JP6157862B2 - Method for separating target substance-receptor complex and free receptor - Google Patents

Method for separating target substance-receptor complex and free receptor Download PDF

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Description

本発明は、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分離する方法に関する。   The present invention relates to a method for separating a target substance-receptor complex from a free receptor.

生体内に存在するペプチドの中には疾患により存在量が変化するものがあり、これらのペプチドは特定の疾患のマーカーになりうる。例えば、血中Ｃ−ペプチドは、インスリンが合成される前段階の物質であるプロインスリンの構成物質であり、インスリンと同程度の割合で血液中に分泌され、ほとんどが分解されないまま血液中を循環し、尿とともに排出される。このため、血中や尿中のＣ−ペプチドを測定することによりインスリンの分泌量を把握することができる。   Some peptides present in the body change in abundance depending on the disease, and these peptides can serve as markers for specific diseases. For example, blood C-peptide is a component of proinsulin, which is a substance at the stage before insulin is synthesized, and is secreted into the blood at a rate similar to that of insulin, and circulates in the blood with almost no decomposition. And discharged with urine. For this reason, the amount of insulin secretion can be grasped by measuring C-peptide in blood or urine.

したがって、特定の疾患に関連するペプチドを特異的に検出することにより、疾患の診断を行うことが可能となり、これらのペプチドの検出方法は重要な臨床検査となりうる。   Therefore, it is possible to diagnose a disease by specifically detecting a peptide related to a specific disease, and the method for detecting these peptides can be an important clinical test.

一方、標的物質に特異的に結合する物質（レセプター）を利用する方法は、標的物質の分離や定量を行う上で広く用いられている。標的物質が抗原である場合には、抗体（断片）を用いた抗原抗体反応を用いることができる。抗体は抗原への結合特異性が非常に高いため、抗原抗体反応を利用することにより抗原を特異的に検出することができる。   On the other hand, a method using a substance (receptor) that specifically binds to a target substance is widely used for separating and quantifying the target substance. When the target substance is an antigen, an antigen-antibody reaction using an antibody (fragment) can be used. Since an antibody has a very high binding specificity to an antigen, the antigen can be specifically detected by utilizing an antigen-antibody reaction.

ここで、インスリン等に代表される生理活性物質は一般的に血中濃度が低い。例えばインスリンと等モルで分泌され、内因性インスリン分泌の指標となるＣ−ペプチドは、血中の濃度が正常範囲で０．６〜１０ｎｇ／ｍＬであり、これは血液中のグルコース量の２０００万分の１程度である。そのため、このＣ−ペプチドのように、血中濃度の低い生理活性物質およびその指標を標的物質として測定するためにはシグナルの増幅が必須である。すなわち、例えば、現存の血糖測定のように１分子のグルコースが１つの発色物質を出す系ではなく、１分子の抗原が数万の発色物質等のシグナルを出す系が必要である。   Here, a physiologically active substance typified by insulin or the like generally has a low blood concentration. For example, C-peptide secreted equimolarly with insulin and serving as an index of endogenous insulin secretion has a blood concentration of 0.6 to 10 ng / mL in the normal range, which is 20 million minutes of the amount of glucose in blood. It is about 1 of. Therefore, signal amplification is indispensable for measuring a physiologically active substance having a low blood concentration and its index as a target substance, such as this C-peptide. That is, for example, a system in which one molecule of glucose emits a signal of tens of thousands of color developing substances is required instead of a system in which one molecule of glucose emits one color developing substance as in the existing blood glucose measurement.

現在ではこのシグナルの増幅に酵素や蛍光物質等が用いられている。酵素の場合、１分子の酵素が触媒作用により単位時間当たり複数個の発色物質あるいは特定波長の光子を出す。蛍光物質の場合は励起光を照射することにより、単位時間当たりに複数個の励起光とは波長の異なる光子を出す。これらの酵素または蛍光物質を抗原特異的に結合する抗体に標識し（以下、標識された抗体を、「標識抗体」と称する。）、当該標識抗体を抗原に結合させ、上記の単位時間を最適な長さに調節することで、抗原は１分子当たり数万の発色物質あるいは光子等のシグナルを出すことができる。   At present, enzymes, fluorescent substances, and the like are used for amplification of this signal. In the case of an enzyme, a single molecule of enzyme emits a plurality of coloring substances or photons of a specific wavelength per unit time by a catalytic action. In the case of a fluorescent substance, by irradiating excitation light, a plurality of photons having different wavelengths from the excitation light are emitted per unit time. The enzyme or fluorescent substance is labeled on an antibody that specifically binds to the antigen (hereinafter, the labeled antibody is referred to as “labeled antibody”), the labeled antibody is bound to the antigen, and the above unit time is optimized. By adjusting the length, the antigen can give tens of thousands of chromogenic or photon signals per molecule.

しかしながら、標識抗体は、抗原との結合の有無に関わらず、存在するだけでシグナルを出し続けるという問題がある。すなわち、抗原の量に対応したシグナルを得たければ、抗原と未結合の標識抗体（以下、「遊離体」と称する。）を系より分離（以下、「Ｂ／Ｆ分離」と称する（Ｂ＝結合体 Ｆ＝遊離体の略）。）する必要がある。このＢ／Ｆ分離を測定操作に含んだ系は酵素免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ」と称する。）等のヘテロジニアス測定系に代表される。特にＥＬＩＳＡは現在、抗原を測定するための一般的な手法であり、研究施設や院内の検査室等で汎用的に使用されている。   However, there is a problem that a labeled antibody continues to output a signal only if it exists regardless of the presence or absence of binding to an antigen. That is, if it is desired to obtain a signal corresponding to the amount of the antigen, the labeled antibody unbound to the antigen (hereinafter referred to as “free form”) is separated from the system (hereinafter referred to as “B / F separation”) (B = Conjugate F = abbreviation of free form))). A system including this B / F separation in the measurement operation is represented by a heterogeneous measurement system such as an enzyme immunoassay (hereinafter referred to as “ELISA”). In particular, ELISA is currently a general technique for measuring antigens and is widely used in research facilities and hospital laboratories.

しかしながら、Ｂ／Ｆ分離の操作は一般的に煩雑であり、正確な測定のためには熟練の技術あるいは大型の装置が必要となる。これらの問題により、ＥＬＩＳＡ等のヘテロジニアス測定系は、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ（患者の身辺での検査）での測定には向いていない。   However, the operation of B / F separation is generally complicated, and skillful technology or a large apparatus is required for accurate measurement. Due to these problems, heterogeneous measurement systems such as ELISA are not suitable for measurement at the point of care.

Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅで抗原を測定するためにはＢ／Ｆ分離の必要の無い測定系あるいは、Ｂ／Ｆ分離操作をなるべく簡便にした測定系を構築する必要がある。後者に応用可能な技術としては電気泳動移動度シフトアッセイ（以下、「ＥＭＳＡ」と称する。）が挙げられる（非特許文献１）。ＥＭＳＡは、核酸とタンパク質との特異的結合を利用するものである。通常、核酸をポリアクリルアミド、アガロースのようなゲル上で電気泳動に掛けると、それぞれの核酸の分子量に応じた位置にバンドが出現する。この際、電気泳動する核酸と相互作用（結合）するタンパク質を事前に系内（核酸を含む試料溶液）に添加した後に電気泳動を行なうと、核酸は本来出現すべき位置よりも高分子量側にバンドがシフトする。これは核酸−タンパク質の複合体が形成されることで全体の分子量が増加したためである。そしてタンパク質と反応しきれなかった未反応の核酸は、分子量が変化していないため、本来の位置にバンドが出現する。このＥＭＳＡの核酸を抗体、タンパク質を抗原に置き換えて考えると、混合溶液に電場を掛けるのみでＢ／Ｆ分離を達成しうる測定系が構築されることは明白である。実際に、非特許文献２や特許文献１では、抗原−標識抗体の複合体と遊離体とを分離し、抗原量を定量する技術が開示されている。   In order to measure an antigen by Point of Care, it is necessary to construct a measurement system that does not require B / F separation or a measurement system that makes B / F separation operation as simple as possible. A technique applicable to the latter is an electrophoretic mobility shift assay (hereinafter referred to as “EMSA”) (Non-Patent Document 1). EMSA utilizes specific binding between a nucleic acid and a protein. Usually, when a nucleic acid is subjected to electrophoresis on a gel such as polyacrylamide or agarose, a band appears at a position corresponding to the molecular weight of each nucleic acid. At this time, if a protein that interacts with (combines with) the nucleic acid to be electrophoresed is added to the system (sample solution containing the nucleic acid) in advance, and then electrophoresis is performed, the nucleic acid will be on the higher molecular weight side than the position where it should originally appear. The band shifts. This is because the overall molecular weight was increased by the formation of a nucleic acid-protein complex. The unreacted nucleic acid that could not react with the protein has no change in molecular weight, and thus a band appears at the original position. When this EMSA nucleic acid is replaced with an antibody and protein is replaced with an antigen, it is clear that a measurement system capable of achieving B / F separation only by applying an electric field to the mixed solution is constructed. Actually, Non-Patent Document 2 and Patent Document 1 disclose a technique for separating an antigen-labeled antibody complex from a free substance and quantifying the amount of the antigen.

特開２００５−１８１２９９号公報JP 2005-181299 A

Garner, M.M.及びRevzin, A.、「特異的DNA領域へのタンパク質結合の定量に関するゲル電気泳動法：大腸菌ラクトースオペロン調節システムの構成要素への適用」、Nucleic Acids Research、9:3047-3060 (1981)Garner, MM and Revzin, A., “Gel electrophoresis for quantification of protein binding to specific DNA regions: application to components of the E. coli lactose operon regulatory system”, Nucleic Acids Research, 9: 3047-3060 (1981 ) 田中喜秀、鳴石奈穂「マイクロチップ電気泳動技術を用いたオンサイト唾液ストレス計側システムの開発」YAKUGAKU ZASSHI 128(11) 1595-1604Yoshihide Tanaka, Naho Narishi “Development of on-site saliva stress measurement system using microchip electrophoresis technology” YAKUGAKU ZASSHI 128 (11) 1595-1604

しかしながら、これらの方法では抗原が限定され、抗原の分子量は標識抗体と同程度のものしか測定出来ないという問題があった。すなわち、分子量が一般的な抗体であるＩｇＧの６０分の１程度しかないＣ−ペプチドのような比較的低分子量の抗原の場合、抗原と標識抗体とが複合体を形成しても分子量の増加率はほとんど無く、Ｂ／Ｆ分離を行なうことが不可能であった。   However, these methods have a problem that the antigen is limited and the molecular weight of the antigen can be measured only to the same extent as the labeled antibody. That is, in the case of an antigen having a relatively low molecular weight such as a C-peptide having a molecular weight of only about 1/60 of IgG, which is a general antibody, the molecular weight increases even if the antigen and the labeled antibody form a complex. There was almost no rate, and B / F separation was impossible.

