JP6148666B2 - サイトメガロウイルス(cmv)の遺伝子変異体 - Google Patents
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Description
最近の報告は、一定の悪性腫瘍、例えば結腸癌、悪性神経膠腫(非特許文献1−7)、髄芽腫(非特許文献8)、EBV陰性ホジキンリンパ腫、子宮頚癌、前立腺癌および乳癌(総説については(非特許文献9、10)を参照されたし)、におけるCMVのゲノムおよびタンパク質の高頻度の存在を示している。本発明者らは、悪性膠芽腫腫瘍の99%、髄芽腫(MB:medulloblastoma)および神経芽腫(NB:neuroblastoma)、悪性黒色腫、結腸、乳、膵臓、前立腺、皮膚、卵巣および子宮癌の>90%において活性CMV感染の存在を確認した(非特許文献1、8)。重要なこととして、このウイルス感染は、同じ患者から得た非癌組織検体において、および健常対照個体において、潜伏性のままである(非特許文献1、3)。
既に1970年代に、Fed Rappのグループは、前立腺癌におけるCMVの高頻度の存在を報告し、動物モデルにおいて発癌性であった腫瘍からのウイルス株を単離した(非特許文献11、12)。幾つかのその後の研究において、CMVは正常ヒト癌を形質転換することができず、そのためこのウイルスは発癌性と見なされなかった。その代わり、宿主細胞機能に対して特異的な効果を持つ非常に多数のウイルスタンパク質によって媒介される腫瘍形成に対するCMVの間接的影響を記述するために腫瘍調節という用語が提案されている((非特許文献13、14)に総説されている)。進化の過程で、CMVは、多くの異なる細胞および免疫機能に影響を及ぼす洗練された機序を発達させてきた(非特許文献15、16)。このウイルスは、感染細胞において約170のタンパク質を生産し、それらのうちのおおよそ50のみが、ウイルス生産に不可欠なものである(非特許文献17)。したがって、これらのウイルスタンパク質のうちの圧倒的多数が、ウイルスのその宿主との共存を支援することとなる重要な宿主機能の制御に向けられる。これらのタンパク質が、癌発生の一因となる宿主機能の制御により、および免疫応答を変調させることにより、免疫系によって発見されないようにウイルス感染腫瘍細胞を守ることとなる(非特許文献15)。癌の病理発生に関与する可能性を秘めているCMV機序は、腫瘍調節機序と呼ばれる(非特許文献10、13)。
CMVは、免疫系による認識を回避するように設計された、洗練された機序を発達させてきた。例えば、CMVは、HLAクラスIおよびクラスII分子の発現ならびに抗原提示を阻害し、T細胞活性化を制御し、NK細胞活性化を阻害し、活性化されたTおよびNK細胞から放出される細胞溶解性ペプチドから細胞を守る(非特許文献16、23)。CMVは、その独自のケモカイン、サイトカインおよび成長因子を生産し、ならびにケモカイン、サイトカインおよび成長因子の細胞生産を制御する(非特許文献15)。これらは、感染細胞を免疫系に不可視にする戦略の例であり、CMV感染腫瘍が、免疫系によってまたはそれらに対して開発された免疫療法によって制御されない理由を説明することができる。それ故、このウイルスが炎症依存性である(非特許文献24)と同時に、感染腫瘍細胞は免疫系に不可視になる((非特許文献16、23)において総説されている)。本発明者らのグループは、初めて、ミエロイド系列の細胞を潜在ウイルスの主要循環キャリアとして同定し(非特許文献24)、T細胞の免疫活性化ならびにその結果としてのTNF−αおよびIFN−γ生産がマクロファージ分化を生じさせる結果となり、潜在CMVの再活性化の重要な要素であることを確認した(非特許文献24、25)。αウイルス感染は、COX−2も誘導し(非特許文献18、26−28)、本発明者らは、最近、このウイルスが5−LO発現も誘導(非特許文献29)して、炎症を誘導し、ウイルス複製を増進し、これが腫瘍生物学に大いに関連していることを発見した。
アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、NK細胞および細胞傷害性T細胞によって媒介される死滅についての機序の最終段階である。薬物によって誘導される死に対する腫瘍細胞の感受性減弱は、抗癌療法が失敗する主な理由の1つである。少なくとも5つの異なるCMVタンパク質(すなわち、IE1、IE2、UL36およびUL37、UL38)は、CMV感染腫瘍細胞のアポトーシスを阻害し、生存を増進することができる。これらのタンパク質は、所望の化学療法効果を妨げることもある。この仮説の裏付けとして、神経芽腫細胞におけるUL36発現は、化学療法に対する耐性を付与する(非特許文献30)。
