JP6187939B2 - Method for testing malignancy of cancer, pluripotent tumorigenic cells and method for preparing the same - Google Patents

Method for testing malignancy of cancer, pluripotent tumorigenic cells and method for preparing the same Download PDF

Info

Publication number
JP6187939B2
JP6187939B2 JP2014503838A JP2014503838A JP6187939B2 JP 6187939 B2 JP6187939 B2 JP 6187939B2 JP 2014503838 A JP2014503838 A JP 2014503838A JP 2014503838 A JP2014503838 A JP 2014503838A JP 6187939 B2 JP6187939 B2 JP 6187939B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
ssea
cell
cancer
cell population
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2014503838A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2013133220A1 (en
Inventor
光 上野
光 上野
鈴木　光浩
光浩 鈴木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Occupational and Environmental Health Japan
Original Assignee
University of Occupational and Environmental Health Japan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Occupational and Environmental Health Japan filed Critical University of Occupational and Environmental Health Japan
Publication of JPWO2013133220A1 publication Critical patent/JPWO2013133220A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP6187939B2 publication Critical patent/JP6187939B2/en
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0695—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

本発明は、細胞集団の潜在的ながん悪性度を試験する方法に関する。本発明はまた、低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞、および該細胞を調製する方法等にも関する。   The present invention relates to a method for testing the potential cancer grade of a cell population. The present invention also relates to pluripotent tumorigenic cells generated from non-tumorigenic cells by reprogramming induced by hypoxia, methods for preparing the cells, and the like.

腫瘍内のがん細胞は同質ではなく実はきわめて多様で不均一である。この不均一性は現在のところ、（互いに排他的なものではないが）２つのモデルにより説明されている。クローン進化モデル（clonal evolution model；非特許文献１）においては、ほとんどのがん細胞が造腫瘍能を有しており、遺伝子の違い（遺伝子変異）およびエピジェネティックな機構の違いを通じて不均一性が生じるとする。一方、がん幹細胞（cancer stem cell；ＣＳＣ）仮説によれば、がん細胞は階層的に構成されており、ＣＳＣと呼ばれる小集団のみが、自己複製し、腫瘍を発生させ、そしてエピジェネティックな変化を通じて多様な表現型を持つ非造腫瘍細胞群を生じることができるとされる（非特許文献２〜４）。ＣＳＣの概念は魅力的ではあるが、現在の一方向的な階層モデルには多くの疑問や矛盾があり、特にＣＳＣの起源については未解明である（非特許文献３、５および６）。一つの仮説は、ＣＳＣは、それが存在する組織の幹細胞ががん化したものと考える。あるいは、ＣＳＣは、非ＣＳＣが幹細胞様の特性を獲得することにより生じる可能性がある。上皮間葉移行（Epithelial-to-Mesenchymal Transition；ＥＭＴ）は、そのようなプロセスが起こり得る一つの機構であると報告されている（非特許文献７）。いずれの場合も、現時点では造腫瘍細胞と非造腫瘍細胞とを識別できる特異的な細胞マーカーは確定していない（非特許文献８および９）。   The cancer cells in the tumor are not homogeneous and are actually very diverse and heterogeneous. This inhomogeneity is currently explained by two models (although not mutually exclusive). In the clonal evolution model (Non-Patent Document 1), most cancer cells have tumorigenicity, and heterogeneity is present through genetic differences (gene mutations) and epigenetic mechanisms. Suppose that it occurs. On the other hand, according to the cancer stem cell (CSC) hypothesis, cancer cells are organized hierarchically, and only a small group called CSCs are self-replicating, generating tumors, and epigenetic. It is said that non-tumorigenic cell groups having various phenotypes can be generated through changes (Non-Patent Documents 2 to 4). Although the concept of CSC is attractive, there are many questions and contradictions in the current one-way hierarchical model, and in particular, the origin of CSC is unclear (Non-Patent Documents 3, 5 and 6). One hypothesis is that the CSC considers the stem cells of the tissue in which it is present to be cancerous. Alternatively, CSCs can arise when non-CSCs acquire stem cell-like properties. Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) has been reported to be one mechanism by which such a process can occur (Non-patent Document 7). In any case, a specific cell marker that can distinguish between a tumorigenic cell and a non-tumorous cell has not been determined at present (Non-Patent Documents 8 and 9).

抗腫瘍血管新生療法は、がんの有効な治療法となることが期待されていた。しかし、臨床試験の結果は期待外れなものであり、がんは決して治らず、得られる生存利益はせいぜい数ヶ月であった。更に驚くべきことには、治療後に治療前よりもむしろ悪化している症例もあった（非特許文献１０〜１２）。腫瘍内の低酸素環境が、原因の少なくとも一つと考えられる（非特許文献１３）。腫瘍内の低酸素領域の存在は、未分化な表現型のがん細胞の存在と、そして臨床的には予後不良とよく相関していることが知られている（非特許文献１４および１５）。低酸素は、低酸素誘導因子（Hypoxia-Inducible Factors；ＨＩＦ）を活性化することにより、多くの遺伝子を活性化する（非特許文献１５および１６）。膠芽細胞腫、結腸直腸がんおよび非小細胞肺がんにおいて、ＨＩＦ２αをターゲティングすることにより自己複製が阻害され、造腫瘍能が低下した（非特許文献１７および１８）。   Anti-tumor angiogenesis therapy was expected to be an effective treatment for cancer. However, the results of the clinical trials were disappointing, the cancer never cured, and the resulting survival benefit was at most several months. Even more surprisingly, there were cases that worsened after treatment rather than before treatment (Non-Patent Documents 10-12). The hypoxic environment in the tumor is considered to be at least one of the causes (Non-patent Document 13). The presence of a hypoxic region within a tumor is known to correlate well with the presence of undifferentiated phenotype cancer cells and clinically with a poor prognosis (Non-patent Documents 14 and 15). . Hypoxia activates many genes by activating hypoxia-inducible factors (HIF) (Non-patent Documents 15 and 16). In glioblastoma, colorectal cancer, and non-small cell lung cancer, targeting HIF2α inhibited self-replication and reduced tumorigenicity (Non-patent Documents 17 and 18).

分化した細胞が幹様細胞に復帰することは不可能であると考えられていたが、京都大学の山中らにより、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４因子を遺伝子導入すれば、線維芽細胞において初期化が誘導され、多能性幹細胞（induced pluripotent SC；ｉＰＳＣ；人工多能性幹細胞）に転換できるという驚くべき発見がなされた（非特許文献１９）。この事実により、分化した非造腫瘍性がん細胞が造腫瘍能を持つＣＳＣに復帰する可能性があり得ることになる。実際に胚性幹（ＥＳ）細胞で発現している遺伝子や上記４つの初期化誘導遺伝子が、より未分化な腫瘍細胞においてより高頻度に発現していることが見出されている（非特許文献２０）。加えて：（ａ）低酸素条件下では遺伝的不安定性が促進される（非特許文献２１）；（ｂ）ＯＣＴ３／４はＨＩＦ−２αの直接の標的である（非特許文献２２）；（ｃ）様々な幹細胞が低酸素微小環境内に存在する（非特許文献２３）；および（ｄ）低酸素はｉＰＳＣの作製効率を向上させる（非特許文献２４）。しかしながら、低酸素により、分化した非造腫瘍細胞において初期化が誘導され、それにより多能性を有する造腫瘍細胞が生成されることを実証した報告は存在しない。   It was thought that differentiated cells could not return to stem-like cells. However, if Yamanaka et al. Of Kyoto University introduced 4 factors of Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, A surprising discovery has been made that reprogramming is induced in fibroblasts and can be converted to induced pluripotent SC (iPSC; induced pluripotent stem cells) (Non-patent Document 19). This fact may lead to the return of differentiated non-tumorigenic cancer cells to CSC with tumorigenic potential. It has been found that genes that are actually expressed in embryonic stem (ES) cells and the above four reprogramming induction genes are expressed more frequently in more undifferentiated tumor cells (non-patented). Reference 20). In addition: (a) genetic instability is promoted under hypoxic conditions (NPL 21); (b) OCT3 / 4 is a direct target of HIF-2α (NPL 22); c) Various stem cells are present in the hypoxic microenvironment (Non-patent Document 23); and (d) Hypoxia improves iPSC production efficiency (Non-patent Document 24). However, there are no reports demonstrating that hypoxia induces reprogramming in differentiated non-tumorigenic cells, thereby producing pluripotent tumorigenic cells.

Nowell, P.C. (1976). The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, 23-28.Nowell, P.C. (1976) .The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, 23-28. Clarke, M.F., Dick, J.E., Dirks, P.B., Eaves, C.J., Jamieson, C.H., Jones, D.L., Visvader, J., Weissman, I.L., and Wahl, G.M. (2006). Cancerstem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshopon cancer stem cells. Cancer Res 66, 9339-9344.Clarke, MF, Dick, JE, Dirks, PB, Eaves, CJ, Jamieson, CH, Jones, DL, Visvader, J., Weissman, IL, and Wahl, GM (2006) .Cancerstem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshopon cancer stem cells.Cancer Res 66, 9339-9344. Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E.R., and Morrison, S.J. (2009). Heterogeneity in cancer: cancer stem cells versus clonal evolution. Cell 138, 822-829.Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E.R., and Morrison, S.J. (2009). Heterogeneity in cancer: cancer stem cells versus clonal evolution.Cell 138, 822-829. Visvader, J.E., and Lindeman, G.J. (2008). Cancer stem cellsin solid tumours: accumulating evidence and unresolved questions. Nat Rev Cancer 8, 755-768.Visvader, J.E., and Lindeman, G.J. (2008) .Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence and unresolved questions. Nat Rev Cancer 8, 755-768. Gupta, P.B., Chaffer, C.L., and Weinberg, R.A. (2009). Cancer stem cells: mirage or reality? Nat Med 15, 1010-1012.Gupta, P.B., Chaffer, C.L., and Weinberg, R.A. (2009) .Cancer stem cells: mirage or reality? Nat Med 15, 1010-1012. Shipitsin, M., and Polyak, K. (2008). The cancer stem cell hypothesis: in search of definitions, markers, and relevance. Lab Invest 88, 459-463.Shipitsin, M., and Polyak, K. (2008) .The cancer stem cell hypothesis: in search of definitions, markers, and relevance.Lab Invest 88, 459-463. Mani, S.A., Guo, W., Liao, M.J., Eaton, E.N., Ayyanan, A., Zhou, A.Y., Brooks, M., Reinhard, F., Zhang, C.C., Shipitsin, M., et al. (2008). The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell 133, 704-715.Mani, SA, Guo, W., Liao, MJ, Eaton, EN, Ayyanan, A., Zhou, AY, Brooks, M., Reinhard, F., Zhang, CC, Shipitsin, M., et al. (2008 The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.Cell 133, 704-715. Clevers, H. (2011). The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nat Med 17, 313-319.Clevers, H. (2011) .The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nat Med 17, 313-319. Quintana, E., Shackleton, M., Foster, H.R., Fullen, D.R., Sabel, M.S., Johnson, T.M., and Morrison, S.J. (2010). Phenotypic heterogeneity among tumorigenic melanoma cells from patients that is reversible and not hierarchically organized. Cancer Cell 18, 510-523.Quintana, E., Shackleton, M., Foster, HR, Fullen, DR, Sabel, MS, Johnson, TM, and Morrison, SJ (2010). Phenotypic heterogeneity among tumorigenic melanoma cells from patients that is reversible and not hierarchically organized. Cancer Cell 18, 510-523. Bergers, G., and Hanahan, D. (2008). Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer 8, 592-603.Bergers, G., and Hanahan, D. (2008) .Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer 8, 592-603. Ebos, J.M., and Kerbel, R.S. (2011). Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat Rev Clin Oncol 8, 210-221.Ebos, J.M., and Kerbel, R.S. (2011). Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat Rev Clin Oncol 8, 210-221. Paez-Ribes, M., Allen, E., Hudock, J., Takeda, T., Okuyama, H., Vinals, F., Inoue, M., Bergers, G., Hanahan, D., and Casanovas, O. (2009).Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell 15, 220-231.Paez-Ribes, M., Allen, E., Hudock, J., Takeda, T., Okuyama, H., Vinals, F., Inoue, M., Bergers, G., Hanahan, D., and Casanovas, O. (2009) .Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis.Cancer Cell 15, 220-231. Loges, S., Mazzone, M., Hohensinner, P., and Carmeliet, P. (2009). Silencing or fueling metastasis with VEGF inhibitors: antiangiogenesis revisited. Cancer Cell 15, 167-170.Loges, S., Mazzone, M., Hohensinner, P., and Carmeliet, P. (2009). Silencing or fueling metastasis with VEGF inhibitors: antiangiogenesis revisited. Cancer Cell 15, 167-170. Gordan, J.D., and Simon, M.C. (2007). Hypoxia-inducible factors: central regulators of the tumor phenotype. Curr Opin Genet Dev 17, 71-77.Gordan, J.D., and Simon, M.C. (2007) .Hypoxia-inducible factors: central regulators of the tumor phenotype. Curr Opin Genet Dev 17, 71-77. Keith, B., and Simon, M.C. (2007). Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell 129, 465-472.Keith, B., and Simon, M.C. (2007). Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer.Cell 129, 465-472. Semenza, G.L. (2003). Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer 3, 721-732.Semenza, G.L. (2003) .Targeting HIF-1 for cancer therapy.Nat Rev Cancer 3, 721-732. Franovic, A., Holterman, C.E., Payette, J., and Lee, S. (2009). Human cancers converge at the HIF-2alpha oncogenic axis. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 21306-21311.Franovic, A., Holterman, C.E., Payette, J., and Lee, S. (2009). Human cancers converge at the HIF-2alpha oncogenic axis.Proc Natl Acad Sci U S A 106, 21306-21311. Li, Z., Bao, S., Wu, Q., Wang, H., Eyler, C., Sathornsumetee, S., Shi, Q., Cao, Y., Lathia, J., McLendon, R.E., et al. (2009). Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell 15, 501-513.Li, Z., Bao, S., Wu, Q., Wang, H., Eyler, C., Sathornsumetee, S., Shi, Q., Cao, Y., Lathia, J., McLendon, RE, et al. (2009). Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell 15, 501-513. Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676.Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006) .Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126, 663-676. Ben-Porath, I., Thomson, M.W., Carey, V.J., Ge, R., Bell, G.W., Regev, A., and Weinberg, R.A. (2008). An embryonic stem cell-like gene expression signature in poorly differentiated aggressive human tumors. Nat Genet 40, 499-507.Ben-Porath, I., Thomson, MW, Carey, VJ, Ge, R., Bell, GW, Regev, A., and Weinberg, RA (2008). An embryonic stem cell-like gene expression signature in poorly differentiated aggressive human tumors. Nat Genet 40, 499-507. Reynolds, T.Y., Rockwell, S., and Glazer, P.M. (1996). Genetic instability induced by the tumor microenvironment. Cancer Res 56, 5754-5757.Reynolds, T.Y., Rockwell, S., and Glazer, P.M. (1996). Genetic instability induced by the tumor microenvironment.Cancer Res 56, 5754-5757. Covello, K.L., Kehler, J., Yu, H., Gordan, J.D., Arsham, A.M., Hu, C.J., Labosky, P.A., Simon, M.C., and Keith, B. (2006). HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth. Genes Dev 20, 557-570.Covello, KL, Kehler, J., Yu, H., Gordan, JD, Arsham, AM, Hu, CJ, Labosky, PA, Simon, MC, and Keith, B. (2006). HIF-2alpha regulates Oct-4 : effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth.Genes Dev 20, 557-570. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., and Quinones-Hinojosa, A. (2010). Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell Stem Cell 7, 150-161.Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., and Quinones-Hinojosa, A. (2010). Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche.Cell Stem Cell 7, 150-161. Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2009). Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 5, 237-241.Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2009). Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 5, 237-241.

本発明は、当該技術分野における上述の現状を鑑み為されたものであり、造腫瘍能を有するがん細胞（すなわち、がん幹細胞）が生じる機構を突き止め、以って細胞集団の潜在的ながん悪性度を試験し得る方法を提供することをその目的とする。本発明はまた、低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞、および該細胞を調製するための方法等を提供することも目的とする。   The present invention has been made in view of the above-described present state of the art, and has determined the mechanism by which cancer cells having tumorigenic potential (that is, cancer stem cells) are generated, and thus the potential of the cell population. The object is to provide a method by which cancer malignancy can be tested. Another object of the present invention is to provide a pluripotent tumorigenic cell generated from a non-tumor cell by reprogramming induced by a low oxygen load, a method for preparing the cell, and the like.

本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意検討した。
本発明者等は先ず、当該技術分野において得られている知見に基づいて、低酸素により非がん幹細胞において初期化が誘導され、それにより多分化能（multipotencyまたはpluripotency）を有する造腫瘍細胞が生じるという仮説を立てた。係る仮説を実証すべく、本発明者等は、いくつかのヒト肺がん細胞株を用いて、造腫瘍細胞と非造腫瘍細胞とを特異的に識別し得る細胞表面マーカーを同定することを試み、ＥＳ細胞特異的な細胞表面マーカーとして知られるＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３がそのようなマーカーとして利用し得ることを見出した。そして、上記の細胞株およびマーカーを用いて、更なる研究を行ったところ、低酸素負荷により、分化した非造腫瘍細胞において容易に初期化が誘導されてがん幹細胞を生じること、そして生じたがん幹細胞は、不均一な表現型の非造腫瘍性の子孫を生じ得るのみならず、３胚葉すべてに及ぶ広範な分化能力を示すことを初めて明確に実証した。本発明者等は更に、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１もＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３と同様に、多能性を有する造腫瘍細胞と非造腫瘍細胞とを特異的に識別し得る細胞表面マーカーとして利用し得ることを見出した。そして、これらのマーカーの発現が、被験者におけるがんの転移および生存率と有意に相関することを本発明者等は見出した。本発明者等は、これらの知見に基づき更に研究を進め、本発明を完成するに至った。The present inventors have intensively studied to solve the above problems.
First, based on the knowledge obtained in the technical field, the present inventors induced reprogramming in non-cancer stem cells by hypoxia, whereby tumorigenic cells having multipotency or pluripotency were produced. I hypothesized that it would occur. In order to prove such a hypothesis, the present inventors tried to identify a cell surface marker capable of specifically discriminating tumorigenic cells and non-tumorigenic cells using several human lung cancer cell lines, It has been found that SSEA-1 and SSEA-3, known as ES cell specific cell surface markers, can be used as such markers. Further research was conducted using the above cell lines and markers, and as a result of hypoxia, reprogramming was easily induced in differentiated non-tumorigenic cells, resulting in cancer stem cells. For the first time, it has been clearly demonstrated that cancer stem cells not only can generate non-tumorigenic offspring with a heterogeneous phenotype, but also show a broad differentiation potential across all three germ layers. The present inventors further identified TRA-1-60 and TRA-1-81 specifically, like SSEA-1 and SSEA-3, between pluripotent tumorigenic cells and non-tumorigenic cells. It was found that it can be used as a cell surface marker to be obtained. The present inventors have found that expression of these markers is significantly correlated with cancer metastasis and survival rate in subjects. Based on these findings, the present inventors have advanced further research and have completed the present invention.