そこで本発明は、電気泳動により標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分離する方法を提供することを目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a method for separating a complex of a target substance and a receptor from a free receptor by electrophoresis.

本発明は、レセプターとして、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いて、標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分子量の差で電気泳動により分離する方法である。   The present invention is a method of separating a target substance / receptor complex and a free receptor by electrophoresis based on a difference in molecular weight using at least two or more kinds of receptors that specifically recognize different sites of the target substance. is there.

実施例１の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of Example 1. 実施例１により得られた標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度の算出の際に指定したレーンを表す図である。FIG. 3 is a diagram showing lanes specified when calculating the signal intensity of the band of the target substance-receptor complex obtained in Example 1. 実施例１において、標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度とＣ−ペプチド量との関係を表す図である。In Example 1, it is a figure showing the relationship between the signal intensity of the band of a target substance-receptor complex, and the amount of C-peptides.

本発明の第一実施形態は、レセプターは、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる、標的物質およびレセプターの複合体標的物質およびレセプターの複合体（以下、「標的物質−レセプターの複合体」または単に「複合体」とも称する場合がある。）と遊離レセプターとを分子量の差で電気泳動により分離する方法である。なお、本明細書中、「標的物質およびレセプターの複合体」または「標的物質−レセプターの複合体」とは、２種以上のレセプターが結合した標的物質のことを意味し、特記しない限り１種のレセプターが結合した標的物質を包含しない。   In the first embodiment of the present invention, at least two or more receptors that specifically recognize different sites of the target substance are used. The target substance and receptor complex Target substance and receptor complex (hereinafter “target”) This may be referred to as “substance-receptor complex” or simply “complex”) and free receptor by electrophoresis based on the difference in molecular weight. In the present specification, the “target substance-receptor complex” or “target substance-receptor complex” means a target substance to which two or more kinds of receptors are bound. It does not include the target substance bound by the receptor.

電気泳動による標的物質−レセプター複合体の検出は、ＥＬＩＳＡ法などと比べて非常に簡便な操作で精度よく検出できるため、非常に有用な手段である。   The detection of the target substance-receptor complex by electrophoresis is a very useful means because it can be detected with high accuracy by a very simple operation as compared with the ELISA method or the like.

本発明によれば、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとの分子量の差により、電気泳動の移動度に差が生じ、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することが可能となる。したがって、本発明の方法によれば、極めて簡便な方法により標的物質を検出できる。また、標的物質が疾患に関連する物質である場合には、該標的物質を検出することにより、疾患の診断を簡便に行うことができる。   According to the present invention, the difference in molecular weight between the target substance-receptor complex and the free receptor causes a difference in electrophoretic mobility, and the target substance-receptor complex and the free receptor can be clearly separated. It becomes. Therefore, according to the method of the present invention, the target substance can be detected by a very simple method. When the target substance is a substance related to a disease, the diagnosis of the disease can be easily performed by detecting the target substance.

また、本発明の方法によると、一旦、予め標的物質の含有量が既知のサンプルで検量線を作成しておくと、その検量線に基づいて、標的物質の含有量を正確に測定できる。本発明によれば、標的物質の含有量を直接的に測定することができるので、信頼性が高く、また、複数のサンプルの標的物質の含有量を簡便にかつ同時に測定できる。   Also, according to the method of the present invention, once a calibration curve is prepared with a sample whose target substance content is known in advance, the content of the target substance can be accurately measured based on the calibration curve. According to the present invention, since the content of the target substance can be directly measured, the reliability is high, and the content of the target substance in a plurality of samples can be measured easily and simultaneously.

したがって、本発明の方法により標的物質が低分子の場合でも、Ｂ／Ｆ分離を簡便に行なうことができる標的物質の測定系を構築することが可能である。よって、本発明によれば、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅで抗原を検出可能な基礎測定原理が提供される。   Therefore, it is possible to construct a target substance measurement system capable of easily performing B / F separation even when the target substance is a low molecule by the method of the present invention. Therefore, according to the present invention, a basic measurement principle capable of detecting an antigen with Point of Care is provided.

以下、本発明の具体的態様について詳細に説明する。   Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described in detail.

［電気泳動に用いるサンプル］
電気泳動に用いるサンプルは、標的物質（例えば、抗原）と、標的物質に特異的に結合するレセプター（例えば、抗体）とを結合させる反応（例えば、抗原抗体反応）を行った後のサンプルである。したがって、電気泳動に用いるサンプルには標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとが含まれる。なお、上記標的物質−レセプター複合体には、すべてのレセプターが標的物質と結合した複合体と、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体と、がある。このうち、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体では分子量の差により、複合体と遊離レセプターとを分離できない場合がある。すなわち、２種のレセプターを使用する場合には、１種のレセプターと標的物質との複合体は、当該レセプターとの分子量の差がほとんど生じないため、本発明の方法によっても、遊離レセプターと複合体との分離が困難である。このため、電気泳動に用いるサンプルでは、可能な限りすべてのレセプターが標的物質と結合して複合体を形成することが好ましい。具体的には、電気泳動に用いるサンプル中の、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体の量が、サンプル中標的物質の１０ｍｏｌ％以下であることが好ましく、サンプル中標的物質の１ｍｏｌ％以下であることがより好ましい。このような量であれば、標準物質の濃度を十分な精度で測定でき、また、疾患の診断にも十分適用できる。なお、電気泳動に用いるサンプル中の、一部のレセプターのみが標的物質と結合した複合体の量の下限は、なるべく低いことが好ましいので、サンプル中標的物質の０ｍｏｌ％であるが、サンプル中標的物質の１ｍｏｌ％以上であれば十分である。 [Samples used for electrophoresis]
The sample used for electrophoresis is a sample after performing a reaction (for example, antigen-antibody reaction) that binds a target substance (for example, an antigen) and a receptor (for example, an antibody) that specifically binds to the target substance. . Therefore, the sample used for electrophoresis contains a target substance-receptor complex and a free receptor. The target substance-receptor complex includes a complex in which all receptors bind to the target substance, and a complex in which only some of the receptors bind to the target substance. Among these, in the complex in which only some of the receptors are bound to the target substance, the complex and the free receptor may not be separated due to the difference in molecular weight. That is, when two kinds of receptors are used, a complex of one kind of receptor and a target substance hardly causes a difference in molecular weight with the receptor. It is difficult to separate from the body. For this reason, in the sample used for electrophoresis, it is preferable that all the receptors bind to the target substance as much as possible to form a complex. Specifically, the amount of the complex in which only some of the receptors are bound to the target substance in the sample used for electrophoresis is preferably 10 mol% or less of the target substance in the sample, and 1 mol of the target substance in the sample. % Or less is more preferable. With such an amount, the concentration of the standard substance can be measured with sufficient accuracy, and it can be sufficiently applied to disease diagnosis. In addition, since the lower limit of the amount of the complex in which only some of the receptors are bound to the target substance in the sample used for electrophoresis is preferably as low as possible, it is 0 mol% of the target substance in the sample. 1 mol% or more of the substance is sufficient.

標的物質と、標的物質に特異的に結合するレセプターとを結合させる反応は、従来公知の方法によって行われる。具体的には、標的物質と、標的物質のそれぞれ異なる部位に特異的に結合する少なくとも２種以上のレセプターと、を混合して反応させる。一態様として、抗原抗体反応の条件を挙げると、反応温度は、通常４〜５０℃、好ましくは４〜４２℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。反応時間は、通常５分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜１６時間、さらに好ましくは３０分間〜１２０分間である。本来の抗原抗体反応の好ましい反応時間は上記の通りであるが、標的物質を迅速に測定する場合には抗原抗体反応を早めに切り上げても問題はない。迅速に測定結果を算出するためには抗原抗体反応を数分〜１０分程度で切り上げることが好ましい。反応溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝溶液、トリシン緩衝液等を使用することができる。標的物質と反応させるレセプターの量は、適宜設定すればよいが、標的物質に対して、通常大過剰のレセプターが添加される。具体的には、レセプターを、標的物質（抗原）１分子に対して、１分子以上の量で添加し、好ましくは１分子を超えて１００分子以下となるような量、より好ましくは１０〜１００分子となるような量で添加される。ここで、通常の検査などでは、標的物質（抗原）の量は不明であるが、このような場合には、一般的にその標的物質（抗原）が試料中に存在する量（例えば、Ｃ−ペプチドでは、０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ程度）を基準として、上記混合比となるように、レセプターを添加すればよい。   The reaction for binding the target substance and the receptor that specifically binds to the target substance is performed by a conventionally known method. Specifically, the target substance and at least two or more receptors that specifically bind to different sites of the target substance are mixed and reacted. In one aspect, the antigen-antibody reaction conditions are usually 4 to 50 ° C., preferably 4 to 42 ° C., and more preferably 20 to 40 ° C. The reaction time is usually 5 minutes to 24 hours, preferably 10 minutes to 16 hours, and more preferably 30 minutes to 120 minutes. Although the preferable reaction time of the original antigen-antibody reaction is as described above, there is no problem even if the antigen-antibody reaction is rounded up early when measuring the target substance quickly. In order to calculate the measurement result quickly, it is preferable to round up the antigen-antibody reaction in several minutes to 10 minutes. Examples of the reaction solvent that can be used include phosphate buffer (PBS), carbonate buffer, Tris buffer, glycine buffer, and tricine buffer. The amount of the receptor to be reacted with the target substance may be appropriately set, but usually a large excess of the receptor is added to the target substance. Specifically, the receptor is added in an amount of 1 molecule or more with respect to 1 molecule of the target substance (antigen), preferably an amount exceeding 1 molecule and 100 molecules or less, more preferably 10 to 100. It is added in such an amount that it becomes a molecule. Here, in a normal test or the like, the amount of the target substance (antigen) is unknown, but in such a case, generally the amount of the target substance (antigen) present in the sample (for example, C- In the case of a peptide, the receptor may be added so that the above mixing ratio is obtained with reference to 0.6 to 10 ng / mL).

反応に供する際には、抗原およびレセプターは適当な溶媒（例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、トリシン緩衝液、グリシン緩衝液、トリス−グリシン緩衝液等）に溶解して用いることができる。標的物質−レセプター結合反応（例えば、抗原抗体反応）を行った試料は電気泳動する前に、前処理を行ってもよい。前処理としては、遠心操作やフィルター濾過により、大きな凝集体を取り除く操作が挙げられる。   When subjected to the reaction, the antigen and receptor are used after being dissolved in an appropriate solvent (for example, phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, Tricine buffer, glycine buffer, Tris-glycine buffer, etc.). be able to. A sample subjected to a target substance-receptor binding reaction (for example, an antigen-antibody reaction) may be subjected to pretreatment before electrophoresis. Examples of the pretreatment include an operation of removing large aggregates by centrifugal operation or filter filtration.

