JP6145257B2 - Methods for assessing estrogenic activity - Google Patents
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Description
本発明は、環境中に存在する、または合成された化学物質について、エストロゲン類似活性を評価する方法を提供する。 The present invention provides a method for assessing estrogen-like activity for chemicals present in the environment or synthesized.
エストロゲンは生体内に存在するステロイドホルモンの一種で、様々な生理作用を有する物質である。このエストロゲンとは異なる化学物質であって、環境中に存在する、または合成された化学物質が体内でエストロゲンと類似した作用を及ぼすことがある。このような化学物質は一般に内分泌攪乱物質と呼ばれ問題になっている。例えば、非特許文献１には、ある化学物質がエストロゲン類似活性を示すかどうか調べるための方法として、ヒト乳がん由来細胞株ＭＣＦ−７（以降適宜、「ヒト乳がん由来細胞株ＭＣＦ−７」を「ＭＣＦ−７細胞」と称する）の細胞増殖を指標とする方法が開示されている。また、非特許文献２には、ＭＣＦ−７細胞のようにエストロゲン受容体を有するエストロゲン類似活性化合物の活性評価方法が開示されている。特許文献１には、エストロゲン類似活性を評価する方法が開示されている。この方法では、まず、エストロゲン類似活性化合物において、標準物質である１７β−エストラジオールにより発現量が３倍以上に上昇することが確認された遺伝子及び／またはＥＳＴ（expressed sequence tag 、発現遺伝子配列断片）をマイクロアレイ基板上に固定する。そして、エストロゲン類似活性を評価したい化学物質で処理した細胞から調製した核酸試料を、このマイクロアレイ基板に接触させることによってハイブリダイズした核酸を検出、比較する。 Estrogens are steroid hormones that exist in the body and are substances that have various physiological functions. This estrogen is a different chemical that can be present in the environment or synthesized in the body to act similar to estrogen. Such chemical substances are generally called endocrine disruptors and are problematic. For example, Non-Patent Document 1 describes a human breast cancer-derived cell line MCF-7 (hereinafter appropriately referred to as “human breast cancer-derived cell line MCF-7” as a method for examining whether a certain chemical substance exhibits estrogen-like activity. A method using the cell proliferation of “MCF-7 cells” as an index is disclosed. Non-Patent Document 2 discloses a method for evaluating the activity of an estrogen-like active compound having an estrogen receptor such as MCF-7 cells. Patent Document 1 discloses a method for evaluating estrogen-like activity. In this method, first, in an estrogen-like active compound, a gene and / or EST (expressed sequence tag) whose expression level was confirmed to be increased three-fold or more by the standard substance 17β-estradiol. Fix on the microarray substrate. Then, a nucleic acid sample prepared from a cell treated with a chemical substance whose estrogen-like activity is to be evaluated is brought into contact with the microarray substrate to detect and compare the hybridized nucleic acid.
非特許文献１に開示されているＭＣＦ−７細胞の増殖を指標とする方法は、非特許文献２において、エストロゲン無添加の状態でＭＣＦ−７細胞を長期間培養した場合、環境の変化に適応してエストロゲン無添加の状態でも高い増殖活性を示す細胞が現れることが指摘されている。従って、非特許文献１の方法を用いる場合には、誤った評価結果を招く恐れがある。
特許文献１は、エストロゲン存在下で発現量が増大することが確認された遺伝子及び／またはＥＳＴを指標とする点で非特許文献１の技術よりに優れるが、検査したい化合物１つに対して１つのマイクロアレイを作製する必要がある。このため、多数の化合物を検査する場合、多大な費用がかかる。
従来の技術では、評価結果の信頼性を向上させようとすると、手続は煩雑になるとともにコストがかかるという問題があった。
このように、正確性と簡便性を兼ね備えるエストロゲン類似活性の評価方法が見出されていなかった。
The method using MCF-7 cell growth as an index disclosed in Non-Patent Document 1 adapts to changes in the environment in Non-Patent Document 2 when MCF-7 cells are cultured for a long time in the absence of estrogen. Thus, it has been pointed out that cells exhibiting high proliferative activity appear even in the absence of estrogen. Therefore, when the method of Non-Patent Document 1 is used, there is a risk of causing an erroneous evaluation result.
Patent Document 1 is superior to the technique of Non-Patent Document 1 in that genes and / or ESTs whose expression level has been confirmed to increase in the presence of estrogen are used as an index, but 1 for each compound to be examined. One microarray needs to be made. For this reason, it is very expensive to test a large number of compounds.
In the conventional technique, there has been a problem that if the reliability of the evaluation result is to be improved, the procedure becomes complicated and expensive.
Thus, an evaluation method for estrogen-like activity that combines accuracy and convenience has not been found.
発明者らは、細胞のＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）の酵素活性を指標とすることで、エストロゲン類似活性が生体に与える影響をより正確かつ簡便に評価する方法を見いだした。 The inventors have found a method for more accurately and simply evaluating the influence of an estrogen-like activity on a living body by using the enzyme activity of cellular UDP-glucuronosyltransferase (UGT) as an index.
本発明に係る評価方法の一態様は、被験物質が細胞に対してエストロゲン活性を有するものであるか評価する評価方法であって、少なくとも次の工程を実施する。
・細胞を培養してスフェロイド形状の細胞を複数形成させる第１工程。
・前記スフェロイド形状の細胞それぞれに対して、第１乃至第３溶液のいずれかを作用させる第２工程。第１溶液は、検査する化学物質（被験化学物質）を含む。第２溶液は、エストロゲン活性を有することが知られている化学物質を含む。第３溶液はエストロゲン活性を持たないことが知られている化学物質を含む。言い換えると第３溶液は、前記第１溶液から前記検査する化学物質を除いた溶液である。
・前記第１乃至第３溶液のうちのいずれかを作用させた各スフェロイド形状の細胞に対して、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性測定溶液を作用させて、各スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性を測定する第３工程。
・測定結果に基づいて、第１溶液が含む化学物質のエストロゲン類似活性を判定する工程。具体的には、（１）前記第１溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性が、前記第２溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性と同等あるいはそれ以上に高い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質は前記第２溶液に含まれる化学物質と等しいあるいはそれ以上のエストロゲン類似活性を有すると判定する。（２）前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性よりも高く、前記第２溶液の活性よりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はゼロから前記第２溶液の活性値の間のエストロゲン類似活性を有すると判定する。（３）前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性と同等あるいはそれよりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はエストロゲン類似活性をもたないと判定する。
これにより、正確性と簡便性とを備えるエストロゲン類似活性の評価方法を提供することができる。
One aspect of the evaluation method according to the present invention is an evaluation method for evaluating whether a test substance has estrogenic activity on cells, and at least the following steps are performed.
A first step of culturing cells to form a plurality of spheroid-shaped cells.
A second step of causing any one of the first to third solutions to act on each of the spheroid-shaped cells. The first solution contains a chemical substance to be tested (test chemical substance). The second solution contains a chemical that is known to have estrogenic activity. The third solution contains a chemical known to have no estrogenic activity. In other words, the third solution is a solution obtained by removing the chemical substance to be inspected from the first solution.
・ Measure the UGT activity of each spheroid-shaped cell by applying a UDP-glucuronyltransferase activity measurement solution to each spheroid-shaped cell on which any one of the first to third solutions is applied. 3rd process to do.
A step of determining estrogen-like activity of the chemical substance contained in the first solution based on the measurement result. Specifically, (1) When the UGT activity of the spheroid-shaped cells treated with the first solution is equal to or higher than the UGT activity of the spheroid-shaped cells treated with the second solution The chemical substance contained in the first solution is determined to have an estrogen-like activity equal to or greater than that of the chemical substance contained in the second solution. (2) When the UGT activity of the cell on which the first solution is acted is higher than the activity of the third solution and lower than the activity of the second solution, the chemical substances contained in the first solution are zero. It is determined to have an estrogen-like activity between the activity values of the second solution. (3) When the UGT activity of the cell on which the first solution is applied is equal to or lower than the activity of the third solution, the chemical substance contained in the first solution has no estrogen-like activity. judge.
Thereby, the evaluation method of estrogen-like activity provided with accuracy and simplicity can be provided.
また、本発明に係る評価方法の一態様において、前記培養する細胞がエストロゲン受容体を有することが好ましい。さらに、前記培養容器が、複数のウェルを有する培養プレートの各ウェル内に、微細な凹凸構造により前記複数の培養空間を有するように形成され、前記複数の培養空間内でスフェロイド形状の細胞を形成することが好ましい。 In one embodiment of the evaluation method according to the present invention, it is preferable that the cultured cell has an estrogen receptor. Further, the culture vessel is formed in each well of a culture plate having a plurality of wells so as to have the plurality of culture spaces by a fine uneven structure, and spheroid-shaped cells are formed in the plurality of culture spaces. It is preferable to do.
本発明によれば、正確性と簡便性を兼ね備えるエストロゲン類似活性の評価方法を提供することが可能となる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to provide the evaluation method of estrogen-like activity which has both accuracy and simplicity.
以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。 Hereinafter, embodiments will be described with reference to the drawings. For clarity of explanation, the following description and drawings are omitted and simplified as appropriate. In the drawings, components having the same configuration or function and corresponding parts are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
本明細書では次の用語を用いる。
用語「スフェロイド」は、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態になったものである。
用語「ウェルプレート」は、多数のくぼみ（穴またはウェル）のついた平板からなる実験・検査器具であり、各ウェルを試験管あるいはシャーレとして利用するものをいう。ウェルの数には例えば、６、２４、９６、３８４などがあり、それ以上の数のものもある。ウェルの底は平らなもの、丸いもののほか、細長いマイクロチューブを多数組み合わせた形式のもの（ディープウェルプレート）もある。
In this specification, the following terms are used.
The term “spheroid” is a three-dimensional state in which many cells aggregate to form a cell mass.
The term “well plate” refers to an experimental / inspection instrument composed of a flat plate with a number of indentations (holes or wells), and each well is used as a test tube or petri dish. The number of wells includes, for example, 6, 24, 96, 384, and others. The bottom of the well is flat, round, or a combination of many elongated microtubes (deep well plate).