本発明はすなわち、以下を提供する。
［１］細胞集団の潜在的ながん悪性度を試験する方法であって、
（１）試験の対象とする細胞集団を用意する工程、
（３）前記の細胞集団におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定する工程、および
（４）前記の１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である場合、前記の試験の対象とする細胞集団は潜在的ながんの悪性度が高いと決定する工程
を含む、方法。
［２］前記測定工程の以前に、
（２）前記細胞集団を低酸素負荷に供する工程
を更に含み、前記測定工程において前記１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定される細胞集団が、前記低酸素負荷工程後の細胞集団である、上記［１］に記載の方法。
［３］前記１以上のマーカータンパク質が、ＳＳＥＡ−１、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される少なくとも１つを含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記１以上のマーカータンパク質がＳＳＥＡ−１を含む、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］前記測定工程において、更に、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１以外の１以上の幼若化マーカー遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルも測定される、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］前記幼若化マーカー遺伝子が、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＲＥＸ１およびＥＲＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子である、上記［５］に記載の方法。
［７］前記低酸素負荷工程において、１０％未満の酸素レベルにおける１０時間以上の低酸素負荷が少なくとも１回行われる、上記［２］〜［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］前記の発現レベルの測定が、フローサイトメトリー法または免疫組織化学法を用いて行われる、上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］被験者におけるがんの悪性度を試験するために、被験者においてがんの存在が疑われる組織から採取された試料に対して行われる、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］前記被験者が前記がんの術後の患者である、上記［９］に記載の方法。
［１１］前記の試験の対象とする細胞集団が、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現の全てが陰性であることを指標にして選択されたものである、上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］前記がんが肺がん、消化器がん、乳がん、皮膚がんまたは脳腫瘍である、上記［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞を調製する方法であって、
（１）非造腫瘍細胞を含む細胞集団を用意する工程、
（２）前記の用意された細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現の全てが陰性であることを指標にして非造腫瘍細胞を選択する工程、
（３）前記の選択された細胞集団を低酸素負荷に供する工程、および
（４）低酸素負荷工程後の細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であることを指標にして、多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程
を含む、方法。
［１４］前記の非造腫瘍細胞を選択する工程および前記の多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程において、前記１以上のマーカータンパク質が、ＳＳＥＡ−１、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される少なくとも１つを含む、上記［１３］に記載の方法。
［１５］前記の非造腫瘍細胞を選択する工程および前記の多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程において、前記１以上のマーカータンパク質がＳＳＥＡ−１を含む、上記［１３］または［１４］に記載の方法。
［１６］前記の選択された多能性を有する造腫瘍細胞において、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１以外の１以上の幼若化マーカー遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が陽性であることを確認することを更に含む、上記［１３］〜［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７］前記幼若化マーカー遺伝子が、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＲＥＸ１およびＥＲＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子である、上記［１６］に記載の方法。
［１８］前記低酸素負荷工程において、１０％未満の酸素レベルにおける１０時間以上の低酸素負荷が少なくとも１回行われる、上記［１３］〜［１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１９］前記の非造腫瘍細胞を選択する工程および前記の多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程において、細胞の選択が、フローサイトメトリー法を用いて行われる、上記［１３］〜［１８］のいずれか１つに記載の方法。
［２０］低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞。That is, the present invention provides the following.
[1] A method for testing the potential cancer malignancy of a cell population,
(1) preparing a cell population to be tested;
(3) measuring the expression level of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 in the cell population, and (4 ) If any of the expression of the one or more marker proteins is positive, the method comprises determining that the cell population to be tested is of high potential malignancy.
[2] Before the measurement step,
(2) The method further comprises the step of subjecting the cell population to a hypoxic load, wherein the cell population in which the expression level of the one or more marker proteins is measured in the measuring step is a cell population after the hypoxic load step. The method according to [1] above.
[3] The above [1] or [2], wherein the one or more marker proteins include at least one selected from the group consisting of SSEA-1, TRA-1-60, and TRA-1-81. Method.
[4] The method according to any one of [1] to [3] above, wherein the one or more marker proteins comprise SSEA-1.
[5] In the measurement step, mRNA or protein expression level of one or more blast marker genes other than SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is also measured. The method according to any one of [1] to [4] above.
[6] The above-mentioned rejuvenation marker gene is one or more genes selected from the group consisting of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, REX1, and ERAS. the method of.
[7] The method according to any one of [2] to [6], wherein in the low oxygen load step, low oxygen load for 10 hours or more at an oxygen level of less than 10% is performed at least once.
[8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the expression level is measured using a flow cytometry method or an immunohistochemistry method.
[9] Any one of the above-mentioned [1] to [8], which is performed on a sample collected from a tissue suspected of having cancer in the subject in order to test the malignancy of the cancer in the subject. The method described in 1.
[10] The method according to [9] above, wherein the subject is a patient after surgery for the cancer.
[11] The expression of at least one marker protein selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 The method according to any one of [1] to [10] above, which is selected using negative as an index.
[12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the cancer is lung cancer, digestive organ cancer, breast cancer, skin cancer, or brain tumor.
[13] A method for preparing pluripotent tumorigenic cells generated from non-tumorigenic cells by reprogramming induced by hypoxia, comprising
(1) preparing a cell population containing non-tumorigenic cells;
(2) The expression of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is negative from the prepared cell population. Selecting non-tumorigenic cells by using as an index,
(3) subjecting the selected cell population to hypoxic load, and (4) from the cell population after the hypoxic load step, SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1- 81. A method comprising a step of selecting a pluripotent tumorigenic cell using as an index one of the expression of one or more marker proteins selected from the group consisting of 81.
[14] In the step of selecting the non-tumor cell and the step of selecting the pluripotent tumor cell, the one or more marker proteins are SSEA-1, TRA-1-60 and TRA- The method according to [13] above, comprising at least one selected from the group consisting of 1-81.
[15] The above [13] or [14], wherein in the step of selecting the non-tumor cell and the step of selecting the pluripotent tumor cell, the one or more marker proteins include SSEA-1. ] Method.
[16] In the selected pluripotent tumorigenic cell, mRNA of one or more blast marker genes other than SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81, or The method according to any one of [13] to [15], further comprising confirming that protein expression is positive.
[17] The above-mentioned [16], wherein the blastogenesis marker gene is one or more genes selected from the group consisting of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, REX1, and ERAS. the method of.
[18] The method according to any one of [13] to [17], wherein in the low oxygen load step, low oxygen load for 10 hours or more at an oxygen level of less than 10% is performed at least once.
[19] The above [13] to [13], wherein in the step of selecting the non-tumor cell and the step of selecting the pluripotent tumor cell, the cell is selected using a flow cytometry method. [18] The method according to any one of [18].
[20] A pluripotent tumorigenic cell generated from a non-tumor cell by reprogramming induced by a hypoxic load.

本発明の試験方法によれば、がん組織等の臨床標本においてマーカータンパク質の発現を検出するだけで、簡便かつ高信頼度に多能性を有する造腫瘍細胞の存在を検出し、以ってがん悪性度を試験できる。あるいは、マーカータンパク質の発現の検出に先立ち、がん組織等の試料中の細胞集団を低酸素負荷に供することにより、多能性を有する造腫瘍細胞への非造腫瘍細胞のリプログラミングを促進し、それにより試験の感度を更に向上させることができる。本発明の試験方法を適用することにより、生体内に存在する造腫瘍細胞または低酸素状態に起因して造腫瘍細胞に転換される見込みが高い非造腫瘍細胞をがんが初発または再発する前に検出して、悪性度を予測することが可能である。あるいは、がんの発症を初期のステージで検出してがん患者の早期治療に導くことも可能である。また、がん患者に対する治療効果を造腫瘍細胞または低酸素状態に起因して造腫瘍細胞に転換される見込みが高い非造腫瘍細胞の存在を指標にして評価することも可能である。更に、本発明により提供される試験方法、新規細胞および該細胞の調製方法は、例えば、非造腫瘍細胞から多能性を有する造腫瘍細胞へのリプログラミングの機構に関する研究や、悪性がんの有効な治療法の確立等のために有用であるばかりか、ｉＰＳ細胞作製においてがん化を防ぐ作製方法の開発にも資する。   According to the test method of the present invention, simply detecting the expression of a marker protein in a clinical specimen such as a cancer tissue, the presence of tumorigenic cells having pluripotency can be detected easily and reliably. Can test for cancer malignancy. Alternatively, prior to detection of marker protein expression, the cell population in a sample of cancer tissue or the like is subjected to a hypoxic load to promote reprogramming of non-tumoral cells to pluripotent tumorigenic cells. Thereby, the sensitivity of the test can be further improved. By applying the test method of the present invention, tumor-forming cells existing in a living body or non-tumor-forming cells that are likely to be converted to tumor-forming cells due to hypoxia before cancer is first developed or recurred. It is possible to detect malignancy and predict the malignancy. Alternatively, it is possible to detect the onset of cancer at an early stage and lead to early treatment of cancer patients. It is also possible to evaluate the therapeutic effect on cancer patients using as an index the presence of tumorigenic cells or non-tumorigenic cells that are likely to be converted to tumorigenic cells due to hypoxia. Furthermore, the test method, novel cell and method for preparing the cell provided by the present invention include, for example, research on the mechanism of reprogramming from non-tumor cells to pluripotent tumor cells, malignant cancer It is useful not only for the establishment of effective treatment methods, but also for the development of production methods for preventing canceration in iPS cell production.

図１は、がん細胞における幹細胞性マーカーの低酸素誘導による活性化を示す。様々ながん細胞および線維芽細胞（TIG3）（A, B）またはN417細胞（A-H）をnormoxia（Nまたは白色カラムで示す）または5% O2（Hyまたは黒色カラムで示す）のいずれかの条件下で12時間インキュベートした後、幹細胞性マーカーの遺伝子活性化およびタンパク質発現のためのRT-PCR（A, C）、定量的リアルタイムPCR（qPCR）（B）、FACS解析（D）または免疫組織化学（E）に供した。hypoxia条件下での様々な時点におけるN417の遺伝子活性化をRT-PCRにより調べた（C）。アルカリホスファターゼ活性（F）、スフィア形成（G）、およびヘキスト33342（5μg/mL）を用いたサイドポピュレーション（SP）アッセイ（H）も行なった。qPCR解析（B）では、normoxia条件下でのTIG3発現レベルを1.0（平均±標準偏差、n=3）とし、それに対してmRNAレベルを正規化した。スフィアアッセイ（G）のために、hypoxiaまたはnormoxiaに暴露した細胞を2週間インキュベートした後、スフィア（直径>75μm）の個数を数えた（平均±標準偏差、n=3、＊ p < 0.01）。SP（H）はベラパミル（50μM）の存在下（+Ver）または非存在下（-）で測定した。ベラパミル感受性の低強度の画分をSPと定義した。FIG. 1 shows activation of stem cell markers in cancer cells by hypoxia induction. Various cancer cells and fibroblasts (TIG3) (A, B) or N417 cells (AH), either normoxia (shown with N or white column) or 5% O 2 (shown with Hy or black column) RT-PCR (A, C), quantitative real-time PCR (qPCR) (B), FACS analysis (D) or immune tissue for gene activation and protein expression of stem cell markers after 12 hours incubation under conditions Subject to chemistry (E). N417 gene activation at various time points under hypoxia conditions was examined by RT-PCR (C). A side population (SP) assay (H) with alkaline phosphatase activity (F), sphere formation (G), and Hoechst 33342 (5 μg / mL) was also performed. In qPCR analysis (B), the TIG3 expression level under normoxia conditions was 1.0 (mean ± standard deviation, n = 3), and the mRNA level was normalized. For sphere assay (G), cells exposed to hypoxia or normoxia were incubated for 2 weeks before counting the number of spheres (diameter> 75 μm) (mean ± standard deviation, n = 3, * p <0.01). SP (H) was measured in the presence (+ Ver) or absence (−) of verapamil (50 μM). The low-intensity fraction sensitive to verapamil was defined as SP. 図２は、「分化した」非造腫瘍細胞が低酸素下においてがん幹細胞に復帰することを示す。（A）様々な選別されたN417細胞画分（注射あたり1.0 x 104細胞、各群についてn=4）をNOD-SCIDマウスに皮下注射し、腫瘍形成を観察した。（B）非選別細胞、SSEA-1+細胞またはSSEA-3+細胞のいずれかにより形成された異種移植腫瘍から分離されたがん細胞をFACSによりSSEA-1およびSSEA-3発現について解析した。各項目について左から、非選別細胞、SSEA-1+細胞、SSEA-3+細胞の場合を示す。（C）N417細胞を5% O2下で12時間インキュベートした後、SSEA-1、SSEA-3、OCT3/4、SOX2およびNANOGの発現をFACSにより解析した。SSEA陽性または陰性画分をそれぞれ青色または赤色で示している。（D）4つのES細胞特異的表面抗原のいずれも発現しない細胞画分を選別した。選別していない細胞および選別した細胞のプロファイルを示す（a, b）。normoxia条件下で12時間インキュベートした後、選別した細胞をhypoxia（5% O2）（d）またはnormoxia（c）のいずれかに12時間暴露した後、ES細胞特異的抗原に対する解析を再度行った。SSEA-1、SSEA-3およびTRA1-81陽性細胞の実際の数を示す（e）。様々な条件における解析した全細胞に対する生細胞の割合を示す（f）。3回の独立した実験を行い、同様の結果を得た。FIG. 2 shows that “differentiated” non-tumorigenic cells revert to cancer stem cells under hypoxia. (A) Various sorted N417 cell fractions (1.0 × 10 4 cells per injection, n = 4 for each group) were injected subcutaneously into NOD-SCID mice and tumor formation was observed. (B) Cancer cells isolated from xenograft tumors formed by either unsorted cells, SSEA-1 + cells or SSEA-3 + cells were analyzed for SSEA-1 and SSEA-3 expression by FACS. From the left for each item, the case of non-sorted cells, SSEA-1 + cells, and SSEA-3 + cells are shown. (C) After incubating N417 cells under 5% O 2 for 12 hours, the expression of SSEA-1, SSEA-3, OCT3 / 4, SOX2 and NANOG was analyzed by FACS. SSEA positive or negative fractions are shown in blue or red, respectively. (D) A cell fraction that did not express any of the four ES cell-specific surface antigens was selected. Profiles of unsorted and sorted cells are shown (a, b). After incubation for 12 hours under normoxia conditions, the sorted cells were exposed to either hypoxia (5% O 2 ) (d) or normoxia (c) for 12 hours and then analyzed for ES cell-specific antigens again. . The actual number of SSEA-1, SSEA-3 and TRA1-81 positive cells is shown (e). The ratio of living cells to total cells analyzed in various conditions is shown (f). Three independent experiments were performed with similar results. 図３は、低酸素負荷により生じたがん幹細胞が多能性であることを示す。（A）様々な解析を含む実験プロトコールを示す。（B）胚様体形成の間の様々な時点における低酸素暴露した細胞および低酸素暴露していない細胞、ならびに何らかの処理をする前の細胞（Cとして示す）を幹細胞性遺伝子および様々なマーカー遺伝子についてのRT-PCRに供した。（C）低酸素暴露した細胞（Hy）および低酸素暴露していない細胞（N）をVEGF-A + PDGF-AAの存在下（それぞれ10ng/mL）または非存在下でEB形成後に2日間インキュベートした後、ヒトVEGFR2およびヒトCD31の発現についてのFACS解析に供した。血管新生増殖因子についての1日目におけるRT-PCR解析も示している。（D）低酸素暴露した細胞（Hy）および低酸素暴露していない細胞（N）を分化促進培地中でEB形成後に12日間インキュベートした後、βIIIチューブリン（a, d）、αFP（b, e）またはαSMA（c, f）の免疫染色に供した。核の染色にはDAPIを用いた。スケールバーは100μmを示す。（E, F）SSEA-1+、SSEA-3+または非選別のN417-GFP細胞をNOD-SCIDマウスの睾丸に注射した。腫瘍が形成された。（E）そのような腫瘍のパラフィン切片に対して、βIIIチューブリン（a）、αFP（b）およびαSMA（c）の発現解析を行った。（F）組織化された組織も腫瘍内に見られた。HE染色により、CK14（d）を発現する真皮（a）、ならびに腺組織（b）および筋肉（c）が明らかにされた。そのような組織中の細胞は抗GFP抗体で染色され（e, f）、これらの組織はがん細胞に由来することを示した。スケールバーは500μmを示す。FIG. 3 shows that cancer stem cells generated by hypoxic load are pluripotent. (A) Shows experimental protocol including various analyses. (B) Stem cell genes and various marker genes for cells exposed to hypoxia and not exposed to hypoxia at various time points during embryoid body formation, and cells prior to any treatment (shown as C) Was subjected to RT-PCR. (C) Cells exposed to hypoxia (Hy) and cells not exposed to hypoxia (N) in the presence of VEGF-A + PDGF-AA (each 10 ng / mL) or in the absence of EB formation for 2 days After that, it was subjected to FACS analysis for expression of human VEGFR2 and human CD31. The RT-PCR analysis at day 1 for angiogenic growth factors is also shown. (D) Cells that were exposed to hypoxia (Hy) and cells that were not exposed to hypoxia (N) were incubated in differentiation-promoting medium for 12 days after EB formation, and then βIII tubulin (a, d), αFP (b, e) or subjected to immunostaining for αSMA (c, f). DAPI was used for nuclear staining. The scale bar indicates 100 μm. (E, F) SSEA-1 +, SSEA-3 + or unselected N417-GFP cells were injected into the testes of NOD-SCID mice. A tumor was formed. (E) Expression analysis of βIII tubulin (a), αFP (b) and αSMA (c) was performed on paraffin sections of such tumors. (F) Organized tissue was also seen within the tumor. HE staining revealed dermis (a) expressing CK14 (d), as well as glandular tissue (b) and muscle (c). Cells in such tissues were stained with anti-GFP antibodies (e, f), indicating that these tissues were derived from cancer cells. The scale bar indicates 500 μm. 図４は、異種移植腫瘍が、機能的な内皮細胞および血管平滑筋細胞にその後分化し、がん細胞の低酸素誘導性のリプログラミングを示すことを示す。（A, B）N417-GFPによる異種移植腫瘍を、個々の図に示されるように、CA9（番号なしおよび1）、SOX2（2）、OCT3/4（3）、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）（4）、hCD31（5）、HIF1α（6）、HIF2α（7）、NANOG（8）、SSEA-1（9）またはKi67（10）に対する抗体を用いた免疫組織化学に供した。CA9染色の状態に従い、腫瘍領域を4群に分類した。a：高度低酸素領域、b：低酸素領域、c：中間領域、d：非低酸素領域。（C）hCD31、mCD31またはhαSMAに対する抗体を用いて、N417-GFP細胞、H358細胞、H460細胞またはH157細胞のいずれかにより形成された異種移植腫瘍を解析した。いくつかの切片では、ヒトおよびマウス両方のαSMAを認識する抗体（αSMAとして示す）を用いた。N417-GFP異種移植腫瘍からのいくつかの切片は、GFPに対する抗体およびhCD31またはhαSMAのいずれかに対する抗体で二重染色された。この結果は、hCD31またはhαSMA発現細胞が実際にがん細胞に由来することを示す。H460およびH157異種移植腫瘍では、mCD31+ ECおよびαSMA+細胞は組織化された構成ではない。スケールバーは100μmを示す。FIG. 4 shows that xenograft tumors subsequently differentiated into functional endothelial cells and vascular smooth muscle cells, indicating hypoxia-induced reprogramming of cancer cells. (A, B) N417-GFP xenograft tumors, as shown in the individual figures, CA9 (unnumbered and 1), SOX2 (2), OCT3 / 4 (3), von Willebrand factor (vWF ) (4), hCD31 (5), HIF1α (6), HIF2α (7), NANOG (8), SSEA-1 (9) or Ki67 (10) were used for immunohistochemistry. According to the state of CA9 staining, the tumor area was classified into 4 groups. a: highly hypoxic region, b: hypoxic region, c: intermediate region, d: non-hypoxic region. (C) Using an antibody against hCD31, mCD31 or hαSMA, a xenograft tumor formed by any of N417-GFP cells, H358 cells, H460 cells or H157 cells was analyzed. In some sections, antibodies that recognize both human and mouse αSMA (shown as αSMA) were used. Several sections from N417-GFP xenograft tumors were double stained with antibodies against GFP and antibodies against either hCD31 or hαSMA. This result indicates that hCD31 or hαSMA-expressing cells are actually derived from cancer cells. In H460 and H157 xenograft tumors, mCD31 + EC and αSMA + cells are not organized components. The scale bar indicates 100 μm. 図５は、SSEA-1陽性細胞およびSSEA-3陽性細胞が、TRA-1-60およびTRA-1-81陽性であることを示す。（A）N417細胞を5% O2下で12時間インキュベートした後、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、OCT3/4、SOX2、NANOG、TRA-1-60およびTRA-1-81の発現をFACSにより解析した。SSEA陽性または陰性画分をそれぞれ青色または赤色で示している。（B）SSEA-1陽性細胞を免疫不全マウスの皮下に移植し、12週間後に、成長した異種移植腫瘍（xenograft）を免疫染色法により解析した。（C）ヒト肺がん標本切片を免疫染色法により解析した。FIG. 5 shows that SSEA-1 positive cells and SSEA-3 positive cells are TRA-1-60 and TRA-1-81 positive. (A) After incubating N417 cells under 5% O 2 for 12 hours, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, OCT3 / 4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 and TRA-1-81 Expression was analyzed by FACS. SSEA positive or negative fractions are shown in blue or red, respectively. (B) SSEA-1-positive cells were transplanted subcutaneously into immunodeficient mice, and 12 weeks later, the grown xenograft tumor (xenograft) was analyzed by immunostaining. (C) Human lung cancer specimen sections were analyzed by immunostaining.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