電気泳動に供するサンプルは、ｐＨを下記泳動用緩衝液（ランニングバッファー）のｐＨに調整することが好ましい。ただし、ランニングバッファーに対し、サンプル（バッファー）の量は微量であるので、サンプル（バッファー）のｐＨがランニングバッファーとは異なっていても泳動が始まれば同じｐＨになり、特にサンプルのｐＨ調整を行わなくともよい。   The sample to be subjected to electrophoresis is preferably adjusted to the pH of the following electrophoresis buffer (running buffer). However, since the amount of sample (buffer) is very small compared to the running buffer, even if the pH of the sample (buffer) is different from that of the running buffer, the pH will be the same when electrophoresis starts, especially when adjusting the pH of the sample. Not necessary.

［標的物質］
本発明における標的物質としては、目的（診断しようとする疾患の種類）に応じて、適宜選択される。 [Target substance]
The target substance in the present invention is appropriately selected according to the purpose (type of disease to be diagnosed).

標的物質としては、特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸、低分子化合物（好ましくは、分子量が１ｋＤａ以下の低分子化合物）およびこれらの複合体等が挙げられる。中でも、標的物質は、本発明の有益性の観点からは、ペプチドであることが好ましい。   The target substance is not particularly limited, and examples thereof include proteins, peptides, sugar chains, nucleic acids, low molecular compounds (preferably low molecular compounds having a molecular weight of 1 kDa or less), and complexes thereof. Among these, the target substance is preferably a peptide from the viewpoint of the benefit of the present invention.

本明細書において、タンパク質またはペプチドには、遊離体、リン酸基、メチル基、アセチル基、糖鎖、脂質、ニトリル基等の修飾を受けた修飾体、酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩、核酸と結合している核タンパク質など他の物質と結合しているタンパク質またはペプチドが含まれる。   In the present specification, protein or peptide includes a free form, a phosphate group, a methyl group, an acetyl group, a sugar chain, a lipid, a modified body such as a lipid, a nitrile group, an acid (eg, inorganic acid, organic acid). Or a salt with a base (eg, alkali metal salt), a protein or peptide bound to another substance such as a nucleoprotein bound to a nucleic acid.

標的物質の分子量としては、本発明の効果をより発揮するという観点からは、１，０００〜３０，０００であることが好ましく、１，０００〜１０，０００であることがより好ましく、１,０００〜５,０００であることがさらに好ましい。標的物質の分子量が上記範囲を超える場合であっても遊離レセプターの分離、標的物質の検出は可能であるが、本発明の効果は、上記範囲内において効果的に発揮される。すなわち、標的物質の分子量が低い場合、例えばペプチドの場合、ペプチド単体を電気泳動で検出しようとすると、泳動後の転写、抗体の添加、染色等の操作を種々検討する必要があり、ペプチドに抗体等のレセプターを結合させた状態で電気泳動を行う方が容易に泳動で対象を検出できる。さらに、ペプチドのような分子量の低い標的物質は、従来のＥＭＳＡの様な方法の場合、分子ふるいによる分離によっても、遊離レセプターと複合体との分子サイズの差が小さいことに起因して明確に分離されない。しかしながら、本発明の分離方法によれば、比較的分子量が小さい標的物質であっても、容易にかつ明確に遊離レセプターと複合体とを分離することができる。かような観点から、本発明では比較的分子量が小さい標的物質であることが好ましい。標的物質が未知物質である場合には公知の分析方法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アミノ酸分析等）により分子量を求めることができる。   The molecular weight of the target substance is preferably 1,000 to 30,000, more preferably 1,000 to 10,000, and more preferably 1,000 from the viewpoint of further exerting the effects of the present invention. More preferably, it is ˜5,000. Even when the molecular weight of the target substance exceeds the above range, the free receptor can be separated and the target substance can be detected, but the effects of the present invention are effectively exhibited within the above range. That is, when the molecular weight of the target substance is low, for example, in the case of a peptide, in order to detect a single peptide by electrophoresis, various operations such as transfer after electrophoresis, addition of antibody, and staining need to be studied. It is easier to detect an object by electrophoresis when electrophoresis is performed in a state where a receptor such as a receptor is bound. Furthermore, a target substance having a low molecular weight such as a peptide can be clearly identified due to the small difference in molecular size between the free receptor and the complex, even in the case of a conventional method such as EMSA, even by separation with a molecular sieve. Not separated. However, according to the separation method of the present invention, a free receptor and a complex can be easily and clearly separated even with a target substance having a relatively small molecular weight. From such a viewpoint, in the present invention, a target substance having a relatively small molecular weight is preferable. When the target substance is an unknown substance, the molecular weight can be determined by a known analysis method (SDS-PAGE, amino acid analysis, etc.).

また、標的物質の分子量が、レセプターの分子量の１／１５０〜１／５であるのが好ましい。標的物質の分子量が、上記範囲内であれば、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとの分子量の差に基づいて、電気泳動における移動度の差が効果的に生じ、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとを電気泳動により簡便に精度よく分離することができる。なお、レセプターの分子量が上記範囲を超える場合であっても遊離レセプターの分離、標的物質の検出は可能であるが、本発明の効果は、上記範囲内において効果的に発揮される。   The molecular weight of the target substance is preferably 1/150 to 1/5 of the molecular weight of the receptor. If the molecular weight of the target substance is within the above range, a difference in mobility in electrophoresis is effectively generated based on the difference in molecular weight between the target substance-receptor complex and the free receptor. The complex and the free receptor can be easily and accurately separated by electrophoresis. Even when the molecular weight of the receptor exceeds the above range, the free receptor can be separated and the target substance can be detected, but the effects of the present invention are effectively exhibited within the above range.

本発明は、Ｃ−ペプチドなどの低分子量の物質であっても、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとの分子量の差により、電気泳動の移動度に差が生じ、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することが可能となる。   In the present invention, even in the case of a low molecular weight substance such as C-peptide, the mobility of electrophoresis is caused by the difference in molecular weight between the target substance-receptor complex and the free receptor, and the target substance-receptor complex And free receptor can be clearly separated.

電気泳動の際、電気泳動される物質（例えば、標的物質−レセプター複合体）は、ゲルと電界とによる力が常に負荷され続ける。そのため、標的物質−レセプター複合体を形成したとしても、電気泳動の際に、標的物質−レセプター複合体の構造が安定に存在することが難しい場合がある。一般的には、低分子量の標的物質に比較的大きな分子量を有する（それぞれ別の部位を認識する）レセプターを２種以上結合させた場合、標的物質に結合するレセプター同士が非常に近接した状態となるため、立体的に不安定な状態で、標的物質−レセプター複合体が電気泳動に耐えうる安定性を有していないことが推測される。すなわち、電気泳動の際にレセプターの少なくとも１種が標的物質から外れるということが生じうる。その場合、電気泳動で検出される対象としては、１種のレセプターが結合する標的物質となり、電気泳動では、レセプター遊離体のシグナルと１種のレセプターが結合する標的物質のシグナルとが分離できず、結果として、精度よく標的物質の濃度が測定できない、という結果となってしまう。   During electrophoresis, a substance to be electrophoresed (for example, a target substance-receptor complex) is constantly loaded with a force from a gel and an electric field. Therefore, even if a target substance-receptor complex is formed, it may be difficult for the structure of the target substance-receptor complex to exist stably during electrophoresis. In general, when two or more receptors having relatively large molecular weights (recognizing different sites) are bound to a low molecular weight target substance, the receptors that bind to the target substance are in close proximity to each other. Therefore, it is presumed that the target substance-receptor complex is not stable enough to withstand electrophoresis in a sterically unstable state. That is, it may occur that at least one of the receptors is detached from the target substance during electrophoresis. In this case, the target to be detected by electrophoresis is a target substance to which one type of receptor binds, and in electrophoresis, the signal of the receptor free substance and the signal of the target substance to which one type of receptor bind cannot be separated. As a result, the concentration of the target substance cannot be measured accurately.

しかしながら、本願発明者は、Ｃ−ペプチドのように、低分子量の標的物質を検出する際に、これらの物質にそれぞれ異なる部位に特異的に結合するレセプターを２種以上用いた場合においても、標的物質−レセプター複合体が電気泳動の際に安定に存在することができ、電気泳動により標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することができることを見出した。これらの効果は、標的物質の分子量が上記範囲内である場合に特に発揮され、極めて簡便な方法により標的物質を検出できる。   However, the present inventor, when detecting low molecular weight target substances such as C-peptide, even when two or more receptors that specifically bind to different sites are used for these substances, It has been found that the substance-receptor complex can exist stably during electrophoresis, and the target substance-receptor complex and the free receptor can be clearly separated by electrophoresis. These effects are particularly exerted when the molecular weight of the target substance is within the above range, and the target substance can be detected by a very simple method.

標的物質の具体例としては以下のタンパク質を好ましく挙げることができる；インスリン、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＬＰ−１(グルカゴン様ペプチドー１)、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、Ｈ−ＦＡＢＰ（心筋型脂肪酸結合タンパク質）、ミオグロビン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ（Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド）。   Specific examples of the target substance are preferably the following proteins: insulin, C-peptide, GLP-1 (glucagon-like peptide-1), GIP (glucose-dependent insulin secretion stimulating polypeptide), adiponectin, H-FABP (Myocardial fatty acid binding protein), myoglobin, troponin I, troponin T, BNP (brain natriuretic peptide), NT-ProBNP (N-terminal pro brain natriuretic peptide).

なお、本明細書において特記しない限り「タンパク質」には、ペプチドが包含されるが、１０ｋＤａ未満のポリペプチドを特に「ペプチド」と称する場合がある。また、タンパク質は天然物であっても合成物であってもよい。   Unless otherwise specified in this specification, “protein” includes a peptide, but a polypeptide of less than 10 kDa may be particularly referred to as “peptide”. The protein may be a natural product or a synthetic product.

標的物質は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）由来の試料（血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等）、細胞（培養細胞、細胞株等）、その培養上清、それらの抽出物、それらの部分精製画分等から調製することができる。また、各種環境の土壌、水等から抽出してもよい。この際、標的物質は、公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することにより、製造されうる。具体的には、例えば、哺乳動物の組織または細胞を界面活性剤の存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、精製されうる。標的物質は市販品であってもよい。   The target substance is a sample (blood, plasma, serum, tissue, joint fluid, urine, human or non-human mammal (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.) Lymph, etc.), cells (cultured cells, cell lines, etc.), culture supernatants thereof, extracts thereof, partially purified fractions thereof and the like. Moreover, you may extract from soil, water, etc. of various environments. At this time, the target substance can be produced by purification using a known protein purification method. Specifically, for example, mammalian tissues or cells are homogenized in the presence of a surfactant, and the resulting crude extract fraction of tissues is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. It can be purified by attaching to a graph or the like. The target substance may be a commercial product.

また、標的物質を精製（抽出）せずに、被検試料をそのまま用いてもよい。例えば、被検者の血液、血漿、血清、組織、関節液、尿、リンパ液等の生体成分等の被検試料を用いて標的物質−レセプター結合反応を行ってもよい。この際、被検試料に対して、希釈、精製等の処理を行ってもよい。   Further, the test sample may be used as it is without purifying (extracting) the target substance. For example, the target substance-receptor binding reaction may be carried out using a test sample such as a biological component such as blood, plasma, serum, tissue, joint fluid, urine, lymph, etc. of the subject. At this time, treatment such as dilution and purification may be performed on the test sample.

