部側に、前記液体から離間してキャピラリー電極が設けられ、該キャピラリー電極は集合体前駆体の噴出口を有しており、
前記集合体前駆体は、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記液体に向けて噴出され、前記液体に接触するときにはその少なくとも一部が前記集合体となっていることを特徴とする、細胞融合方法に関する。
本発明の標的細胞または標的組織への選定分子の導入方法は、
前記選定分子を含む液体である導入液と、前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、
荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を、前記導入液、および、前記標的細胞または標的組織に接触させるステップとを含み、
前記導入液が収容される容器の開口部側に、前記導入液から離間してキャピラリー電極が設けられ、該キャピラリー電極は集合体前駆体の噴出口を有しており、
前記集合体前駆体は、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記導入液に向けて噴出され、前記液体に接触するときにはその少なくとも一部が前記集合体となっていることを特徴とする。
本発明の選定分子の導入方法において用いる標的細胞とは、選定分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特に特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒトを含む動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞などが挙げられる。これらの標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
一方、本発明に用いられる標的組織とは、選定分子を導入する標的となる組織のことを示し、特に特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、移植に用いられるドナーからの臓器、再生医療の方法を用いて再構成された皮膚や歯根などの組織、カルス培養で構築された植物に分化前の組織、などが挙げられる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
本発明の標的細胞または標的組織内への選定分子の導入方法において用いる選定分子とは、標的細胞または標的組織に導入するために選定した分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではない。このような選定分子の具体例としては、DNA、RNAなどのポリヌクレオチドまたはその誘導体、シグナル伝達蛋白質や転写調節因子などの蛋白質やペプチドとその誘導体などの高分子化合物があげられる。
「集合体前駆体」とは、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体を生成させるための前駆体であり、例えば、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガス、キセノンガスからなる群より選ばれる1種以上を含むガスが挙げられる。ガスの組み合わせはこれらに限定されるものではなく、また、固体や液体を前駆体に含んでもよい。
まず、標的細胞を前培養する(ステップS101)。標的細胞の前培養(ステップS101)の方法は、特に限定されないが、プレートなどの細胞培養容器上で培養した培養接着細胞や、培養液中に懸濁した状態で標的細胞を培養する方法が挙げられる。前培養に用いる培地は、標的細胞を培養することのできる組成の培地であれば特に限定されるものではないが、たとえば寒天培地をはじめとする固体培地や試験管やフラスコ内の液体培地などが挙げられる。
標的細胞を前培養後(ステップS101)、培養液を完全に除去し、標的細胞上に選定分子を含む微量の水溶液(導入液)を添加する(ステップS102)。なお、標的細胞の代わりに標的組織を用いる場合は、例えば、切除してきた組織切片あるいは直接組織上に選定分子を含む微量の水溶液を添加する。
次に、この導入液の所望の位置に、集合体前駆体を噴出することができるようにキャピラリー電極の位置を調節した後、集合体前駆体をキャピラリー電極の噴出口から導入液および標的細胞に向けて噴出する(ステップS103)。
次に、キャピラリー電虚と底面電極との間に電圧を印加することにより(ステップS104)、集合体前駆体(例えば、Heガス)から集合体が生成する(ステップS105)。この集合体(荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体)が導入液および標的細胞に接触し、作用を及ぼすことにより、選定分子が標的細胞に導入される。
また、選定分子が細胞に導入される場合には、選定分子が導入された標的細胞を後培養する(ステップS106)。
本発明の選定分子導入装置は、上記の選定分子導入方法に用いられるものであって、
前記導入液を収容するための容器と、
該容器の開口部側に、前記液体から離間して設けられた集合体前駆体の噴出口を有するキャピラリー電極と、
前記集合体前駆体を、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記液体に向けて噴出するための噴出機構と、
前記集合体前駆体が前記液体に接触するときには前記集合体を含むものとなるようにするための電圧印加機構とを備える。
本発明の標的細胞の細胞融合方法は、
前記標的細胞を含む液体に、前記集合体を接触させるステップを含み、