以下の説明において、「値Ａから値Ｂの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値Ａ以上値Ｂ以下」を意味する。
加えて、「Ａ、Ｂ、・・・、Ｃ、及びこれらの組合せ」という記載の「これらの組合せ」は、その前に記載のＡ、Ｂ、・・・、Ｃのうちの二つ以上の任意の数の組合せであることを意味する。言い換えると、「Ａ、Ｂ、・・・、Ｃ、及びこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、・・・、Ｃのうちのいずれか一つと、これらの任意の数の組合せとのうちの一方、ということもできる。
In the following description, the term “range from value A to value B” means “value A or more and value B or less” unless otherwise specified.
In addition, “the combination” described as “A, B,..., C, and combinations thereof” means two or more of A, B,. Means any number of combinations. In other words, “A, B,..., C, and a combination thereof” means either one of A, B,..., C, and any combination of these. It can also be said.
一実施形態では、細胞のＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（以下適宜、「ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素」を「ＵＧＴ」と称する）の酵素活性を指標とすることで、エストロゲン類似活性が生体に与える影響をより正確かつ簡便に評価する方法を提供する。ここで、まず上述した二つの課題を解決する手法について、その概略を説明する。 In one embodiment, the effect of estrogen-like activity on a living body by using as an index the enzyme activity of cellular UDP-glucuronosyltransferase (hereinafter, “UDP-glucuronosyltransferase” is referred to as “UGT” as appropriate) It is possible to provide a method for more accurately and conveniently evaluating. Here, an outline of a technique for solving the above-described two problems will be described first.
一つ目の課題である正確な評価方法は、ＵＧＴ活性を指標とすることによって実現する。ＵＧＴは生体内でエストロゲンおよびエストロゲン類似物質の代謝・排出に関わる酵素である。例えば、非特許文献３ではＭＣＦ−７細胞にエストロゲンまたはエストロゲン類似物質を作用させた場合、ＵＧＴ１Ａ１０の発現量が増大することが報告されている。しかし、非特許文献３にはエストロゲンによる発現誘導が濃度依存的ではないことが示されている。そのため、ＵＧＴの発現量を指標とした場合、検査したい化学物質の濃度によっては、エストロゲン類似活性があるにも関わらず検出できない可能性がある。一方、ＭＣＦ−７細胞に対して一般的にＵＧＴ誘導効果が知られている化学物質を作用させた場合、ＵＧＴ発現量に大きな変化が見られないにも関わらず、ＵＧＴ活性は８〜９倍に向上することを、発明者らは非特許文献４で報告している。
即ち、検査したい化学物質を細胞に作用させたときのＵＧＴ活性の向上を調べることで、遺伝子発現量を指標とする従来技術よりも正確に、その化学物質がエストロゲン類似活性を有するものであるかどうか評価することができる。そのため、検査する化学物質を細胞に作用させる工程が必要であり、この工程の手法を見出した。
The accurate evaluation method that is the first problem is realized by using UGT activity as an index. UGT is an enzyme involved in metabolism and excretion of estrogen and estrogen-like substances in vivo. For example, Non-Patent Document 3 reports that the expression level of UGT1A10 increases when estrogen or an estrogen-like substance is allowed to act on MCF-7 cells. However, Non-Patent Document 3 shows that expression induction by estrogen is not concentration-dependent. Therefore, when the expression level of UGT is used as an index, there is a possibility that it cannot be detected depending on the concentration of the chemical substance to be examined even though there is an estrogen-like activity. On the other hand, when a chemical substance generally known to have a UGT-inducing effect is allowed to act on MCF-7 cells, the UGT activity is 8-9 times despite the fact that no significant change is observed in the expression level of UGT. The inventors have reported in Non-Patent Document 4 that this is improved.
That is, by examining the improvement in UGT activity when a chemical substance to be tested is allowed to act on cells, whether the chemical substance has an estrogen-like activity more accurately than the conventional technique using gene expression level as an index Can be evaluated. For this reason, a process for causing a chemical substance to be tested to act on cells is necessary, and a technique for this process has been found.
二つ目の課題である簡便な評価方法は、細胞に対して検査物質を作用させる工程と酵素活性測定用試薬を作用させる工程とを同一の細胞培養ウェルプレート上で行なうことで提供される。一般にＵＧＴ酵素活性は代謝産物であるグルクロン酸抱合体の生成量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や液体クロマトグラフィーによって測定することで表される。しかし薄層クロマトグラフィーを行なうためには放射性同位体で標識されたＵＤＰ−グルクロン酸を用意する必要がある。その結果、放射線物質漏洩を防ぐため、ＲＩ（Radioisotope）施設の設置や、届出などの特別なケアが必要となり、汎用性に課題がある。また液体クロマトグラフィーと比較した場合、薄層クロマトグラフィーは、定量性に劣るという欠点がある。一方、液体クロマトグラフィーはグルクロン酸抱合体の生成量を精度よく測定することができるが、直接測るためには検査対象の検出波長が既知である必要がある。このため、未知の化学物質を速やかに調べることができない。 A simple evaluation method, which is the second problem, is provided by performing the step of allowing a test substance to act on cells and the step of causing an enzyme activity measurement reagent to act on the same cell culture well plate. In general, the UGT enzyme activity is expressed by measuring the amount of glucuronic acid conjugate, which is a metabolite, by thin layer chromatography (TLC) or liquid chromatography. However, in order to perform thin layer chromatography, it is necessary to prepare UDP-glucuronic acid labeled with a radioisotope. As a result, in order to prevent radiation material leakage, special care such as installation of RI (Radioisotope) facilities and notification is necessary, and there is a problem in versatility. Moreover, when compared with liquid chromatography, thin layer chromatography has the disadvantage of being inferior in quantitativeness. On the other hand, liquid chromatography can accurately measure the production amount of glucuronic acid conjugates, but in order to directly measure it, the detection wavelength of the test object needs to be known. For this reason, unknown chemical substances cannot be examined quickly.
そこで、まず、検査する化学物質を細胞に作用させてＵＧＴ活性を変化させた後に、ＵＤＰ−グルクロン酸抱合によって蛍光波長がシフトすることが知られている試薬を作用させる。次に、プレートリーダーまたは液体クロマトグラフィーによって、シフトした蛍光波長を測定する。この手順によって、ＵＧＴ活性を評価する方法を見いだした。しかしながら、この方法では作用させたエストロゲン濃度に依存的なＵＧＴ活性の上昇は見られない、またはわずかな上昇幅であるため精度よく検出することができない。そのため、ウェルプレート内で細胞を三次元的に培養し、ＵＧＴ活性を高めることで、プレートリーダーや液体クロマトグラフィーで充分測定可能な蛍光を検出できる方法を発見した。 Therefore, first, a chemical substance to be examined is allowed to act on cells to change UGT activity, and then a reagent known to shift the fluorescence wavelength due to UDP-glucuronic acid conjugation is allowed to act. Next, the shifted fluorescence wavelength is measured by a plate reader or liquid chromatography. By this procedure, a method for evaluating UGT activity was found. However, this method does not show an increase in UGT activity depending on the concentration of estrogen acted on, or cannot detect it accurately because it is a slight increase. Therefore, we have discovered a method that can detect fluorescence that can be sufficiently measured by a plate reader or liquid chromatography by culturing cells three-dimensionally in a well plate and increasing UGT activity.
続いて、一実施形態の評価方法の詳細を説明する。評価方法は、被験物質（被験化学物質）が細胞に対してエストロゲン活性を有するものであるか否かを評価する。例えば、第１乃至第４工程の手順を実施することにより実現する。以下に第１乃至第４工程の概略を説明する。なお、第１乃至第４工程は説明を容易にするために工程を分けたものであり、これに限られるものではない。
第１工程は、細胞を培養してスフェロイド形状の細胞を形成する培養処理である。以降の説明において、「スフェロイド形状の細胞」を「スフェロイド」と称することもある。
第２工程は、培養したスフェロイド形状の細胞へ、化学物質を含む溶液を作用させる作用処理である。
第３工程は、第１乃至第３溶液のいずれかを作用させた各スフェロイド形状の細胞に対して、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性測定溶液を作用させて、各スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性を測定する測定処理である。
第４工程は、測定結果に基づいて、被験物質がエストロゲン類似活性を有するか否かを判定する判定処理である。
Then, the detail of the evaluation method of one Embodiment is demonstrated. The evaluation method evaluates whether or not the test substance (test chemical substance) has estrogenic activity on the cells. For example, this is realized by performing the procedures of the first to fourth steps. The outline of the first to fourth steps will be described below. Note that the first to fourth steps are separated for ease of explanation, and the present invention is not limited to this.
The first step is a culture process for culturing cells to form spheroid-shaped cells. In the following description, “spheroid-shaped cells” may be referred to as “spheroids”.
The second step is an action treatment in which a solution containing a chemical substance is allowed to act on cultured spheroid-shaped cells.
In the third step, the UDP-glucuronyltransferase activity measurement solution is allowed to act on each spheroid-shaped cell on which any one of the first to third solutions is applied, and the UGT activity of each spheroid-shaped cell is measured. It is a measurement process to measure.
The fourth step is a determination process for determining whether the test substance has an estrogen-like activity based on the measurement result.
以下、一実施形態の評価方法について、最初に、培養処理で用いる培養容器について説明し、次に、培養処理から判定処理までを実施する評価方法の手順について詳細に説明する。 Hereinafter, regarding the evaluation method of one embodiment, first, a culture vessel used in the culture process will be described, and then the procedure of the evaluation method for performing the culture process to the determination process will be described in detail.
１．培養容器
＊ 培養容器の概略
図１は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図２Ａは、図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図であり、図２Ｂに、他の態様の断面図を示す。培養プレート１は、複数のウェル２１を備える。複数のウェル２１は、仕切り部２２によって、隣り合うウェル２１と隔てられる。複数のウェル２１それぞれには、培養容器１０が形成されている。
図３に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図４は、図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間１１が仕切り部２２に隣接する場合、壁１２は、図２Ａに示すように、仕切り部２２の壁面の一部分と同じになってもよいし、図２Ｂに示すように、仕切り部２２の壁面に隣接して壁１２が配置されてもよい。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部１３は、培養プレート１に形成された各ウェル２１の底部と同じ領域であり、各ウェル２１の底部が用いられる。底部１３は、培養空間１１の底を形成する。底部１３のうち、培養空間１１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面１４」とも称する。
1. Culture Container * Outline of Culture Container FIG. 1 is a diagram showing the entire culture plate used in one embodiment of the present invention. 2A is a cross-sectional view taken along the line II-II of the culture plate shown in FIG. 1, and FIG. 2B shows a cross-sectional view of another embodiment. The culture plate 1 includes a plurality of wells 21. The plurality of wells 21 are separated from the adjacent wells 21 by the partition portion 22. A culture vessel 10 is formed in each of the plurality of wells 21.