（定義）
本発明において、がんは任意の種類のがんであってよく、固形がん［例えば、消化器がん（例えば、胃がん、食道がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、胆道がん、膵臓がん等）、泌尿器または生殖器のがん（例えば、腎がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、腎盂および尿管がん、胆嚢がん、胆管がん、精巣がん、陰茎がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、卵管がん等）、脳・神経系のがん（例えば、脳腫瘍（グリオブラストーマ等）、脊髄腫瘍等）、頭頸部がん（例えば、喉頭がん、口腔がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がん等）、呼吸器系のがん（例えば、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、転移性肺がんを含む）、気管支がん等）、乳がん、皮膚がん（例えば、悪性黒色腫等）、骨のがん（例えば、骨肉腫等）、筋肉のがん（例えば、横紋筋肉腫等）等］、血液がん［例えば、骨髄腫、白血病、リンパ腫等］等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明が対象とするがんとしては、低酸素状態の発生と関連するがんが特に好ましいものとして挙げられ、従って任意の固形がんが特に好ましい。固形がんとして具体的には、肺がん、消化器がん、乳がん、皮膚がんおよび脳腫瘍が好ましく、肺がん、消化器がんおよび乳がんがより好ましく、肺がんおよび消化器がんが更により好ましく、肺がんが特に好ましい。(Definition)
In the present invention, cancer may be any kind of cancer, and solid cancer [eg, gastrointestinal cancer (eg, stomach cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer, anus Cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, etc.), urological or genital cancer (eg, renal cancer, renal cell cancer, bladder cancer, prostate cancer, renal pelvis and ureteral cancer, gallbladder) Cancer, bile duct cancer, testicular cancer, penile cancer, uterine cancer, endometrial cancer, uterine sarcoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, etc. ), Brain / nervous cancer (eg, brain tumor (glioblastoma, etc.), spinal cord tumor, etc.), head and neck cancer (eg, laryngeal cancer, oral cancer, salivary gland cancer, sinus cancer, thyroid gland) Cancer), respiratory cancer (eg, lung cancer (including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, metastatic lung cancer), bronchial cancer, etc.), breast cancer, Skin cancer (eg, malignant melanoma), bone cancer (eg, osteosarcoma, etc.), muscle cancer (eg, rhabdomyosarcoma, etc.)], blood cancer [eg, myeloma, leukemia, etc. , Lymphoma, etc.], but is not limited thereto. As cancer targeted by the present invention, cancer associated with the occurrence of hypoxia is particularly preferred, and therefore any solid cancer is particularly preferred. Specifically, solid cancer is preferably lung cancer, digestive organ cancer, breast cancer, skin cancer and brain tumor, more preferably lung cancer, digestive organ cancer and breast cancer, even more preferably lung cancer and digestive organ cancer, lung cancer Is particularly preferred.

本発明で用いられる細胞集団の由来または本発明の対象は、通常、哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、これらに限定されない。   The origin of the cell population used in the present invention or the subject of the present invention is usually a mammal. Examples of mammals include, for example, laboratory animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, pets such as dogs and cats, humans, Examples include, but are not limited to, primates such as monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees.

本発明において発現レベルの検出の対象とされるStage-Specific Embryonic Antigen（ステージ特異的胎児抗原；ＳＳＥＡ）−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１（以下、これらを総称して「本発明のマーカータンパク質」または単に「本発明のマーカー」と呼称することもある）は、特定のモノクローナル抗体により特異的に認識される表面糖鎖抗原として見出されたものであり、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞において発現することが知られている。本発明のマーカーは、具体的には例えば、Myung, J.S. et al., Cell Stem Cell 4, 440-452 (2009)（ＳＳＥＡ−１）、Muramatsu T. et al., Trends Glycosci Glyc 21, 197-206 (2009)（ＳＳＥＡ−３）、William, M.S. et al., Stem Cells 25, 720-730（2007)（ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１）等に記載されている。   Stage-Specific Embryonic Antigen (Stage Specific Fetal Antigen; SSEA) -1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 (hereinafter collectively referred to as expression-level detection targets in the present invention) The “marker protein of the present invention” or simply “the marker of the present invention”) is a surface sugar antigen specifically recognized by a specific monoclonal antibody, It is known to be expressed in pluripotent stem cells such as ES cells. Specific examples of the marker of the present invention include Myung, JS et al., Cell Stem Cell 4, 440-452 (2009) (SSEA-1), Muramatsu T. et al., Trends Glycosci Glyc 21, 197- 206 (2009) (SSEA-3), William, MS et al., Stem Cells 25, 720-730 (2007) (TRA-1-60 and TRA-1-81) and the like.

本明細書において、「造腫瘍細胞」とは、良性または悪性の、進行性増殖を示す腫瘍の形成を惹起できる細胞をいう。細胞集団の造腫瘍能を評価する方法として、例えば核型分析、軟寒天コロニー形成試験、免疫不全動物における腫瘍形成能試験等が知られており、当業者はこれらの試験のいずれかまたは組み合わせにより、所与の細胞集団が造腫瘍能を有するのか否かを評価することができる。
造腫瘍細胞は、一般にがん幹細胞として知られる細胞であり得る。がん幹細胞とは、継続的に増殖可能な腫瘍の再構築に必要ながん細胞であって、自己複製能、およびがん細胞集団内の多様な表現型を有するがん細胞のすべてを産生できる分化能を有する細胞と定義される（例えば、上記非特許文献２を参照）。自己複製能とは、***した２つの娘細胞のどちらか１つ、あるいは、両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同等の能力および分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。As used herein, “tumor-forming cells” refers to cells that can induce the formation of benign or malignant tumors that exhibit progressive growth. As a method for evaluating the tumorigenicity of a cell population, for example, karyotype analysis, soft agar colony formation test, tumorigenicity test in immunodeficient animals, etc. are known, and those skilled in the art can use any or a combination of these tests. It can be assessed whether a given cell population has tumorigenic potential.
Tumor-forming cells can be cells commonly known as cancer stem cells. Cancer stem cells are cancer cells that are needed to reconstruct a continuously proliferative tumor and produce all cancer cells that have the ability to self-renew and have diverse phenotypes within the cancer cell population. It is defined as a cell having a differentiation potential that can be produced (for example, see Non-Patent Document 2 above). Self-renewal ability refers to the ability of one or both of two divided daughter cells to produce cells that have the same ability and degree of differentiation as the parent cell in the cell lineage. .

本明細書において、「非造腫瘍細胞」とは上記の造腫瘍細胞ではない細胞をいう。非造腫瘍細胞は造腫瘍能を有しないがん細胞であってもよいし、あるいはがん細胞でなくてもよい。   In the present specification, the “non-tumor cell” refers to a cell that is not the above-described tumor cell. Non-tumor-forming cells may be cancer cells that do not have tumorigenicity, or may not be cancer cells.

本明細書において「多能性（pluripotency）」とは、分化多能性のことであって、内胚葉、中胚葉および外胚葉の３つの胚葉のいずれの系列の細胞にも分化できる、細胞が有する能力のことをいう。細胞が多能性を有するか否かを評価する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、細胞を浮遊培養して胚様体を形成させ、更に胚様体を種々の分化培地中で培養した後、組織特異的なマーカー発現の有無を検出することにより三胚葉全てに分化できたかどうかを確認する方法、細胞を免疫不全マウスに移植することによりテラトーマが形成されることを確認する方法、等が挙げられる。   As used herein, “pluripotency” refers to pluripotency, which is a cell that can differentiate into cells of any of the three germ layers of endoderm, mesoderm, and ectoderm. The ability to have. Methods for evaluating whether a cell has pluripotency are known in the art. For example, cells are suspended in culture to form embryoid bodies, and embryoid bodies are cultured in various differentiation media. Then, a method for confirming whether or not it has been differentiated into all three germ layers by detecting the presence or absence of tissue-specific marker expression, a method for confirming that teratoma is formed by transplanting cells into immunodeficient mice, Etc.

本明細書において「リプログラミング」または「初期化」とは、分化した細胞が、エピジェネティックな変化を受けて、上に定義した意味での多能性を有する細胞に変容されることをいう。   As used herein, “reprogramming” or “initialization” means that a differentiated cell undergoes an epigenetic change and is transformed into a cell having pluripotency as defined above.

本明細書において「幼若化マーカー遺伝子」とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞において特異的な発現を示す遺伝子をいう（例えば、実験医学増刊Vol.26, No.5, p.29-34を参照）。ここでいう「特異的な発現」とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞においては高いｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現が見られるが、当該細胞が分化すると急速に発現が低下することを意味する。本発明において用いることができる幼若化マーカー遺伝子としては、以下に限定されないが、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＲＥＸ１、ＥＲＡＳ等が挙げられ、好ましいものとしてはＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣおよびＮＡＮＯＧである。
本明細書において「幼若化マーカータンパク質」とは、上で定義される「幼若化マーカー遺伝子」のタンパク質を意味する。In the present specification, the “juvenile marker gene” refers to a gene exhibiting specific expression in pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells (for example, Experimental Medicine Vol. 26, No. 5, p. See .29-34). As used herein, “specific expression” means that high mRNA and / or protein expression is observed in pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, but the expression rapidly decreases when the cells differentiate. means. Examples of the rejuvenation marker gene that can be used in the present invention include, but are not limited to, OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, REX1, ERAS, and the like. Are OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC and NANOG.
As used herein, “juvenile marker protein” means a protein of the “juvenile marker gene” defined above.

本明細書において、マーカータンパク質の発現レベルの測定は、後述するように、通常、当該マーカータンパク質に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカーの発現が「陽性」であるとは、該マーカーが細胞表面上（または細胞内）に発現しており、当該マーカーに対する抗体による特異的結合が検出できることをいう。マーカーの発現が「陰性」であるとは、該マーカーが細胞表面上（または細胞内）に実質的に発現しておらず、当該マーカーに対する抗体による特異的結合が検出できないことをいう。なお、当業者に明らかなように、発現レベルは定性的なものであってもよいし、定量的なものであってもよい。   In the present specification, the measurement of the expression level of a marker protein is usually performed by flow cytometry analysis using a specific antibody or the like for the marker protein, as will be described later. “Positive” expression of the marker means that the marker is expressed on the cell surface (or in the cell) and specific binding by an antibody to the marker can be detected. “Negative” expression of a marker means that the marker is not substantially expressed on the cell surface (or in the cell) and specific binding by an antibody to the marker cannot be detected. As will be apparent to those skilled in the art, the expression level may be qualitative or quantitative.

（試験方法）
本発明は、細胞集団の潜在的ながん悪性度を試験する方法（以下、本発明の試験方法ともいう）を提供する。本発明の試験方法は、
（１）試験の対象とする細胞集団を用意する工程、
（３）前記の細胞集団におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定する工程、および
（４）前記の１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である場合、前記の試験の対象とする細胞集団は潜在的ながんの悪性度が高いと決定する工程
を含む。(Test method)
The present invention provides a method for testing the potential cancer malignancy of a cell population (hereinafter also referred to as the test method of the present invention). The test method of the present invention comprises:
(1) preparing a cell population to be tested;
(3) measuring the expression level of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 in the cell population, and (4 ) If any of the expression of the one or more marker proteins is positive, the step comprises determining that the cell population to be tested is of high potential malignancy.

本発明の試験方法において、細胞集団の潜在的ながん悪性度とは、当該細胞集団が生体内（例えば、上記哺乳動物の生体内）の特定の部位（例えば、当該細胞集団が由来する組織）に存在する時に生じることが見込まれるがんの悪性度をいう。ここで、がんの悪性度は、当業者により、生体内における多能性を有する造腫瘍細胞またはがん幹細胞の存在の有無と関連付けられ得る任意のがん悪性度を意味し、例えば、予後不良の度合い（例えば、生存率、治療抵抗性、および悪化または再発の可能性、等）、ならびに／あるいは転移、増殖および／または浸潤の可能性および／または早さと関連するものであり得る。
本発明者等は、本発明のマーカータンパク質が、多能性を有する造腫瘍性細胞と非造腫瘍性細胞とを特異的に識別できる細胞表面マーカー（またはがん幹細胞マーカー）として使用できることを見出した。そのため、がん組織等の臨床標本において本発明のマーカータンパク質の発現を検出するだけで、簡便かつ高信頼度にがん悪性度を試験できる。
本発明者等は更に、分化した非造腫瘍細胞（従って、本発明のマーカータンパク質を発現しない）が、低酸素負荷によりリプログラミングされて、本発明のマーカータンパク質を発現する、多能性を有する造腫瘍細胞になり得ることも見出した。従って、ある細胞集団が、後述するようにして、低酸素負荷に供され、更に本発明のマーカータンパク質の発現レベルを測定された場合に、本発明のマーカータンパク質を発現すれば、元々の細胞集団内には、多能性を有する造腫瘍細胞が存在していたか、あるいは、低酸素状態に起因して多能性を有する造腫瘍細胞にリプログラミングされる蓋然性が高い分化した非造腫瘍細胞が存在していたと理解される。このようにして、本発明の試験方法により細胞集団の潜在的ながん悪性度を決定することができる。特に、がん組織中でのがん幹細胞の頻度が低いために検出が容易でない場合であっても、細胞集団を低酸素負荷に供することにより、多能性を有する造腫瘍細胞にリプログラミングされる蓋然性が高い非造腫瘍細胞は容易にリプログラミングされて本発明のマーカータンパク質を発現するようになる。従って、本発明の試験方法において、細胞集団を低酸素負荷に供する工程を含めることにより、試験の感度を更に高めることができる。In the test method of the present invention, the potential cancer malignancy of a cell population refers to a specific site (for example, a tissue from which the cell population is derived) in which the cell population is in vivo (for example, in the mammal in vivo). ) Is the malignancy of cancer that is expected to occur when present. Here, malignancy of cancer means any cancer malignancy that can be associated with the presence or absence of pluripotent tumorigenic cells or cancer stem cells in vivo by a person skilled in the art, for example, prognosis It may be related to the degree of failure (eg, survival rate, resistance to treatment, and the possibility of worsening or recurrence, etc.) and / or the likelihood and / or speed of metastasis, growth and / or invasion.
The present inventors have found that the marker protein of the present invention can be used as a cell surface marker (or cancer stem cell marker) that can specifically distinguish pluripotent tumorigenic cells and non-tumorigenic cells. It was. Therefore, the cancer malignancy can be tested easily and with high reliability simply by detecting the expression of the marker protein of the present invention in a clinical specimen such as cancer tissue.
We further have pluripotency where differentiated non-tumorigenic cells (and thus do not express the marker protein of the invention) are reprogrammed by hypoxia to express the marker protein of the invention. It has also been found that it can be a tumorigenic cell. Therefore, when a certain cell population is subjected to a hypoxic load as described later and the expression level of the marker protein of the present invention is further measured, if the marker protein of the present invention is expressed, the original cell population Among them, there are pluripotent tumorigenic cells or differentiated non-tumorigenic cells that have a high probability of being reprogrammed to pluripotent tumorigenic cells due to hypoxia. It is understood that it existed. In this way, the potential cancer malignancy of the cell population can be determined by the test method of the present invention. In particular, even if detection is not easy due to the low frequency of cancer stem cells in cancer tissue, the cell population is reprogrammed to pluripotent tumorigenic cells by subjecting it to hypoxic load. Non-tumor cells with a high probability of being easily reprogrammed to express the marker protein of the present invention. Therefore, in the test method of the present invention, the sensitivity of the test can be further increased by including a step of subjecting the cell population to a low oxygen load.

（１）試験の対象とする細胞集団を用意する工程 (1) Step of preparing a cell population to be tested

本発明の試験の対象とする細胞集団は、本発明による潜在的ながん悪性度の試験を所望される任意の細胞集団であってよい。該細胞集団は、被験者から採取された生体試料、あるいは当業者により研究、開発または医療等の目的のために用いられるあらゆる細胞集団、等であり得る。該細胞集団は良性または悪性（すなわち、がん細胞）の腫瘍細胞を含むものであってもよいし、あるいは含まないものであってもよい。   The cell population that is the subject of the test of the present invention may be any cell population for which a potential cancer malignancy test according to the present invention is desired. The cell population may be a biological sample collected from a subject, or any cell population used by a person skilled in the art for research, development or medical purposes. The cell population may or may not contain benign or malignant (ie, cancer cells) tumor cells.