［レセプター］
本発明においてレセプターとは標的物質と特異的に結合することができる物質を指す。本発明において、レセプターは、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる。すなわち、抗原の異なるエピトープを認識する２種以上の抗体を用いる。 [Receptor]
In the present invention, a receptor refers to a substance that can specifically bind to a target substance. In the present invention, at least two or more receptors that specifically recognize different sites of the target substance are used. That is, two or more antibodies that recognize different epitopes of the antigen are used.

レセプターとしては、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する２種以上であれば特に制限されず、例えば、抗体、抗原との結合活性を有する抗体の断片（抗体フラグメント）、ＤＮＡアプタマー等の核酸、タンパク質、タンパク質で構成された受容体、バインディングプロテイン、ペプチド、生体レセプター、糖鎖などが挙げられる。これらのでも、標的物質（抗原）との特異的結合性が高いことから、レセプターとしては抗体または抗体の断片を用いることが好ましい。これらの抗体は、組み合わせて用いてもよい。なお、抗原の同じエピトープを認識するレセプターを組み合わせる場合は、異なるエピトープを認識する他のレセプターもさらに必要である。   The receptor is not particularly limited as long as it is two or more types that specifically recognize different sites of the target substance. For example, an antibody, an antibody fragment having an activity of binding to an antigen (antibody fragment), a DNA aptamer, etc. Examples include nucleic acids, proteins, receptors composed of proteins, binding proteins, peptides, biological receptors, sugar chains and the like. Of these, since the specific binding property to the target substance (antigen) is high, it is preferable to use an antibody or an antibody fragment as the receptor. These antibodies may be used in combination. When combining receptors that recognize the same epitope of an antigen, other receptors that recognize different epitopes are further required.

抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。抗原への特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。   Examples of antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single chain antibodies, modified antibodies (eg, “humanized antibodies” in which only the antigen recognition site is humanized), chimeric antibodies, and bifunctionality capable of simultaneously recognizing two epitopes. An antibody etc. are mentioned. The antibody may be of any class such as IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. From the viewpoint of specific binding to an antigen, it is more preferable to use a monoclonal antibody.

抗体の断片（フラグメント）としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体等が挙げられる。 The antibody fragment (fragment) is prepared by genetic engineering such as Fab fragment, Fab ′ fragment, F (ab) ′ 2 fragment, single chain antibody (scFv), scFv-Fc, minibody, diabody and the like. And their derivatives modified with a molecule having a protein stabilizing action such as polyethylene glycol (PEG).

なお、かかるレセプターは、標的物質との結合が阻害されない範囲内において修飾を受けたものであってもよい。かかる修飾の例としては、検出効率を向上するための、蛍光標識物質を化学結合で結合させた蛍光標識化、レセプターを構成する原子を放射性同位体で標識する放射能標識化、対になる物質に対して特異的な結合性を示す物質を化学的に結合させた特異的結合対標識化（例えば、ビオチン、多糖に結合性を示すレクチンを化学的に結合させた標識など）等が例示される。標識に用いられる標識物質としては、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）またはテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはフィコエリトリン等の酵素が挙げられる。また、レセプター（例えば、抗体）とグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光発光蛋白質などと融合させてもよい。また、電気泳動等に有利なように化学修飾したレセプターでもよく、修飾前のレセプターが有する官能基と反応できる架橋剤を使用して化学修飾を行うことができる。架橋剤としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）Ｎ−スクシンイミジル（４−イオードアセチル）アミノベンゾエート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）、６−ヒドラジノニコチミド（６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｎｉｃｏｔｉｍｉｄｅ）（ＨＹＮＩＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（ＭＢＣ）等の多官能性試薬が挙げられる。かような修飾物質の修飾方法は従来公知の方法により行うことができる。 Such a receptor may be modified so long as the binding to the target substance is not inhibited. Examples of such modifications include fluorescent labeling in which a fluorescent labeling substance is bound by a chemical bond to improve detection efficiency, radiolabeling in which atoms constituting the receptor are labeled with a radioisotope, and a pairing substance Specific binding pair labeling (for example, biotin, a label that chemically binds a lectin that binds to a polysaccharide, etc.) chemically bound to a substance that exhibits specific binding properties to The Examples of labeling substances used for labeling include fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, radioisotopes such as 125 I, 32 P, 14 C, 35 S or 3 H, alkaline phosphatase, peroxidase, β- Enzymes such as galactosidase or phycoerythrin are included. Alternatively, a receptor (for example, an antibody) may be fused with a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). Alternatively, a receptor chemically modified so as to be advantageous for electrophoresis or the like may be used, and chemical modification can be performed using a crosslinking agent capable of reacting with a functional group of the receptor before modification. Examples of the cross-linking agent include N-hydroxysuccinimide (NHS) N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate) (SIAB), dimaleimide (dimalimide), dithio-bis-nitro. Benzoic acid (dithio-bis-nitrobenzoic acid) (DTNB), N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate (N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate) (SATA), N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) ) Propionate (N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate) (SPDP ), Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), 6-hydrazinonicotimide (6-hydrazinonicotide IC) And polyfunctional reagents such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBC). Such a modification method of the modifying substance can be performed by a conventionally known method.

なお、レセプターとしては、電気泳動緩衝液中で標的物質結合活性を維持していることが必要である。   The receptor is required to maintain the target substance binding activity in the electrophoresis buffer.

レセプターの製造は従来公知の方法により作製することができる。   The receptor can be produced by a conventionally known method.

例えば、モノクローナル抗体は次の手順で作成することができる。   For example, a monoclonal antibody can be prepared by the following procedure.

まず、抗原を、動物に対して、抗原の投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられる。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。抗原を免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、Nature 256:495(1975)記載の方法に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧなどを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。   First, an antigen is administered to animals together with itself, a carrier, or a diluent at a site where antibody production is possible by administration of the antigen. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Examples of animals used include mammals such as monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and the like. The antibody titer in the antiserum can be measured by a conventional method. By selecting an individual having an antibody titer from an animal immunized with the antigen, collecting the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization, and fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method described in Nature 256: 495 (1975). Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG). Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, and the like. The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method similar thereto, but can usually be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum. Separation and purification of the monoclonal antibody is the same as the separation and purification of a normal polyclonal antibody, for example, a salting-out method, an alcohol precipitation method, an isoelectric precipitation method, an electrophoresis method, an adsorption / desorption method using an ion exchanger (for example, DEAE), It can be carried out according to a method for separating and purifying immunoglobulins by ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or specific purification using protein A or protein G.

一方、ポリクローナル抗体は、例えば次の手順で作成することができる。   On the other hand, a polyclonal antibody can be prepared, for example, by the following procedure.

ポリクローナル抗体は、例えば、抗原とキャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から活性型ハプトグロビンに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造されうる。抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた抗原に対して抗体が効率良く製造できれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアーとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。抗原とキャリアーとの複合体は、免疫される動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作成の場合と同様の哺乳動物が挙げられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の手順で行なうことができる。   Polyclonal antibodies, for example, create a complex of an antigen and a carrier, immunize a mammal in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method, collect an antibody-containing substance against active haptoglobin from the immunized animal, It can manufacture by performing isolation | separation purification. When forming a complex of an antigen and a carrier, the kind of carrier and the mixing ratio of the antigen and the carrier can be any type of antigen as long as the antibody can be efficiently produced against the antigen cross-linked to the carrier. You may make it bridge | crosslink in a ratio. Examples of the carrier include bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, and the like. Various condensing agents can be used for coupling the antigen and the carrier, and active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithiobilidyl group, and the like are used. The complex of an antigen and a carrier is administered to a immunized animal at a site where antibody production is possible, together with the carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration can usually be carried out about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total. Examples of animals used include mammals similar to those used in the production of monoclonal antibodies. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably blood of animals immunized by the above method. The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed by the same procedure as the separation and purification of the monoclonal antibody.

抗体は市販品を用いてもよい。   Commercially available antibodies may be used.

抗体の市販品としては、例えば、抗原をＣ−ｐｅｐｔｉｄｅとする場合には、Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［７Ｅ１０］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ−ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０３ ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［５Ｂ８］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ−ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０３ ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［２Ｂ７］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ−ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０３ ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［２Ａ１１］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｎｏｖａ社製））とＡｎｔｉ−ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０３ ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ−ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０1 ＳＰＴＮ−５（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））とＡｎｔｉ−ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０３ ＳＰＲＮ−５（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製））、Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［２Ａ１１］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｎｏｖａ社製））とＡｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［４Ｈ８］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））、Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［４Ｈ８］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））とＡｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［５Ｂ８］（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ａｂｃａｍ社製））等の組み合わせが挙げられる。   As a commercially available antibody, for example, when the antigen is C-peptide, Anti C-peptide antibody [7E10] (Mouse monoclonal (manufactured by Abcam)) and Anti-h C-peptide 9103 SPRN-5 (Mouse) monoclonal (manufactured by Medix Biochemica)), Anti C-peptide antibody [5B8] (Mouse monoclonal (manufactured by Abcam)) and Anti-h C-peptide 9103 SPRN-5 (Mousemon, Inc.) -Peptide antibody [2B7] (Mouse monoclonal (abcam)) and A ti-h C-peptide 9103 SPRN-5 (Mouse monoclonal (manufactured by Medix Biochemical)), Anti C-peptide antibody [2A11] (Mouse monoclonal (manufactured by abnova) ti-P5-Np5) Mouse monoclonal (manufactured by Medix Biochemica)), Anti-h C-peptide 9101 SPTN-5 (manufactured by Mouse biochema (manufactured by Medix Biochemica) and Anti-h C-peptide N5MpM ), Anti C-peptide ant ibody [2A11] (Mouse monoclonal (manufactured by abnova)) and Anti C-peptide antigen [4H8] (Mouse monoclonal (manufactured by abcamo)), Anti C-peptide antigen (H8) manufactured by Anti C-peptide antigen (H8) Combinations such as Anti C-peptide antibody [5B8] (Mouse monoclonal (manufactured by abcam)) are included.

［電気泳動］
本発明では、電気泳動下においても標的物質とレセプターとが特異的に結合することが必要であるため、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下で電気泳動を行う必要がある。本発明では、電気泳動下において、用いる２種以上のレセプターの標的物質認識部位および当該レセプターの認識部位と結合する標的物質の結合部位が維持されていればよい。例えば、陰イオン系界面活性剤（例えばＳＤＳ、ＬＤＳ）またはカオトロピック剤（尿素、ホルムアミド、グアニジン、ヨウ化カリウム）等のタンパク質変性剤を使用する場合であっても、レセプター（抗体）のパラトープおよび抗原のエピトープが変性しないものであれば問題ない。 [Electrophoresis]
In the present invention, since it is necessary for the target substance and the receptor to specifically bind even under electrophoresis, it is necessary to perform electrophoresis in an environment in which the receptor maintains the target substance binding activity. In the present invention, it is only necessary to maintain the target substance recognition sites of two or more receptors used and the binding sites of target substances that bind to the receptor recognition sites under electrophoresis. For example, paratopes and antigens of receptors (antibodies) even when protein denaturants such as anionic surfactants (eg SDS, LDS) or chaotropic agents (urea, formamide, guanidine, potassium iodide) are used. There is no problem as long as the epitope is not denatured.