In FIG. 3, the structural example of the culture container used by embodiment of this invention is shown. 4 is a cross-sectional view of the culture vessel shown in FIG. 3 taken along the line IV-IV.
The culture vessel 10 has a culture space 11, a wall 12, and a bottom portion 13.
The culture space 11 is an area partitioned by the wall 12 and the bottom 13 and is a three-dimensional space area (culture area) for culturing cells. The culture space 11 is also simply referred to as “space” or “microspace”.
The wall 12 is a partition wall that partitions the culture space 11, and can be said to be a convex portion that forms an uneven pattern in the culture vessel 10. When the culture space 11 is adjacent to the partition part 22, the wall 12 may be the same as a part of the wall surface of the partition part 22 as shown in FIG. 2A, or as shown in FIG. The wall 12 may be disposed adjacent to the wall surface.
The bottom 13 functions as a substrate of the culture vessel 10 and the surface on the side where the culture space 11 is arranged becomes a part of the culture region (culture surface). The bottom 13 is the same region as the bottom of each well 21 formed in the culture plate 1, and the bottom of each well 21 is used. The bottom 13 forms the bottom of the culture space 11. Of the bottom portion 13, the surface of the bottom portion that is a part of the surface forming the culture space 11 and serves as the culture region is also referred to as a “bottom culture surface 14”.
図３，４では、培養容器１０に形成される培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁１２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部１３の厚さＴを示す。図３，４では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、株化肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径の相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底（底部培養面１４）から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面１４が平面の場合、高さＨは、壁１２の高さと同じである。
壁１２の幅Ｗは、壁１２の厚さであるとともに、隣接する培養空間１１間を隔てる距離であるともいえる。
3 and 4, the equivalent diameter D, the height (depth) H, the width (thickness) W of the wall 12 and the thickness T of the bottom 13 are shown with respect to the culture space 11 formed in the culture vessel 10. . In FIGS. 3 and 4, the bottom portion 13 is illustrated as being integrally formed with the wall 12.
The equivalent diameter D is a diameter of an inscribed circle inscribed in the culture space 11. More specifically, the equivalent diameter D is the inscribed circle of the shape of the surface parallel to the bottom 13 of the culture space 11 (front shape), in other words, the shape of the surface perpendicular to the direction of the height H of the culture space 11. The diameter of When the shape of the front surface of the culture space 11 differs according to the height H, the maximum value of the space region in which the established hepatocytes are cultured is defined as the equivalent diameter of the equivalent diameter.
The height H is the length from the bottom of the culture space 11 (bottom culture surface 14) to the top surface of the wall 12, and can also be said to be the depth of the culture space 11. Further, when the bottom culture surface 14 is a flat surface, the height H is the same as the height of the wall 12.
The width W of the wall 12 is not only the thickness of the wall 12 but also the distance separating the adjacent culture spaces 11.
培養容器１０内（言い換えると、各ウェル２１内）において、複数の培養空間１１は、図３に示すようにアレイ状に配置される。培養容器１０に含まれる培養空間１１の数または大きさは、培養プレート１に作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。具体的には、ウェル２１の数が多くなるに従って、培養空間１１の数が小さくなる関係にある。同じ大きさのウェル２１のとき、ウェル２１の中の培養空間１１の数は、相当直径Ｄが大きい場合や幅Ｗが大きい場合に小さくなる関係にある。図１乃至４では、構成をわかりやすく説明するため、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、培養容器１０に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図３，４では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（各ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。 In the culture vessel 10 (in other words, in each well 21), the plurality of culture spaces 11 are arranged in an array as shown in FIG. The number or size of the culture spaces 11 included in the culture vessel 10 depends on the number of wells 21 (size of the wells 21) prepared in the culture plate 1 and the sizes of the culture spaces 11 and the walls 12. . Specifically, there is a relationship in which the number of culture spaces 11 decreases as the number of wells 21 increases. In the case of the wells 21 having the same size, the number of the culture spaces 11 in the well 21 has a relationship of decreasing when the equivalent diameter D is large or when the width W is large. 1 to 4 are schematic diagrams showing the number of culture spaces 11 reduced for easy understanding of the configuration, and the number of culture spaces 11 included in the culture vessel 10 is different from the actual one. In addition, FIGS. 3 and 4 show nine culture spaces 11. This is shown for explanation, and does not correspond to the number of culture spaces 11 included in the actual culture vessel 10 (each well 21).
発明者らは、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍であり、高さＨが相当直径Ｄの０．３倍〜２倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で株化肝細胞を培養することによって、均一な直径の株化肝細胞のスフェロイドを培養することができることを見出した。従って、所望するスフェロイドの大きさに応じて、培養容器１０に配置される培養空間１１の大きさを選択することにより、培養するスフェロイドの大きさを制御することが可能になる。一実施形態では、株化肝細胞として、ヒト由来の株化肝細胞を培養してスフェロイド形成させる。以下に詳細を説明する。 The inventors have a plurality of culture spaces 11 in which the equivalent diameter D is 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid and the height H is 0.3 to 2 times the equivalent diameter D. By using the culture vessel 10 having a water contact angle of 45 degrees or less on the surface and culturing the established hepatocytes in each culture space 11, spheroids of the established hepatocytes having a uniform diameter can be cultured. I found it. Therefore, the size of the spheroids to be cultured can be controlled by selecting the size of the culture space 11 arranged in the culture vessel 10 according to the desired size of the spheroids. In one embodiment, human-derived established hepatocytes are cultured to form spheroids. Details will be described below.
図１乃至４を参照して、所望のスフェロイドを形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の大きさ、形状等と、培養表面の特性を説明する。
＊ 培養空間の大きさ、形状等
培養空間１１の相当直径Ｄについて、細胞が増殖するに従いスフェロイドの直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。このため、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．２〜４倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径１００μｍの株化肝細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
With reference to FIG. 1 thru | or 4, the magnitude | size of the culture space 11 of a micro order for forming a desired spheroid, a shape, etc., and the characteristic of a culture surface are demonstrated.
* Size, shape, etc. of culture space Regarding the equivalent diameter D of the culture space 11, it is necessary to consider that the diameter of the spheroid increases as the cells grow. Therefore, what is important is to secure a culture space 11 in which the spheroids do not come into contact with cells in the adjacent culture space 11. For this reason, the equivalent diameter D of the culture space 11 is preferably in the range of 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid, and more preferably in the range of 1.2 to 4 times.
For example, in order to form a spheroid of a established hepatocyte having a diameter of 100 μm, the height H is set to the equivalent diameter D within the range of 1 to 5 times the diameter of the desired spheroid, that is, the equivalent diameter D is in the range of 100 to 500 μm. A culture vessel 10 having a bottom 13 in which culture spaces 11 having a value divided by 0.3 in a range of 0.3 to 2 are regularly arranged is used.
株化肝細胞の培養空間１１の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させているような場合は、十分に細胞が底面に接着性していることから培地交換時に細胞が剥離することがない。そのため、本実施形態のような、培養空間１１の相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、高さＨが相当直径Ｄの０．３〜２倍の範囲という、深い空間は必要ないため、そのような空間での培養は行わない。
一方、一実施形態では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。好ましい範囲のスフェロイドを形成させるために好ましい高さＨ、相当直径Ｄを検討した結果、細胞増殖によりスフェロイドが過剰に大きくなることを防ぐためには、相当直径Ｄが１００μｍ〜２００μｍの範囲、高さＨが５０μｍ〜１００μｍの範囲が好ましい。培養空間１１の底までアミノ酸等の栄養分を十分に供給するため、かつ老廃物の蓄積を防ぐために、培養空間１１の高さＨは、培地交換や試験溶液交換時にスフェロイドが剥離しない限り低い方が好ましい。具体的には、培養空間１１の高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．３〜２の範囲が好ましく、０．５〜１の範囲がより好ましいことを見いだした。
When cell growth and growth are maintained by strengthening cell adhesion with the surface of the culture space 11 of established hepatocytes, the cells are sufficiently adhered to the bottom surface, so that the cells are detached when the medium is changed. There is nothing to do. Therefore, as in this embodiment, a deep space in which the equivalent diameter D of the culture space 11 is in the range of 1 to 5 times the desired spheroid diameter and the height H is in the range of 0.3 to 2 times the equivalent diameter D. Is not necessary, so culture in such a space is not performed.
On the other hand, in one embodiment, since cell adhesion is suppressed as described later, it is necessary to design an optimum height H that can supply amino acids, oxygen, and the like and that does not desorb spheroids. As a result of examining the preferred height H and equivalent diameter D to form a preferred range of spheroids, in order to prevent the spheroids from becoming excessively large due to cell proliferation, the equivalent diameter D is in the range of 100 μm to 200 μm and the height H Is preferably in the range of 50 μm to 100 μm. In order to sufficiently supply nutrients such as amino acids to the bottom of the culture space 11 and to prevent the accumulation of waste products, the height H of the culture space 11 should be lower as long as the spheroids do not peel off during medium exchange or test solution exchange. preferable. Specifically, it was found that the value obtained by dividing the height H of the culture space 11 by the equivalent diameter D is preferably in the range of 0.3 to 2, and more preferably in the range of 0.5 to 1.
一実施形態では、試験溶液をスフェロイド中心部まで拡散または輸送させるためには、スフェロイドの直径は最大２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ以下が好ましい。さらに加えて、細胞間の相互作用の効果を最大限に引き出すためには、スフェロイドの直径は、最小５０μｍが好ましく、６０μｍ〜１５０μｍの範囲がより好ましい。ここで、細胞間の相互作用は、細胞同士の接着、あるいは細胞間での物質のやり取りのことを指す。また細胞間の相互作用による効果とは、本発明においては、検査する化学物質（例えば、エストラジオール）の吸収、代謝、排出機能の向上を指す。 In one embodiment, in order for the test solution to diffuse or transport to the center of the spheroid, the diameter of the spheroid is preferably less than 200 μm maximum, preferably 150 μm or less. In addition, in order to maximize the effect of interaction between cells, the spheroid diameter is preferably 50 μm at the minimum, and more preferably in the range of 60 μm to 150 μm. Here, the interaction between cells refers to the adhesion between cells or the exchange of substances between cells. Moreover, the effect by the interaction between cells refers to the improvement of absorption, metabolism, and excretion functions of a chemical substance to be examined (for example, estradiol) in the present invention.
壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面での細胞増殖を防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、２〜５０μｍの範囲がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０〜１３５度の範囲が好ましく、９０度〜１２０度の範囲がより好ましい。 The width W of the wall 12 is the thickness of the wall 12 that separates the culture space 11 adjacent to the culture space 11. Accordingly, the width W of the wall 12 is preferably in the range of 2 to 50 μm in order to prevent cell growth on the upper surface of the wall 12 and to facilitate entry of cells into the culture space 11, and preferably one cell body. The following size, that is, a range of 5 to 30 μm is preferable, and a range of 5 to 10 μm is more preferable. Furthermore, from the same viewpoint, the angle θ formed by the upper surface of the wall 12 and the side surface of the culture space 11 is preferably in the range of 90 to 135 degrees, and more preferably in the range of 90 to 120 degrees.
図５Ａに、培養空間１１でスフェロイドを培養する状態を表す概略図を示す。図５Ａでは、図４に示す断面図を用い、スフェロイド９を、○印で示す。スフェロイド９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
図１に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成するため、各ウェル２１において、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。
FIG. 5A is a schematic diagram showing a state in which spheroids are cultured in the culture space 11. In FIG. 5A, the spheroid 9 is indicated by a circle using the cross-sectional view shown in FIG. The spheroid 9 is cultured in each of the plurality of culture spaces 11.
When culturing on the culture plate 1 shown in FIG. 1, the culture conditions are set and the medium is exchanged for each well 21. Therefore, since a plurality of culture spaces 11 are formed in each well 21, a plurality of spheroids can be cultured in each well 21 under the same conditions. In addition, since spheroids can be cultured using a well plate, it becomes possible to use an apparatus or the like used in conventional cell culture.
Assuming that the diameter DSP of the spheroid 9 is a value dsp (dsp is a positive value), the equivalent diameter D of the culture space 11 is preferably in a range of 5 times the value dsp to the value dsp (dsp ≦ D ≦ 5 dsp). Further, the height H of the culture space 11 is preferably in the range of 0.3 times the value dsp to 25 times the value dsp (5 × 5) (0.3 dsp ≦ H ≦ 25 dsp).
図５Ｂに、培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。図５Ｂは、スフェロイド９の相当直径Ｄに沿って切断した切断部端面を模式的に示した図である。上述したように、スフェロイドの直径の平均が５０μｍ以上２００μｍ未満であることが好ましく、特に、６０μｍ〜１５０μｍの範囲が好ましい。図５Ｂでは、スフェロイド９の切断部端面が５個の細胞８により形成されている様子を示す。例えば、細胞８の直径ＤＣＬが２０μｍであり、スフェロイド９の直径ＤＳＰが６０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に３個並ぶことにより形成される。同様に、スフェロイド９の直径ＤＳＰが１５０μｍのスフェロイド９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に５個並ぶことにより形成される。図５Ｂは説明を容易にするために細胞８を直線上に並べて模式的に示したものであり、細胞８は必ずしも直線上に並ぶとは限らない。 FIG. 5B is a schematic diagram illustrating an example of a preferred size of spheroids cultured in the culture space. FIG. 5B is a diagram schematically showing a cut end surface cut along the equivalent diameter D of the spheroid 9. As described above, the average diameter of the spheroids is preferably 50 μm or more and less than 200 μm, and particularly preferably in the range of 60 μm to 150 μm. FIG. 5B shows a state where the cut end surface of the spheroid 9 is formed by five cells 8. For example, when forming the spheroid 9 in which the diameter DCL of the cell 8 is 20 μm and the diameter DSP of the spheroid 9 is 60 μm, the cell 8 is formed by arranging three cells 8 in a straight line. Similarly, when the spheroid 9 having a diameter DSP of 150 μm is formed, for example, it is formed by arranging five cells 8 on a straight line. FIG. 5B schematically shows the cells 8 arranged in a straight line for ease of explanation, and the cells 8 are not necessarily arranged in a straight line.
加えて、１試験領域（１ウェル、１シャーレ）にあるスフェロイドは、その直径が半値幅の範囲内にあるものが全体の７０％以上含まれることが好ましい。言い換えると、スフェロイドの直径の大きさがそろっていることが好ましい。その理由は以下の通りである。まず、スフェロイドの大きさによって代謝活性値が異なることが知られていることから、様々な直径のスフェロイドが混在していると精度の高い結果が得られない。また、小さい（５０μｍ以下の）スフェロイドの代謝機能は極端に低いことが知られている。そのため、このようなスフェロイドが多く含まれている場合、代謝機能を減衰させるようなサイトカインを評価する際に測定限界値以下となり、代謝機能の減衰の有無が判定できない可能性がある。
「半値幅の範囲」とは、１試験領域にあるスフェロイドの総個数ＮＴうち、直径の大きさと存在する個数との対応を取ったときに、存在する個数が最大となる直径Ｄ１の個数Ｎ１に対して、個数Ｎ１の半分の個数（Ｎ１／２）となる複数の直径のうち、最小の直径Ｄ２から最大の直径Ｄ３までの範囲に存在するスフェロイドの個数Ｎ２をいう。
スフェロイドの大きさを一様にするために、上述した総個数ＮＴに対して個数Ｎ２が７０％以上であることが好ましく、総個数ＮＴに対する個数Ｎ２の割合が高くなることがより好ましい。
In addition, the spheroids in one test region (1 well, 1 petri dish) preferably include 70% or more of the spheroids whose diameter is in the range of half width. In other words, it is preferable that the spheroids have the same diameter. The reason is as follows. First, since it is known that the metabolic activity value varies depending on the size of the spheroids, a highly accurate result cannot be obtained if spheroids of various diameters are mixed. Moreover, it is known that the metabolic function of small (less than 50 μm) spheroids is extremely low. Therefore, when many such spheroids are contained, there is a possibility that it is less than the measurement limit when evaluating a cytokine that attenuates metabolic function, and the presence or absence of metabolic function attenuation cannot be determined.
The “half-width range” is the number N1 of diameters D1 that maximizes the number of existing spheroids NT in one test area when the size of the diameter corresponds to the number of existing spheroids. On the other hand, it refers to the number N2 of spheroids existing in the range from the minimum diameter D2 to the maximum diameter D3 among a plurality of diameters that are half the number N1 (N1 / 2).
In order to make the size of the spheroids uniform, the number N2 is preferably 70% or more with respect to the total number NT described above, and the ratio of the number N2 to the total number NT is more preferable.
培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図３に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有するスフェロイドを形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
培養空間１１の側面の形状は、図４に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図７Ａ〜７Ｃに示すような形状であってもよい。
The shape of the culture space 11 (front shape) or the shape of the surface parallel to the bottom portion 13 is not limited to the shape shown in FIG. 3, for example, as shown in FIGS. Alternatively, other shapes (such as an ellipse or rhombus) may be used. In order to form a spheroid having a higher density and a uniform diameter, a symmetric structure is preferable.
The shape of the side surface of the culture space 11 is not limited to the shape shown in FIG. 4 and may be, for example, the shapes as shown in FIGS.
培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂、及びこれらの組合せからなる群から選択される。 Materials constituting the culture vessel 10 include acrylic resin, polylactic acid, polyglycolic acid, styrene resin, acrylic / styrene copolymer resin, polycarbonate resin, polyester resin, polyvinyl alcohol resin, ethylene / vinyl alcohol. Selected from the group consisting of a copolymer copolymer resin, a thermoplastic elastomer, a vinyl chloride resin, a silicon resin, and combinations thereof.
培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養したスフェロイドを観察することが可能になる。培養容器の観察性を確保することにより、培養容器をそのまま用いて、免疫組織学法による蛍光染色観察や、Green Fluorescent Protein（ＧＦＰ）などのレポータ遺伝子を使用したin situ法が可能となる。
加えて、培養容器１０の底部１３を構成するポリマーの全光線透過率が、８５％以上９９％未満であることが好ましい。全光線透過率（total luminous transmittance）は、日本工業規格（ＪＩＳ Ｋ７３７５）により測定する。全光線透過率を高くすることにより、底部１３の上に培養されたスフェロイドの観察性を確保することができる。
The thickness T of the bottom 13 of the culture vessel 10 is preferably 1 mm or less from the viewpoint of observability. However, as long as it does not hinder observation with a microscope, it may be 1 mm or more, and does not limit the thickness T of the bottom portion 13. By ensuring the observability of the bottom 13 of the culture vessel, it is possible to observe the cultured spheroids using the culture plate as it is. By ensuring the observability of the culture vessel, it is possible to observe the fluorescent staining by immunohistological method or in situ method using a reporter gene such as Green Fluorescent Protein (GFP) using the culture vessel as it is.
In addition, the total light transmittance of the polymer constituting the bottom 13 of the culture vessel 10 is preferably 85% or more and less than 99%. The total light transmittance is measured according to Japanese Industrial Standard (JIS K7375). By increasing the total light transmittance, the observability of the spheroids cultured on the bottom 13 can be ensured.
＊ 培養表面の特性
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間１１を囲む壁１２及び底部培養面１４の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度〜２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。
* Characteristics of the culture surface Next, characteristics of the culture surface for culturing the cells, that is, the characteristics of the wall 12 and the bottom culture surface 14 surrounding the culture space 11, particularly the hydrophilization treatment will be described. The culture surface cannot cover the surface unless a culture solution 11 enters the culture space 11 in order to put a culture medium in each culture space 11 and when a coating solution is used. For this reason, it is preferable to make a water contact angle 45 degrees or less. More preferably, it is the range of 0 degree-20 degree | times. In addition, the value of the water contact angle is premised on a value obtained by producing and measuring a flat plate on which the concave and convex patterns of the culture space 11 and the wall 12 are not formed under the same conditions as the culture vessel 10.