被験者から採取された生体試料を用いることにより、該被験者における潜在的ながん悪性度を試験することができる。用いられる生体試料は、通常、被験者においてがんの存在が疑われる組織から採取された試料である。がんの存在が疑われる組織としては、例えば、上記したがん種の原発または転移が疑われる組織、腫瘍細胞またはがん細胞を含むことが既知である組織、治療（例えば、外科的治療、抗がん剤治療、放射線療法、免疫療法、温熱療法等）されているがんの組織、等が挙げられる。また、がんの術後（外科的切除・摘出後）の再発と、がん幹細胞の残存とが関連する可能性が示唆されており、従って、がんの術後の患者から採取された術後組織の試料を用いることも好ましい。
本発明の試験方法に供される生体試料は、被験者から採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、試験の目的、すなわち試験の対象とするがん種に応じて、血液、骨髄液、リンパ液等の体液試料や、肺、各種消化器、***、皮膚、脳組織等の種々の臓器の生検試料等を利用できる。体液試料または生検試料等からの、培養に供する細胞集団の調製は、当業者に慣用されている手順に従えばよい。By using a biological sample collected from a subject, the potential cancer malignancy in the subject can be tested. The biological sample used is usually a sample collected from a tissue suspected of having cancer in a subject. Examples of tissues suspected of having cancer include, for example, tissues suspected of primary or metastasis of the above-mentioned cancer types, tissues known to contain tumor cells or cancer cells, treatment (for example, surgical treatment, Anticancer drug treatment, radiation therapy, immunotherapy, hyperthermia, etc.). In addition, it has been suggested that recurrence after cancer surgery (after surgical resection / extraction) may be related to the survival of cancer stem cells. Therefore, surgery taken from patients after cancer surgery It is also preferable to use a post-tissue sample.
The biological sample used in the test method of the present invention is not particularly limited as long as it can be collected from a subject, and depending on the purpose of the test, that is, the cancer type to be tested, blood, bone marrow Body fluid samples such as fluid and lymph fluid, biopsy samples of various organs such as lung, various digestive organs, breast, skin, and brain tissue can be used. Preparation of a cell population to be cultured from a body fluid sample or a biopsy sample may be performed according to a procedure commonly used by those skilled in the art.

前記の研究、開発または医療等の目的のために用いられる細胞集団についても、本発明による潜在的ながん悪性度の試験を所望される任意の細胞集団であってよい。
例えば、非造腫瘍細胞から多能性を有する造腫瘍細胞へのリプログラミングの機構に関する研究のために、所与の細胞集団を用いることができる。それに限定されるものではないが、特にこのような研究目的での本発明の試験方法の適用において、試験の対象とする細胞集団として、予め非造腫瘍細胞のみを選別したものを用いることもまた好ましい。この場合、例えば、１つ以上の本発明のマーカータンパク質に対する特異的抗体、好ましくは全ての本発明のマーカータンパク質に対する特異的抗体を用いたフローサイトメトリー法において、用いられた全ての特異的抗体に対する結合が陰性であることを指標として該選別を行うことができる。
また、種々のがんの有効な治療法の確立のために、インビトロにおいて特定の処置（例えば、抗がん剤の候補物質の投与）を施されたがん細胞集団と、該処置を施されていない同一の由来のがん細胞集団とを本発明の試験方法に供し、両細胞集団の潜在的ながん悪性度を比較することにより、当該処置（例えば、候補物質）の有効性を評価することができる。これにより、特に、多能性を有する造腫瘍細胞（もしくはがん幹細胞）および／または該細胞にリプログラミングされる蓋然性が高い非造腫瘍細胞を標的化した有効な抗がん療法の開発に資することができる。
あるいは、医療目的での移植用細胞集団を本発明の試験方法に供することにより、該細胞集団の安全性を評価することもできる。例えば、作製したｉＰＳ細胞を本発明の試験方法に供することで該ｉＰＳ細胞のがん化の可能性を評価し得るため、がん化を防ぐｉＰＳ細胞の作製方法の開発に資することができる。The cell population used for the aforementioned research, development or medical purposes may also be any cell population for which testing for potential cancer malignancy according to the present invention is desired.
For example, a given cell population can be used for studies on the mechanism of reprogramming from non-tumorigenic cells to pluripotent tumorigenic cells. Although not limited thereto, it is also possible to use a cell population that has been previously selected only for non-tumorigenic cells as the cell population to be tested, particularly in the application of the test method of the present invention for such research purposes. preferable. In this case, for example, against all the specific antibodies used in the flow cytometry method using specific antibodies against one or more marker proteins of the present invention, preferably specific antibodies against all the marker proteins of the present invention. The selection can be performed using negative binding as an index.
In addition, in order to establish an effective therapy for various cancers, a cancer cell population that has been subjected to a specific treatment in vitro (for example, administration of a candidate substance for an anticancer drug), and the treatment, Evaluate the effectiveness of the treatment (for example, a candidate substance) by subjecting it to a cancer cell population of the same origin that has not been subjected to the test method of the present invention and comparing the potential cancer malignancy of both cell populations. can do. This contributes particularly to the development of effective anticancer therapies targeting pluripotent tumorigenic cells (or cancer stem cells) and / or non-tumorigenic cells that are likely to be reprogrammed into the cells. be able to.
Alternatively, the safety of the cell population can also be evaluated by subjecting the cell population for transplantation for medical purposes to the test method of the present invention. For example, since the possibility of canceration of the iPS cell can be evaluated by subjecting the produced iPS cell to the test method of the present invention, it can contribute to the development of a method for producing iPS cell that prevents canceration.

（２）用意された細胞集団を低酸素負荷に供する工程 (2) A step of subjecting the prepared cell population to a low oxygen load

上記工程（１）において用意された細胞集団が本工程において低酸素雰囲気下で培養されてもよい。即ち、本工程の実施は任意である。本明細書において低酸素雰囲気とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が１８％未満の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は１５％未満（例、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満等）、１０％未満（例、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満等）、または５％未満（例、４％未満、３％未満、２％未満等）である。また、培養対象の細胞の生存を維持するため、雰囲気は、最小限度の酸素を含む必要がある。この観点から、雰囲気中の酸素濃度は、通常０．０１％以上であり、好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は０．１％以上（例、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上等）、０．５％以上（例、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上等）、または１．０％以上（例、１．１％以上、１．２％以上、１．３％以上、１．４％以上等）である。   The cell population prepared in the above step (1) may be cultured in a low oxygen atmosphere in this step. In other words, this step is optional. In this specification, the hypoxic atmosphere means that the oxygen concentration in the atmosphere when culturing cells is significantly lower than that in the air. Specifically, the oxygen concentration is lower than the oxygen concentration in the atmosphere generally used in normal cell culture. For example, the oxygen concentration in the atmosphere is less than 18%. Preferably, the oxygen concentration in the atmosphere is less than 15% (eg, less than 14%, less than 13%, less than 12%, less than 11%, etc.), less than 10% (eg, less than 9%, less than 8%, less than 7%) , Less than 6%, etc.), or less than 5% (eg, less than 4%, less than 3%, less than 2%, etc.). In addition, the atmosphere needs to contain a minimum amount of oxygen in order to maintain the survival of the cells to be cultured. From this viewpoint, the oxygen concentration in the atmosphere is usually 0.01% or more, and preferably the oxygen concentration in the atmosphere is 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.9% or more, etc.), or 1.0% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).

酸素濃度以外の雰囲気条件は、通常の細胞培養で一般的に使用される条件を適用することができる。例えば、雰囲気中のＣＯ２濃度は、通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％である。雰囲気中の湿度は、通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％である。Conditions generally used in normal cell culture can be applied to atmospheric conditions other than the oxygen concentration. For example, the CO 2 concentration in the atmosphere is usually in the range of about 1 to 10%, preferably about 5%. The humidity in the atmosphere is usually in the range of about 70 to 100%, preferably about 95 to 100%.

細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なＣＯ２インキュベーター内で細胞を培養する方法が容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なＣＯ２インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社等のメーカー製の低酸素培養用ＣＯ２インキュベーターを用いることができる）。あるいは、三菱ガス化学株式会社から市販されているアネロパック等の嫌気培養用製品を用いることも好適な例として挙げられる。このような製品を用いることにより、低酸素条件を迅速かつ簡単に実現できる。A method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is easy, and a preferable example is given. CO 2 incubators with adjustable oxygen concentrations are available from various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture manufactured by Thermo scientific, Ikemoto Riken, Toji Field, Waken Pharmaceutical, etc.) 2 incubators can be used). Alternatively, the use of an anaerobic culture product such as Anero Pack commercially available from Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. is also a suitable example. By using such a product, low oxygen conditions can be realized quickly and easily.

低酸素条件下で細胞を培養する期間は、本発明の試験方法を実現できる限り特に限定されない。該培養期間は、多能性を有する造腫瘍細胞にリプログラミングされる蓋然性が高い分化した非造腫瘍細胞において、低酸素負荷により当該リプログラミングを誘導し得る期間であるべきである。このような観点から、該培養期間としては、例えば、１時間以上、３時間以上、５時間以上、７時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１５時間以上、２０時間以上、１日以上または２日以上である。また、細胞生存にとっては不利な条件（すなわち、低酸素雰囲気条件）下での培養であることから、培養期間が長すぎると細胞が死滅してしまい、適切な試験ができない恐れがある。培養期間の上限は当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、５０日以下、４０日以下、３０日以下、２０日以下、１０日以下、７日以下、５日以下、４日以下、３日以下または２日以下である。低酸素条件下での好ましい培養期間は、試験の対象とする細胞集団、雰囲気中の酸素濃度等によっても変動し、当業者は用いる細胞集団、酸素濃度等に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。
また、本工程において低酸素雰囲気下での培養は少なくとも１回行われるが、低酸素負荷によりリプログラミングを誘導される非造腫瘍細胞を増加させるという観点から、上記期間の培養を複数回（例、２回、３回、４回、５回またはそれより多く）行うこともまた好ましい。The period during which cells are cultured under hypoxic conditions is not particularly limited as long as the test method of the present invention can be realized. The culture period should be a period in which the reprogramming can be induced by hypoxic load in differentiated non-tumor cells that have a high probability of being reprogrammed into pluripotent tumorigenic cells. From such a viewpoint, the culture period is, for example, 1 hour or more, 3 hours or more, 5 hours or more, 7 hours or more, 10 hours or more, 12 hours or more, 15 hours or more, 20 hours or more, 1 day or more, or 2 days or more. In addition, since the culture is performed under conditions unfavorable for cell survival (that is, under a low oxygen atmosphere condition), if the culture period is too long, the cells may die and an appropriate test may not be performed. The upper limit of the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art. For example, 50 days or less, 40 days or less, 30 days or less, 20 days or less, 10 days or less, 7 days or less, 5 days or less, 4 days or less Below, 3 days or less or 2 days or less. The preferred culture period under hypoxic conditions also varies depending on the cell population to be tested, the oxygen concentration in the atmosphere, etc., and those skilled in the art will appropriately adjust the culture period according to the cell population used, oxygen concentration, etc. be able to.
In this step, the culture in a low oxygen atmosphere is performed at least once. From the viewpoint of increasing the number of non-tumorigenic cells that are induced to reprogram by a low oxygen load, the culture in the above period is repeated a plurality of times (examples (2 times, 3 times, 4 times, 5 times or more) is also preferred.

また、特に非造腫瘍細胞のリプログラミングの機構に関する研究や治療法の開発等の目的の場合、用意された試験の対象とする細胞集団を低酸素負荷に供する前、低酸素負荷と同時に、各回の低酸素負荷の間に、または低酸素負荷後に、当該細胞集団を所定の処理（例えば、任意の試薬への暴露等）に付すこともできる。   In particular, in the case of research on the mechanism of reprogramming of non-tumorigenic cells and the development of therapeutic methods, the cell populations to be prepared are subjected to each test before the hypoxic load and before the hypoxic load. The cell population can be subjected to a predetermined treatment (for example, exposure to an arbitrary reagent, etc.) during or after the hypoxic load.

本発明の試験方法において用いられる培地の基礎培地としては、通常の細胞培養で一般的に使用されるものを用いることができ、培養対象の細胞集団の種類に応じて適宜選択することが可能である。基礎培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。   As the basal medium of the medium used in the test method of the present invention, those generally used in normal cell culture can be used, and can be appropriately selected according to the type of cell population to be cultured. is there. Examples of the basal medium include, but are not limited to, DMEM, EMEM, RPMI-1640, α-MEM, F-12, F-10, M-199, and the like. A mixture of the above basal media may also be used.

本発明の試験方法において用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば血清、成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、糖類（例えばグルコース等）、ステロイド（例えばβ−エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。   The culture medium used in the test method of the present invention can contain additives known per se. Examples of the additive include, but are not limited to, serum, growth factors (eg, insulin), iron sources (eg, transferrin), polyamines (eg, putrescine), minerals (eg, sodium selenate), organic acids (eg, Pyruvate, lactic acid, etc.), serum proteins (eg, albumin, etc.), amino acids (eg, L-glutamine, etc.), reducing agents (eg, 2-mercaptoethanol, etc.), vitamins (eg, ascorbic acid, d-biotin, etc.), sugars ( For example, glucose etc.), steroids (eg β-estradiol, progesterone etc.), antibiotics (eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.), buffering agents (eg HEPES etc.) and the like. Each of the additives is preferably contained within a concentration range known per se.

本発明の方法で用いられる培養温度は、培養対象の細胞集団の種類に応じて適宜設定することができる。培養温度は、通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃である。   The culture temperature used in the method of the present invention can be appropriately set according to the type of cell population to be cultured. The culture temperature is usually in the range of about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.

（３）前記の細胞集団におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定する工程 (3) measuring the expression level of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 in the cell population

本工程では、上記工程（１）で用意された細胞集団、または上記工程（２）の処理後の細胞集団における本発明のマーカータンパク質のうちの少なくとも１つの発現レベルが測定される。試験の対象とする細胞集団に応じて、本発明のマーカータンパク質のうちのいずれが特に好ましいかは変動し得るが、多能性を有する造腫瘍細胞に対する高い特異性の観点から、例えば、ＳＳＥＡ−１、ＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１の少なくともいずれか１つの発現レベルが測定されることが好ましく、少なくともＳＳＥＡ−１の発現レベルが測定されることがより好ましい。また、ＳＳＥＡ−１およびＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１の両方について発現を検出することにより、試験の精度を更に高めることができる。あるいは、ＳＳＥＡ−１もしくはＳＳＥＡ−３のいずれか、またはそれらの両方の発現レベルが測定されてもよい。また、本発明のマーカータンパク質とともに、上述した幼若化マーカー遺伝子の１つ以上についてのｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルも測定することもまた好ましい。後述するように、これらの遺伝子の発現レベルは、本発明のマーカータンパク質の発現が陽性の細胞が実際に多能性を有する造腫瘍細胞であるかどうかの検証のために有用である。   In this step, the expression level of at least one of the marker proteins of the present invention in the cell population prepared in the above step (1) or the cell population after the treatment in the above step (2) is measured. Depending on the cell population to be tested, which of the marker proteins of the present invention is particularly preferred may vary, but from the viewpoint of high specificity for pluripotent tumorigenic cells, for example, SSEA- 1, it is preferable to measure the expression level of at least one of TRA-1-60 or TRA-1-81, and it is more preferable to measure at least the expression level of SSEA-1. In addition, the accuracy of the test can be further increased by detecting the expression of both SSEA-1 and TRA-1-60 or TRA-1-81. Alternatively, the expression level of either SSEA-1 or SSEA-3, or both, may be measured. It is also preferable to measure the mRNA or protein expression level for one or more of the above-mentioned blastogenesis marker genes together with the marker protein of the present invention. As described later, the expression levels of these genes are useful for verifying whether cells positive for the expression of the marker protein of the present invention are actually pluripotent tumorigenic cells.

本発明のマーカータンパク質または幼若化マーカータンパク質の発現レベルの測定は、特異的抗体を用いた免疫学的手法により行うことができる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー法、免疫組織化学法、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング等の自体公知の手法が挙げられ、好ましくは、フローサイトメトリー法および免疫組織化学法である。感度や迅速性、特定のマーカーを発現する細胞を選択的に回収できる等といった優位性から、フローサイトメトリー法は特に好ましい。また、免疫組織化学法は、組織標本に対して簡便かつ迅速に実施できる等の利点を有する。これらの手法のためのプロトコール、キットおよび機器は、当該技術分野において周知されていて市販されている。   The measurement of the expression level of the marker protein or the juvenile marker protein of the present invention can be performed by an immunological technique using a specific antibody. Examples of the immunological technique include per se known techniques such as flow cytometry, immunohistochemistry, radioisotope immunoassay (RIA), ELISA, and Western blotting. Preferably, flow cytometry And immunohistochemistry. The flow cytometry method is particularly preferred because of its advantages such as sensitivity, rapidity, and ability to selectively recover cells expressing a specific marker. Moreover, the immunohistochemical method has an advantage that it can be easily and rapidly performed on a tissue specimen. Protocols, kits and equipment for these procedures are well known in the art and are commercially available.

本発明のマーカータンパク質または幼若化マーカータンパク質を特異的に認識する抗体は、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ベクトン・ディッキンソン社、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社等の供給元から市販されている抗体を用いることができる（後述の実験例も参照されたい）。   As the antibody specifically recognizing the marker protein or the blastogenesis marker protein of the present invention, an antibody commercially available from suppliers such as R & D Systems, Becton Dickinson, eBioscience, etc. can be used (Experiment described below) See also example).

本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組み換え技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol. 6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。In this specification, antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, chimeric antibodies that can be produced using genetic recombination techniques, humanized antibodies and single-chain antibodies, and binding fragments thereof. However, it is not limited to these. Preferably, the antibody is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or a binding fragment thereof. The binding fragment means a partial region of the aforementioned antibody having specific binding activity, and specifically includes, for example, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv, sFv, dsFv, sdAb and the like. (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, p.441-456, 1996). The class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification.

幼若化マーカーのｍＲＮＡ発現レベルを測定する場合、常法に従い、ＲＮＡを生体試料から単離することができる。ＲＮＡを抽出するための一般的な方法が、当該技術分野において周知されており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997)等、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。具体的には、Ｑｉａｇｅｎなどの製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従ってＲＮＡ単離を行うことができる。   When measuring the mRNA expression level of a blastogenesis marker, RNA can be isolated from a biological sample according to a conventional method. General methods for extracting RNA are well known in the art and are described in standard molecular biology textbooks such as Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). It is disclosed. Specifically, RNA isolation can be performed according to the manufacturer's instructions using a purification kit, buffer set, and protease obtained from a manufacturer such as Qiagen.

幼若化マーカーのｍＲＮＡ発現レベルの測定方法としては、特に限定されるものではないが、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999))；ＲＮａｓｅプロテクション・アッセイ法（Hod, Biotechniques 13: 852-854 (1992))；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）(Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992))；リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)）；ならびにマイクロアレイ解析法等がある。マイクロアレイ解析法は、製造業者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのマイクロアレイ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いる等して、市販されている装置によって実施することができる。   The method for measuring the mRNA expression level of the blast marker is not particularly limited, but Northern blotting and in situ hybridization (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)); RNase protection Assay method (Hod, Biotechniques 13: 852-854 (1992)); Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)); Real-time quantitative RT-PCR (Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)); and microarray analysis. Microarray analysis methods can be performed with commercially available equipment, such as using Affymetrix GeneChip technology, Agilent Technologies microarray technology or Incyte microarray technology, according to the manufacturer's instructions.