したがって、本発明においては、電気泳動法としては、標的物質−レセプター複合体とレセプター遊離体との移動度が異なり、分離できるものであればいずれの方法も使用できる。具体的には、アガロースゲル電気泳動、パルスフィールド電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis；ＰＦＧＥ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis；ＰＡＧＥ）等のゲル電気泳動；泳動ゲル中にｐＨ勾配を形成させた等電点電気泳動；等電点電気泳動（１次元目）およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を組み合わせた二次元電気泳動；尿素及びホルムアミドを変性剤として使用する変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）；などが挙げられる。なお、上記担体電気泳動では、上記以外にも、デキストラン等のゲルを下記記載のキャピラリー高分子等の担体を代わりに使用してもよい。また、マイクロチップ電気泳動等の無担体電気泳動法でも担体を用いた電気泳動法でもよい。   Therefore, in the present invention, any method can be used as the electrophoresis method as long as the mobility of the target substance-receptor complex and the receptor free form are different and can be separated. Specifically, gel electrophoresis such as agarose gel electrophoresis, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE); pH gradient in the electrophoresis gel Isoelectric focusing (formation of 2); two-dimensional electrophoresis combining isoelectric focusing (first dimension) and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); using urea and formamide as denaturing agents Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE); In the carrier electrophoresis, in addition to the above, a gel such as dextran may be used instead of a carrier such as a capillary polymer described below. Further, carrierless electrophoresis such as microchip electrophoresis or electrophoresis using a carrier may be used.

ここで、本発明に係る電気泳動では、上述のように、陰イオン系界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＤＳ）、カオトロピック剤（例えば、尿素、ホルムアミド、グアニジン、ヨウ化カリウム）等のタンパク質変性剤を使用（例えば、上記変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）しても、あるいは上記タンパク質変性剤を使用しなくても（ｎａｔｉｖｅな電気泳動）、いずれでもよい。後者の場合には、トリス−グリシンシステムを使用した高いｐＨ条件の緩衝液を一般的に使用する。   Here, in the electrophoresis according to the present invention, as described above, protein denaturants such as anionic surfactants (for example, SDS, LDS) and chaotropic agents (for example, urea, formamide, guanidine, potassium iodide). May be used (for example, the denaturant gradient gel electrophoresis described above) or the protein denaturant may not be used (native electrophoresis). In the latter case, a high pH condition buffer using a Tris-Glycine system is generally used.

また、キャピラリー電気泳動に用いるキャピラリー内に分子ふるい効果を持たせるようなポリマーを泳動用緩衝液等と共に充填してもよい（キャピラリー高分子溶液電気泳動）。この際、キャピラリーに充填されるポリマー（キャピラリー高分子）としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、ポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール）、ポリプロピレンオキサイド等のポリエーテル類；ポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミン；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸メチル等のポリ（メタ）アクリル酸エステル等のポリ（メタ）アクリル酸系ポリマー；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等のポリアミド系ポリマー；；ポリビニルアセテート，ポリビニルピロリドン、ポリビニルオキサゾリドン等のポリビニル系ポリマー；プルラン、エルシナン、キサンタン、デキストラン、グアガム等の水溶性ヒドロキシルポリマー；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性セルロース；およびこれらの誘導体、ならびにこれらポリマーを構成するモノマーユニットのコポリマー等が挙げられる。   In addition, the capillary used for capillary electrophoresis may be filled with a polymer that gives a molecular sieving effect together with a buffer for electrophoresis (capillary polymer solution electrophoresis). In this case, the polymer (capillary polymer) filled in the capillary is not particularly limited as long as it is usually used in this field. Specifically, polyethylene oxide (polyethylene glycol), polypropylene oxide Polyalkyleneimines such as polyethyleneimine; Poly (meth) acrylic acid polymers such as poly (meth) acrylic acid and poly (meth) acrylic acid esters such as methyl poly (meth) acrylate; Polyacrylamide Polyamide polymers such as polymethacrylamide; Polyvinyl polymers such as polyvinyl acetate, polyvinyl pyrrolidone, and polyvinyl oxazolidone; Water-soluble hydroxyl polymers such as pullulan, erucinane, xanthan, dextran, and guar gum; Cellulose, hydroxyethyl cellulose, water-soluble cellulose such as hydroxypropyl cellulose; and derivatives thereof, and copolymers such as a monomer unit constituting these polymers.

これらのうち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロース電気泳動を使用することが好ましく、透明性が高く、電気的に中性であることから、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することがより好ましい。この際、ポリアクリルアミドゲルは、濃度勾配ゲルであってもあるいは均一濃度ゲルであってもよい。具体的には、４−１６％（ｗ／ｖ）の濃度勾配ゲル、５−２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ゲル、あるいは８〜１２％（ｗ／ｖ）の一定濃度ゲルを用いることができる。一般的には一定濃度ゲルよりは濃度勾配ゲルの方が、バンドがシャープである。ポリアクリルアミドゲルは適宜調製してもよいし、市販品を用いてもよい。ポリアクリルアミドゲルとしては、トリス−グリシンゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等）、トリス−酢酸ゲル（例えばＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、またはビストリスゲル（例えば、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）が挙げられる。アクリルアミドゲルを製造する際に用いられる緩衝液のｐＨは６〜８程度であることが好ましい。   Among these, it is preferable to use polyacrylamide gel electrophoresis and agarose electrophoresis, and it is more preferable to use polyacrylamide gel electrophoresis because it is highly transparent and electrically neutral. In this case, the polyacrylamide gel may be a concentration gradient gel or a uniform concentration gel. Specifically, 4-16% (w / v) concentration gradient gel, 5-20% (w / v) concentration gradient gel, or 8-12% (w / v) constant concentration gel is used. it can. In general, a band is sharper in a concentration gradient gel than in a constant concentration gel. The polyacrylamide gel may be appropriately prepared or a commercially available product may be used. Examples of the polyacrylamide gel include tris-glycine gel (for example, Novex (registered trademark) Tris-glycine gel (Invitrogen), etc.), tris-acetate gel (for example, NuPAGE Novex (registered trademark) (Invitrogen)), or bistris gel ( Examples thereof include Native PAGE Novex (registered trademark) Bistris gel (Invitrogen) and the like. It is preferable that the pH of the buffer used when producing the acrylamide gel is about 6-8.

泳動ゲル中にｐＨ勾配を形成させた等電点電気泳動にも本発明は適用できる。等電点電気泳動にて検出する場合は、標的物質−レセプターの複合体と遊離レセプターとを等電点が収束へ向かう移動速度の差で分離を行う。   The present invention can also be applied to isoelectric focusing in which a pH gradient is formed in the electrophoresis gel. In the case of detecting by isoelectric focusing, the target substance-receptor complex and the free receptor are separated by the difference in the moving speed of the isoelectric point toward convergence.

電気泳動は、通常、緩衝液を電気泳動用緩衝液（ランニングバッファー）として用いて行われる。ここで、緩衝液は、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されず、通常電気泳動に使用される緩衝液が同様にしてあるいは適宜修正して使用できる。具体的には、緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝液組成物を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類等を含有する溶液等が挙げられる。具体的な泳動用緩衝液としては、例えば、トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、トリス−トリシン緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝溶液、ＭＯＳＰ緩衝溶液等や、一般に電気泳動用緩衝液として使用される緩衝液が挙げられ、市販の電気泳動用キット中に提供されている緩衝液等も使用することができる。泳動用緩衝液は、一般に電気泳動用緩衝液として使用される濃度で使用することができる。   Electrophoresis is usually performed using a buffer as a buffer for electrophoresis (running buffer). Here, the buffer solution is not particularly limited as long as the receptor maintains the target substance binding activity, and the buffer solution usually used for electrophoresis can be used in the same manner or appropriately modified. Specifically, the buffer solution is not particularly limited as long as it is a solution containing a conventionally known buffer solution composition having a buffer capacity, for example, an organic acid such as citric acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid, And solutions containing salts thereof; amino acids such as glycine, taurine, and arginine; solutions containing inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid, and acetic acid; and salts thereof Can be mentioned. Specific examples of the electrophoresis buffer include Tris-glycine buffer, Tris buffer, Tris-tricine buffer, Tris-HCl buffer, MES buffer, MOSP buffer, etc. And a buffer solution provided in a commercially available electrophoresis kit can also be used. The electrophoresis buffer can be used at a concentration generally used as an electrophoresis buffer.

緩衝液のｐＨは、特に制限されず、レセプターが標的物質結合活性を維持する環境下であれば特に制限されない。ただし、レセプターが標的物質結合活性を維持し、かつ負に帯電する環境下としては、試薬の安定性、反応性などを考慮すると、通常、中性〜弱塩基性付近であることが好ましい。かような観点から、泳動用緩衝液のｐＨは、６〜９であることがより好ましい。緩衝液のｐＨ調整には、塩酸などの酸性物質や水酸化ナトリウムなどの塩基性物質を用いて適宜調整すればよい。   The pH of the buffer solution is not particularly limited as long as it is in an environment where the receptor maintains the target substance binding activity. However, in an environment in which the receptor maintains the target substance binding activity and is negatively charged, it is usually preferably in the vicinity of neutral to weakly basic in view of the stability and reactivity of the reagent. From such a viewpoint, the pH of the electrophoresis buffer is more preferably 6-9. The pH of the buffer solution may be adjusted as appropriate using an acidic substance such as hydrochloric acid or a basic substance such as sodium hydroxide.

電気泳動における印加電電圧は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常５〜２０００Ｖ／ｃｍの範囲で印加される。   The applied voltage in electrophoresis may be appropriately selected from the range usually used in this field, and is usually applied in the range of 5 to 2000 V / cm.

電気泳動時間は通常、３０〜１８０分であり得る。迅速な分離という観点からは、泳動時間は数分〜１０分程度であることが好ましい。なお、電気泳動温度は、特に制限されないが、通常、室温（２０〜２５℃）で行われる。   The electrophoresis time can usually be 30 to 180 minutes. From the viewpoint of rapid separation, the electrophoresis time is preferably about several minutes to 10 minutes. The electrophoresis temperature is not particularly limited, but is usually performed at room temperature (20 to 25 ° C.).

電気泳動後に標的物質−レセプター複合体および遊離レセプターを検出する方法の１つとしてゲル染色が挙げられる。レセプターがタンパク質である場合の染色方法としては、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色法、銀染色法や、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製）、Ｄｅｅｐ Ｐｕｒｐｌｅ Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）などの色素を用いた染色法などが挙げられる。また、遊離レセプターと分離された標的物質−レセプター複合体のバンドを、画像解析ソフトウェア等を用いて、当該バンドの色素のシグナル強度（染色の濃さ）（以下、「バンドのシグナル強度」とも称する場合がある。）を算出し、標的物質量を定量することもできる。また、キャピラリー電気泳動の場合は、ＵＶ／ＶＩＳ吸光光度計（フォトダイオードアレイ）等を用いて直接検出することができる。   One method for detecting the target substance-receptor complex and free receptor after electrophoresis is gel staining. As a staining method when the receptor is a protein, CBB (Coomassie Brilliant Blue) staining method, silver staining method, SYPRO (registered trademark) Ruby Protein Stain (manufactured by Takara Bio Inc.), Deep Purple Total Protein Stain (GE Healthcare) A dyeing method using a dye such as Japan). Further, the band of the target substance-receptor complex separated from the free receptor is imaged using image analysis software or the like, and the signal intensity (staining density) of the dye of the band (hereinafter also referred to as “band signal intensity”). In some cases, the target substance amount can be quantified. In the case of capillary electrophoresis, it can be directly detected using a UV / VIS absorptiometer (photodiode array) or the like.

［検出方法］
本発明の分離法により、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを明確に分離することができる。したがって、本発明の分離法を用いれば、標的物質である抗原を検出することができる。 [Detection method]
By the separation method of the present invention, the target substance-receptor complex and the free receptor can be clearly separated. Therefore, when the separation method of the present invention is used, an antigen as a target substance can be detected.

標的物質に対して、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上のレセプターを混合して反応させ、標的物質−レセプター複合体と、遊離レセプターとの分子量差を増大させた後、混合試料を電気泳動に掛け、標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分子量に依存する移動度の差で分離し、標的物質−レセプター複合体からのシグナルを検出することで、標的物質を検出する。   After increasing the molecular weight difference between the target substance-receptor complex and the free receptor by mixing and reacting with the target substance at least two or more receptors that specifically recognize different parts of the target substance , The mixed sample is subjected to electrophoresis, the target substance-receptor complex and the free receptor are separated by the difference in mobility depending on the molecular weight, and the signal from the target substance-receptor complex is detected. To detect.

具体的には、本発明の第一実施形態の変形例は、標的物質と、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する２種以上のレセプターとを結合させて、標的物質−レセプター複合体を形成させる段階と、電気泳動を行う段階と、標的物質を検出する段階と、を含む、標的物質の検出方法である。ここで「検出」とは、「標的物質の存在、非存在、または濃度を検出」することを意味する。このような方法により、簡便にかつ特異的に標的物質を検出することができる。   Specifically, in the modification of the first embodiment of the present invention, the target substance and two or more kinds of receptors that specifically recognize different parts of the target substance are bound to each other, and the target substance-receptor complex is bound. Is a method for detecting a target substance, which comprises a step of performing electrophoresis, a step of performing electrophoresis, and a step of detecting a target substance. Here, “detection” means “detecting the presence, absence or concentration of the target substance”. By such a method, the target substance can be detected simply and specifically.

標的物質−レセプター複合体を形成させる段階、および、電気泳動を行う段階については、上記第一実施形態で記載したとおりである。   The step of forming the target substance-receptor complex and the step of performing electrophoresis are as described in the first embodiment.

標的物質の検出方法としては、上記した染色法により得られたバンドのシグナル強度から標的物質量を定量する方法に加えて、標的物質−レセプター複合体を可視化する方法も用いることができる。   As a method for detecting a target substance, a method for visualizing a target substance-receptor complex can be used in addition to a method for quantifying the amount of a target substance from the signal intensity of a band obtained by the staining method described above.

染色法により得られたバンドのシグナル強度から標的物質量を定量する方法としては、具体的には、下記の方法により求めることができる。   As a method for quantifying the amount of the target substance from the signal intensity of the band obtained by the staining method, specifically, it can be obtained by the following method.

例えば、電気泳動後の染色（例えば、銀染色）の結果より、標的物質−レセプター複合体のバンドが検出される。当該バンドの色素のシグナル強度は、標的物質量に比例する。すなわち、予め測定した標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度について、標的物質量との検量線を作成することができ、当該検量線に基づいて、検出された標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度を比較することで、サンプル中の標的物質量を正確に測定できる。   For example, the band of the target substance-receptor complex is detected from the result of staining after electrophoresis (for example, silver staining). The signal intensity of the dye in the band is proportional to the amount of the target substance. That is, a calibration curve with the target substance amount can be created for the signal intensity of the target substance-receptor complex band measured in advance, and the detected target substance-receptor complex band is detected based on the calibration curve. By comparing the signal intensities, the amount of the target substance in the sample can be accurately measured.

本発明では、予め標的物質量が既知のサンプルを用いて、標的物質量に対する標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度の関係（検量線）を作成することが好ましい。すなわち、予め標的物質量が既知のサンプルについて、電気泳動を行い、標的物質−レセプター複合体のバンドのシグナル強度を算出し、標準物質量とバンドのシグナル強度との検量線を作成する。画像解析としては、特に制限されず、公知の画像解析ソフトが用いられる。例えば、ｉｍａｇｅＪ、ＮＩＨｉｍａｇｅ、ＳＣＩＯＮｉｍａｇｅ、等が挙げられる。画像解析より標的物質量を算出する具体的な方法としては、検出された標的物質−レセプター複合体バンドにおいて、測定範囲（レーン）を指定し、画像解析により縦方向に対する濃度分布図を表示させ、それぞれのピークを積分することで算出することができる。   In the present invention, it is preferable to create a relationship (calibration curve) of the signal intensity of the band of the target substance-receptor complex with respect to the target substance quantity using a sample whose target substance quantity is known in advance. That is, electrophoresis is performed on a sample whose target substance amount is known in advance, the signal intensity of the band of the target substance-receptor complex is calculated, and a calibration curve between the standard substance amount and the signal intensity of the band is created. The image analysis is not particularly limited, and known image analysis software is used. For example, imageJ, NIHimage, SCIOImage, etc. can be mentioned. As a specific method for calculating the target substance amount from image analysis, a measurement range (lane) is designated in the detected target substance-receptor complex band, and a concentration distribution diagram in the vertical direction is displayed by image analysis. It can be calculated by integrating each peak.

また、標的物質−レセプター複合体を可視化する方法としては、標的物質が可視化できるのであればいずれの方法も用いることができ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）を用いることができる。この際、標的物質に直接反応する一次レセプター（例えば、一次抗体）を標識してもよいし（直接法）、標識していない一次レセプター（例えば、一次抗体）を用いて１度目の標的物質−レセプター結合反応（例えば、抗原抗体反応）を行い、一次レセプター（一次抗体）自体を標的物質（例えば、抗原）とする別のレセプター（二次レセプター）（例えば、抗体（二次抗体））を標識してもよい（間接法）。   As a method for visualizing the target substance-receptor complex, any method can be used as long as the target substance can be visualized. Enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunity A measurement method (FIA) and a chemiluminescence immunoassay method (CLIA) can be used. At this time, a primary receptor (for example, a primary antibody) that reacts directly with the target substance may be labeled (direct method), or an unlabeled primary receptor (for example, a primary antibody) is used for the first target substance— Perform a receptor binding reaction (for example, antigen-antibody reaction) and label another receptor (secondary receptor) (for example, antibody (secondary antibody)) that uses the primary receptor (primary antibody) itself as a target substance (for example, antigen) (Indirect method).

標識に用いられる標識物質としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（Ｌｉｆｅ社）、Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｏｕｒ（Ａｎａ ｓｐｅｃ社）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ社）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３Ｈ等のラジオアイソトープ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（例えばセイヨウペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼまたはフィコエリトリン等の酵素、アクリジニウムエステルなどの化学物質が挙げられる。酵素を標識物質として用いた場合には、酵素に依存する第２のシグナル（例えば無色の基質からの着色生成物の形成）を発生させてもよく、この場合標識酵素の他基質が必要となる。例えば、ペルオキシダーゼの場合、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどが用いられ、アルカリホスファターゼの場合、パラニトロフェニルリン酸ナトリウムなどが用いられる。 Examples of labeling substances used for labeling include Alexa Floor (Life), Hilite Floor (Ana spec), IRDye (LI-COR), FITC (fluorescein isocyanate), FITC (Fluorescein Isothiocyanate), PE (phycoAthly, PCr) (Allophycocyanin), fluorescent materials such as Cy-3, Cy-5, tetramethylrhodamine isocyanate, radioisotopes such as 125 I, 32 P, 14 C, 35 S or 3 H, alkaline phosphatase, peroxidase (eg, peroxidase), Examples thereof include enzymes such as β-galactosidase or phycoerythrin, and chemical substances such as acridinium ester. When an enzyme is used as a labeling substance, a second signal that depends on the enzyme (for example, formation of a colored product from a colorless substrate) may be generated. In this case, a substrate other than the labeling enzyme is required. . For example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or the like is used in the case of peroxidase, and sodium paranitrophenyl phosphate or the like is used in the case of alkaline phosphatase.

標識物質により標識する方法は従来公知の方法を用いることができ、例えば、特定の官能基と結合を形成できる活性基と蛍光物質などの標識物質とが結合した標識物質活性基と、レセプターとを混合して標識する方法や活性基をその両端に具備する各種のクロスリンカーを用いて、標識物質とレセプターとをクロスリンカーを介して架橋することで標識する方法などがある。それ以外の方法としては、ビオチン化抗体用いたＬＡＢ（Ｌｉｎｋｅｄ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ）法、ＬＳＡＢ（Ｌｉｎｋｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ）法などが挙げられる。   As a method of labeling with a labeling substance, a conventionally known method can be used. For example, an active group capable of forming a bond with a specific functional group and a labeling substance active group in which a labeling substance such as a fluorescent substance is bound, and a receptor. There are a method of labeling by mixing, a method of labeling by cross-linking a labeling substance and a receptor through a crosslinker using various crosslinkers having active groups at both ends. Other methods include LAB (Linked Avidin-Biotin) method using biotinylated antibody, LSAB (Linked Streptavidin-Biotin) method and the like.

上記標識物質の検出法としては、従来公知の方法を用いることができる。酵素により生じた産物の検出および／または定量は、当該産物の吸光度を測定することにより行なうことができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いた場合には、６５５ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。また、標識物質がラジオアイソトープの場合、放射線計数装置で測定すればよいし、蛍光物質の場合には蛍光励起して視覚化するか、定量を行う場合には、蛍光測定器や画像処理システムで測定すればよい。   As a method for detecting the labeling substance, a conventionally known method can be used. Detection and / or quantification of the product produced by the enzyme can be performed by measuring the absorbance of the product. For example, when 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine is used as the enzyme substrate, the absorbance at 655 nm may be measured. In addition, when the labeling substance is a radioisotope, it may be measured with a radiation counter. In the case of a fluorescent substance, it is visualized by fluorescence excitation, or when quantification is performed, a fluorescence measuring instrument or an image processing system is used. Just measure.

標的物質の定量は、例えば、既知濃度の標的物質が含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作製することによって、試料中に含まれる標的物質の量を簡便に定量することができる。   The target substance can be quantified by, for example, creating a calibration curve using the fluorescence intensity obtained using a standard sample containing a known concentration of the target substance, thereby simplifying the amount of target substance contained in the sample. It can be quantified.

本発明により求められる検量線は、泳動条件などの外来要因にはよらず、定常的なものであるため、検量線として有効である。このため、この検量線を利用することにより、サンプル中の標的物質量を正確に測定することが可能である。よって、本発明によれば、サンプル中の標的物質量を、電気泳動によって測定することができる。   The calibration curve obtained by the present invention is effective as a calibration curve because it is a stationary curve regardless of external factors such as electrophoresis conditions. For this reason, it is possible to accurately measure the amount of the target substance in the sample by using this calibration curve. Therefore, according to the present invention, the amount of the target substance in the sample can be measured by electrophoresis.

上記検出方法は、特に標的物質が何らかの疾患に関与するマーカーである場合に臨床検査において非常に有用な手段となる。   The above detection method is a very useful means in clinical examination, particularly when the target substance is a marker involved in some disease.

例えば、ヒトＣ−ペプチドは３１個のアミノ酸からなるペプチドであり、インスリン前駆物質であるプロインスリンの構成成分である。Ｃ−ペプチドはプロインスリンがエンドペプチダーゼにより切断されインスリンが血中へ放出される際に、分解産物として同時に放出される。したがって、Ｃ−ペプチドはインスリンの分泌動態の指標としての役割を果たし、血中Ｃ−ペプチドの動態は糖尿病患者等の内因性インスリンの分泌能を調べるために重要な指標となり得る。実際、Ｃ−ペプチドの測定は糖尿病の診断または治療に利用されており、更にはインスリノーマ、インスリン自己免疫症候群などの診断にも有用である。本発明の第一の実施形態の分離方法またはこの変形例の検出方法によれば、Ｃ−ペプチドのような低分子のペプチドであっても分離・検出可能であるため、これによりＣ−ペプチド量を定量化することができる。さらに、正常値と比較することにより、インスリンの分泌量を検査することができる。正常値より被験者のＣ−ペプチド量が低ければ、被験者のインスリン分泌能が低下していることがわかる。したがって、本発明の好適な実施形態は、標的物質がＣ−ペプチドである。   For example, human C-peptide is a peptide consisting of 31 amino acids and is a constituent of proinsulin, which is an insulin precursor. C-peptide is simultaneously released as a degradation product when proinsulin is cleaved by endopeptidase and insulin is released into the blood. Therefore, C-peptide plays a role as an indicator of insulin secretion kinetics, and blood C-peptide kinetics can be an important indicator for investigating endogenous insulin secretory ability in diabetic patients and the like. In fact, the measurement of C-peptide is used for the diagnosis or treatment of diabetes, and is also useful for the diagnosis of insulinoma, insulin autoimmune syndrome and the like. According to the separation method of the first embodiment of the present invention or the detection method of this modified example, even a low molecular weight peptide such as C-peptide can be separated and detected. Can be quantified. Furthermore, the amount of insulin secreted can be examined by comparing with normal values. If the amount of C-peptide of the subject is lower than the normal value, it can be seen that the subject's insulin secretion ability is reduced. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the target substance is a C-peptide.

［診断方法］
また、本発明の他の実施形態は、第一の実施形態の分離・検出方法を用いた標的物質に関与する疾患の診断方法である。具体的には、被検者から試料を採取する段階と、前記試料中の標的物質と標的物質に特異的に結合するレセプターとを結合させて標的物質−レセプター複合体を形成させる段階と、電気泳動を行う段階と、標的物質を検出する段階と、標的物質の健常者の値と比較して被検者が標的物質に関与する疾患に罹患しているか否かを判定する段階と、を含み、前記レセプターは、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上である、標的物質に関与する疾患の診断方法である。ここで、被検者又は健常者は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であることが好ましい。上記疾患としては、例えば、標的物質がＣ−ペプチドの場合、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などが挙げられる。健常者の値と比較して被験者のＣ−ペプチド量が高ければ、インスリンノーマ、肥満、肝疾患、クッシング症候群、末端肥大症、異常インスリン血症、インスリン自己免疫症候群などに罹患している可能性があり、健常者の値と比較して被験者のＣ−ペプチド量が低ければ、糖尿病、低血糖、低栄養状態、褐色細胞腫、下垂体副腎機能低下症などに罹患している可能性がある。 [Diagnosis method]
Another embodiment of the present invention is a method for diagnosing a disease associated with a target substance using the separation / detection method of the first embodiment. Specifically, a step of collecting a sample from a subject, a step of binding a target substance in the sample and a receptor that specifically binds to the target substance to form a target substance-receptor complex, Performing electrophoresis, detecting a target substance, and determining whether the subject suffers from a disease related to the target substance by comparing with a value of a healthy target substance. The receptor is a method for diagnosing a disease associated with a target substance, which is at least two or more kinds that specifically recognize different sites of the target substance. Here, the subject or the healthy person is preferably a human or a non-human mammal. Examples of the disease include when the target substance is a C-peptide, insulinoma, obesity, liver disease, Cushing syndrome, acromegaly, abnormal insulinemia, insulin autoimmune syndrome, diabetes, hypoglycemia, undernutrition, Examples include pheochromocytoma and hypopituitar adrenal function. If the C-peptide level of the subject is higher than that of healthy subjects, it may be affected by insulinoma, obesity, liver disease, Cushing's syndrome, acromegaly, abnormal insulinemia, insulin autoimmune syndrome, etc. If the C-peptide level of the subject is lower than that of healthy subjects, there is a possibility of suffering from diabetes, hypoglycemia, malnutrition, pheochromocytoma, hypopituitar adrenal function, etc. .

さらに、本発明の他の実施形態は、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上のレセプターを含む、を含む標的物質に関与する疾患の検査キットである。   Furthermore, another embodiment of the present invention is a test kit for a disease involving a target substance, comprising at least two or more receptors that specifically recognize different sites of the target substance.

検査キットに含まれる２種以上のレセプターは、好適にはレセプターを含む容器を含む。レセプターは予め緩衝液に溶解された状態であってもよい。２種以上のレセプターは、予め混合されていてもよいし、個別に容器に充填されていてもよい。また。上記検査キットは、アッセイ用の緩衝液またはその濃縮ストック溶液を含む電気泳動用セットを含むのが好ましい。電気泳動用セットには、その他、電気泳動槽、電気泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、又はペリスタポンプ等の一般的な電気泳動用装置；電気泳動用試薬；ゲル等の担体；検出試薬等を含めることができる。   The two or more receptors contained in the test kit preferably include a container containing the receptors. The receptor may be in a state preliminarily dissolved in a buffer solution. Two or more kinds of receptors may be mixed in advance, or may be individually filled in a container. Also. The test kit preferably includes an electrophoresis set including an assay buffer or a concentrated stock solution thereof. The electrophoresis set includes other electrophoresis apparatuses such as electrophoresis tanks, glass plates for electrophoresis, buffer tanks, spacers, combs, clips, power supplies, or peristaltic pumps; reagents for electrophoresis; gels, etc. A carrier; a detection reagent and the like.

さらに、標準サンプルとして濃度が既知である標的物質およびこれを含む容器をキットが含んでいてもよい。レセプターは、診断が容易となることから、蛍光物質等の標識物質で標識されていることが好ましい。キットに含まれる各試薬は、１試料測定分毎に容器に分注されて提供されていてもよく、複数試料測定分が各試薬毎に纏めて個々の容器に含まれて提供されてもよい。後者の場合は、用時に各試薬を所定の測定用容器に分注して使用する。試薬が１試料測定分毎に提供される場合は、各試薬を含む容器はカートリッジとして一体成形されてもよく、そのカートリッジの異なる区画に各試薬が格納されていてもよい。レセプターが凍結乾燥品としてキットに含まれる場合は、これらを溶解するために適した上述のような緩衝液が更にキットに含まれることがある。これらのレセプターが含まれる、あるいはキットに含まれることのあるアッセイ用のその他の容器はレセプターおよび標的物質と相互作用せず、アッセイに利用される反応、例えば酵素反応、化学発光反応を妨害しない材料であればどんな材質のものでもよい。必要であればそのような相互作用を起こさないように表面を予め処理して提供されてもよい。検査キットには、通常取り扱い説明書が添付される。   Furthermore, the kit may contain a target substance having a known concentration as a standard sample and a container containing the target substance. The receptor is preferably labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance because diagnosis is easy. Each reagent included in the kit may be provided by being dispensed into a container for each sample measurement, or a plurality of sample measurements may be provided for each reagent in a separate container. . In the latter case, each reagent is dispensed into a predetermined measurement container before use. When the reagent is provided for each sample measurement, the container containing each reagent may be integrally formed as a cartridge, and each reagent may be stored in a different section of the cartridge. When the receptor is included in the kit as a lyophilized product, a buffer as described above suitable for dissolving them may be further included in the kit. Other containers for assays that contain these receptors, or that may be included in kits, do not interact with receptors and target substances and do not interfere with the reactions used in the assay, such as enzyme reactions and chemiluminescent reactions Any material can be used. If necessary, the surface may be pre-treated to avoid such interaction. An instruction manual is usually attached to the test kit.

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

（実施例１）
１．抗体溶液１の調製
Ａｎｔｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ［７Ｅ１０］（ａｂｃａｍ社製，Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（２ｍｇ／ｍＬ）２５０μＬを、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ ７．４）６ｍＬで希釈した。 Example 1
1. Preparation of Antibody Solution 1 Anti-C-peptide antibody [7E10] (abcam, Mouse monoclonal) (2 mg / mL) 250 μL was diluted with PBS buffer solution (50 mM, pH 7.4) 6 mL.

２．抗体溶液２の調製
Ａｎｔｉ ｈ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ９１０３ ＳＰＲＮ−５（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（５ｍｇ／ｍＬ）１５０μＬを、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ ７．４）９．２３ｍＬで希釈した。 2. Preparation of Antibody Solution 2 Anti h C-peptide 9103 SPRN-5 (Medix Biochemical, Mouse monoclonal) (5 mg / mL) 150 μL was diluted with PBS buffer solution (50 mM, pH 7.4) 9.23 mL.

３．Ｃ−ペプチド抗原溶液
Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ（ｈｕｍａｎ）（ＷＡＫＯ社製、分子量＝３，６１７）５００μｇを、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ ７．４）４．１４ｍＬに溶解し、Ｃ−ペプチド抗原溶液を調製した。 3. C-peptide antigen solution C-Peptide (human) (WAKO, molecular weight = 3,617) 500 μg was dissolved in 4.14 mL of PBS buffer solution (50 mM, pH 7.4) to prepare a C-peptide antigen solution. did.

４．測定サンプルの調製
３．で調製したＣ−ペプチド抗原溶液を、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ ７．４）にてそれぞれ、１５倍、３０倍、６０倍、１２０倍、２４０倍に希釈し、Ｃ−ペプチド希釈系列溶液ａ〜ｅを作製した。Ｃ−ペプチド希釈系列溶液ａ〜ｅを、下記表１に従って、それぞれ上記１．および２．で調製した抗体溶液１および２と、ＰＢＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ ７．４）と、サンプルバッファーと、混合し、室温（２５℃）で１時間静置し、Ｃ−ペプチド希釈系列溶液１〜１５（表１中、「レーン番号」として記載）を調製した。 4). 2. Preparation of measurement sample The C-peptide antigen solution prepared in step 1 was diluted 15 times, 30 times, 60 times, 120 times, and 240 times with a PBS buffer solution (50 mM, pH 7.4), respectively. -E were produced. The C-peptide dilution series solutions a to e were respectively prepared as described in 1. above according to Table 1 below. And 2. The antibody solutions 1 and 2 prepared in 1 above, PBS buffer solution (50 mM, pH 7.4), and sample buffer were mixed and allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 1 hour. 15 (described as “lane number” in Table 1) was prepared.

なお、ＴＲＩＳ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）（和光純薬）０．４９ｇ、ブロモフェノールブルー（和光純薬）８０ｍｇ、およびグリセロール（和光純薬）８ｍＬを、ミリＱ水で２０ｍＬにメスアップし、塩酸（和光純薬）でｐＨ７．４に調整したものを、サンプルバッファーとして用いた。   Note that 0.49 g of TRIS (trishydroxymethylaminomethane) (Wako Pure Chemical Industries), 80 mg of bromophenol blue (Wako Pure Chemical Industries), and 8 mL of glycerol (Wako Pure Chemical Industries) were made up to 20 mL with milli-Q water, and hydrochloric acid was added. What was adjusted to pH 7.4 with (Wako Pure Chemical Industries) was used as a sample buffer.

５．電気泳動
ゲルウェルに、カソードバッファーおよびアノードバッファーを所定の量、充填した。その後、上記４．で作製したそれぞれの泳動サンプル（Ｃ−ペプチド希釈系列溶液１〜１５）をゲルのウェルに５μＬずつアプライした。 5. Electrophoresis Gel wells were filled with a predetermined amount of cathode buffer and anode buffer. Thereafter, the above 4. 5 μL each of the electrophoresis samples (C-peptide dilution series solutions 1 to 15) prepared in the above was applied to the wells of the gel.

室温（２５℃）にて１５０Ｖ定電圧にて電気泳動を行なった。ブロモフェノールブルーの泳動最前線がゲル全体の３分の４程度まで進行したら泳動を止め、和光純薬；銀染色ＫｉｔワコーＩを使用し、添付文書記載の手順に従って銀染色を行なった。使用した機材および溶液は以下のとおりである。   Electrophoresis was performed at a constant voltage of 150 V at room temperature (25 ° C.). When the forefront of bromophenol blue progressed to about 4/3 of the entire gel, the electrophoresis was stopped and silver staining was performed using Wako Pure Chemical; Silver Stain Kit Wako I according to the procedure described in the package insert. The equipment and solutions used are as follows.

銀染色の結果を図１に示す。   The result of silver staining is shown in FIG.

１種の抗体のみを用いた泳動サンプル（Ｃ−ペプチド希釈系列溶液１〜４および５〜８／レーン番号１〜４および５〜８）では、抗原の濃度を増加しても高分子量側に明確なバンドは出現しなかった。一方、２種の抗体を混合した泳動サンプル（Ｃ−ペプチド希釈系列溶液９〜１４／レーン番号９〜１４）では、高分子量側（分子量マーカーで２４２ｋＤａ辺り）にシャープなバンドが出現し、そのバンドの濃さ（シグナル強度）は抗原の濃度に対応していることが確認された。また、高分子量側のバンドが濃くなるにつれ、低分子量側（分子量マーカーで１４６ｋＤａ辺り）のバンドが減少していることがわかる。これらのことより、上記の手順で、比較的低分子量の抗原に対して標識抗体を複数個反応させることで、標的物質−レセプター複合体と遊離体との分子量差を増大させ、電気泳動により標的物質−レセプター複合体と遊離体とを分子量の差で分離することが可能であることが示された。   Electrophoresis samples using only one type of antibody (C-peptide dilution series solutions 1 to 4 and 5 to 8 / lane numbers 1 to 4 and 5 to 8) clearly show high molecular weight even when the antigen concentration is increased. No band appeared. On the other hand, in the electrophoresis sample (C-peptide dilution series solution 9-14 / lane numbers 9-14) in which two kinds of antibodies are mixed, a sharp band appears on the high molecular weight side (around 242 kDa as a molecular weight marker). It was confirmed that the density (signal intensity) corresponds to the antigen concentration. It can also be seen that the band on the low molecular weight side (around 146 kDa for the molecular weight marker) decreases as the band on the high molecular weight side becomes darker. Based on the above, the above procedure increases the molecular weight difference between the target substance-receptor complex and the free form by reacting a plurality of labeled antibodies against a relatively low molecular weight antigen. It was shown that the substance-receptor complex and the free form can be separated by the difference in molecular weight.

次に、フリーソフトである「ｉｍａｇｅＪ」を用いて、Ｃ−ペプチドの定量解析を行った。定量解析は、標的物質−レセプター複合体バンドが検出できた９，１０，１１，１２，１３，１４の各レーンについて、図２Ａに示されるそれぞれのレーンを指定（０．３ｃｍ×１．５ｃｍ）し、縦方向に対する濃度分布図を表示させ、それぞれのピークを積分することで算出した。   Next, “imageJ”, which is free software, was used for quantitative analysis of C-peptide. In the quantitative analysis, for each lane of 9, 10, 11, 12, 13, and 14 in which the target substance-receptor complex band was detected, each lane shown in FIG. 2A was designated (0.3 cm × 1.5 cm). Then, a concentration distribution diagram with respect to the vertical direction was displayed, and each peak was calculated by integration.

図２Ｂに、算出したＣ−ペプチド量に対する標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度との関係をプロットした。図２Ｂにより、Ｃ−ペプチド量が０〜１．６ｎｇの範囲において、各レーン、すなわちレーン９〜１３の標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度に対して良好な直線性を示した（以下、当該直線性を、「Ｃ−ペプチド量とバンド染色の濃さとの直線性」と称する。）。すなわち、Ｃ−ペプチド量と複合体バンドのシグナル強度とは比例関係であり、シグナル強度から、Ｃ−ペプチド量を正確に測定できることが考察される。定量性の低い銀染色でこの結果は驚くべきことである。   FIG. 2B plots the relationship between the calculated C-peptide amount and the signal intensity of the target substance-receptor complex band. FIG. 2B shows good linearity with respect to the signal intensity of the target substance-receptor complex band in each lane, that is, lanes 9 to 13, in the range of C-peptide amount of 0 to 1.6 ng (hereinafter, referred to as “the C-peptide amount”). The linearity is referred to as “linearity between the amount of C-peptide and the intensity of band staining”). That is, the amount of C-peptide and the signal intensity of the complex band are in a proportional relationship, and it is considered that the amount of C-peptide can be accurately measured from the signal intensity. This result is surprising with the low quantitative silver staining.

Ｃ−ペプチド量３．２ｎｇにおいては、レーン１４の標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度が、Ｃ−ペプチド量とバンドのシグナル強度との直線性から外れている。これは遊離抗体のバンド（下部の１４６ｋＤａ付近のバンド）がレーン１３の結果で消失していることから考えると、添加されたＣ−ペプチドの量に対し、あらかじめ添加されていた抗体の量が不足していたと思われる（レーン１３でバンドが消失していたことから、レーン１３で用いたＣ−ペプチド希釈系列溶液中のＣ−ペプチドと抗体との量がほぼ同じであったと考えられる）。この問題を解決することは非常に簡単で、あらかじめ添加する抗体の量を増やせばよい。   When the amount of C-peptide is 3.2 ng, the signal intensity of the target substance-receptor complex band in lane 14 deviates from the linearity between the amount of C-peptide and the signal intensity of the band. Considering that the free antibody band (band near 146 kDa at the bottom) disappeared as a result of lane 13, the amount of antibody added in advance was insufficient with respect to the amount of C-peptide added. (Because the band disappeared in lane 13, the amount of C-peptide and antibody in the C-peptide diluted series solution used in lane 13 was considered to be approximately the same). It is very easy to solve this problem, and the amount of antibody added in advance may be increased.

したがって、本発明の方法によると、この各測定サンプルレーンの標的物質−レセプター複合体バンドのシグナル強度を測定することで、別途求めたＣ−ペプチド量とバンドのシグナル強度との比例関係により、サンプルのＣ−ペプチド含有量を正確に算出できることが期待できる。   Therefore, according to the method of the present invention, by measuring the signal intensity of the target substance-receptor complex band in each of the measurement sample lanes, the proportional relationship between the amount of C-peptide obtained separately and the signal intensity of the band can be obtained. It can be expected that the C-peptide content of can be calculated accurately.

Claims (5)

レセプターとして、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する少なくとも２種以上を用いる、標的物質およびレセプターの複合体と遊離レセプターとを分子量の差でゲル電気泳動により分離する方法。 A method for separating a target substance / receptor complex and a free receptor by gel electrophoresis based on a difference in molecular weight, using at least two or more kinds of receptors that specifically recognize different sites of the target substance. 前記標的物質の分子量は１，０００〜３０，０００である、請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the molecular weight of the target substance is 1,000 to 30,000. 前記標的物質の分子量は、前記レセプターの分子量の１／１５０〜１／５である、請求項１または２に記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, wherein the molecular weight of the target substance is 1/150 to 1/5 of the molecular weight of the receptor. 標的物質と、標的物質のそれぞれ異なる部位を特異的に認識する２種以上のレセプターとを結合させて、標的物質−レセプター複合体を形成させる段階と、ゲル電気泳動を行う段階と、標的物質のシグナル強度を検出する段階と、を含む、標的物質の定量方法。A target substance and two or more types of receptors that specifically recognize different sites of the target substance are bound to form a target substance-receptor complex, a gel electrophoresis step, a target substance Detecting the signal intensity, and a method for quantifying the target substance. 予め既知のサンプルを用いて、標的物質量に対する標的物質−レセプター複合体のシグナル強度の検量線を作成し、当該検量線を用いて、前記検出したシグナル強度を比較することで、標的物質量を定量する、請求項４に記載の標的物質の定量方法。Using a known sample in advance, create a calibration curve of the signal intensity of the target substance-receptor complex with respect to the target substance quantity, and compare the detected signal intensity using the calibration curve to determine the target substance quantity. The method for quantifying a target substance according to claim 4, wherein the quantification is performed.
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