前記標的細胞を含む液体が収容される容器の開口部側に、前記液体から離間してキャピラリー電極が設けられ、該キャピラリー電極は集合体前駆体の噴出口を有しており、
前記集合体前駆体は、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記液体に向けて噴出され、前記液体に接触するときにはその少なくとも一部が前記集合体となっていることを特徴とする。
本実施例では、動物樹立細胞株(COS7細胞)への選定分子の導入を実施した。本実施例では、図1に示すような構成の選定分子導入装置を使用した。本実施例では、集合体前駆体としてHeガスを使用し、Duty1%、周波数20kHz、パルス周波数25pps、流量1〜10sccm、照射時間4秒、距離3mmの条件で導入を行った。
(1) 40倍写真内で細胞数が100〜200になるようにインキュベータで培養。
(2) GFP溶液を細胞に滴下。
(3) 試料、capillaryを顕微鏡にセット。
(4) XYZステージで位置および高さを調節。
(5) 照射条件を入力(パール工業株式会社製電源)。
(6) 金属線中央付近に集合体を照射。
(7) 照射後培養液を加え、インキュベータで24時間培養。
(8) 顕微鏡で観察及び記録。
(8−1)実験前後の細胞を目視で数え、生存率を求めた(40倍写真内)。
(8−2)40倍写真内の蛍光発現細胞を目視で数え、導入効率を求めた。
上記実施例と同様の導入方法において、照射時間による導入効率の違いを比較する試験を実施した。なお、Duty1%、周波数20kHz、パルス周波数25pps、2次電圧21.5kVpp、流量1〜10sccm、距離1mmに設定し、照射時間を2〜10秒の間で変化させた。試験結果を図4に示す。図4から分かるように、照射時間5秒での導入効率が77.5%と最も高くなった。
実施例1と同様の導入方法(キャピラリー電極を用いた場合)と、従来のアーク型電極を用いた導入方法との導入率を比較する試験を行った。集合体前駆体としてHeを使用し、Duty1%、周波数20kHz、パルス周波数25pps、流量1〜10sccm、距離1mmに設定した。2次電圧は16〜25kVppの範囲内で、照射時間は2〜10秒の間で変化させた。
Claims (6)
- 標的細胞または標的組織(ヒトの生体内の細胞、および、ヒトの個体を除く)への選定分子の導入方法であって、
前記選定分子を含む液体である導入液と、前記標的細胞または標的組織とを接触させるステップと、
荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体(液滴を除く)を、前記導入液、および、前記標的細胞または標的組織に接触させるステップとを含み、
前記導入液が収容される容器の開口部側に、前記導入液から離間してキャピラリー電極が設けられ、該キャピラリー電極は集合体前駆体の噴出口を有しており、
前記集合体前駆体は、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガスおよびキセノンガスからなる群より選ばれる1種以上を含み、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記導入液に向けて噴出され、前記液体に接触するときにはその少なくとも一部が前記集合体となっており、
前記容器の前記キャピラリー電極とは反対側に対向電極が設けられており、
前記キャピラリー電極と前記対向電極との間に所定の電圧が印加される、選定分子の導入方法。 - 前記キャピラリー電極の外径が1mm以下である、請求項1に記載の導入方法。
- 前記集合体前駆体の噴出量が100sccm以下である、請求項1または2に記載の導入方法。
- 前記キャピラリー電極を複数同時に使用し、キャピラリー電極ごとの前記集合体前駆体の噴出量が100sccm以下である、請求項1〜3のいずれかに記載の導入方法。
- 請求項1に記載の導入方法に用いられる選定分子導入装置であって、
前記導入液を収容するための容器と、
該容器の開口部側に、前記液体から離間して設けられた集合体前駆体の噴出口を有するキャピラリー電極と、
前記集合体前駆体を、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記液体に向けて噴出するための噴出機構と、
前記集合体前駆体が前記液体に接触するときには前記集合体を含むものとなるようにするための電圧印加機構とを備え、
前記電圧印加機構は、前記キャピラリー電極と、前記容器の前記キャピラリー電極とは反対側に設けられた対向電極と、前記キャピラリー電極および前記対向電極に接続された直流または交流の電源とを備える、選定分子導入装置。 - 標的細胞(ヒトの生体内の細胞、および、ヒトの個体を除く)の細胞融合方法であって、
前記標的細胞を含む液体に、荷電粒子、励起原子および励起分子からなる群から選択される一種または複数種からなる集合体(液滴を除く)を接触させるステップを含み、
前記標的細胞を含む液体が収容される容器の開口部側に、前記液体から離間してキャピラリー電極が設けられ、該キャピラリー電極は集合体前駆体の噴出口を有しており、
前記集合体前駆体は、空気、窒素ガス、酸素ガス、二酸化炭素ガス、ヘリウムガス、ネオンガス、アルゴンガス、クリプトンガスおよびキセノンガスからなる群より選ばれる1種以上を含み、前記キャピラリー電極の前記噴出口から前記液体に向けて噴出され、前記液体に接触するときにはその少なくとも一部が前記集合体となっており、
前記容器の前記キャピラリー電極とは反対側に対向電極が設けられており、
前記キャピラリー電極と前記対向電極との間に所定の電圧が印加される、細胞融合方法。
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