（４）前記の１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である場合、前記の試験の対象とする細胞集団は潜在的ながんの悪性度が高いと決定する工程 (4) A step of determining that the cell population to be tested is high in malignancy of potential cancer when any of the expression of the one or more marker proteins is positive.

本工程での上記決定（または区別）のために、工程（３）で得られた１以上の本発明のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であるか否かが評価される。当該評価において、工程（３）の測定における抗体の非特異的反応による影響を判定することが好ましい。そのために、例えば、工程（３）の測定において、本発明のマーカータンパク質を検出するために用いた抗体と同一のアイソタイプの抗体（アイソタイプコントロール）を用いて同様に発現レベルを測定し、特異的抗体での測定で得られた発現レベルと、アイソタイプコントロールでの測定で得られた発現レベルとを比較してもよい。このような手順は当該技術分野において周知である。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われ得る。   For the above determination (or distinction) in this step, it is evaluated whether any of the expression of one or more marker proteins of the present invention obtained in step (3) is positive. In the said evaluation, it is preferable to determine the influence by the nonspecific reaction of the antibody in the measurement of a process (3). Therefore, for example, in the measurement of the step (3), the expression level is similarly measured using the same isotype antibody (isotype control) as the antibody used for detecting the marker protein of the present invention, and the specific antibody You may compare the expression level obtained by measurement by (1) and the expression level obtained by measurement by isotype control. Such procedures are well known in the art. The comparison of the expression level can be preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.

本発明のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であった細胞が実際に多能性を有する造腫瘍細胞であることを他の手段により検証することは、試験の信頼性をより高めるために好ましい。そのような手段としては、上述の１以上の幼若化マーカー遺伝子の発現が陽性であることの確認（上述）、分化多能性の確認（上述し、実験例にも示している）、造腫瘍能の確認（上述し、実験例にも示している）、エピジェネティック制御酵素（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素、ＤＮＡメチル化酵素等が挙げられる）の発現パターンのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞との類似性の確認、等が挙げられる。また、このような試験を行うために、本発明のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である細胞を選択的に回収する必要がある場合、本発明のマーカータンパク質に対する特異的抗体を用いて、セルソーターや、磁性ビーズ、細胞吸着用カラム等により、該抗体に特異的に結合する細胞を単離すればよい。   It is preferable to verify that the cells positive for any of the expression of the marker protein of the present invention are actually pluripotent tumorigenic cells by other means in order to further improve the reliability of the test. . Such means include confirmation of positive expression of one or more blast marker genes (described above), confirmation of differentiation pluripotency (described above and also shown in experimental examples), Confirmation of tumor ability (described above and also shown in experimental examples), expression patterns of epigenetic regulatory enzymes (eg, histone deacetylase, DNA methylase, etc.) with ES cells or iPS cells Confirmation of similarity, etc. are mentioned. Further, in order to perform such a test, when it is necessary to selectively collect cells positive for any of the expression of the marker protein of the present invention, using a specific antibody against the marker protein of the present invention, Cells that specifically bind to the antibody may be isolated using a cell sorter, magnetic beads, a cell adsorption column, or the like.

（試験用の試薬等）
本発明の試験方法と関連して、本発明はまた、細胞集団の潜在的ながん悪性度の試験用試薬を提供する。該試薬は、本発明のマーカータンパク質を特異的に認識する抗体を含む。該試薬は、上記の幼若化マーカータンパク質を特異的に認識する抗体を更に含んでもよい。これらの抗体としては、本発明の試験方法において上述したものを用いることができ、好ましい実施形態としても上述の通りである。(Test reagents, etc.)
In connection with the test method of the present invention, the present invention also provides a reagent for testing the potential cancer malignancy of a cell population. The reagent includes an antibody that specifically recognizes the marker protein of the present invention. The reagent may further contain an antibody that specifically recognizes the blastogenesis marker protein. As these antibodies, those described above in the test method of the present invention can be used, and preferred embodiments are also as described above.

低酸素負荷工程を含む本発明の試験方法と関連して、本発明は更に、低酸素培養機器および上記の試験用試薬を含む、細胞集団の潜在的ながん悪性度の試験用システム（キット）を提供する。「低酸素培養機器」とは、低酸素雰囲気下での細胞培養を可能にする機器を意味する。該機器としては、本発明の試験方法について上述したものを用いることができ、低酸素雰囲気下での細胞培養が可能なインキュベーター、嫌気培養用製品（例、上掲のアネロパック）等を挙げることができる。「低酸素雰囲気」の定義は上述の通りである。   In connection with the test method of the present invention comprising a hypoxic load step, the present invention further comprises a system (kit) for testing the potential cancer malignancy of a cell population comprising a hypoxic culture apparatus and the test reagent described above. )I will provide a. “Low oxygen culture device” means a device that enables cell culture in a low oxygen atmosphere. As the apparatus, those described above for the test method of the present invention can be used, and examples include an incubator capable of culturing cells in a low oxygen atmosphere, an anaerobic culture product (eg, anero pack described above), and the like. it can. The definition of “low oxygen atmosphere” is as described above.

（治療方法）
本発明はまた、悪性度の高いがんを有する対象における前記がんの治療方法を提供する。当該方法は、前記対象においてがんの存在が疑われる組織から採取された試料に対して本発明の試験方法を適用する工程、および、前記試料には潜在的ながんの悪性度が高い細胞が含まれると決定された場合に、がんに対する療法を前記対象に施す工程を含む。
本発明の試験方法およびその好ましい実施形態については上述した通りである。また、がんに対する療法としては、悪性度の高いがんに対して一般に行われている任意の療法が挙げられ、例えば、外科的治療、抗がん剤治療、放射線療法、免疫療法、温熱療法等である。(Method of treatment)
The present invention also provides a method for treating the cancer in a subject having a highly malignant cancer. The method includes a step of applying the test method of the present invention to a sample collected from a tissue suspected of having cancer in the subject, and cells having high potential malignancy of cancer in the sample. When it is determined that is included, the method includes the step of applying a therapy for cancer to the subject.
The test method of the present invention and preferred embodiments thereof are as described above. In addition, the therapy for cancer includes any therapy generally performed for high-grade cancer, such as surgical treatment, anticancer drug treatment, radiation therapy, immunotherapy, thermotherapy. Etc.

（スクリーニング方法）
本発明はまた、がんの予防および／または治療剤のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、
（１）がん細胞を含む細胞集団を用意する工程であって、前記細胞集団は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質を発現する細胞を含む前記工程、
（２）前記の用意された細胞集団から、がんの予防および／または治療剤の候補物質の暴露に供した細胞集団と、前記候補物質の暴露に供しなかった対照細胞集団とを調製する工程、
（３）前記暴露後の細胞集団および前記対照細胞集団におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定する工程、および
（４）前記暴露後の細胞集団における前記の１以上のマーカータンパク質の発現の全てが、前記対照細胞集団における対応するマーカータンパク質の発現と比べて有意に低いレベルである場合、がんの予防および／または治療剤として前記候補物質を選択する工程
を含む。上記の工程（１）、（３）および（４）は、本発明の試験方法の記載に準じて行うことができ、好ましい実施形態についても同様である。上記の工程（２）における候補物質は任意の物質（例、天然または合成の化合物）であってよく、また暴露の条件は、スクリーニング試験の目的に応じて適宜設定することができる。当該方法により、多能性を有する造腫瘍細胞を標的とした抗がん剤のスクリーニングが可能となる。
また、本発明の試験方法と同様にして、上記の工程（１）の後であってかつ工程（３）の以前において、細胞集団を低酸素負荷に供してもよい。その場合の候補物質の暴露は、低酸素負荷に供する前、低酸素負荷と同時に、各回の低酸素負荷の間に、または低酸素負荷後に、行ってよい。当該工程を追加する場合、上記の工程（１）で用意される細胞集団は、必ずしも前記の１以上のマーカーを発現する細胞を含まなくてもよい。当該工程を追加することにより、多能性を有する造腫瘍細胞のみならず、多能性を有する造腫瘍細胞にリプログラミングされる蓋然性が高い非造腫瘍細胞をも標的とする抗がん剤のスクリーニングが可能となる。(Screening method)
The present invention also provides a screening method for a preventive and / or therapeutic agent for cancer. The method is
(1) A step of preparing a cell population containing cancer cells, wherein the cell population is selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 The process comprising a cell expressing the above marker protein,
(2) A step of preparing, from the prepared cell population, a cell population subjected to exposure to a candidate substance for cancer prevention and / or treatment and a control cell population not subjected to exposure to the candidate substance. ,
(3) The expression level of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 in the cell population after exposure and the control cell population And (4) when all of the expression of the one or more marker proteins in the cell population after exposure is at a significantly lower level compared to the expression of the corresponding marker protein in the control cell population, Selecting the candidate substance as an agent for preventing and / or treating cancer. Said process (1), (3) and (4) can be performed according to description of the test method of this invention, and it is the same also about preferable embodiment. The candidate substance in the above step (2) may be any substance (eg, natural or synthetic compound), and the exposure conditions can be appropriately set according to the purpose of the screening test. This method makes it possible to screen for anticancer agents targeting pluripotent tumorigenic cells.
Similarly to the test method of the present invention, the cell population may be subjected to a low oxygen load after the above step (1) and before the step (3). In this case, the exposure of the candidate substance may be performed before the low oxygen load, simultaneously with the low oxygen load, during each low oxygen load, or after the low oxygen load. When adding the said process, the cell population prepared by said process (1) does not necessarily need to contain the cell which expresses said 1 or more marker. By adding this process, an anticancer agent that targets not only pluripotent tumorigenic cells but also non-tumorigenic cells that have a high probability of being reprogrammed to pluripotent tumorigenic cells. Screening becomes possible.

本発明は更に、非造腫瘍細胞から多能性を有する造腫瘍細胞へのリプログラミングを促進する因子のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、
（１）非造腫瘍細胞を含む細胞集団を用意する工程、
（２）前記の用意された細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現の全てが陰性であることを指標にして非造腫瘍細胞を選択する工程、
（３）前記の選択された非造腫瘍細胞集団を、予め定められた因子の暴露に供する工程、
（４）前記暴露後の細胞集団におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定する工程、および
（５）前記の１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である場合、非造腫瘍細胞から多能性を有する造腫瘍細胞へのリプログラミングを促進する因子として前記因子を選択する工程
を含む。
上記の工程（１）および（２）は、後述する本発明の調製方法に関して説明する通りに行うことができ、好ましい実施形態についても同様である。上記の工程（３）における因子は、スクリーニングを所望される任意の因子であってよく、例えば、物質（例、天然または合成の化合物）、環境条件（例、温度、周囲気体等）、放射線等であり得る。暴露の条件は、スクリーニング試験の目的に応じて適宜設定することができる。上記の工程（４）は、本発明の試験方法に関して説明した通りに行うことができ、好ましい実施形態についても同様である。
また、本発明の試験方法と同様にして、マーカータンパク質の発現を検出する以前に、選択された非造腫瘍細胞を低酸素負荷に供してもよい。その場合の因子の暴露は、上述した通り、低酸素負荷に供する前、低酸素負荷と同時に、各回の低酸素負荷の間に、または低酸素負荷後に、行ってよい。The present invention further provides a screening method for factors that promote reprogramming from non-tumor cells to pluripotent tumor cells. The method is
(1) preparing a cell population containing non-tumorigenic cells;
(2) The expression of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is negative from the prepared cell population. Selecting non-tumorigenic cells by using as an index,
(3) subjecting the selected non-tumorigenic cell population to exposure to a predetermined factor;
(4) measuring the expression level of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 in the cell population after the exposure; and (5) when any one of the expression of the one or more marker proteins is positive, the step of selecting the factor as a factor that promotes reprogramming from a non-tumor cell to a pluripotent tumor cell. Including.
Said process (1) and (2) can be performed as it demonstrates regarding the preparation method of this invention mentioned later, and is the same also about preferable embodiment. The factor in the above step (3) may be any factor desired to be screened, such as a substance (eg, natural or synthetic compound), environmental conditions (eg, temperature, ambient gas, etc.), radiation, etc. It can be. The exposure conditions can be appropriately set according to the purpose of the screening test. Said process (4) can be performed as it demonstrated regarding the test method of this invention, and it is the same also about preferable embodiment.
Similarly to the test method of the present invention, the selected non-tumorigenic cells may be subjected to a hypoxic load before detecting the expression of the marker protein. In this case, as described above, the exposure of the factor may be performed before being subjected to the low oxygen load, simultaneously with the low oxygen load, during each low oxygen load, or after the low oxygen load.

（調製方法）
本発明はまた、低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞を調製する方法（以下、本発明の調製方法ともいう）を提供する。本発明の調製方法は、
（１）非造腫瘍細胞を含む細胞集団を用意する工程、
（２）前記の用意された細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現の全てが陰性であることを指標にして非造腫瘍細胞を選択する工程、
（３）前記の選択された細胞集団を低酸素負荷に供する工程、および
（４）低酸素負荷工程後の細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であることを指標にして、多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程
を含む。(Preparation method)
The present invention also provides a method for preparing pluripotent tumorigenic cells generated from non-tumorigenic cells by reprogramming induced by hypoxia (hereinafter also referred to as the preparation method of the present invention). The preparation method of the present invention comprises:
(1) preparing a cell population containing non-tumorigenic cells;
(2) The expression of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is negative from the prepared cell population. Selecting non-tumorigenic cells by using as an index,
(3) subjecting the selected cell population to hypoxic load, and (4) from the cell population after the hypoxic load step, SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1- And a step of selecting pluripotent tumorigenic cells using as an index one of the positive expressions of one or more marker proteins selected from the group consisting of 81.

（１）非造腫瘍細胞を含む細胞集団を用意する工程 (1) A step of preparing a cell population containing non-tumorigenic cells

非造腫瘍細胞を含む細胞集団としては、非造腫瘍細胞を含んでいる限り任意のものを使用することができ、本発明の試験方法において試験の対象とする細胞集団として上述したものが挙げられ、典型的には、腫瘍細胞またはがん細胞を含む細胞集団である。本工程は、本発明の試験方法の工程（１）と同様にして行うことができる。   As the cell population containing non-tumor-forming cells, any cell population can be used as long as it contains non-tumor-forming cells. Examples of the cell population to be tested in the test method of the present invention include those described above. Typically, a cell population comprising tumor cells or cancer cells. This step can be performed in the same manner as step (1) of the test method of the present invention.

（２）前記の用意された細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現の全てが陰性であることを指標にして非造腫瘍細胞を選択する工程 (2) The expression of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is negative from the prepared cell population. The process of selecting non-tumorigenic cells using a certain index

本工程の選択は、例えば、工程（１）で用意された細胞集団に対して、１つ以上の本発明のマーカータンパク質に対する特異的抗体、好ましくは全ての本発明のマーカータンパク質に対する特異的抗体を用いて、セルソーターや、磁性ビーズ、細胞吸着用カラム等により、用いられたいずれの抗体にも特異的に結合しない細胞を単離することにより行うことができる。
細胞集団の由来等に応じて、本発明のマーカータンパク質のうちのいずれが特に好ましいかは変動し得るが、多能性を有する造腫瘍細胞に対する高い特異性の観点から、例えば、ＳＳＥＡ−１または、ＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１の少なくともいずれか１つの発現が選択のために利用されることが好ましく、少なくともＳＳＥＡ−１の発現が利用されることがより好ましい。また、ＳＳＥＡ−１およびＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１の両方について発現を利用することにより、選択の精度を更に高めることができる。あるいは、ＳＳＥＡ−１もしくはＳＳＥＡ−３のいずれか、またはそれらの両方の発現が利用されてもよい。特異的抗体としては、本発明の試験方法について説明したものを利用することができる。なお、単に多能性を有する造腫瘍細胞を濃縮するという目的であれば、本工程における非造腫瘍細胞の回収が高い純度であることは要求されないが、本発明の調製方法は、特に低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞を取得するものであるため、本工程において多能性を有する造腫瘍細胞が実質的に存在しない程度（例えば、０．１％未満）まで除去されることが好ましい。The selection in this step is performed by, for example, selecting specific antibodies against one or more marker proteins of the present invention, preferably specific antibodies against all the marker proteins of the present invention, from the cell population prepared in step (1). It can be carried out by isolating cells that do not specifically bind to any of the antibodies used with a cell sorter, magnetic beads, cell adsorption column, or the like.
Depending on the origin of the cell population, which of the marker proteins of the present invention is particularly preferred may vary, but from the viewpoint of high specificity for tumorigenic cells having pluripotency, for example, SSEA-1 or Preferably, expression of at least one of TRA-1-60 or TRA-1-81 is utilized for selection, and more preferably, expression of at least SSEA-1 is utilized. Also, the accuracy of selection can be further increased by utilizing expression for both SSEA-1 and TRA-1-60 or TRA-1-81. Alternatively, expression of either SSEA-1 or SSEA-3, or both may be utilized. As the specific antibody, those described for the test method of the present invention can be used. For the purpose of simply concentrating pluripotent tumorigenic cells, it is not required that the recovery of non-tumorigenic cells in this step be of high purity, but the preparation method of the present invention is particularly suitable for hypoxia. In order to obtain pluripotent tumorigenic cells generated from non-tumorigenic cells by reprogramming induced by loading, there is substantially no pluripotent tumorigenic cells in this step ( For example, it is preferably removed to less than 0.1%.

（３）前記の選択された細胞集団を低酸素負荷に供する工程 (3) subjecting the selected cell population to a hypoxic load

工程（２）で取得した非造腫瘍細胞集団が本工程で低酸素負荷に供される。本工程についても、本発明の試験方法の工程（２）について説明したのと同様にして行うことができる。本工程の低酸素負荷により、細胞集団中の非造腫瘍細胞の少なくとも一部が、リプログラミングを誘導されて多能性を有する造腫瘍細胞に転換され得る。   The non-tumorigenic cell population obtained in step (2) is subjected to hypoxic load in this step. This step can be performed in the same manner as described for step (2) of the test method of the present invention. By the hypoxic load of this step, at least a part of the non-tumorigenic cells in the cell population can be converted to pluripotent tumorigenic cells induced by reprogramming.