培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。 Regarding the surface where the culture space 11 is arranged in an array, when the surface is highly hydrophobic and the water contact angle exceeds 45 degrees, that is, when the wettability is low, bubbles are generated in the space when a medium or a coating solution is added. It becomes easy to enter, and a space where cells cannot be cultured may be generated. Therefore, it is necessary to make the surface hydrophilic so that the water contact angle is 45 degrees or less. Examples of the hydrophilization method include a method of depositing SiO 2 and a method of performing plasma treatment.
加えて、培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるため、細胞接着性を抑制することが好ましい。細胞接着性を抑制するためには、水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような表面を用いることで可能になる。細胞接着性を抑制することと、水接触角との関係については、例えば、Y Ikada著、"Surface modification of polymers for medical applications"、 Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp. 725-736に記載されている。水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを底部培養面１４に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる。
また、水接触角を４５度以下にすることで、細胞接着性を抑制する物質をコートしてより接着性を抑制することにより、効率よくスフェロイドを形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を４５度以下にした後、リン脂質・高分子複合体やポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）をコートしてもよい。
In addition, in order to efficiently form spheroids in the culture vessel 10, it is preferable to suppress cell adhesion. In order to suppress cell adhesion, it is possible to use a surface having a water contact angle of 45 degrees or less, preferably 40 degrees or less, more preferably 20 degrees or less. For the relationship between inhibiting cell adhesion and water contact angle, see, for example, Y Ikada, “Surface modification of polymers for medical applications”, Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp. 725-736. Have been described. Examples of the method for setting the water contact angle to 45 degrees or less include a method of depositing glass on the bottom culture surface 14 and a method of forming a functional group on the surface using a plasma treatment method. A functional group is formed on the surface by plasma treatment or the like.
In addition, by setting the water contact angle to 45 degrees or less, a spheroid can be efficiently formed by coating a substance that suppresses cell adhesion and further suppressing adhesion. For example, after a plasma treatment is performed and the water contact angle is set to 45 degrees or less, a phospholipid / polymer complex or poly (2-hydroxyethyl methacrylate) may be coated.
上述したように培養空間１１を有する培養容器１０で効率よくスフェロイドを形成させるためには、細胞接着を抑制する方が好ましい。一方、培地交換や試験溶液交換の際にスフェロイドが培養空間１１から離脱することを防ぐ目的から、スフェロイドの一部は培養表面（壁１２の表面または底部培養面１４）に接着している方が好ましい。そのため、培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーと、培養表面への細胞の接着を促進するポリマーとの混合物を培養表面にコートしてもよい。培養表面への細胞の接着を阻害するポリマーは、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、リン脂質、リン脂質・高分子複合体、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーである。細胞接着性を促進するポリマーは、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びこれらの組合せからなる群から選択されるポリマーである。コート溶液の一例として、リン脂質、リン脂質・高分子複合体である２−メタ クリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーとポリ−Ｌ−リシン溶液との混合物が挙げられる。ＭＰＣ溶液濃度は０．００１％〜１％の範囲が好ましく、０．０１％〜０．１％の範囲がより好ましい。ポリ−Ｌ−リシン溶液の濃度は０．００１〜０．１％の範囲が好ましく、０．００５〜０．０１５％の範囲がより好ましい。ＭＰＣ溶液とポリ−Ｌ−リシン溶液の混合比は５０：５０〜１００：０の範囲が好ましく、７５：２５〜９０：１０の範囲がより好ましい。 As described above, in order to efficiently form spheroids in the culture vessel 10 having the culture space 11, it is preferable to suppress cell adhesion. On the other hand, in order to prevent spheroids from detaching from the culture space 11 during medium exchange or test solution exchange, it is preferable that a part of the spheroids adhere to the culture surface (the surface of the wall 12 or the bottom culture surface 14). preferable. Therefore, the culture surface may be coated with a mixture of a polymer that inhibits cell adhesion to the culture surface and a polymer that promotes cell adhesion to the culture surface. Polymers that inhibit cell adhesion to the culture surface include hydrophilic polymer chains that inhibit cell adhesion, phospholipids, phospholipid / polymer complexes, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA), polyvinyl alcohol, A polymer selected from the group consisting of agarose, chitosan, polyethylene glycol, albumin, and combinations thereof. The polymer that promotes cell adhesion is a polymer selected from the group consisting of poly-L-lysine, poly-D-lysine, collagen, laminin, fibronectin, and combinations thereof. As an example of the coating solution, a mixture of a phospholipid, a 2-methacryloyloxyethylphosphorischoline (MPC) polymer that is a phospholipid / polymer complex, and a poly-L-lysine solution can be given. The MPC solution concentration is preferably in the range of 0.001% to 1%, and more preferably in the range of 0.01% to 0.1%. The concentration of the poly-L-lysine solution is preferably in the range of 0.001 to 0.1%, more preferably in the range of 0.005 to 0.015%. The mixing ratio of the MPC solution and the poly-L-lysine solution is preferably in the range of 50:50 to 100: 0, and more preferably in the range of 75:25 to 90:10.
２．培養処理から判定処理までの手順
一実施形態の評価方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、培養処理（第１工程）と、作用処理（第２工程）とを同一のウェル内で行うことが好ましい。さらに加えて、測定処理（第３工程）を培養処理及び作用処理と同一のウェル内で行うことがより好ましい。そのため、一実施形態では、例えば、図１に示す培養プレート１の複数のウェル２１を用い、複数のウェル２１のうち、一つのウェル２１内で培養処理から測定処理までの各工程を実施する場合を説明する。言い換えると、一つのウェル内で培養から測定までの処理において、処理の途中で細胞を別のウェル２１に移動させることはない。培養プレート１が有するウェル２１の数は、検査したい化学物質の種類等に応じて選択する。
2. Procedure from culture treatment to determination treatment From the viewpoint of operability, the evaluation method of one embodiment preferably uses a culture plate having a plurality of wells. In particular, it is preferable to perform the culture treatment (first step) and the action treatment (second step) in the same well. In addition, it is more preferable to perform the measurement process (third step) in the same well as the culture process and the action process. Therefore, in one embodiment, for example, when a plurality of wells 21 of the culture plate 1 shown in FIG. 1 are used and each step from the culture process to the measurement process is performed in one well 21 of the plurality of wells 21. Will be explained. In other words, in the process from culture to measurement in one well, cells are not moved to another well 21 during the process. The number of wells 21 in the culture plate 1 is selected according to the type of chemical substance to be examined.
＊ 培養処理
培養処理では、上述した培養容器１０によって形成される培養空間１１を用いて、ウェルプレート内で細胞を培養してスフェロイドを複数形成させる。言い換えると、ウェルプレート内で細胞を三次元的に培養し、所望の大きさの複数のスフェロイドを形成する。
一実施形態の評価方法では、培養する細胞として、エストロゲンレセプターを有するヒトがん細胞由来の株化細胞および初代細胞を用いる。株化細胞の例として、乳がん由来のＭＣＦ−７細胞やＴ−４７Ｄ細胞、子宮がん由来のＲＬ−９５−２細胞、腺管がん由来のＺＲ−７５−１細胞などを用いることができる。エストロゲンレセプターの発現有無はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）などの細胞資源バンクが提供する細胞のデータシートによって確認することができる。
* Culture process In the culture process, a plurality of spheroids are formed by culturing cells in a well plate using the culture space 11 formed by the culture vessel 10 described above. In other words, the cells are three-dimensionally cultured in the well plate to form a plurality of spheroids having a desired size.
In the evaluation method of one embodiment, cell lines derived from human cancer cells having estrogen receptor and primary cells are used as cells to be cultured. Examples of cell lines include breast cancer-derived MCF-7 cells and T-47D cells, uterine cancer-derived RL-95-2 cells, ductal cancer-derived ZR-75-1 cells, and the like. . The presence or absence of estrogen receptor expression can be confirmed by a cell data sheet provided by a cell resource bank such as ATCC (American Type Culture Collection).
細胞を維持するための培養液には、ｐＨ６．８から８．４の間に緩衝作用のある培地または緩衝液を用いる。さらにグルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものが好ましい。またＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）などの血清を含んでいても良い。例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ（Minimum essential medium）、Ｌ−１５（L-15 medium modified）、及びＤＭＥＭ（Dulbecco Modify Eagle Medium）などを用いることができる。
細胞を培養する際は、温度３７℃、気相の二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％に維持することが好ましい。
上述した細胞容器を用いることにより、細胞が本来有する接着性を利用して、スフェロイドと呼ばれる凝集塊を形成させる。スフェロイドを形成させることによって、ＵＧＴ活性を向上させることができる。
検査する化学物質を細胞に作用させる際には、スフェロイドの相当直径が５０μｍ以上２００μｍ未満、より好ましくは６０μｍ以上１５０μｍ以下であるものを用いる。このような直径が好ましい理由は、上述の培養容器で説明した通りである。
培養容器１０を形成する凹凸パターン（凹凸構造）により形成される複数の培養空間１１の相当直径を、複数の培養空間の深さで割った値が１以上２未満であることが好ましい。
加えて、培養容器１０を形成する凹凸パターンにより形成される複数の培養空間１１の深さが１〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。さらに加えて、一つの培養空間の一端から、一つの培養空間に隣接する培養空間の一端までである、凹凸パターンの凸形状及び凹形状の組合せのピッチが１〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。
As a culture solution for maintaining cells, a medium or buffer solution having a buffering action between pH 6.8 and 8.4 is used. Furthermore, those containing nutrients such as glucose, amino acids and vitamins are preferred. In addition, serum such as FBS (Fetal Bovine Serum) may be included. For example, RPMI 1640, MEM (Minimum essential medium), L-15 (L-15 medium modified), DMEM (Dulbecco Modify Eagle Medium), etc. can be used.
When culturing cells, it is preferable to maintain a temperature of 37 ° C. and a gas phase carbon dioxide concentration of 5 vol%.
By using the above-described cell container, an agglomerate called spheroid is formed using the inherent adhesiveness of the cell. UGT activity can be improved by forming spheroids.
When a chemical substance to be tested is allowed to act on cells, a spheroid having an equivalent diameter of 50 μm or more and less than 200 μm, more preferably 60 μm or more and 150 μm or less is used. The reason why such a diameter is preferable is as described in the above culture vessel.
The value obtained by dividing the equivalent diameter of the plurality of culture spaces 11 formed by the concave / convex pattern (concave / convex structure) forming the culture vessel 10 by the depth of the plurality of culture spaces is preferably 1 or more and less than 2.
In addition, it is preferable that the depth of the plurality of culture spaces 11 formed by the concavo-convex pattern forming the culture vessel 10 is in the range of 1 to 1000 μm. In addition, it is preferable that the pitch of the combination of the convex and concave shapes of the concave-convex pattern from one end of one culture space to one end of the culture space adjacent to one culture space is in the range of 1 to 1000 μm. .
スフェロイド形状の株化肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、スフェロイド形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器１０が形成されたウェル２１を用いることにより、同一の容器でスフェロイド形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成したスフェロイドを移動させることなく、細胞に第１乃至第３溶液を作用させることが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。 The method for obtaining the spheroid-shaped established hepatocytes is not particularly limited, such as roller bottle culture, spinner flask culture, and hanging drop culture. However, since these methods use an apparatus according to the culture method, it is necessary to perform the spheroid formation treatment and the contact treatment in separate containers. The inventors discovered that the spheroid formation treatment and the contact treatment can be performed in the same container by using the well 21 in which the culture container 10 described above is formed. Thereby, operation becomes simple and it becomes possible to make a 1st thru | or 3rd solution act on a cell, without moving the formed spheroid. In particular, it can be used in an automatic culture apparatus in screening of pharmaceuticals that evaluate many compounds at once. In addition, cell damage and contamination can be prevented.
スフェロイドを形成するための培養容器１０の好ましいサイズについては上述したが、スフェロイド形成処理から接触処理を実施する場合には、特に次の培養容器１０のサイズが好ましいことを発見した。
培養容器１０は、高さＨを相当直径Ｄで割った値が０．５〜２の範囲であって、相当直径Ｄが１００μｍ〜１０００μｍの範囲の培養空間１１が、少なくとも２個以上配置されていることが好ましい。加えて、培養空間１１を隔てる壁１２の幅Ｗは２μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。このような培養容器１０を用いることで、簡単にかつ均一な直径のスフェロイドを得ることができる。
Although the preferable size of the culture vessel 10 for forming spheroids has been described above, it has been found that the size of the next culture vessel 10 is particularly preferable when the contact treatment is performed from the spheroid formation treatment.
The culture vessel 10 has a value obtained by dividing the height H by the equivalent diameter D in the range of 0.5 to 2, and at least two culture spaces 11 in which the equivalent diameter D is in the range of 100 μm to 1000 μm are arranged. Preferably it is. In addition, the width W of the wall 12 separating the culture space 11 is preferably in the range of 2 μm to 50 μm. By using such a culture vessel 10, a spheroid having a uniform diameter can be obtained easily.
培養容器１０を用いてスフェロイド形成を行う場合の細胞播種密度は特に限定されないが、５０００個／ｃｍ２〜１，０００，０００個／ｃｍ２の範囲が好ましく、５０〜１５０μｍの直径のスフェロイドを形成させるためには、５０個〜２５０個の細胞が１１の区画に存在していることが好ましいことから、１００，０００個／ｃｍ２〜５００，０００個／ｃｍ２の範囲がより好ましい。スフェロイドを形成させるための培養時間は１日〜１５日であればよい。 The cell seeding density when spheroid formation is performed using the culture vessel 10 is not particularly limited, but is preferably in the range of 5000 cells / cm 2 to 1,000,000 cells / cm 2 and forms spheroids with a diameter of 50 to 150 μm. In order to achieve this, it is preferable that 50 to 250 cells exist in 11 compartments, and therefore the range of 100,000 / cm 2 to 500,000 / cm 2 is more preferable. The culture time for forming spheroids may be 1 to 15 days.
＊ 作用処理
作用処理では、培養したスフェロイドに評価したい化学物質を作用させる。
スフェロイドは、評価したい化学物質を作用させる前の、少なくとも２４時間以上、より好ましくは２４時間以上１２０時間未満、培地または緩衝液で培養されたものを用いる。
評価したい化学物質に加え、当該化学物質を評価するために必要となる他の化学物質をスフェロイドに作用させる。例えば、検査する化学物質を含む第１溶液、エストロゲン活性を有することが知られている化学物質を含む第２溶液、及び、エストロゲン活性を持たないことが知られている化学物質を含む第３溶液を用いる。第３溶液は、例えば、化学物質を含まず、ＤＭＳＯ（Dimethyl Sulfoxide）などの溶媒のみを含む溶液を用意する。
* Action treatment In the action treatment, the chemical substance to be evaluated is allowed to act on the cultured spheroids.
As the spheroids, those cultured in a medium or a buffer solution for at least 24 hours or more, more preferably 24 hours or more and less than 120 hours, before using the chemical substance to be evaluated are used.
In addition to the chemical substance to be evaluated, other chemical substances necessary for evaluating the chemical substance are allowed to act on the spheroid. For example, a first solution containing a chemical substance to be tested, a second solution containing a chemical substance known to have estrogenic activity, and a third solution containing a chemical substance known to have no estrogenic activity Is used. As the third solution, for example, a solution containing no chemical substance and containing only a solvent such as DMSO (Dimethyl Sulfoxide) is prepared.
効率や信頼性の観点から、一度に第１乃至第３溶液に含まれる化学物質を、２以上のサンプリング数で検査することが好ましい。このために細胞はあらかじめウェルプレート上で培養されていることが好ましい。また検査する化学物質を含む溶液を細胞に対して作用させる処理も、同一のウェルプレートで行なうことが好ましい。
第２溶液として、異なるエストロゲン活性を有する２つ以上の化学物質溶液を用意することが好ましい。これにより、第１溶液のエストロゲン類似活性をより詳細に評価することができる。例えば、３種類の第２溶液Ａ〜Ｃを用いる場合には、第２溶液Ａとしてエストラジオール、第２溶液Ｂとしてエストロン、第２溶液Ｃとしてエストリオールを含む溶液を用意する。この場合、それぞれの化学物質のエストロゲン活性は相対的に第２溶液Ａが１００、第２溶液Ｂが５０、第２溶液Ｃが１０であり、第３溶液がゼロと表現することができる。これらの溶液をスフェロイドに作用させたときのＵＧＴ活性と、第１溶液を作用させたときのＵＧＴ活性を比較する。これにより、第１溶液に含まれる評価する化学物質がゼロから１００の間でどの程度のエストロゲン活性を有するのかを評価することができる。
なお、化学物質のエストロゲン活性値は独立行政法人国立環境研究所から「化学物質のエストロゲン活性データ」（http://www.nies.go.jp/archiv-edc/estrogen/index.html）として公開されている。
From the viewpoint of efficiency and reliability, it is preferable to inspect the chemical substances contained in the first to third solutions at a time with a sampling number of 2 or more. For this purpose, the cells are preferably cultured in advance on a well plate. Moreover, it is preferable to perform the process which makes the solution containing the chemical substance to be tested act on the cells in the same well plate.
It is preferable to prepare two or more chemical substance solutions having different estrogenic activities as the second solution. Thereby, the estrogen-like activity of the first solution can be evaluated in more detail. For example, when three types of second solutions A to C are used, a solution containing estradiol as the second solution A, estrone as the second solution B, and estriol as the second solution C is prepared. In this case, the estrogenic activity of each chemical substance can be expressed as 100 for the second solution A, 50 for the second solution B, 10 for the second solution C, and zero for the third solution. The UGT activity when these solutions are allowed to act on spheroids is compared with the UGT activity when the first solution is allowed to act. Thereby, it is possible to evaluate how much estrogen activity the chemical substance to be evaluated contained in the first solution has between zero and 100.
In addition, the estrogen activity value of chemical substances is published as “Estrogen activity data of chemical substances” (http://www.nies.go.jp/archiv-edc/estrogen/index.html) from the National Institute for Environmental Studies. Has been.
第１乃至第３溶液に含まれる化学物質は、まずＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶かし、これを浸透圧２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ以上３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ未満、ｐＨが６．８から８．４の間に緩衝作用をもつバッファー液に希釈する。このとき最終的な有機溶媒の濃度は体積分率０．１ｖｏｌ％以下となるように調製する。また希釈に用いるバッファー液は、細胞培養に用いた培地または緩衝液を用いても良い。
スフェロイドを形成した細胞に対して、第１乃至第３溶液のいずれかを、１時間以上７２時間以下、より好ましくは１時間以上２４時間以下、作用させる。スフェロイドを形成した細胞へ第１乃至第３溶液のいずれかを作用させる時間を「化学物質作用時間」と称する。化学物質作用時間は、化学物質の活性が上昇するまでに要する時間を考慮すると、１時間以上であることが好ましい。加えて、化学物質作用時間が長時間になると、細胞が死に至ることが懸念されるため、２４時間以下であることが好ましい。
The chemical substances contained in the first to third solutions are first dissolved in an organic solvent such as DMSO, and this is osmotic pressure of 200 mOsm / kg · H 2 O or more and less than 315 mOsm / kg · H 2 O, and the pH is 6.8-8. 4. Dilute into buffer solution with buffering action between 4. At this time, it prepares so that the density | concentration of the final organic solvent may be 0.1 vol% or less of volume fraction. As the buffer solution used for dilution, the medium or buffer solution used for cell culture may be used.
Any of the first to third solutions is allowed to act on the spheroid-formed cells for 1 hour to 72 hours, more preferably 1 hour to 24 hours. The time for which any one of the first to third solutions is allowed to act on the spheroid-formed cells is referred to as “chemical substance action time”. The chemical substance action time is preferably 1 hour or longer considering the time required for the activity of the chemical substance to increase. In addition, if the chemical substance action time is long, there is a concern that the cell will die, and therefore it is preferably 24 hours or less.
＊ 測定処理
測定処理では、上述した化学物質作用時間終了後、スフェロイドを形成した細胞に作用させた第１乃至第３溶液を取り除き、スフェロイドを形成した細胞をバッファー液で洗浄する。その後、速やかにＵＧＴ代謝基質およびＵＤＰグルクロン酸を含むＵＧＴ活性測定溶液を少なくとも１時間、より好ましくは１時間以上２時間以下、各細胞に作用させる。スフェロイドを形成した細胞へＵＧＴ活性測定溶液を作用させる時間を「測定溶液作用時間」と称する。測定溶液作用時間は、ＵＧＴ活性測定溶液が細胞に作用するまでにかかる時間と、ＵＧＴ活性測定溶液が細胞に悪影響を及ぼす時間とを考慮して決定する。
ＵＧＴ代謝基質は、ＵＧＴによってグルクロン酸抱合を受ける物質であり、抱合体が発光を示すもの、あるいは抱合体の吸収波長または励起／蛍光波長があらかじめ知られているものを用いる。例えば4-Methylumbelliferone、p-Nitrophenol、7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）、Estradiolなどを用いることができる。
* Measurement process In the measurement process, after the chemical substance action time ends, the first to third solutions applied to the spheroid-formed cells are removed, and the spheroid-formed cells are washed with a buffer solution. Thereafter, a UGT activity measurement solution containing a UGT metabolic substrate and UDP glucuronic acid is immediately allowed to act on each cell for at least 1 hour, more preferably from 1 hour to 2 hours. The time during which the UGT activity measurement solution is allowed to act on the spheroid-formed cells is referred to as “measurement solution action time”. The measurement solution action time is determined in consideration of the time taken for the UGT activity measurement solution to act on the cells and the time that the UGT activity measurement solution adversely affects the cells.
The UGT metabolic substrate is a substance that undergoes glucuronidation by UGT, and a substance in which the conjugate emits light, or a substance in which the absorption wavelength or excitation / fluorescence wavelength of the conjugate is known in advance is used. For example, 4-Methylumbelliferone, p-Nitrophenol, 7-hydroxy-4- (trifluoromethyl) coumarin (7-HFC), Estradiol, etc. can be used.
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いる場合は、測定溶液作用時間内にＵＧＴの代謝反応を停止させた後、速やかに溶液を回収し、遠心分離とフィルター濾過によって精製する。その後、ＨＰＬＣによってグルクロン酸抱合体の産生量を測定する。代謝反応を停止するためには、用いたＵＧＴ代謝基質に適したものを選択すればよく、例えば7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）を用いた場合、アセトニトリル／酢酸（９４ｖｏｌ％／６ｖｏｌ％）溶液を用いる。
マイクロプレートリーダーを用いる場合は、測定溶液作用時間内にＵＧＴの代謝反応を停止させた後、ＵＧＴ活性測定溶液に含まれるＵＧＴ代謝基質のグルクロン酸抱合体由来の発光または吸光または蛍光を測定する。この際、同一のマイクロプレート内に測定対象であるグルクロン酸抱合体の希釈系列を設けることで、得られた発光強度または吸光度または蛍光強度からグルクロン酸抱合体の産生量を算出することができる。
When using HPLC (High Performance Liquid Chromatography), after stopping the metabolic reaction of UGT within the measurement solution action time, the solution is quickly recovered and purified by centrifugation and filter filtration. Thereafter, the production amount of the glucuronic acid conjugate is measured by HPLC. In order to stop the metabolic reaction, a substance suitable for the UGT metabolic substrate used may be selected. For example, when 7-hydroxy-4- (trifluoromethyl) coumarin (7-HFC) is used, acetonitrile / acetic acid (94 vol) % / 6 vol%) solution.
When a microplate reader is used, the metabolic reaction of UGT is stopped within the measurement solution action time, and then luminescence, absorbance or fluorescence derived from the glucuronide conjugate of the UGT metabolic substrate contained in the UGT activity measurement solution is measured. At this time, by providing a dilution series of the glucuronic acid conjugate to be measured in the same microplate, the production amount of the glucuronic acid conjugate can be calculated from the obtained emission intensity, absorbance or fluorescence intensity.
マイクロプレートリーダーを用いて発光を測定する場合は、側面および底面が白色不透明なプレートを用いて細胞を培養することが望ましい。あるいは側面が白色不透明で底面が透明なプレートを用いて細胞を培養し、ＵＧＴ活性を測定する際に底面に白色シールを貼り付けてもよい。またはＵＧＴ活性測定溶液を回収し、速やかに側面および底面が白色不透明なプレートに移し変えて発光を測定してもよい。
マイクロプレートリーダーを用いて吸光を測定する場合は、底面が透明なプレートを用いて細胞を培養しなければならない。あるいは細胞の培養からＵＧＴ活性測定を作用させる処理までを底面が不透明なプレートで実施し、ＵＧＴ活性測定溶液を回収して速やかに底面が透明なプレートに移し変えて吸光度を測定してもよい。
マイクロプレートリーダーを用いて蛍光を測定する場合は、側面が黒色不透明で底面が透明なプレートを用いて細胞を培養することが望ましい。あるいは細胞の培養からＵＧＴ活性測定を作用させる処理までを底面が不透明なプレートで実施し、ＵＧＴ活性測定溶液を回収して速やかに底面が透明かつ側面が黒色不透明なプレートに移し変えて蛍光強度を測定してもよい。
When measuring luminescence using a microplate reader, it is desirable to culture cells using a plate with white and opaque white and bottom surfaces. Alternatively, cells may be cultured using a plate with a white opaque surface and a transparent bottom surface, and a white seal may be attached to the bottom surface when measuring UGT activity. Alternatively, the UGT activity measurement solution may be collected, and immediately transferred to a plate having a white and opaque side and bottom to measure luminescence.
When measuring absorbance using a microplate reader, cells must be cultured using a plate with a transparent bottom. Alternatively, the process from cell culture to treatment for measuring UGT activity may be carried out on a plate with an opaque bottom surface, and the UGT activity measurement solution may be collected and quickly transferred to a plate with a transparent bottom surface to measure the absorbance.
When measuring fluorescence using a microplate reader, it is desirable to culture cells using a plate with a black opaque side and a transparent bottom. Alternatively, the process from cell culture to UGT activity measurement is performed on a plate with an opaque bottom surface, and the UGT activity measurement solution is collected and quickly transferred to a plate with a transparent bottom surface and a black opaque side surface to increase the fluorescence intensity. You may measure.
＊判定処理
判定処理では、具体的には次のように判定する。ＵＧＴ活性は、言い換えると、グルクロン酸抱合体産生量である。
（１）第１溶液を作用させたスフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性が、第２溶液を作用させたスフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性と同等あるいはそれ以上に高い場合、第１溶液に含まれる化学物質は第２溶液に含まれる化学物質と等しいあるいはそれ以上のエストロゲン類似活性を有すると判定する。例えば、第２溶液のエストロゲン活性値を［Ｂ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ］として、第１溶液に含まれる化学物質のエストロゲン類似活性は［Ｂ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ］以上と評価される。
（２）第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、第３溶液の活性よりも高く、第２溶液の活性よりも低い場合、第１溶液に含まれる化学物質はゼロから第２溶液の活性値の間のエストロゲン類似活性を有すると判定する。第１溶液に含まれる化学物質のエストロゲン類似活性はゼロから［Ｂ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ］の間であると評価される。
（３）第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、第３溶液の活性と同等あるいはそれよりも低い場合、第１溶液に含まれる化学物質はエストロゲン類似活性をもたないと判定する。
* Judgment process In the judgment process, specifically, the following judgment is made. In other words, the UGT activity is the production amount of glucuronide conjugate.
(1) A chemical substance contained in the first solution when the UGT activity of the spheroid-shaped cells treated with the first solution is equal to or higher than the UGT activity of the spheroid-shaped cells treated with the second solution Is determined to have an estrogen-like activity equal to or greater than the chemical substance contained in the second solution. For example, assuming that the estrogen activity value of the second solution is [B-Activity], the estrogen-like activity of the chemical substance contained in the first solution is evaluated to be [B-Activity] or more.
(2) When the UGT activity of the cell on which the first solution is applied is higher than the activity of the third solution and lower than the activity of the second solution, the chemical substance contained in the first solution is from zero to the second solution Determine estrogen-like activity between activity values. It is estimated that the estrogen-like activity of the chemical substance contained in the first solution is between zero and [B-Activity].
(3) When the UGT activity of the cell on which the first solution is applied is equal to or lower than the activity of the third solution, it is determined that the chemical substance contained in the first solution has no estrogen-like activity.
実施例及び比較例について説明する。一実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。
マイクロ空間が形成された３次元（３Ｄ）の培養プレートを用いる場合（実施例１）と、培養領域（培養底面）が平坦な２次元（２Ｄ）の平板プレートを用いる場合（比較例１）とにおいて、グルクロン酸抱合酵素活性の測定をおこなった。さらに実施例１と比較例１で培養した細胞に対してエストロゲンを作用させ、ＵＧＴ活性上昇の濃度依存性を検証した（実施例２）。
Examples and comparative examples will be described. One embodiment is not limited to these examples.
When using a three-dimensional (3D) culture plate in which a micro space is formed (Example 1), when using a two-dimensional (2D) flat plate with a flat culture region (culture bottom surface) (Comparative Example 1) The glucuronidase activity was measured. Further, estrogen was allowed to act on the cells cultured in Example 1 and Comparative Example 1 to verify the concentration dependence of UGT activity increase (Example 2).
［実施例１］
１．試験条件
（Ｓｔｅｐ１−１）細胞の準備（培養処理）
培養する細胞はヒト乳がん由来細胞ＭＣＦ−７を使用した。
培養容器は、図８に示す２４個のウェル２１ａを有する培養プレート（２４ウェル培養プレート）１ａ（３Ｄ）を使用した。各ウェル２１ａの底部培養面には、凹凸パターン（微細パターン）によって培養容器１０ａが形成されている。各培養容器１０ａは、相当直径Ｄが２００μｍ、高さＨが１００μｍで形成される培養空間１１ａを有する。また、壁１２ａの幅Ｗは１０μｍである。
細胞間接着を促進し立体的な組織構造を作製するために、底部培養面を０．０５ｖｏｌ％ＭＰＣポリマーでコートした。
培地はグルコース濃度０．３５ｖｏｌ％のＲＰＭＩ培地を用いた。細胞播種密度が１×１０５個／ｃｍ２となるように、各ウェルに細胞懸濁液を導入し、３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２環境下で３日間培養した。
[Example 1]
1. Test conditions (Step 1-1) Preparation of cells (culture treatment)
As a cell to be cultured, human breast cancer-derived cell MCF-7 was used.
As a culture vessel, a culture plate (24 well culture plate) 1a (3D) having 24 wells 21a shown in FIG. 8 was used. A culture vessel 10a is formed on the bottom culture surface of each well 21a by a concave / convex pattern (fine pattern). Each culture vessel 10a has a culture space 11a formed with an equivalent diameter D of 200 μm and a height H of 100 μm. The width W of the wall 12a is 10 μm.
In order to promote cell-cell adhesion and create a three-dimensional tissue structure, the bottom culture surface was coated with 0.05 vol% MPC polymer.
As the medium, RPMI medium having a glucose concentration of 0.35 vol% was used. The cell suspension was introduced into each well so that the cell seeding density was 1 × 10 5 cells / cm 2, and cultured for 3 days in an environment of 37 ° C. and 5 vol% CO 2 .
実施例１の比較対象として、培養プレートを変更した比較例１を実施した。
比較例１の培養容器は市販の細胞培養グレード品であって、培養面が平坦な平板プレート（２Ｄ）を使用した。平板プレートを用いる以外は実施例１と同じ条件で実施した。
As a comparison target of Example 1, Comparative Example 1 in which the culture plate was changed was performed.
The culture container of Comparative Example 1 was a commercially available cell culture grade product, and a flat plate (2D) having a flat culture surface was used. It implemented on the same conditions as Example 1 except using a flat plate.
（Ｓｔｅｐ１−２）（測定処理：ＵＧＴ活性測定溶液の作用）
実施例、比較例ともに次の条件で試験を実施した。
細胞を培養後、培地（上澄み）を取り除いた後、7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）を１０μｍｏｌ／Ｌ含む培地を添加した。さらに２０ｍｍｏｌ／ＬのＵＤＰＧＡ（ウリジン二リン酸グルクロン酸）をそれぞれ添加し３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２環境下で１時間インキュベートした。
(Step 1-2) (Measurement process: action of UGT activity measurement solution)
Both the examples and comparative examples were tested under the following conditions.
After culturing the cells, the medium (supernatant) was removed, and a medium containing 10 μmol / L of 7-hydroxy-4- (trifluoromethyl) coumarin (7-HFC) was added. Further, 20 mmol / L UDPGA (uridine diphosphate glucuronic acid) was added thereto and incubated at 37 ° C. in a 5 vol% CO 2 environment for 1 hour.
（Ｓｔｅｐ１−３）（測定処理：活性測定）
ウェル内の培地をマイクロピペットで回収し、０．４５μｍ孔径のメンブレンフィルターによって精製した。精製したものをＨＰＬＣ装置に導入した。カラムはInertsil ODS-SP（5μm 4.6mm i.d. × 150 mm）を使用し、移動相は２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．５）／アセトニトリル／メタノール（６８：２６：６，ｖ／ｖ／ｖ）とした。波長３２８ｎｍにて励起を行い、波長４１０ｎｍの蛍光を検出した。
(Step 1-3) (Measurement processing: activity measurement)
The medium in the well was collected with a micropipette and purified with a membrane filter having a pore diameter of 0.45 μm. The purified product was introduced into the HPLC apparatus. The column used was Inertsil ODS-SP (5 μm 4.6 mm id × 150 mm), and the mobile phase was 20 mmol / L KH 2 PO 4 (pH 3.5) / acetonitrile / methanol (68: 26: 6, v / v / v). ). Excitation was performed at a wavelength of 328 nm, and fluorescence at a wavelength of 410 nm was detected.
２．試験結果
図９に培養後の細胞の形態写真を、図１０に活性測定結果を示した。
図１０の活性測定結果から立体的に細胞を培養（３Ｄ）することで、グルクロン酸抱合酵素活性が飛躍的に向上することが明らかになった。
2. Test Results FIG. 9 shows a morphological photograph of the cells after culture, and FIG. 10 shows the activity measurement results.
From the activity measurement results in FIG. 10, it was revealed that glucuronidase activity was dramatically improved by sterically culturing (3D) cells.
［実施例２］
１．試験条件
（Ｓｔｅｐ２−１）細胞の準備（培養処理）
実施例１のＳｔｅｐ１−１と同様の操作方法で培養細胞を準備した。比較対象も同様に市販の平板プレート（２Ｄ）を用いた。
（Ｓｔｅｐ２−２）作用処理
化学物質添加群はエストロゲン活性を有する化学物質１７β−エストラジオール）を２５０、５００、１０００ｎｍｏｌ／Ｌ含む培地に、非添加群は１７β‐エストラジオールの溶媒であるＤＭＳＯを含む培地に交換して、３７度４時間インキュベートした。
（Ｓｔｅｐ２−３）（測定処理：ＵＳＴ活性測定溶液の作用）
上澄みを取り除いた後、7-hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin（7-HFC）を１０μｍｏｌ／Ｌ含む培地を添加し、さらに２０ｍｍｏｌ／ＬのＵＤＰＧＡ（ウリジン二リン酸グルクロン酸）をそれぞれ添加し３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２環境下で１時間インキュベートした。
（Ｓｔｅｐ２−４）（測定処理：活性測定）
実施例１のＳｔｅｐ１−３と同様の方法で分析を行った。
[Example 2]
1. Test conditions (Step 2-1) Preparation of cells (culture treatment)
Cultured cells were prepared by the same operation method as in Step 1-1 of Example 1. Similarly, a commercially available flat plate (2D) was used as a comparison target.
(Step 2-2) Action treatment The chemical addition group is a medium containing 250, 500, 1000 nmol / L of the chemical substance 17β-estradiol having estrogenic activity), and the non-addition group is a medium containing DMSO which is a solvent for 17β-estradiol. Changed and incubated at 37 degrees for 4 hours.
(Step 2-3) (Measurement processing: action of UST activity measurement solution)
After removing the supernatant, a medium containing 10 μmol / L of 7-hydroxy-4- (trifluoromethyl) coumarin (7-HFC) was added, and further 20 mmol / L UDPGA (uridine diphosphate glucuronic acid) was added. Incubation was performed at 5 ° C. in a 5 vol% CO 2 environment for 1 hour.
(Step 2-4) (Measurement process: activity measurement)
Analysis was performed in the same manner as in Step 1-3 of Example 1.
２．試験結果
平板プレートで培養した細胞にＤＭＳＯを含む培地を作用させたときのＵＧＴ活性値を１として、立体培養した細胞と平板培養した細胞に各濃度の１７β‐エストラジオールを作用させたときのＵＧＴ活性値を図１１に示した。図１１の測定結果から立体的に細胞を培養することで１７β‐エストラジオールの濃度依存的にＵＧＴ活性値が上昇することが明らかになった。一方、比較対象の平板プレートの活性値は１７β‐エストラジオールの濃度依存的なＵＧＴ活性の上昇傾向が小さく、差が明らかではなかった。
2. Test Results UGT activity value when a medium containing DMSO was allowed to act on cells cultured on a flat plate, and UGT activity when each concentration of 17β-estradiol was allowed to act on three-dimensionally cultured cells and plated cells The values are shown in FIG. From the measurement results of FIG. 11, it was revealed that the UGT activity value increased depending on the concentration of 17β-estradiol by culturing the cells three-dimensionally. On the other hand, the activity value of the comparison flat plate had a small tendency to increase the UGT activity depending on the concentration of 17β-estradiol, and the difference was not clear.
なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。 In addition, this invention is not limited to embodiment shown above. Within the scope of the present invention, it is possible to change, add, or convert each element of the above-described embodiment to a content that can be easily considered by those skilled in the art.
１、１ａ 培養プレート
８ 細胞
９ スフェロイド
１０、１０ａ 培養容器
１１、１１ａ 培養空間
１２ 壁
１３ 底部
１４ 底部培養面
２１、２１ａ ウェル
２２ 仕切り部
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1, 1a Culture plate 8 Cell 9 Spheroid 10, 10a Culture container 11, 11a Culture space 12 Wall 13 Bottom 14 Bottom culture surface 21, 21a Well 22 Partition
Claims (15)
培養容器に形成される複数の培養空間内で、細胞を培養してスフェロイド形状の細胞を複数形成させる第１工程と、
前記スフェロイド形状の細胞それぞれに対して、検査する化学物質を含む第１溶液、エストロゲン活性を有することが知られている化学物質を含む第２溶液、及び、前記第１溶液から前記検査する化学物質を除いた第３溶液のうちのいずれかを作用させる第２工程と、
前記第１乃至第３溶液のうちのいずれかを作用させた各スフェロイド形状の細胞に対して、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性測定溶液を作用させて、各スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性を測定する第３工程と、
前記第１溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性が、前記第２溶液を作用させた前記スフェロイド形状の細胞のＵＧＴ活性と同等あるいはそれ以上に高い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質は前記第２溶液に含まれる化学物質と等しいあるいはそれ以上のエストロゲン類似活性を有すると判定し、前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性よりも高く、前記第２溶液の活性よりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はゼロから前記第２溶液の活性値の間のエストロゲン類似活性を有すると判定し、前記第１溶液を作用させた細胞のＵＧＴ活性が、前記第３溶液の活性と同等あるいはそれよりも低い場合、前記第１溶液に含まれる化学物質はエストロゲン類似活性をもたないと判定する第４工程と、
を含むことを特徴とし、
前記培養する細胞がエストロゲン受容体を有することを特徴とする評価方法。 An evaluation method for evaluating whether a test substance has estrogenic activity on cells,
A first step of culturing cells to form a plurality of spheroid-shaped cells in a plurality of culture spaces formed in a culture vessel;
A first solution containing a chemical substance to be examined for each of the spheroid-shaped cells, a second solution containing a chemical substance known to have estrogen activity, and a chemical substance to be examined from the first solution A second step of acting any one of the third solutions excluding
The UGT activity of each spheroid-shaped cell is measured by applying a UDP-glucuronyltransferase activity measurement solution to each spheroid-shaped cell on which any one of the first to third solutions is applied. A third step;
If the UGT activity of the spheroid-shaped cells treated with the first solution is equal to or higher than the UGT activity of the spheroid-shaped cells treated with the second solution, it is included in the first solution It is determined that the chemical substance has an estrogen-like activity equal to or higher than the chemical substance contained in the second solution, and the UGT activity of the cell on which the first solution is applied is higher than the activity of the third solution. When the activity of the second solution is lower than that of the second solution, the chemical substance contained in the first solution is determined to have an estrogen-like activity between zero and the activity value of the second solution, and the first solution is allowed to act. If the UGT activity of the obtained cells is equal to or lower than the activity of the third solution, it is determined that the chemical substance contained in the first solution does not have an estrogen-like activity. A fourth step,
Including ,
The evaluation method, wherein the cultured cells have an estrogen receptor .
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