様々な起源の癌においてCMVタンパク質が頻繁に検出されることを実証するデータが増えている。膠芽腫;神経芽腫;髄芽腫;膵臓腫瘍からの結腸、乳および前立腺癌;肉腫;悪性黒色腫;扁平上皮癌腫;卵巣癌;子宮頚癌の>90は、腫瘍細胞における高CMVタンパク質発現を明示するが、その腫瘍を包囲する非腫瘍組織は、一貫してウイルス陰性である。本発明者らは、患者生検材料も調査し、それらがすべてCMVタンパク質発現について非常に陽性であることを発見した。CMVタンパク質発現は腫瘍内に広範に分布し、CMV RNA転写産物は容易に検出されるが、極めて対照的に、CMV DNAを同じ組織試料において検出することは難しかった。これは、物議をかもす問題となっており、当分野の研究者の多くを悩ませ、これが人為的結果を表すのかどうか関心が高まっている。
本明細書の中で言及する場合の「イントロン」は、遺伝子の最終成熟RNA産物を生成するためにRNAスプライシングによって除去される遺伝子内の任意のヌクレオチド配列である。用語イントロンは、遺伝子内のDNA配列を指すが、イントロンを有する遺伝子から転写されたRNA転写産物内の対応する配列では除去されている。
略号
5−LO 5−リポオキシゲナーゼ(lipoxigenase)
BrC 乳癌
CC 結腸癌
CDS コード配列
CK サイトケラチン
CMV サイトメガロウイルス
COX シクロオキシゲナーゼ
CTL 細胞傷害性Tリンパ球
EBV エプスタイン・バーウイルス
FACS フローサイトメトリー
FISH 蛍光in−situハイブリダイゼーション
GBM 多形膠芽腫
HCMV ヒトサイトメガロウイルス
HCMV−IEA ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子抗原
HD 健常ドナー
HHV ヒトヘルペスウイルス
HLA ヒト白血球抗原
HSV 単純ヘルペスウイルス
IE 前初期遺伝子
IEΔi2 イントロン2が欠失した最初期遺伝子
IHC 免疫組織化学
IMN 伝染性単核球症
MB 髄芽種
MHC 主要組織適合遺伝子複合体
MIE 主要前初期遺伝子
NB 神経芽腫
NK ナチュラルキラー細胞
NTC 無テンプレート対照
OvC 卵巣癌
PBS リン酸緩衝食塩水
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
pp65 ポリペプチド65
RNA リボ核酸
SnRNP 核内低分子リボ核タンパク質
STAT シグナル伝達兼転写活性化因子
UL ユニークロング
US ユニークショート
VEGFR 血管内皮細胞成長因子
RT 室温
臨床試料
本発明者らは、膠芽腫(n=120)、髄芽腫(n=37)、神経芽腫(n=49)、結腸(41)、***(69)、前立腺(n=17)、卵巣(25)、子宮頚(40)、膵臓(n=10)の腫瘍についての 、ならびに乳癌のリンパ節転移(n=35)および結腸および乳癌の89の脳転移についての固定パラフィン包埋腫瘍検体から400を超える試料を得、CMVタンパク質発現について分析した。本発明者らは、DNA調製および可能な場合はRNA調製のために24名のGBM患者から33の膠芽腫、23の神経芽腫、2の髄芽腫、18の結腸癌、20の乳癌、10の卵巣癌、10の膵臓癌検体および原発性腫瘍細胞培養物の新鮮または凍結腫瘍試料を得た。
免疫組織化学(IHC)
CMV IE、pp65および後期タンパク質に対する3つの異なるCMV特異的抗体を使用して免疫組織化学で切片をCMVタンパク質について染色した。すべてのパラフィン包埋組織切片を脱ろうし、アルコール系列で再水和し、記載されている(1、3)ような高感度免疫組織化学によって染色した。使用した一次抗体は、CMV−IEAに対する抗体(抗IE1−72およびIE1−86、IgG2a、Chemicon International、米国)、HCMV−LAに対する抗体(IgG2a、Chemicon)、CMV−pp65に対する抗体(IgG1、NovoCastra、米国)、ならびにアイソタイプ対照としての役割を果たす、平滑筋細胞アルファアクチンに対する抗体(IgG2a、Biogenex、カリフォルニア州サン・ラモン)およびフォン・ヴィレブランド因子(IgG1、DakoCytomation、デンマーク)であった。
GBM組織の単個細胞浮遊液用に、アキュターゼ(Accutase)(Sigma−Aldrich)が入っているペトリ皿の中で、滅菌したメスの刃で腫瘍を小片に切断した。腫瘍を15分間、37℃でインキュベートした。この間に、腫瘍を1回インキュベーターから取り出し、ピペットによって解離させた。インキュベーション後、腫瘍をピペッティングによってさらに解離させ、50mLチューブでセルストレーナ(75μm)(Falcon、BD Biosciences Pharmingen、スウェーデン国ストックホルム)に移した。2mLシリンジプランジャーを使用して、セルストレーナに通して腫瘍を細分した。PBSを使用してストレーナをすすぎ、その後、8分間、1200rpmで遠心分離した。
健常ドナーからのバッフィーコート(倫理許可01/420)を受け取り、一晩、室温で振盪し続けた後、Lymphoprep(Axis−Shield、ノルウェー国オスロ)を製造業者の指示書に従って使用して末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。10分間のRBCバッファー[pH8.0]での溶解によって赤血球を除去した。25〜30×106の精製PBMCを、200μLの各抗体VGEF R2/KDR−FITC(R&D、FAB357F)およびCD34−PE(Biolegend、343506)で希釈し、5mLの最終体積になるまでPBSを添加し、37℃で1時間インキュベートした。細胞を回転沈降させ(5分、1500rpm)、PBSで1回洗浄し、40μmセルストレーナ(BD Falcon)に通した。MoFlo Cytomation計器での選別まで、細胞を氷上で保持した。いずれかの抗体について陽性のまたは二重陽性の細胞を選別後に別々に回収し、DNeasy Blood & Tissue DNA抽出キット(Quiagen)を製造業者の指示書に従って使用して、対照としての非標識細胞と一緒にDNA抽出した。本明細書中で述べるTaqMan PCRにおいてその精製されたDNAを使用してウイルス含有量を検証した。
DNA抽出
QIAGENキット(カリフォルニア州バレンシア)を製造業者の指示書に従って使用することにより、塩析技術により、またはTrizol抽出により、腫瘍組織、腫瘍細胞および血液細胞からDNAを抽出して、同じ試料からDNA、RNAおよびタンパク質を得た。
腫瘍組織、腫瘍細胞および血液細胞から抽出したDNA試料を、フォワードおよびリバースプライマーを使用するネステッドPCRによって、MIE遺伝子のエクソン2および3(配列番号5〜8;Soderbergら、「American Society of Microbiology」、1993年)から増幅した。この方法は広範に使用されているが、この方法によって、以前に、健常対照において、CMVウイルス血症患者において、または様々な起源の細胞タイプ(線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、癌細胞)を感染させる多数のCMV株の実験研究において、イントロン2が欠如しているCMV IEゲノム変異体が検出されたことはない。
全CMV MIE遺伝子をカバーするプライマーを使用することによる一段階PCRを開発した。簡単に言うと、PCRバッファー(Applied Biosystem)から成るPCR反応混合物中おおよそ70〜200ngのDNAを使用した。増幅サイクルをPCRマシン(Applied Biosystem)で行った。50増幅サイクルは、50℃で2分間のUNG活性化、95℃で10分間のホットスタート、95℃で10秒間の変性、60℃で1分間のアニーリングおよび伸長から成った。未感染またはCMV(AD169もしくはVR1814もしくはTB40)感染MRC−5細胞からDNAおよびRNAを抽出した。OligodT20でのRT−PCRのためにSuperscript III First−Strand Synthesis SystemでcDNAを調整した。GelRED NucleidAcid Gel Stain(Biotium、カリフォルニア州ヘイワード)を含有する増幅PCR産物を1.5〜2%アガロースゲル上で泳動させ、UV線で可視化した。PCR増幅バンドを切り出し、精製し、自動シークエンシング(ABI 3730 DNAアナライザー)によって分析した。米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Centre for Biotechnology Information)BLSAT検索をCMVゲノムの確認に用いた。シークエンシングしたすべてのデータを、アラインメントソフトウェアを使用して参照CMV−IEゲノム(MERLIN)に対してアラインした。
配列番号9:フォワード:5’−TGACGAGGGCCCTTCCT−3’、
配列番号10:リバース:5’−CCTTGGTCACGGGTGTCT−3’、
配列番号11:プローブ、5’FAM−AAGGTGCCACGGCCCG−NFQMGB−3’
配列番号12:IEDNA:フォワード:5’−GTGACCCATGTGCTTATGACTCTAT−3’、
配列番号13:リバース:5’−CTCAACATAGTCTGCAGGAACGT−3’、
配列番号14:プローブ、5’FAM−TTGGTCACGGGTGTCTCNFQMGB−3’
使用したプライマーを図5に記載する。Applied Biosystem Veriti 96ウェルサーマルサイクラーを使用してPCRを行い、そのPCRプロファイルは、94℃で2分間;94℃で30秒の35サイクル;55℃または60℃(表に示すとおり)、40秒;72℃で50秒間;72℃で7分間の最終伸長および4℃で保持であった。DNAまたはcDNA試料を増幅し、CMV IE遺伝子セグメントの検出のための高感度で高特異的な方法を明らかにした。PCR産物を1.5%GelRed染色アガロースゲル上で泳動させ、Bio−radゲル・ドキュメンテーション・システムで可視化した。
DNA抽出
Omega bio−tekキット(米国ジョージア州)を製造業者の指示書に従って使用することにより3mLの全血からDNAを抽出し、100uLのH2Oで溶出した。
10分間、95℃でDNAを加熱することによってDNAを変性させた。その試料を氷上で10分間冷却して、鎖分離を保った。その後、0.125pmolの各々のビオチン化された捕捉用プライマーを含有する36.4μLの3.75M NaClを添加した。
(ネステッドPCRにも使用したものであり、上述のTaqmanプライマーの結合領域外にハイブリダイズする)プライマーの補足後、ビオチンで5’を標識し、HPLC精製した(Cybergene):
配列番号16:MIE II 3’−ビオチン:CTC GGG GTT CTC GTT GCA AT(21−mer)
Complete Protease Inhibitor Cocktail(Roche)、ホスファターゼ阻害剤カクテル(Sigma)および1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を補足した、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA:radioimmunoprecipitation assay)タンパク質抽出バッファー(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1%TritonX−100および2mM EDTA)で細胞ペレットまたは組織試料を可溶化した。腫瘍組織から、製造業者のプロトコル(Invitrogen)によるDNAおよびRNAのTRIZOL単離後に、タンパク質を抽出した。ミクロBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を使用してタンパク質濃度を定量した。0.1Mのジチオトレイトール(DTT)を含有するNovex Tricine SDS Sample Buffer(Invitrogen)中で試料を調製し、5分間、沸騰させた。同量(25μg/レーン)のタンパク質をNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)4〜12%Bis−Tris Gel(Invitrogen)に負荷し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE:sodium dodecyl sulphate−polyacrylamide gel electrophoresis)によって分離し、トランスブロット装置(Bio−Rad)でフッ化ポリビニリデン(PVDF)膜(Amersham)上に電気的に転写した。0.05%Tween 20(TBST)を補足したTris−HCl緩衝食塩水に溶解した5%脱脂粉乳で45分間、膜をブロックした。次の一次抗体を明記する希釈度で用いて免疫標識を行った:マウスモノクローナル抗前初期抗原(IEA)(1:1000;Argene)ならびにウサギポリクローナル抗IE72(1:2000)および抗IE86(1:1000;親切にも米国Oregon Health and Science UniversityのJay Nelson教授から提供されたもの)。同等の負荷量のタンパク質を、マウスモノクローナル抗β−アクチン(1:3000)での免疫標識によって検証した。3回のTBST洗浄の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合させた抗マウス(1:3000)または抗ウサギ(1:3000)IgGのいずれかと共に膜をインキュベートした。結合抗体をECL−plusキット(Amersham)によって検出した。
プローブ調製のために、全CMVゲノムを含有するプラスミド(親切にもポートランドのNelson博士によって提供されたもの)を、Nick Translation Kit(Vysis、米国イリノイ州ダウナーズ・グローブ)を製造業者の推奨基準に従って使用することにより標識した。スライド調製のために、細胞をコルセミド(Gibco)で処理し、HBSSで洗浄した。細胞ペレットを冷4%KClに再浮遊させ、14〜16時間、37℃でインキュベートした。遠心分離によって細胞を回収し、4%KClにまた再浮遊させた。冷固定溶液(3:1 メタノール:酢酸)をその細胞浮遊液にゆっくりと添加し、氷上で1時間インキュベートした。固定細胞を洗浄し、固定溶液に再浮遊させ、使用するまで20℃で保管した。20uLの細胞浮遊液をスライド調製に使用した。おおよそ200ngのプローブを、8uLのハイブリダイゼーション混合物[2uLのHybrizol、2uLのCot−1 DNA(両方ともInvitrogenからのもの)、および0.5Molの酢酸Na、pH5.2(Sigma Aldrich)中]および30uLのエタノール(95%)に添加し、ドライアイス上で15分間、インキュベートした。遠心分離後、上清を廃棄し、そのペレット(プローブ)に70%エタノールを添加し、再び遠心分離してそのプローブを精製した。プローブを8uLのHybridisolおよび2uLの蒸留水に溶解し、スライドに添加し、72℃で8分間変性させ、その後、一晩、37℃でインキュベートした。スライドを2×食塩水・クエン酸ナトリウム(SCC:Saline sodium citrate)中で3分間、70℃で洗浄し、脱水し、その後、Vectashield(Vector、Vectashield)でマウントした。
調査したすべての腫瘍検体および調査したすべての転移の90%より多くが、免疫組織化学またはフローサイトメトリー分析により、CMVタンパク質陽性であった(図1A、図1B、表1)。さらに、フローサイトメトリーにより、膠芽腫の21の初代細胞培養物がCMV IE、pp65および後期タンパク質を発現することが明らかになった(図1)。CMVタンパク質陽性細胞の数は、細胞系によって異なり、および同じ細胞系でも試料採取時が異なると異なった(図4、および4〜69%の幅がある)。しかし、同じ試料採取時のIE、pp65および後期CMVタンパク質に対する4つの抗体を使用すると陽性細胞数についてかなり一致した結果が得られた(図4に例示)。悪性黒色腫、皮膚癌、肉腫、腎臓癌および膵臓癌の試料は、調査したすべての試料(n=18)に関してCMV陽性であることが判明した。腫瘍細胞における高いタンパク質発現の事実にもかかわらず、本発明者らは、腫瘍組織からの組織検体または細胞溶解産物と繊維芽細胞または内皮細胞とを共培養することによって、髄芽腫、神経芽腫および膠芽腫腫瘍の新鮮腫瘍組織(n=21)から感染性ウイルスを得ることができなかった(図示なし)。上気道感染を有する1名の1歳の男児およびCMV症候群(移植後の潜在CMVの再活性化に起因するCMV感染)を有する2名骨髄移植患者からCMV IEΔi2変異体を単離した。
1)前初期遺伝子のイントロン2が欠如しているCMVの新規遺伝子変異体(CMV IEΔi2)は、調査した試料の84%で存在する、癌患者におけるCMVの最も一般的な変異体である。この株は、健常ドナーの15%で存在し、ウイルス血症患者の10%で血漿中に存在し、臨床CMV単離物間でのその出現率は3%である。
2)多数のCMVタンパク質が、腫瘍細胞におけるCMV IEΔi2変異体から生産された。
3)CMV IEΔi2変異体は、ヒトのCD34陽性細胞において検出される。
4)CMV IEΔi2変異体は、ヒトの内皮成長因子−2(VEGFR2)陽性細胞において検出される。
5)CMV IEΔi2変異体は、ヒトのCD133陽性細胞において検出される。
6)CMV IEΔi2 DNAは、FISHによって実証されるように、wt感染細胞におけるまたは野生型CMV DNAを保有する健常ドナーにおける中央位置とは対照的に、癌細胞の核の辺縁に位置した。
7)癌細胞におけるCMV IEΔi2感染は、腫瘍細胞では許容されず、標的細胞へのウイルスRNAおよびタンパク質の伝達を媒介するエキソソーム/微粒子/濃密体と同様の欠陥ウイルス粒子の生産を生じさせる結果となった。
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Claims (10)
- 野生型ヒトサイトメガロウイルス(CMV)Merlin株Genbank参照配列AY446894.2(野生型CMV)の遺伝子変異体であって、
前記遺伝子変異体は、サイトメガロウイルスMerlinゲノムの前初期(IE)遺伝子の位置173904から位置174019のイントロン2ヌクレオチド(配列番号17)を欠き、且つ配列番号1の配列を含む、遺伝子変異体。 - 哺乳動物におけるサイトメガロウイルス(CMV)関連癌形態を診断するため、哺乳動物において癌を発生する素因を検出するため、又は輸血若しくは移植による癌の危険の伝達を除去するために哺乳動物組織、細胞及び体液をスクリーニングするためのデータを得る方法であって、該方法は、
a)前記哺乳動物、哺乳動物組織、哺乳動物細胞、又は哺乳動物体液からの生体試料の専門分析を行う工程;及びその後、
b)前記生体試料において、請求項1記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体(CMV Merlin IEΔi2)の存在又は不在を検出する工程と、を含む方法。 - 前記哺乳動物または哺乳動物組織または細胞移植からの前記生体試料が、血液試料、組織試料、幹細胞試料、臓器移植移植片試料、***試料、尿試料、唾液試料、細胞スワブまたは母乳試料から成る群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 請求項1記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体(CMV Merlin IEΔi2)の存在又は不在は、Taqman PCR若しくはシーケンスキャプチャーPCRアッセイ等のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)等のDNA配列若しくはcDNA配列の検出法、又はFISH(蛍光in situハイブリダイゼーション)技術等のISH(in situハイブリダイゼーション)を含む方法により決定される、請求項2又は3記載の方法。
- 前記PCRは、少なくとも請求項1記載のIE遺伝子の対立遺伝子のエクソン2及びエクソン3の部分を増幅することにより、又はGenbank参照配列AY446894.2のCMV Merlinゲノムの前初期(IE)領域のエクソン2及びエクソン3の部分を増幅することにより、あるいは少なくとも請求項2記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体(CMV Merlin IEΔi2)のエクソン2及びエクソン3の部分を増幅することにより行われる、請求項4記載の方法。
- 前記癌が、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、悪性黒色腫、皮膚癌、および肉腫、腎臓癌、膵臓癌ならびにそれらの転移から成る群より選択される、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号1又はそのPCRプライマー若しくはそのISHプローブを含む核酸を用いることにより、請求項1記載のヒトサイトメガロウイルス(CMV Merlin IEΔi2)の遺伝子変異体を検出する、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- in vitro法である、請求項2〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物におけるサイトメガロウイルス(CMV)関連癌形態を診断するため、哺乳動物において癌を発生する素因を検出するため、又は輸血若しくは移植による癌の危険の伝達を除去するために哺乳動物組織、細胞及び体液をスクリーニングするための、請求項1記載のヒトサイトメガロウイルス(CMV Merlin IEΔi2)の遺伝子変異体若しくはそれに由来するPCRプライマー若しくはISHプローブの使用であって、
癌等が、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、悪性黒色腫、皮膚癌、肉腫、腎臓癌、及び膵臓癌から成る群より選択される、使用。 - 哺乳動物、哺乳動物組織又は細胞移植から得られた生体試料において、請求項1記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体(CMV Merlin IEΔi2)を検出するための、Taq Man ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、シーケンスキャプチャーPCRアッセイ、又はISH若しくはFISH検出を行うための試薬を含む、キット。
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