（４）低酸素負荷工程後の細胞集団から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であることを指標にして、多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程 (4) One of the expression of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 from the cell population after the hypoxic load step A step of selecting pluripotent tumorigenic cells using positiveness as an index

本工程では、工程（３）において生じ得た多能性を有する造腫瘍細胞が、本発明のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であることを指標にして選択的に回収される。本工程の選択についても、例えば、工程（３）の後の細胞集団に対して、本発明のマーカータンパク質に対する特異的抗体を用いて、セルソーターや、磁性ビーズ、細胞吸着用カラム等により、該抗体に特異的に結合する細胞を単離することにより行うことができる。
細胞集団の由来等に応じて、本発明のマーカータンパク質のうちのいずれが特に好ましいかは変動し得るが、多能性を有する造腫瘍細胞に対する高い特異性の観点から、例えば、ＳＳＥＡ−１または、ＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１の少なくともいずれか１つの発現が選択のために利用されることが好ましく、少なくともＳＳＥＡ−１の発現が利用されることがより好ましい。また、ＳＳＥＡ−１およびＴＲＡ−１−６０またはＴＲＡ−１−８１の両方について発現を利用することにより、選択の精度を更に高めることができる。あるいは、ＳＳＥＡ−１もしくはＳＳＥＡ−３のいずれか、またはそれらの両方の発現が利用されてもよい。特異的抗体としては、本発明の試験方法について説明したものを利用することができる。
得られた細胞集団が実際に多能性を有する造腫瘍細胞であることを他の手段により検証することは好ましい。そのために、例えば、得られた細胞集団の一部に対して、上述の１以上の幼若化マーカー遺伝子の発現が陽性であることの確認（上述）、分化多能性の確認（上述し、実験例にも示している）、造腫瘍能の確認（上述し、実験例にも示している）、エピジェネティック制御酵素（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素、ＤＮＡメチル化酵素等が挙げられる）の発現パターンのＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞との類似性の確認、等を行うことができる。In this step, the pluripotent tumorigenic cells that can be generated in the step (3) are selectively collected using as an index that one of the expression of the marker protein of the present invention is positive. Regarding the selection of this step, for example, using the antibody specific for the marker protein of the present invention against the cell population after step (3), the antibody is obtained by cell sorter, magnetic beads, cell adsorption column, etc. This can be done by isolating cells that specifically bind to.
Depending on the origin of the cell population, which of the marker proteins of the present invention is particularly preferred may vary, but from the viewpoint of high specificity for tumorigenic cells having pluripotency, for example, SSEA-1 or Preferably, expression of at least one of TRA-1-60 or TRA-1-81 is utilized for selection, and more preferably, expression of at least SSEA-1 is utilized. Also, the accuracy of selection can be further increased by utilizing expression for both SSEA-1 and TRA-1-60 or TRA-1-81. Alternatively, expression of either SSEA-1 or SSEA-3, or both may be utilized. As the specific antibody, those described for the test method of the present invention can be used.
It is preferable to verify that the obtained cell population is actually a pluripotent tumorigenic cell by other means. Therefore, for example, confirmation of the expression of one or more of the above-mentioned blastogenesis marker genes is positive for a part of the obtained cell population (described above), confirmation of differentiation pluripotency (described above, (Also shown in experimental examples), confirmation of tumorigenicity (described above, also shown in experimental examples), epigenetic regulatory enzymes (for example, histone deacetylase, DNA methylase, etc.) The similarity of the expression pattern with ES cells or iPS cells can be confirmed.

（多能性を有する造腫瘍細胞）
本発明は更に、低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞（以下、本発明の造腫瘍細胞ともいう）を提供する。本発明の造腫瘍細胞の由来となる非造腫瘍細胞は、任意の非造腫瘍細胞であってよく、例えば、上述した任意のがん種の非造腫瘍細胞である。本発明の造腫瘍細胞は、それに限定されないが、例えば、上述した本発明の調製方法により取得することができる。(Pluripotent tumorigenic cells)
The present invention further provides pluripotent tumorigenic cells (hereinafter also referred to as tumorigenic cells of the present invention) generated from non-tumorigenic cells by reprogramming induced by hypoxia. The non-tumor cell from which the tumorigenic cell of the present invention is derived may be any non-tumor cell, for example, a non-tumor cell of any cancer type described above. The tumorigenic cells of the present invention are not limited thereto, but can be obtained by, for example, the preparation method of the present invention described above.

本発明の造腫瘍細胞は、好ましくは、単離されかつ精製されている。「単離および精製」とは、本発明の造腫瘍細胞以外の細胞の混入を除去する処理がなされていることを意味する。本発明の造腫瘍細胞の純度は、高ければ高いほど好ましい。該純度は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上（例えば実質的に１００％）である。   The tumorigenic cells of the present invention are preferably isolated and purified. “Isolation and purification” means that treatment to remove contamination of cells other than the tumorigenic cells of the present invention has been performed. The purity of the tumorigenic cell of the present invention is preferably as high as possible. The purity is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 99% or more (for example, substantially 100%).

例えば、本発明の造腫瘍細胞の遺伝子発現解析、タンパク質解析、代謝解析等を行うことにより、がん研究が促進される。また、該細胞群を用いることにより、効率のよい腫瘍モデルを構築することができる。このような腫瘍モデルは、腫瘍発生・形成過程、治療抵抗性、転移過程等を研究する上で有用である。また、これらの研究を通じて、多能性を有する造腫瘍細胞（またはがん幹細胞）およびがんの理解につながるとともに、これを標的とした医薬品開発が可能となる。   For example, cancer research is promoted by performing gene expression analysis, protein analysis, metabolism analysis, and the like of the tumorigenic cells of the present invention. Moreover, an efficient tumor model can be constructed | assembled by using this cell group. Such tumor models are useful for studying tumor development / formation processes, treatment resistance, metastasis processes, and the like. These studies will lead to an understanding of pluripotent tumorigenic cells (or cancer stem cells) and cancer, and drug development targeting them will be possible.

以下に実験例等を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実験例等に限定されるものではない。   The present invention will be described more specifically with reference to the following experimental examples, but the scope of the present invention is not limited to the following experimental examples.

［実験方法］
細胞培養
本研究で用いた全ての細胞は、単一細胞から再クローニングした（従って遺伝子背景は同一である）。ヒトの肺がん細胞株H157、H358、A549（非小細胞）、H460（大細胞）、N417（小細胞）、および悪性黒色腫細胞株Num2Bを10%ウシ胎児血清を含有するRPMI1640培地（Hyclone社）中で培養した。低酸素条件はアネロパックキット（三菱ガス化学株式会社）を用いて達成した。異所性遺伝子またはマイクロRNAを発現する細胞の作製は、pCDNA6.2、LipofectamineおよびBlasticidin（インビトロジェン社）を用いて行った。マイクロRNAのためのオリゴヌクレオチドは、BLOCK-iTプログラム（インビトロジェン社）を用いて設計した。分化アッセイ（図3）のために、胚様体（EB）形成後の細胞をSmGM-、FGM-2-またはHCM-BulletKit（ロンザ社，スイス国）中でインキュベートした。

RT-PCR解析
RT-PCR解析およびSYBR-Greenを用いたリアルタイムRT-PCR解析は標準的な方法により行った。GAPDH mRNAを用いて、RNAインプット量を正規化した。

FACS解析および免疫組織化学
FACSおよび免疫染色のために用いた抗体を下記表１に示す。[experimental method]
Cell culture All cells used in this study were recloned from a single cell (thus the genetic background is identical). Human lung cancer cell lines H157, H358, A549 (non-small cells), H460 (large cells), N417 (small cells), and malignant melanoma cell line Num2B in RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (Hyclone) Incubated in. Hypoxic conditions were achieved using an anero pack kit (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.). Preparation of cells expressing an ectopic gene or microRNA was performed using pCDNA6.2, Lipofectamine and Blasticidin (Invitrogen). Oligonucleotides for microRNA were designed using the BLOCK-iT program (Invitrogen). For differentiation assay (FIG. 3), cells after embryoid body (EB) formation were incubated in SmGM-, FGM-2- or HCM-BulletKit (Lonza, Switzerland).

RT-PCR analysis
RT-PCR analysis and real-time RT-PCR analysis using SYBR-Green were performed by standard methods. The amount of RNA input was normalized using GAPDH mRNA.

FACS analysis and immunohistochemistry
The antibodies used for FACS and immunostaining are shown in Table 1 below.

単一細胞への分離のために、細胞または異種移植腫瘍（xenograft）をTrypLE Express（インビトロジェン社）で5分間消化した。FACS解析、サイドポピュレーション（SP）解析および細胞選別はFACSAria II（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて行った。死細胞の除去のために7AAD（1μg/mL）を用いた。図中、アイソタイプコントロール抗体を用いて得られたFACSシグナルを灰色のシャドウで示している。アイソタイプ抗体で観察された最大の蛍光を上回る蛍光を示す細胞を陽性と考えた。そのような陽性細胞の割合を一部の図において示している。異種移植腫瘍は4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。切片（5μm）を一次抗体、次いでHRP標識二次抗体、次いでジアミノベンジジンと共にインキュベートした。
免疫染色およびフローサイトメトリーの詳細なプロトコールは以下の通りである。
（免疫染色）
腫瘍は4%パラホルムアルデヒドで4℃にて固定後、20%スクロース／PBS溶液、4℃にて一晩静置し、アルコールによる透徹後、パラフィンにて包埋処理を行なった。薄切は5μmとして、スライドガラス上に固定し再度アルコールによる脱パラフィン処理を行なった。抗原賦活化液（Antigen Retrieval Reagent, Basic; R&D systems）にて95℃, 20分加熱により賦活化処理を行なった。SSEA-1(1/500希釈)、TRA1-60（1/500希釈）、TRA1-81（1/500希釈）、OCT3/4（1/250希釈）、SOX2（1/250希釈）、NANOG（1/100希釈）抗体にて１次抗体反応後、Polink-2 Plus HRP Mouse with DAB Kit (GBI Labs)による、HRP-標識ポリマー検出システムDAB染色法を用いた。発色方法はメーカープロトコールに従った。染色後充分に水洗し、透徹処理の後にエンテラン（Merk）にて封入処理したものを検鏡した。
（フローサイトメトリー (Fluorescence Activated Cell Sorter)）
回収したがん細胞はBSAを含むFACS Buffer（1% FCS, 2mM EDTAを含むPBS）を用いて非特異的反応を阻害した後、FACS Bufferにて希釈したSSEA-1-FITC（BD Bioscience）にて染色した。核内染色には膜透過性を昂進させるため、Foxp3 Staining Kit（eBioscience）を用いた。メーカープロトコールに従って細胞を前処理後、OCT4-Alexa647、SOX2-Alexa647（BD Bioscience）で染色した。死細胞の除去判定のために、染色後の細胞懸濁液へ1μg/mlの7-AAD（BD Bioscience）を1/400容量添加し、FACS Cant II（アナライザー）/ Aria II（セルソーター）（BD Bioscience）にて測定、FlowJo Software（Treestar,Inc.）によって解析した。

腫瘍形成アッセイ
細胞をNOD-SCIDマウスまたはNOD/SCID IL2Rγnullマウスに皮下注射した。腫瘍成長を毎週測定し、出現を注射から12週間後に評価した。マウスを用いた全ての手順は、日本国政府による法律第105号および告示第6号の下で産業医科大学倫理委員会により認可されたものである。

統計解析
全てのデータは平均±標準偏差として示している。2群間の比較には、スチューデントのt検定を用いた（p<0.05を有意とした）。
Cells or xenograft tumors (xenograft) were digested with TrypLE Express (Invitrogen) for 5 minutes for separation into single cells. FACS analysis, side population (SP) analysis, and cell sorting were performed using FACSAria II (Becton Dickinson). 7AAD (1 μg / mL) was used for removal of dead cells. In the figure, the FACS signal obtained using the isotype control antibody is indicated by a gray shadow. Cells showing fluorescence above the maximum fluorescence observed with isotype antibodies were considered positive. The percentage of such positive cells is shown in some figures. Xenograft tumors were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin. Sections (5 μm) were incubated with primary antibody, then HRP-labeled secondary antibody, and then diaminobenzidine.
Detailed protocols for immunostaining and flow cytometry are as follows.
(Immunostaining)
Tumors were fixed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C., allowed to stand overnight at 20 ° C. in a 20% sucrose / PBS solution, cleared with alcohol, and then embedded in paraffin. The thin slice was 5 μm, fixed on a slide glass, and deparaffinized with alcohol again. Activation treatment was performed by heating at 95 ° C. for 20 minutes with an antigen activation solution (Antigen Retrieval Reagent, Basic; R & D systems). SSEA-1 (1/500 dilution), TRA1-60 (1/500 dilution), TRA1-81 (1/500 dilution), OCT3 / 4 (1/250 dilution), SOX2 (1/250 dilution), NANOG ( 1/100 dilution) After the primary antibody reaction with the antibody, the HRP-labeled polymer detection system DAB staining method by Polink-2 Plus HRP Mouse with DAB Kit (GBI Labs) was used. The color development method followed the manufacturer's protocol. After dyeing, the sample was thoroughly washed with water, and after encapsulating with Enteran (Merk).
(Flow cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorter))
The collected cancer cells were blocked with SSEA-1-FITC (BD Bioscience) diluted with FACS Buffer after inhibiting non-specific reaction using FACS Buffer containing BSA (PBS containing 1% FCS, 2 mM EDTA). And stained. For intranuclear staining, Foxp3 Staining Kit (eBioscience) was used to enhance membrane permeability. Cells were pretreated according to the manufacturer's protocol and then stained with OCT4-Alexa647 and SOX2-Alexa647 (BD Bioscience). To determine the removal of dead cells, 1/400 volume of 1 μg / ml 7-AAD (BD Bioscience) was added to the stained cell suspension, and FACS Cant II (analyzer) / Aria II (cell sorter) (BD Bioscience) and analyzed by FlowJo Software (Treestar, Inc.).

Tumorigenic assay cells were injected subcutaneously into NOD-SCID mice or NOD / SCID IL2Rγ null mice. Tumor growth was measured weekly and appearance was assessed 12 weeks after injection. All procedures using mice were approved by the Ethics Committee of Occupational Medical University under Law No. 105 and Notification No. 6 by the Japanese government.

Statistical analysis All data are shown as mean ± standard deviation. For comparison between the two groups, Student's t-test was used (p <0.05 was considered significant).

実験例1：低酸素によりがん細胞において幹細胞マーカーが活性化される
低酸素（hypoxia）によりES細胞マーカー遺伝子が活性化されるかどうかを確かめるために、5つのヒト肺がん細胞株および悪性黒色腫細胞株をスクリーニングした。細胞を5% O2で12時間インキュベートした後、RT-PCR解析または定量的リアルタイムPCR解析のいずれかに供した。N417、H358、H460およびNum2B細胞において4つの初期化誘導遺伝子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC）の全てが活性化されたが（図1A、1B）、ヒト線維芽細胞（TIG3）はこれらの遺伝子のいずれの活性化も示さなかった。N417およびNum2Bでは、「ナイーブ」マーカーであるREX1を含む試験した全ての胚性遺伝子が活性化されていた。以降の実験では、N417を主に用いた。N417で得られた結果の殆どは、H358細胞においても確認された。
hypoxiaのN417細胞では、TGF-βがすぐに下方調節され、その後幹細胞性（stemness）遺伝子の活性化が見られた（図1C）。幹細胞性遺伝子およびES細胞特異的細胞表面抗原（SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81）の低酸素誘導性発現がFACSおよび免疫組織化学により確認された（図1D、1E）。低酸素下において、N417はアルカリホスファターゼ活性の亢進を示し（図1F）、非接着性の球形の細胞集塊を形成した（図1G）。Hoechst 33342での染色後に観察されたベラパミル感受性のサイドポピュレーション（SP）は、正常酸素（normoxia）での0.27%から、hypoxiaにおいて7.05%に増加していた（図1H）。上述した低酸素誘導性の反応は、6つの異なるN417クローン（GFPを発現するN417（N417-GFP）の3クローンを含む）で確認され、H358細胞の3クローンにおいても観察された。
これらの結果から、いくつかのがんの非造腫瘍細胞は、低酸素下で初期化されて、造腫瘍性の細胞のみならず、iPS細胞のような多分化能（multipotencyまたはpluripotency）を有する幹細胞様細胞に復帰し得るという仮説を立てた。Experimental example 1: Stem cell marker is activated in cancer cells by hypoxia Five human lung cancer cell lines and malignant melanoma to confirm whether ES cell marker gene is activated by hypoxia Cell lines were screened. Cells were incubated with 5% O 2 for 12 hours before being subjected to either RT-PCR analysis or quantitative real-time PCR analysis. All four reprogramming-inducible genes (OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC) were activated in N417, H358, H460 and Num2B cells (FIGS. 1A and 1B), but human fibroblasts (TIG3) Did not show any activation of these genes. In N417 and Num2B, all tested embryonic genes, including the “naive” marker REX1, were activated. In subsequent experiments, N417 was mainly used. Most of the results obtained with N417 were also confirmed in H358 cells.
In hypoxia N417 cells, TGF-β was immediately down-regulated, followed by activation of the stemness gene (Figure 1C). Hypoxia-induced expression of stem cell genes and ES cell-specific cell surface antigens (SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81) was confirmed by FACS and immunohistochemistry (Fig. 1D, 1E). Under hypoxia, N417 showed increased alkaline phosphatase activity (FIG. 1F) and formed non-adherent spherical cell clusters (FIG. 1G). Verapamil-sensitive side population (SP) observed after staining with Hoechst 33342 increased from 0.27% in normoxia to 7.05% in hypoxia (FIG. 1H). The hypoxia-inducible reaction described above was confirmed in 6 different N417 clones (including 3 clones of N417 (N417-GFP) expressing GFP) and was also observed in 3 clones of H358 cells.
From these results, some cancer non-tumorigenic cells are reprogrammed under hypoxia and have multipotency or pluripotency like iPS cells as well as tumorigenic cells We hypothesized that they could return to stem cell-like cells.

実験例2：SSEA-1およびSSEA-3は、造腫瘍細胞と非造腫瘍細胞とを識別できるマーカーである
非がん幹細胞（non-CSC）のがん幹細胞（CSC）への復帰を証明するためには、これらの2つの細胞集団を分離することが必要であった。CSCの同定のために、ES細胞特異的細胞表面抗原（SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-81）を用いた。SSEA-1およびSSEA-3の発現は、N417細胞において互いに排他的であった。SSEA-1/SSEA-3陰性画分はTra1-81陽性細胞を含まなかった。重要なことに、いずれも低酸素に暴露された細胞から選別された、SSEA-1/SSEA-3陰性画分、および4つの抗原全てに陰性の画分は、異種移植腫瘍を形成しなかった。SSEA-1/SSEA-3陰性画分は、より許容性（permissive）の高いNOD/SCIDインターロイキン2受容体γ鎖欠損（NOD/SCID IL2Rγnull）マウスにおいても、注射から32週間後であっても腫瘍を作らないことが確認された。対照的に、低酸素に暴露された細胞から選別されたSSEA-1+細胞またはSSEA-3+細胞は、連続的に移植可能な異種移植腫瘍を形成し、これは未選別の親細胞よりも迅速かつ活発に増殖した（図2A）。SSEA-3+細胞またはSSEA-1+細胞のいずれかにより形成された異種移植腫瘍は、未選別の細胞により形成された腫瘍と同様の比率でSSEA-3+/-細胞およびSSEA-1+/-細胞を含んでおり、元々の腫瘍内の表現型の不均一性を再現していた（図2B）。これらの結果は、SSEA-1/SSEA-3陰性細胞は「分化した」非造腫瘍細胞であること、ならびに、SSEA-1+細胞画分およびSSEA-3+細胞画分の両方共、CSCを含むことを示している。
我々は次に、低酸素に暴露された細胞におけるSSEA遺伝子および初期化遺伝子の発現を解析した（図2C）。SSEA-1+画分およびSSEA-3+画分の両方が、OCT3/4、SOX2およびNANOGの発現の大幅な増加を示した。対照的に、異種移植腫瘍を形成し得なかった陰性画分は、それらの発現を実質的に示さなかった。我々は更に、低酸素に暴露された細胞で観察された全ての幹細胞様属性（図1）はSSEA-1+細胞およびSSEA-3+細胞の特性であることを確認した。Experimental example 2: SSEA-1 and SSEA-3 demonstrate the return of non-cancer stem cells (non-CSC) to cancer stem cells (CSC), a marker that can distinguish between tumor-forming cells and non-tumor-forming cells In order to do this, it was necessary to separate these two cell populations. ES cell-specific cell surface antigens (SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-81) were used for CSC identification. The expression of SSEA-1 and SSEA-3 was mutually exclusive in N417 cells. The SSEA-1 / SSEA-3 negative fraction did not contain Tra1-81 positive cells. Importantly, the SSEA-1 / SSEA-3 negative fraction and the fraction negative for all four antigens, all selected from cells exposed to hypoxia, did not form xenograft tumors. . The SSEA-1 / SSEA-3 negative fraction was also found in the more permissive NOD / SCID interleukin 2 receptor gamma chain deficient (NOD / SCID IL2Rγ null ) mice at 32 weeks after injection. It was also confirmed that no tumor was formed. In contrast, SSEA-1 + cells or SSEA-3 + cells sorted from cells exposed to hypoxia form continuously transplantable xenograft tumors, which are more than unsorted parental cells. Proliferated rapidly and actively (FIG. 2A). Xenograft tumors formed by either SSEA-3 + cells or SSEA-1 + cells will have a similar proportion of SSEA-3 +/- and SSEA-1 + / -Contained cells and reproduced phenotypic heterogeneity within the original tumor (Figure 2B). These results indicate that SSEA-1 / SSEA-3 negative cells are “differentiated” non-tumorigenic cells and that both SSEA-1 + and SSEA-3 + cell fractions It is included.
We next analyzed the expression of the SSEA and reprogramming genes in cells exposed to hypoxia (Figure 2C). Both SSEA-1 + and SSEA-3 + fractions showed a significant increase in OCT3 / 4, SOX2 and NANOG expression. In contrast, the negative fractions that failed to form xenograft tumors did not substantially show their expression. We further confirmed that all stem cell-like attributes (Fig. 1) observed in cells exposed to hypoxia were characteristic of SSEA-1 + and SSEA-3 + cells.

実験例3：分化した非造腫瘍細胞は、低酸素下において、驚くほどに短い期間で初期化を達成し造腫瘍細胞になる
4つの胚性抗原のいずれも発現しない細胞画分を選別した（図2D-a,-b）。選別した非造腫瘍細胞をnormoxiaで12時間培養した後、12時間、hypoxiaに暴露するかまたはnormoxiaに維持し、上記4つの胚性抗原の発現を再び解析した。normoxiaにおいても染色陽性の細胞のわずかな増加が観察されたが（図2D-c）、増加はhypoxia条件下でより顕著であり、SSEA-1+細胞は72倍増加していた（図2D-d,e）。解析された細胞全体のうちの生細胞の割合は、選別直後に96.8%、normoxiaでの培養後に92.7%、hypoxiaでの培養後に84.5%であった（図2D-f）。解析の期間（24時間）およびhypoxia条件とnormoxia条件との間で細胞生存率が同様であったことから、無視できる程度のSSEA-1+またはSSEA-3+細胞が残っていたか、または陰性細胞画分にそれら陽性細胞が混入し、24時間以内に著しく増殖したかまたは遥かに良く生存したという可能性は実質的に除外される。低酸素に暴露する前に陰性画分を連続して2回選別した場合も、SSEA-1+細胞およびSSEA-3+細胞について得られた結果は、上記と同様であった。以上の結果から、分化した非CSCは、驚くほど短い期間内に、低酸素誘導性のリプログラミング（hypoxia-induced reprogramming；HIR）によりCSCに復帰すると我々は結論した。
最初の低酸素暴露の後、4つ全ての抗原に対して染色陰性の細胞を選別して再度低酸素に暴露し、上記と同様に解析を行った。上記と同様、およそ10-15%または0.2-0.4%の細胞がそれぞれSSEA-1+またはSSEA-3+となった。このような手順を3サイクル繰り返したところ、同様の比率の細胞が各時点においてSSEA-1+またはSSEA-3+となることが確認された。このことは、ある特別な細胞画分のみでなく、あらゆる非CSCがCSCに復帰できることを示している。Experimental Example 3: Differentiated non-tumorigenic cells are remodeled and become tumor-forming cells in a surprisingly short period of time under hypoxia
Cell fractions that did not express any of the four embryonic antigens were selected (FIG. 2D-a, -b). The selected non-tumorigenic cells were cultured in normoxia for 12 hours, then exposed to hypoxia or maintained in normoxia for 12 hours, and the expression of the above four embryonic antigens was analyzed again. A slight increase in staining-positive cells was also observed in normoxia (Fig. 2D-c), but the increase was more pronounced under hypoxia conditions, and SSEA-1 + cells were increased 72-fold (Fig. 2D- d, e). The proportion of living cells out of the total analyzed cells was 96.8% immediately after selection, 92.7% after culture with normoxia, and 84.5% after culture with hypoxia (FIG. 2D-f). Negligible SSEA-1 + or SSEA-3 + cells remained, or negative cells due to similar period of analysis (24 hours) and hypoxia and normoxia conditions The possibility that the fractions were contaminated with those positive cells and proliferated significantly within 24 hours or survived much better is virtually excluded. The results obtained for SSEA-1 + and SSEA-3 + cells were similar to those described above even when the negative fraction was sorted twice consecutively prior to exposure to hypoxia. From these results, we conclude that differentiated non-CSC reverts to CSC by hypoxia-induced reprogramming (HIR) within a surprisingly short period of time.
After the initial hypoxic exposure, cells negative for all four antigens were selected and exposed again to hypoxia and analyzed as described above. As above, approximately 10-15% or 0.2-0.4% of cells became SSEA-1 + or SSEA-3 +, respectively. When such a procedure was repeated 3 cycles, it was confirmed that cells at the same ratio became SSEA-1 + or SSEA-3 + at each time point. This indicates that any non-CSC, not just a particular cell fraction, can revert to CSC.

実験例4：低酸素により生成されたCSCは多能性である
我々は次に、低酸素に暴露されたN417細胞が幹細胞のような複数系列への分化能を有し得るかどうかを調べた。低酸素暴露された細胞を24時間、ハンギングドロップ培養を行い、胚様体（EB）を形成させた。次に、細胞を種々の分化促進培地で培養した。実験手順は図3Aに示した。EBの形成を通じて、低酸素により活性化された初期化遺伝子は急速に（OCT3/4）または徐々にのいずれかで下方調節され、一方、3つの胚葉の様々な分化マーカー遺伝子が上方調節された（図3B）。低酸素に暴露しなかった場合、細胞は内胚葉系列および中胚葉系列のマーカー遺伝子の活性化を示さなかった。興味深いことに、典型的なEMTマーカー遺伝子であるビメンチンおよびフィブロネクチンは低酸素に暴露された細胞画分においてのみ活性化され、TGF-β1およびその受容体は、細胞を正常酸素に維持した場合も、低酸素に暴露した場合も、同様に活性化された。低酸素に暴露された細胞では、1日目から血管新生増殖因子が活性化され、4日目には内皮細胞（EC）マーカーであるヒトCD31（hCD31）およびヒトVEGFR-2を発現した（図3C）。陽性細胞の数は、細胞をVEGFおよびPDGFと共に培養した場合に更に増加した。分化促進培地中での2週間において、低酸素処理した細胞のみが外胚葉（βIIIチューブリン）、内胚葉（αフェトプロテイン；αFP）および中胚葉（α平滑筋アクチン；α-SMA）の分化マーカーを発現した（図3D）。このような多様な分化能力は、低酸素に暴露したH358細胞においても観察された。
次に、NOD-SCIDマウスの睾丸にSSEA-1+、SSEA-3+、または未選別の低酸素暴露したN417-GFP細胞を注入した（注入あたり104細胞）。2ヶ月後、未選別細胞では3回のうち2回の注入で、SSEA-1+細胞またはSSEA-3+細胞では全6回の注入すべてで腫瘍が形成され、βIIIチューブリン、αFPおよびα-SMAが腫瘍細胞内に検出された（図3E）。更に、腫瘍は、サイトケラチン14陽性の真皮、腺組織、筋肉等、3胚葉全てからの種々の分化により誘導された組織を含んでいた（図3F）。これらの組織化された組織がヒト細胞から構成されていることをGFP（図3F-e,f）、ヒトミトコンドリアおよびヒト核に対する抗体を用いた免疫組織化学により確認した。
これらの結果は、低酸素に暴露されたN417細胞は実際に多能性を有する細胞に初期化することを実証している。Example 4: CSC produced by hypoxia is pluripotent We next examined whether N417 cells exposed to hypoxia could have the potential to differentiate into multiple lineages like stem cells . Cells exposed to hypoxia were subjected to hanging drop culture for 24 hours to form embryoid bodies (EB). Next, the cells were cultured in various differentiation promoting media. The experimental procedure is shown in FIG. 3A. Through EB formation, reprogramming genes activated by hypoxia were down-regulated either rapidly (OCT3 / 4) or gradually, while various differentiation marker genes in the three germ layers were up-regulated (Figure 3B). When not exposed to hypoxia, cells did not show activation of endoderm-line and mesoderm-line marker genes. Interestingly, the typical EMT marker genes vimentin and fibronectin are activated only in the fraction of cells exposed to hypoxia, and TGF-β1 and its receptor also maintain cells in normoxia, It was similarly activated when exposed to hypoxia. In cells exposed to hypoxia, angiogenic growth factors were activated from day 1 and on day 4 expressed the endothelial cell (EC) markers human CD31 (hCD31) and human VEGFR-2 (Fig. 3C). The number of positive cells was further increased when cells were cultured with VEGF and PDGF. For 2 weeks in differentiation-promoting medium, only hypoxia treated cells show differentiation markers for ectoderm (βIII tubulin), endoderm (αfetoprotein; αFP) and mesoderm (α smooth muscle actin; α-SMA) Expressed (Figure 3D). Such diverse differentiation ability was also observed in H358 cells exposed to hypoxia.
The testes of NOD-SCID mice were then injected with SSEA-1 +, SSEA-3 +, or unselected hypoxia-exposed N417-GFP cells (10 4 cells per injection). Two months later, tumors formed with 2 out of 3 injections in unsorted cells and all 6 injections in SSEA-1 + or SSEA-3 + cells, βIII tubulin, αFP and α- SMA was detected in tumor cells (Figure 3E). Furthermore, the tumor contained tissues induced by various differentiations from all three germ layers, such as cytokeratin 14-positive dermis, glandular tissue, and muscle (FIG. 3F). It was confirmed by immunohistochemistry using antibodies against GFP (FIG. 3F-e, f), human mitochondria and human nucleus that these organized tissues were composed of human cells.
These results demonstrate that N417 cells exposed to hypoxia actually reprogram to pluripotent cells.

実験例5：異種移植腫瘍は、機能的な内皮細胞および血管平滑筋細胞にその後分化し、がん細胞の初期化を示している
N417-GFP異種移植腫瘍を組織学的に分析した。炭酸脱水酵素9（CA9）染色による評価を行なったところ、低酸素領域はまだら状またはパッチ状に散在しており、そのような低酸素領域内にOCT3/4陽性細胞およびSOX2陽性細胞が検出された（図4A）。CA9染色の状態に従い、腫瘍領域を4群に分類した：（a）殆どのがん細胞がCA9陽性である領域（高度低酸素領域）、（b）CA9陽性細胞により囲まれた領域（低酸素領域）、（c）僅かにCA9染色された細胞により囲まれた領域（中間領域）、（d）CA9陽性細胞を実質的に欠いた領域（非低酸素領域）（図4B）。高度低酸素領域および低酸素領域（a, b）内では、細胞はSOX2（a2, b2）、OCT3/4（a3, b3）、HIF1α（a6）、HIF2α（a7）、NANOG（a8）またはSSEA-1（a9）に対する染色が陽性であった。そのような低酸素領域においては、細胞は増殖マーカーKi-67（a10）の発現をほぼ欠いていた。低酸素領域の外側部分では、恐らくはがん細胞または宿主の炎症細胞のいずれかに由来する多くのアポトーシス細胞が観察された。中間領域では、SOX2およびOCT3/4の検出はほんの僅かであるか、または殆ど検出されなかった（c2、c3の矢印）。非低酸素領域では、SOX2（d2）およびOCT3/4（d3）は検出されず、細胞は増殖活性を示していた（d10）。
赤血球を含有する血管が各細胞島の中央領域に見られた。興味深いことに、hCD31陽性細胞は、低酸素領域内に比較的散在して検出された（a5, b5）。しかしながら、hCD31陽性細胞は、α-SMA陽性細胞（図4C）と共に集まって組織化され、非低酸素領域において血管を形作っており（c5, d5）、血管は徐々に成熟してより機能的になるかのようであった。この概念を支持する事実として、通常比較的大きな血管のECにおいて検出されるフォン・ヴィルブランド因子は、非低酸素領域内の血管においてのみ染色された（d4の矢印）。hCD31陽性細胞はヒトVEGFR-2も発現していた。
ECおよび血管平滑筋細胞（VSMC）を検出するために、hCD31、マウスCD31（mCD31）およびヒトαSMA（hαSMA）特異的抗体を用いた。これらのいずれも、異種の抗原と反応しないことを確認した。N417-GFP異種移植腫瘍内の実質的に全ての血管細胞は、hCD31抗体およびhαSMA抗体でのみ検出された（図4C）。そのようなhCD31陽性細胞およびhαSMA陽性細胞は抗GFP抗体で標識され、腫瘍内のECおよびVSMCが実際にがん細胞に由来することを更に確認した。H358異種移植腫瘍内の血管はhCD31抗体およびhαSMA抗体で染色されたが、mCD31抗体では染色されなかった。対照的に、H157異種移植腫瘍内およびH460異種移植腫瘍内のほぼ全てのECはmCD31陽性であった（それぞれ、約100%および約95%）。またこれらの腫瘍ではヒトおよびマウス両方のαSMAを認識する抗体を用いて検出されたECおよびαSMA陽性細胞は、血管様構造をとっていなかった。しかしながら、重要なことに、H460異種移植腫瘍では限られた領域が低酸素状態であり、この低酸素領域内の細胞ではSOX2、OCT3/4、SSEA-1およびhCD31が検出された。
興味深いことに、N417細胞およびH358細胞はH157細胞およびA549細胞よりも細胞増殖活性が遥かに低かったが、N417細胞またはH358細胞により形成された異種移植腫瘍は、H157細胞またはA549細胞により形成された異種移植腫瘍よりも急速に成長した。Example 5: Xenograft tumor subsequently differentiates into functional endothelial cells and vascular smooth muscle cells, showing cancer cell reprogramming
N417-GFP xenograft tumors were analyzed histologically. Evaluation by carbonic anhydrase 9 (CA9) staining revealed that the hypoxic region was scattered in a mottled or patchy manner, and OCT3 / 4-positive cells and SOX2-positive cells were detected in such hypoxic region. (FIG. 4A). According to the state of CA9 staining, tumor areas were classified into 4 groups: (a) areas where most cancer cells are CA9 positive (highly hypoxic areas), (b) areas surrounded by CA9 positive cells (hypoxia) (Region), (c) a region surrounded by slightly CA9-stained cells (intermediate region), and (d) a region substantially lacking CA9-positive cells (non-hypoxic region) (FIG. 4B). Within advanced hypoxia and hypoxia (a, b), cells are SOX2 (a2, b2), OCT3 / 4 (a3, b3), HIF1α (a6), HIF2α (a7), NANOG (a8) or SSEA -1 (a9) staining was positive. In such a hypoxic region, the cells almost lacked the expression of the proliferation marker Ki-67 (a10). In the outer part of the hypoxic region, many apoptotic cells were observed, probably derived from either cancer cells or host inflammatory cells. In the middle region, the detection of SOX2 and OCT3 / 4 was negligible or hardly detected (arrows c2, c3). In the non-hypoxic region, SOX2 (d2) and OCT3 / 4 (d3) were not detected, and the cells showed proliferative activity (d10).
Blood vessels containing erythrocytes were found in the central region of each cell island. Interestingly, hCD31 positive cells were detected relatively scattered in the hypoxic region (a5, b5). However, hCD31 positive cells are assembled and organized together with α-SMA positive cells (Fig. 4C), forming blood vessels in non-hypoxic regions (c5, d5), and blood vessels gradually mature and become more functional It seemed to be. In support of this concept, von Willebrand factor, usually detected in ECs of relatively large vessels, was stained only in vessels in non-hypoxic regions (d4 arrow). hCD31 positive cells also expressed human VEGFR-2.
HCD31, mouse CD31 (mCD31) and human αSMA (hαSMA) specific antibodies were used to detect EC and vascular smooth muscle cells (VSMC). None of these were confirmed to react with foreign antigens. Virtually all vascular cells within N417-GFP xenograft tumors were detected only with hCD31 and hαSMA antibodies (FIG. 4C). Such hCD31 positive cells and hαSMA positive cells were labeled with an anti-GFP antibody, further confirming that EC and VSMC in the tumor were actually derived from cancer cells. Blood vessels in H358 xenograft tumors were stained with hCD31 and hαSMA antibodies, but not with mCD31 antibodies. In contrast, almost all ECs in H157 xenograft and H460 xenograft tumors were mCD31 positive (about 100% and about 95%, respectively). In these tumors, EC and αSMA positive cells detected using antibodies recognizing both human and mouse αSMA did not have a blood vessel-like structure. Importantly, however, a limited region was hypoxic in H460 xenograft tumors, and SOX2, OCT3 / 4, SSEA-1, and hCD31 were detected in cells within this hypoxic region.
Interestingly, N417 and H358 cells were much less proliferative than H157 and A549 cells, but xenograft tumors formed by N417 or H358 cells were formed by H157 or A549 cells It grew faster than xenograft tumors.

実験例6：TRA-1-60/-81もSSEA-1/-3と同様に悪性がんの診断マーカーとなる
我々は更に、多能性を有する造腫瘍細胞と非造腫瘍細胞との識別を可能とする、SSEA-1またはSSEA-3以外のマーカーを探索した。
その目的のために、種々の初期化遺伝子およびES細胞特異的細胞表面抗原について、SSEA-1および／またはSSEA-3との発現の相関性を調べた。
具体的には先ず、上記のヒト肺がん細胞を5% O2で12時間インキュベートした後、FACS解析を行った。SSEA-1、SSEA-3およびSSEA-4の各々の陽性画分および陰性画分についてのOCT3/4、SOX2、NANOG、TRA-1-60およびTRA-1-81の発現を図5Aに示す。結果は、SSEA-1陰性細胞およびSSEA-3陰性細胞はTRA-1-60/-81陰性であること、および、SSEA-1陽性細胞およびSSEA-3陽性細胞はTRA-1-60/-81陽性であることを示している。重要なこととして、一部のSSEA-1/-3陽性細胞がTRA-1-60/-81陽性となるのではなく、ほぼ全てのSSEA-1/-3陽性細胞がTRA-1-60/-81陽性であり、また同時に、ほぼ全てのSSEA-1/-3陰性細胞はTRA-1-60/-81陰性であった。これは、特にSSEA-1について顕著であった。一方、SSEA-4陽性細胞はTRA-1-60/-81陰性であった。
この結果は、培養ヒト肺がん細胞による異種移植腫瘍（xenograft）のみならず、ヒト肺がん標本においても確認された（図5BおよびC）。図5Bは、FACS選別したSSEA-1陽性細胞103個をマトリゲルに封入して免疫不全マウスの皮下に移植し、12週間後に、成長した腫瘍（xenograft）を免疫染色法により解析したものである。一方、図5Cは、インフォームドコンセントを得て採取したヒト肺がん標本切片を免疫染色法で解析したものである（無作為に選んだ98症例で解析）。いずれの結果も、SSEA-1陽性細胞は同時にTRA-1-60/-81陽性であることを示している。
以上より、TRA-1-60/-81もSSEA-1/-3と同様に、多能性を有する造腫瘍細胞と非造腫瘍細胞とを識別するマーカーとして利用できることが実証された。Example 6: TRA-1-60 / -81 is also a diagnostic marker for malignant cancer, like SSEA-1 / -3. We further distinguish between pluripotent and non-tumor cells We searched for markers other than SSEA-1 or SSEA-3.
To that end, the correlation of expression with SSEA-1 and / or SSEA-3 was examined for various reprogramming genes and ES cell specific cell surface antigens.
Specifically, first, the above human lung cancer cells were incubated with 5% O 2 for 12 hours, and then FACS analysis was performed. The expression of OCT3 / 4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 and TRA-1-81 for the positive and negative fractions of SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4 is shown in FIG. 5A. The results show that SSEA-1 negative cells and SSEA-3 negative cells are TRA-1-60 / -81 negative, and SSEA-1 positive cells and SSEA-3 positive cells are TRA-1-60 / -81. It shows that it is positive. Importantly, not all SSEA-1 / -3 positive cells are TRA-1-60 / -81 positive, but almost all SSEA-1 / -3 positive cells are TRA-1-60 / At the same time, almost all SSEA-1 / -3 negative cells were TRA-1-60 / -81 negative. This was particularly noticeable for SSEA-1. On the other hand, SSEA-4 positive cells were TRA-1-60 / -81 negative.
This result was confirmed not only in xenograft tumors with cultured human lung cancer cells but also in human lung cancer specimens (FIGS. 5B and C). Fig. 5B shows 10 3 FACS-sorted SSEA-1-positive cells encapsulated in Matrigel and transplanted subcutaneously into immunodeficient mice, and 12 weeks later, the tumors grown (xenograft) were analyzed by immunostaining. . On the other hand, FIG. 5C shows an immunostaining analysis of human lung cancer specimen sections collected with informed consent (analyzed in 98 randomly selected cases). Both results indicate that SSEA-1 positive cells are simultaneously TRA-1-60 / -81 positive.
From the above, it was demonstrated that TRA-1-60 / -81 can also be used as a marker for discriminating between pluripotent tumorigenic cells and non-tumorigenic cells, like SSEA-1 / -3.

実験例7：SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60またはTRA-1-81の発現は肺がんの転移および生存率と有意に相関する
我々は次に、ヒト肺がん標本において、SSEA-1、NANOG、OCT3/4およびSOX2の4因子の発現（免疫染色法による）と、各種臨床病理所見（性別、がん腫の大きさ、組織分類、および転移）との相関を調べた。結果を表2に示す。結果は、SSEA-1のみが、その発現と、診断時点での転移の有無との有意な相関を示した。Experimental Example 7: SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 or TRA-1-81 expression is significantly correlated with metastasis and survival of lung cancer. , NANOG, OCT3 / 4 and SOX2 expression (by immunostaining) were correlated with various clinical pathological findings (gender, carcinoma size, histology, and metastasis). The results are shown in Table 2. As a result, only SSEA-1 showed a significant correlation between its expression and the presence or absence of metastasis at the time of diagnosis.

我々は更に、ヒト肺がん標本において、その生存率と各種因子との多変量解析を行った。結果を表3に示す。結果は、転移およびSSEA-1の発現が生存率と有意に相関することを示した。SSEA-1が最も強力な予後判定因子になる可能性も示された。   In addition, we performed multivariate analysis of survival rate and various factors in human lung cancer specimens. The results are shown in Table 3. The results showed that metastasis and SSEA-1 expression were significantly correlated with survival rate. It was also shown that SSEA-1 could be the most powerful prognostic factor.

本発明の試験方法によれば、がん組織等の臨床標本においてマーカータンパク質の発現を検出するだけで、多能性を有する造腫瘍細胞の存在を検出し、以って簡便かつ高信頼度にがん悪性度を試験できる。あるいは、マーカータンパク質の発現の検出に先立ち、がん組織等の試料中の細胞集団を低酸素負荷に供することにより、多能性を有する造腫瘍細胞への非造腫瘍細胞のリプログラミングを促進し、それにより試験の感度を更に向上させることができる。本発明の試験方法を適用することにより、生体内に存在する造腫瘍細胞または低酸素状態に起因して造腫瘍細胞に転換される見込みが高い非造腫瘍細胞をがんが初発または再発する前に検出して、悪性度を予測することが可能である。あるいは、がんの発症を初期のステージで検出してがん患者の早期治療に導くことも可能である。また、がん患者に対する治療効果を造腫瘍細胞または低酸素状態に起因して造腫瘍細胞に転換される見込みが高い非造腫瘍細胞の存在を指標にして評価することも可能である。更に、本発明により提供される試験方法、新規細胞および該細胞の調製方法は、例えば、非造腫瘍細胞から多能性を有する造腫瘍細胞へのリプログラミングの機構に関する研究や、悪性がんの有効な治療法の確立等のために有用であるばかりか、ｉＰＳ細胞作製においてがん化を防ぐ作製方法の開発にも資する。   According to the test method of the present invention, the presence of a pluripotent tumorigenic cell is detected simply by detecting the expression of a marker protein in a clinical specimen such as a cancer tissue, and thus simple and highly reliable. Can test for cancer malignancy. Alternatively, prior to detection of marker protein expression, the cell population in a sample of cancer tissue or the like is subjected to a hypoxic load to promote reprogramming of non-tumoral cells to pluripotent tumorigenic cells. Thereby, the sensitivity of the test can be further improved. By applying the test method of the present invention, tumor-forming cells existing in a living body or non-tumor-forming cells that are likely to be converted to tumor-forming cells due to hypoxia before cancer is first developed or recurred. It is possible to detect malignancy and predict the malignancy. Alternatively, it is possible to detect the onset of cancer at an early stage and lead to early treatment of cancer patients. It is also possible to evaluate the therapeutic effect on cancer patients using as an index the presence of tumorigenic cells or non-tumorigenic cells that are likely to be converted to tumorigenic cells due to hypoxia. Furthermore, the test method, novel cell and method for preparing the cell provided by the present invention include, for example, research on the mechanism of reprogramming from non-tumor cells to pluripotent tumor cells, malignant cancer It is useful not only for the establishment of effective treatment methods, but also for the development of production methods for preventing canceration in iPS cell production.

本出願は日本で出願された特願２０１２−０５２３４８（出願日：２０１２年３月８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
This application is based on Japanese Patent Application No. 2012-052348 filed in Japan (filing date: March 8, 2012), the contents of which are incorporated in full herein.

Claims (19)

肺がん細胞を含む細胞集団の潜在的ながん悪性度を試験する方法であって、
（１）試験の対象とする、肺がん細胞を含む細胞集団を用意する工程、
（３）前記の細胞集団におけるＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定する工程、および
（４）前記の１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である場合、前記測定工程に供された細胞集団には多能性を有する造腫瘍細胞が存在すると決定し、以って前記の試験の対象とする細胞集団は潜在的ながんの悪性度が高いと決定する工程
を含む、方法。 A method for testing the potential cancer malignancy of a cell population comprising lung cancer cells, comprising:
(1) preparing a cell population containing lung cancer cells to be tested;
(3) measuring the expression level of one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1 and SSEA-3 in the cell population, and (4) any of the expression of the one or more marker proteins Is positive, it is determined that there is a pluripotent tumorigenic cell in the cell population subjected to the measurement step, and the cell population to be tested is a potential cancer. A method comprising determining that the grade of malignancy is high. 前記測定工程の以前に、
（２）前記細胞集団を低酸素負荷に供する工程
を更に含み、前記測定工程において前記１以上のマーカータンパク質の発現レベルを測定される細胞集団が、前記低酸素負荷工程後の細胞集団であり、前記工程（４）において、前記の１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性である場合、前記の試験の対象とする細胞集団には多能性を有する造腫瘍細胞または低酸素状態に起因して多能性を有する造腫瘍細胞にリプログラミングされる蓋然性が高い分化した造腫瘍細胞が存在すると決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。 Before the measurement process,
(2) The method further comprises the step of subjecting the cell population to a hypoxic load, wherein the cell population in which the expression level of the one or more marker proteins is measured in the measuring step is a cell population after the hypoxic load step, In the step (4), if any one of the expression of the one or more marker proteins is positive, the cell population to be tested is caused by pluripotent tumorigenic cells or hypoxia The method of claim 1, further comprising determining that there are differentiated tumorigenic cells that are likely to be reprogrammed into pluripotent tumorigenic cells. 前記低酸素負荷工程において、１０％未満の酸素レベルにおける１０時間以上の低酸素負荷が少なくとも１回行われる、請求項２に記載の方法。   The method according to claim 2, wherein in the low oxygen load step, a low oxygen load of 10 hours or more at an oxygen level of less than 10% is performed at least once. 前記の試験の対象とする細胞集団が、ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３の両方の発現が陰性であることを指標にして選択されたものである、請求項２または３に記載の方法。   The method according to claim 2 or 3, wherein the cell population to be tested is selected based on the negative expression of both SSEA-1 and SSEA-3. 前記１以上のマーカータンパク質がＳＳＥＡ−１を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。   5. The method of any one of claims 1-4, wherein the one or more marker proteins comprise SSEA-1. 前記測定工程において、更に、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルも測定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。   The said measurement process WHEREIN: Furthermore, the expression level of 1 or more protein selected from the group which consists of TRA-1-60 and TRA-1-81 is also measured. Method. 前記測定工程において、更に、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１以外の１以上の幼若化マーカー遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルも測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。   The mRNA or protein expression level of one or more blast marker genes other than SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 is also measured in the measuring step. The method of any one of -6. 前記幼若化マーカー遺伝子が、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＲＥＸ１およびＥＲＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子である、請求項７に記載の方法。   The method according to claim 7, wherein the blastogenic marker gene is one or more genes selected from the group consisting of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, REX1 and ERAS. 前記の発現レベルの測定が、フローサイトメトリー法または免疫組織化学法を用いて行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the measurement of the expression level is performed using a flow cytometry method or an immunohistochemistry method. 試験の対象とする細胞集団が肺がんの術後の患者から採取されたものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the cell population to be tested is collected from a patient after surgery for lung cancer. がん悪性度が転移の可能性または生命予後不良の度合いである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 10, wherein the cancer malignancy is a possibility of metastasis or a poor life prognosis. 低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍性の肺がん細胞から生じた多能性を有する造腫瘍細胞を調製する方法であって、
（１）非造腫瘍性の肺がん細胞を含む細胞集団を用意する工程、
（２）前記の用意された細胞集団から、ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３の両方の発現が陰性であることを指標にして非造腫瘍細胞を選択する工程、
（３）前記の選択された細胞集団を低酸素負荷に供する工程、および
（４）低酸素負荷工程後の細胞集団から、ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質の発現のいずれかが陽性であることを指標にして、多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程
を含む、方法。 A method of preparing pluripotent tumorigenic cells generated from non-tumorigenic lung cancer cells by reprogramming induced by hypoxia, comprising:
(1) preparing a cell population containing non-tumorigenic lung cancer cells;
(2) a step of selecting non-tumorigenic cells from the prepared cell population using, as an index, negative expression of both SSEA-1 and SSEA-3;
(3) subjecting the selected cell population to a hypoxic load; and (4) one or more markers selected from the group consisting of SSEA-1 and SSEA-3 from the cell population after the hypoxic load step A method comprising a step of selecting tumorigenic cells having pluripotency using as an index that any one of protein expressions is positive. 前記の非造腫瘍細胞を選択する工程および前記の多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程において、前記１以上のマーカータンパク質がＳＳＥＡ−１を含む、請求項１２に記載の方法。   13. The method of claim 12, wherein in the step of selecting the non-tumor cell and the step of selecting the pluripotent tumor cell, the one or more marker proteins comprise SSEA-1. 前記の非造腫瘍細胞を選択する工程において、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現が陰性であることも当該選択の指標として用いられ、かつ／または、
前記の多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程において、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現が陽性であることも当該選択の指標として用いられる、
請求項１２または１３に記載の方法。 In the step of selecting the non-tumor cell, the expression of one or more proteins selected from the group consisting of TRA-1-60 and TRA-1-81 is also used as an indicator of the selection, And / or
In the step of selecting tumorigenic cells having pluripotency, the expression of one or more proteins selected from the group consisting of TRA-1-60 and TRA-1-81 is also positive. Used as
14. A method according to claim 12 or 13. 前記の選択された多能性を有する造腫瘍細胞において、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１以外の１以上の幼若化マーカー遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が陽性であることを確認することを更に含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。   Expression of mRNA or protein of one or more juvenile marker genes other than SSEA-1, SSEA-3, TRA-1-60 and TRA-1-81 in the selected pluripotent tumorigenic cells 15. The method according to any one of claims 12 to 14, further comprising confirming that is positive. 前記幼若化マーカー遺伝子が、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＲＥＸ１およびＥＲＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子である、請求項１５に記載の方法。   16. The method according to claim 15, wherein the blastogenesis marker gene is one or more genes selected from the group consisting of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC, NANOG, LIN28, REX1 and ERAS. 前記低酸素負荷工程において、１０％未満の酸素レベルにおける１０時間以上の低酸素負荷が少なくとも１回行われる、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 12 to 16, wherein in the low oxygen load step, a low oxygen load of 10 hours or more at an oxygen level of less than 10% is performed at least once. 前記の非造腫瘍細胞を選択する工程および前記の多能性を有する造腫瘍細胞を選択する工程において、細胞の選択が、フローサイトメトリー法を用いて行われる、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。   In the step of selecting the non-tumor cell and the step of selecting the pluripotent tumor cell, the selection of cells is performed using a flow cytometry method. 2. The method according to item 1. 低酸素負荷で誘導されるリプログラミングにより非造腫瘍性の肺がん細胞から生じた、ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３からなる群から選択される１以上のマーカータンパク質を発現する、多能性を有する造腫瘍細胞を６０％以上の細胞純度で含む、細胞調製物。 A pluripotent construct that expresses one or more marker proteins selected from the group consisting of SSEA-1 and SSEA-3, generated from non-tumorigenic lung cancer cells by reprogramming induced by hypoxia A cell preparation comprising tumor cells with a cell purity of 60% or higher.
JP2014503838A 2012-03-08 2013-03-04 Method for testing malignancy of cancer, pluripotent tumorigenic cells and method for preparing the same Expired - Fee Related JP6187939B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012052348 2012-03-08
JP2012052348 2012-03-08
PCT/JP2013/055865 WO2013133220A1 (en) 2012-03-08 2013-03-04 Cancer malignancy testing method, pluripotent tumorigenic cells, and preparation method therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2013133220A1 JPWO2013133220A1 (en) 2015-07-30
JP6187939B2 true JP6187939B2 (en) 2017-08-30

Family

ID=49116697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014503838A Expired - Fee Related JP6187939B2 (en) 2012-03-08 2013-03-04 Method for testing malignancy of cancer, pluripotent tumorigenic cells and method for preparing the same

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6187939B2 (en)
WO (1) WO2013133220A1 (en)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005230832B2 (en) * 2004-04-01 2010-11-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
JP2008278798A (en) * 2007-05-10 2008-11-20 Tokyo Medical & Dental Univ Method for detecting bladder cancer
BRPI0906681A2 (en) * 2008-01-25 2019-11-26 Hansabiomed Ou molecule associated with metastatic human tumor, methods of detecting both active gene and protein and to interfere with gene expression
JP5212977B2 (en) * 2008-06-10 2013-06-19 国立大学法人福井大学 Cancer stem cell enrichment method using low oxygen culture equipment and sugar-free medium
US20090317411A1 (en) * 2008-06-16 2009-12-24 Academia Sinica Compositions for inducing immune responses specific to globo h and ssea3 and uses thereof in cancer treatment
JP2010099039A (en) * 2008-10-27 2010-05-06 Fujifilm Corp Method for detecting neuroblastoma
JP2010130993A (en) * 2008-12-08 2010-06-17 Bio Matrix Research Inc Method for evaluating degree of malignancy of breast cancer, and array and kit for use in the evaluation method

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2013133220A1 (en) 2015-07-30
WO2013133220A1 (en) 2013-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kim et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression
JP6653689B2 (en) Cancer stem cell population and method for producing the same
Wang et al. Identification and characterization of CD133+ CD44+ cancer stem cells from human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines
JP2020073920A (en) Method for diagnosing pancreatic cancer
Debeb et al. Characterizing cancer cells with cancer stem cell-like features in 293T human embryonic kidney cells
Yasuda et al. Fibroblasts induce expression of FGF4 in ovarian cancer stem-like cells/cancer-initiating cells and upregulate their tumor initiation capacity
EP2529223B1 (en) Biomarkers for circulating tumor cells
Christensen et al. Immunohistochemical expression of stem cell, endothelial cell, and chemosensitivity markers in primary glioma spheroids cultured in serum-containing and serum-free medium
Habu et al. Expression of Oct3/4 and Nanog in the head and neck squamous carcinoma cells and its clinical implications for delayed neck metastasis in stage I/II oral tongue squamous cell carcinoma
GB2546213A (en) Method of isolating circulating tumor cells
Miconi et al. Immunophenotypic characterization of human glioblastoma stem cells: correlation with clinical outcome
JP2014506453A (en) Innate pluripotent somatic cells
US9846164B2 (en) Detection of human somatic cell reprogramming
Hopkinson et al. Establishment of a normal-derived estrogen receptor-positive cell line comparable to the prevailing human breast cancer subtype
KR101360409B1 (en) Novel Therapeutic Target for Gastric Cancer Based on Gastric Cancer Stem Cell
US20150017638A1 (en) Methods for assessing risk for cancer using biomarkers
JP6990586B2 (en) Delta 133p53 beta and delta 133p53 gamma isoforms are biomarkers for cancer stem cells
JP6187939B2 (en) Method for testing malignancy of cancer, pluripotent tumorigenic cells and method for preparing the same
Poojan et al. Flow cytometry‐based characterization of label‐retaining stem cells following transplacental BrdU labelling
Sadahira et al. WRN protein as a novel erythroblast immunohistochemical marker with applications for the diagnosis of Werner syndrome
KR102064588B1 (en) Biomarkers for detecting of diffrentiation to parathyroid cell and use thereof
Zavros et al. Development of Human Pituitary Adenoma Organoids to Facilitate Effective Targeted Treatments of Cushing's Disease.
Aiken Characterization of cellular heterogeneity in the SHH subgroup of medulloblastoma
Lefort et al. YB-1 is Required for the Genesis and Metastatic Capacity of Human Breast Cancer
Taskiran et al. Embryonic microenvironment suppresses YY1 and YY1-related genes in prostate cancer stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160203

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170104

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170303

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170411

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170609

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20170612

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170711

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170724

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6187939

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees