JP6130191B2 - Inhibitor of D-amino acid oxidase - Google Patents
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本発明は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）に対する阻害剤、および精神神経疾患、より詳しくは、Ｄ−セリン量の減少に起因する精神神経疾患、またはＮ−メチルーＤ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体）を介する神経伝達の異常に起因する精神神経疾患、特に統合失調症または双極性障害の改善薬として有用なＤ−アミノ酸オキシダーゼ阻害剤に関する。 The present invention relates to an inhibitor for D-amino acid oxidase (DAO), and a neuropsychiatric disorder, more specifically, a neuropsychiatric disorder caused by a decrease in the amount of D-serine, or an N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA type). The present invention relates to a D-amino acid oxidase inhibitor useful as a remedy for neuropsychiatric disorders caused by abnormal neurotransmission via glutamate receptors), particularly schizophrenia or bipolar disorder.
従来、Ｄ−アミノ酸は動物には存在しないか存在しても極微量と考えられていたが、近年、Ｄ−アミノ酸は哨乳動物を含む高等動物において重要な生理機能を担っていることが見出されている。 Traditionally, D-amino acids were thought to be absent or present in animals in trace amounts, but recently D-amino acids have been found to play important physiological functions in higher animals including mammals. Has been issued.
なかでもD-セリンは、神経細胞においてL-グルタミン酸受容体の一種であるN-メチル-D- アスパラギン酸受容体（NMDA型L-グルタミン酸受容体、NMDA受容体) のグリシン結合部位に結合し、この受容体のL-グルタミン酸作動性の神経伝達を増強することが報告されている。従って、D-セリンはNMDA受容体にコアゴニストとして結合し、L-グルタミン酸のNMDA受容体への結合を介した興奮を調節する神経調節因子であると考えられている。 Among them, D-serine binds to the glycine binding site of N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA type L-glutamate receptor, NMDA receptor), which is a kind of L-glutamate receptor in nerve cells, This receptor has been reported to enhance L-glutamate-mediated neurotransmission. Thus, D-serine is thought to be a neuromodulator that binds to the NMDA receptor as a co-agonist and regulates excitation through the binding of L-glutamate to the NMDA receptor.
生体内においてD-アミノ酸を立体特異的に分解する酸化酵素としては、D-アミノ酸オキシダーゼ（DAO ）が知られている。この酵素は、D-セリンやＤ−アラニンなどの中性および塩基性のD-アミノ酸を分解する酵素であり、以下の反応式に示すように酸素を電子受容体としたD-アミノ酸の酸化的脱アミノ化反応を触媒する。この反応により、基質であるD-アミノ酸に対応する2-オキソ酸、過酸化水素およびアンモニアが生成する。
D-アミノ酸 + O2 + H2O → 2-オキソ酸 + H2O2 + NH3
D-アミノ酸オキシダーゼ活性を欠失している変異体マウスにおいては中枢神経系および血清中におけるD-セリンレベルが野生型マウスと比較して高いことが報告されている（非特許文献１）。すなわち、D-アミノ酸オキシダーゼは、D-セリンを生理的基質として分解し、その体内濃度の調節を担う酵素である。
D-amino acid oxidase (DAO) is known as an oxidase that stereospecifically degrades D-amino acids in vivo. This enzyme decomposes neutral and basic D-amino acids such as D-serine and D-alanine. As shown in the following reaction formula, the oxidative activity of D-amino acid using oxygen as an electron acceptor is shown. Catalyze the deamination reaction. By this reaction, 2-oxoacid, hydrogen peroxide and ammonia corresponding to the substrate D-amino acid are produced.
D-amino acid + O 2 + H 2 O → 2-oxo acid + H 2 O 2 + NH 3
It has been reported that mutant mice lacking D-amino acid oxidase activity have higher levels of D-serine in the central nervous system and serum than wild-type mice (Non-patent Document 1). That is, D-amino acid oxidase is an enzyme that degrades D-serine as a physiological substrate and controls the concentration in the body.
NMDA受容体の機能低下を含む、L-グルタミン酸系神経伝達の異常は、統合失調症や双極性障害などの様々な精神神経疾患の発症に関わっていると考えられており、この受容体を賦活する物質は新規抗精神病薬として期待される。 Abnormalities in L-glutamate neurotransmission, including reduced NMDA receptor function, are thought to be involved in the development of various neuropsychiatric disorders such as schizophrenia and bipolar disorder. This substance is expected as a novel antipsychotic drug.
統合失調症患者を対象とした連鎖解析により、統合失調症の感受性候補因子の１つとしてD-アミノ酸オキシダーゼ（DAO)が同定されている（非特許文献２）。この知見を受け、DAO の機能亢進による脳内D-セリン濃度の減少がNMDA受容体の機能不全を引き起こし、ひいては統合失調症が発症するという説が提唱され、この説を支持する幾つかの研究が報告されている（非特許文献３、４、５、６）。従って、DAO 活性を阻害することにより脳内D-セリン濃度を高めることは、統合失調症の病態を改善する方法の１つになり得ると考えられる。実際、統合失調症改善薬としての利用を念頭に置いたDAO 阻害剤の研究が報告されている（非特許文献７）。
D-amino acid oxidase (DAO) has been identified as one of susceptibility candidate factors for schizophrenia by linkage analysis for schizophrenia patients (Non-patent Document 2). Based on this finding, it has been proposed that a decrease in D-serine concentration in the brain due to DAO hyperactivity causes NMDA receptor dysfunction, which in turn leads to the development of schizophrenia, and several studies support this theory. Has been reported (
このように、DAO の阻害剤は、体内D-セリン濃度を上昇させると考えられるため、統合失調症の改善薬としての有用性が期待できる。このことは、DAO 活性を欠失しているマウスでは、フェンサイクリジン（NMDA受容体遮断薬）により引き起こされる統合失調症様症状の１つである自発的運動量亢進現象が抑制されるとの報告によっても裏付けられる（非特許文献８）。 Thus, since DAO inhibitors are thought to increase D-serine concentration in the body, they can be expected to be useful as remedies for schizophrenia. It is reported that in mice lacking DAO activity, spontaneous hyperactivity is one of the schizophrenia-like symptoms caused by phencyclidine (NMDA receptor blocker). (Non-patent Document 8).
これまでにD-アミノ酸オキシダーゼ阻害剤自体は幾つか知られているが、統合失調症を含む精神神経疾患に対する医薬品としての使用についての検討はほとんど進んでいない。 Some D-amino acid oxidase inhibitors have been known so far, but studies on their use as pharmaceuticals for neuropsychiatric disorders including schizophrenia have hardly progressed.
また、特許文献１には、統合失調症を含む中枢神経系障害の処置のための候補分子を同定する方法が記載され、候補化合物としてD-アミノ酸オキシダーゼおよびD-アスパラギン酸オキシダーゼの各種アンタゴニストを使用することが示唆されているが、具体的にアンタゴニストであるとして記載されているのは、ベンゾアート、アミノエチルシステイン- ケチミン、アミノエチルシステイン（チアリシン）、システアミン、パンテテイン、シスタチオニンおよびS-アデノシルメチオニンのみである。また、これらの化合物が医薬品として使用できることについては確認されていない。
現在使用されている統合失調症の治療薬としては、脳内ドーパミン作動性神経機能の異常亢進に起因する症状を抑制するために、ドーパミン受容体拮抗作用を有する向精神薬が使用されている。例えば、フェノチアジン骨格、チオキサンテン骨格、ブチロフェノン骨格、ベンズアミド骨格を有する化合物、5-HT受容体拮抗作用も有する三環性化合物などがある。しかしながら、これらの化合物は妄想や幻覚といった統合失調症の陽性症状は緩和するが、NMDA受容体の機能低下に起因すると考えられている感情鈍麻や意欲減衰といった陰性症状は改善できない。このため、NMDA受容体を賦活する薬物は統合失調症の陽性症状と陰性症状の両方を改善する新規抗精神病薬として期待される。 As a therapeutic drug for schizophrenia currently used, a psychotropic drug having a dopamine receptor antagonistic action is used in order to suppress symptoms caused by abnormal enhancement of brain dopaminergic nerve function. For example, there are compounds having a phenothiazine skeleton, a thioxanthene skeleton, a butyrophenone skeleton, a benzamide skeleton, a tricyclic compound having a 5-HT receptor antagonistic action, and the like. However, these compounds relieve the positive symptoms of schizophrenia such as delusions and hallucinations, but cannot improve negative symptoms such as blunted feelings and reduced motivation, which are thought to be due to NMDA receptor dysfunction. Therefore, a drug that activates the NMDA receptor is expected as a novel antipsychotic agent that improves both the positive and negative symptoms of schizophrenia.
上記の知見から、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの阻害剤はＮＭＤＡ受容体を介する神経活動の調節薬、特に統合失調症や双極性障害の改善薬としての可能性を有することが期待される。従って、この酵素の阻害剤であって、安全性が高く医薬として利用できる物質を見出すことは新たな抗精神病薬の開発の点で有用である。 From the above findings, inhibitors of D-amino acid oxidase are expected to have potential as modulators of neural activity via NMDA receptors, particularly as ameliorators of schizophrenia and bipolar disorder. Therefore, finding an inhibitor of this enzyme that is highly safe and can be used as a medicine is useful in terms of the development of a new antipsychotic drug.
本発明者らは、上記現状に鑑み、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの阻害剤を同定するための検討を行った。その結果、抗ウイルス薬として知られているアシクロビルがＤ−アミノ酸オキシダ−ゼに阻害作用を示すことを見出し、本発明を完成した。 In view of the above-mentioned present situation, the present inventors have conducted studies for identifying inhibitors of D-amino acid oxidase. As a result, the inventors have found that acyclovir, which is known as an antiviral drug, exhibits an inhibitory action on D-amino acid oxidase, thereby completing the present invention.
即ち、本発明はアシクロビルを有効成分とするＤ−アミノ酸オキシダ−ゼ阻害剤である。また、本発明は、精神神経疾患、より詳しくはＤ−セリン量の減少に起因する精神神経疾患、またはＮ−メチルーＤ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体）を介する神経伝達の異常に起因する精神神経疾患、特に統合失調症および双極性障害の改善薬である、Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ阻害剤に関する。 That is, the present invention is a D-amino acid oxidase inhibitor containing acyclovir as an active ingredient. In addition, the present invention relates to a neuropsychiatric disorder, more specifically a neuropsychiatric disorder caused by a decrease in the amount of D-serine, or an abnormality in neurotransmission via an N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA type glutamate receptor). The present invention relates to a D-amino acid oxidase inhibitor, which is an ameliorating agent for resulting neuropsychiatric disorders, particularly schizophrenia and bipolar disorder.
アシクロビルは、Ｄ−セリンを分解するＤ−アミノ酸オキシダーゼの阻害剤として有効であることが本発明において実証された。また、アシクロビルは現在抗ヘルペスウイルス薬として使用されており、安全性が高く副作用が少ないことが確認されているので、Ｄ−セリンが関与するＮＭＤＡ受容体を介する神経活動の調節薬、特に統合失調症や双極性障害の改善薬としての効果が期待される。 Acyclovir has been demonstrated in the present invention to be effective as an inhibitor of D-amino acid oxidase that degrades D-serine. Acyclovir is currently used as an anti-herpes virus drug, and since it has been confirmed that it is safe and has few side effects, it is a regulator of neuronal activity via NMDA receptor involving D-serine, particularly schizophrenia. It is expected to be effective as a remedy for symptom and bipolar disorder
本発明で用いるアシクロビルは、下記の化学構造を有する、化学名９−〔（２−ヒドロキシエトキシ）メチル〕グアニン（化学式：Ｃ8 Ｈ11Ｎ5 Ｏ3 、分子量：225.2)の化合物であり、白色〜微黄白色の結晶性の粉末として得られ、水に難溶で、酸性またはアルカリ性水溶液に溶ける。現在、アシクロビルは抗ヘルペスウイルス薬として使用されており、その作用機作は、ヘルペスウイルス感染細胞内で、ヘルペスウイルスに特異的なチミジンキナーゼによりリン酸化されて活性体となり、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼを阻害してヘルペスウイルスの増殖を防ぐというものである。 Acyclovir used in the present invention is a compound of the chemical name 9-[(2-hydroxyethoxy) methyl] guanine (chemical formula: C 8 H 11 N 5 O 3 , molecular weight: 225.2) having the following chemical structure, It is obtained as a slightly yellowish white crystalline powder, hardly soluble in water, and soluble in acidic or alkaline aqueous solutions. At present, acyclovir is used as an anti-herpesvirus drug, and its mechanism of action is phosphorylated by herpesvirus-specific thymidine kinase to become active in herpesvirus-infected cells and inhibits viral DNA polymerase To prevent the growth of herpes virus.
以下の実施例において実証しているように、アシクロビルはＤ−アミノ酸オキシダーゼに対して阻害効果を有する。従って、アシクロビルの投与により神経細胞におけるＤ−セリンの分解が抑制され、神経細胞におけるＤ−セリンの不足によって生じる精神神経疾患を改善することが期待できる。特に、統合失調症と双極性障害は、Ｌ−グルタミン酸の結合と共にＤ−セリンの結合が必要なＮ−メチルーＤ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体）を介する神経伝達の異常が原因の１つと考えられている。 As demonstrated in the examples below, acyclovir has an inhibitory effect on D-amino acid oxidase. Therefore, it can be expected that administration of acyclovir suppresses the degradation of D-serine in nerve cells and improves a neuropsychiatric disorder caused by deficiency of D-serine in nerve cells. In particular, schizophrenia and bipolar disorder are caused by abnormal neurotransmission via N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA-type glutamate receptor) that requires D-serine binding as well as L-glutamate binding. It is considered one.
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、ヒトを含む哺乳動物の組織、特に脳、腎臓および肝臓において発現しており、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アルギニンなどの中性および塩基性のＤ−アミノ酸を分解する。 D-amino acid oxidase is expressed in mammalian tissues including humans, particularly brain, kidney and liver, and degrades neutral and basic D-amino acids such as D-serine, D-alanine and D-arginine. To do.
アシクロビルは、既に抗ヘルペスウイルス薬として使用されている医薬品である。先発品は、グラクソ・スミスクライン株式会社 (http://glaxosmithkline.co.jp/)から販売されているゾビラックスであり、錠剤、顆粒、および軟膏等の剤形で販売されている。例えば、錠剤として販売されている「ゾビラックス錠200 ・400 」の添付文書によれば、その用法・用量は、単純疱疹に対しては、通常、成人には１回アシクロビルとして200 mgを１日５回経口投与する。また、通常、小児には体重１kg当たり１回アシクロビルとして20mgを 1日４回経口投与する。ただし、１回最高用量は200 mgとする。同様に、造血幹細胞移植における単純ヘルペスウイルス感染症（単純疱疹）の発症抑制のためには、通常、成人には１回アシクロビルとして200 mgを１日５回造血幹細胞移植施行７日前より施行後３５日まで経口投与する。また、通常、小児には体重１kg当たり１回アシクロビルとして20mgを１日４回造血幹細胞移植施行７日前より施行後３５日まで経口投与する。ただし、１回最高用量は200 mgとする。同様に、帯状疱疹に対しては、通常、成人には１回アシクロビルとして800 mgを１日５回経口投与する。また、通常、小児には体重１kg当たり１回アシクロビルとして20mgを１日４回経口投与する。ただし、１回最高用量は800 mgとする。同様に、性器ヘルペスの再発抑制のためには、通常、小児には体重１kg当たり１回アシクロビルとして20mgを１日４回経口投与する。ただし、１回最高用量は200 mgとする。なお、これらの用量はいずれの場合においても年齢、症状より適宜増減すると記載されている。従って、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ阻害剤としてのアシクロビルを、統合失調症を含む精神神経疾患の治療のための医薬品として使用する場合、投与量は対象となる患者の年齢、体重、性別、病状、投与方法などに応じて変動するものであり、適切な臨床試験に基づいて決定されるべきであるが、上記の錠剤としての使用例も含め、現在までの抗ヘルペスウイルス薬としての使用例に基づく量が目安となるものと考えられる。
Acyclovir is a drug already used as an anti-herpesvirus drug. The original product is Zovirax sold by Glaxosmithkline Co., Ltd. (http://glaxosmithkline.co.jp/), and is sold in dosage forms such as tablets, granules, and ointments. For example, according to the package insert of “Zovirax Tablets 200/400” sold as a tablet, the dosage and administration are usually 200 mg as acyclovir once a day for herpes simplex. Orally administered twice. In general, for children, 20 mg of acyclovir once per kg body weight is orally administered 4 times a day. However, the maximum single dose is 200 mg. Similarly, in order to suppress the onset of herpes simplex virus infection (herpes simplex) in hematopoietic stem cell transplantation, the usual adult dose of 200 mg as acyclovir once 5 times a day from 7 days before hematopoietic stem cell transplantation 35 Orally administered until day. In general, for children, 20 mg of acyclovir once per kg of body weight is orally administered 4 times a day from 7 days before hematopoietic stem cell transplantation until 35 days after the implementation. However, the maximum single dose is 200 mg. Similarly, for shingles, usually 800 mg of acyclovir is orally administered to an
アシクロビルを有効成分とする医薬組成物を製造するには、必要により慣用の医薬品添加物を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤などの経口用製剤、溶液剤や懸濁剤などの注射用製剤、スプレーやエアロゾルなどの経粘膜投与用製剤とすることができる。添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、安定剤、溶解剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、粘度調整剤、ゲル化剤、分散剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤などが使用できる。 In order to produce a pharmaceutical composition containing acyclovir as an active ingredient, conventional pharmaceutical additives are added as necessary, and oral preparations such as tablets, granules, powders, capsules, and liquids, solutions and suspensions, etc. Injectable preparations, transmucosal administration preparations such as sprays and aerosols. Examples of additives include excipients, binders, disintegrants, lubricants, antioxidants, stabilizers, solubilizers, solubilizers, surfactants, emulsifiers, viscosity modifiers, gelling agents, and dispersions. Agents, pH adjusters, colorants, flavoring agents, and the like can be used.
本発明の改善薬を適用しうる疾患には、ＮＭＤＡ受容体の機能低下との関係が示唆されている統合失調症、双極性障害、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳失調、ハンチントン病などが挙げられる。なかでも統合失調症は、人口の１％に発生し、比較的若い時期に発症するため、社会的に大きな損失となり、また医療経済の面でも問題である。症状としては、幻覚、妄想、精神運動興奮などの陽性症状と精神運動抑制、意欲低下、自発性の欠如、感情の平板化、抑うつ症状などの陰性症状があり、多くの患者で各種認知機能障害を伴い、特にある種の記憶障害が重篤であることが報告されている。従って、本発明によりこれらの症状の改善が期待できる薬剤を提供できることは非常に有用である。 Diseases to which the ameliorating agent of the present invention can be applied include schizophrenia, bipolar disorder, depression, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebellar ataxia, Huntington's disease, etc., which have been suggested to be associated with reduced function of NMDA receptors. Is mentioned. Among them, schizophrenia occurs in 1% of the population and develops at a relatively young age, so it is a significant social loss and is also a problem in the medical economy. Symptoms include positive symptoms such as hallucinations, delusions, psychomotor excitement, and psychomotor suppression, decreased motivation, lack of voluntaryness, flattening of emotions, and negative symptoms such as depressive symptoms. In particular, certain types of memory impairment have been reported to be severe. Therefore, it is very useful to be able to provide a drug that can be expected to improve these symptoms according to the present invention.
（試験例１）アシクロビルのD-アミノ酸オキシダーゼ（DAO)に対する阻害活性
ヒトDAO を用いて、D-セリンと同等に基質となるD-アラニンを用いた場合の試験物質の阻害活性を、ヒドラジンを用いる2-オキソ酸の比色定量法により測定した。
材料
酵素：組換えタンパク質として大腸菌で発現させたヒトDAO を以下のように調製して用いた。なお、この酵素は大腸菌発現用プラスミドpRSET-B （Invitrogen社）を用いて、N 末にHis タグが付加された融合タンパク質として大腸菌BL21(DE3)pLysS株で発現させた。
(Test Example 1) Inhibitory activity of acyclovir against D-amino acid oxidase (DAO) Using human DAO, the inhibitory activity of the test substance when D-alanine, which is a substrate equivalent to D-serine, is used using hydrazine It was measured by a colorimetric method for 2-oxo acid.
Material enzyme: Human DAO expressed in E. coli as a recombinant protein was prepared and used as follows. This enzyme was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS as a fusion protein with a His tag added to the N terminus using the plasmid pRSET-B (Invitrogen) for expression in E. coli.
酵素を発現する大腸菌の培養液から、10,000× g、4 ℃、10分間の遠心により菌体を回収し、BugBuster Protein Extraction Reagent（Novagen 社）を用いた溶解により可溶性画分を得た。可溶性画分をニッケルカラム（His GraviTrap column：GE Healthcare 社）に添加した後、0.5 M NaClおよび400 mMイミダゾールを含む20 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）を添加してカラムに結合した組換えDAO を溶出した。溶出液を透析膜に移し、2 mM EDTA 、5 mM 2- メルカプトエタノールおよび10 %グリセロールを含む1 L の10 mM ピロリン酸ナトリウムバッファー（pH 8.3）に対する4 ℃、3 時間の透析を２回行った。透析後の溶液を２mLマイクロチューブに回収し、10,000× g、4 ℃、10分間の遠心後に上清を分取し、これを精製酵素として以降の実験に用いた。 Bacterial cells were collected from a culture solution of E. coli expressing the enzyme by centrifugation at 10,000 × g, 4 ° C. for 10 minutes, and a soluble fraction was obtained by lysis using BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen). The soluble fraction was added to a nickel column (His GraviTrap column: GE Healthcare), followed by recombinant DAO bound to the column by adding 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.5 M NaCl and 400 mM imidazole. Was eluted. The eluate was transferred to a dialysis membrane and dialyzed twice at 4 ° C for 3 hours against 1 L of 10 mM sodium pyrophosphate buffer (pH 8.3) containing 2 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol and 10% glycerol. . The dialyzed solution was collected in a 2 mL microtube, and the supernatant was collected after centrifugation at 10,000 × g, 4 ° C. for 10 minutes, and used as a purified enzyme in subsequent experiments.
基質：Sigma 社から購入したD-アラニンを滅菌水に溶解後、HCl またはNaOH溶液でpH 8.0にして使用した。 Substrate: D-alanine purchased from Sigma was dissolved in sterile water and adjusted to pH 8.0 with HCl or NaOH solution.
化合物：アシクロビルはWako社から購入し、100 ％(v/v）ジメチルスルホキシドに溶解して使用した。
試験方法
適切な量のDAO を含む120 μL の反応液（0.3 〜8.0 μg のDAO 、250 μM FAD 、22 unitsのAspergillus niger カタラーゼ、50 mM ピロリン酸ナトリウムバッファー：pH8.3 ）を1.5 mLマイクロチューブに調製した。調製した反応液に30μL の25 mM 基質（D-アラニン）を添加し、37℃で10分間の酵素反応を行った。10μL の100 % （w/v ）トリクロロ酢酸を添加して反応を止め、20,000× g、4 ℃、10分間の遠心後に150 μL の上清を分取した。100 μL の0.1 % （w/v ）2,4-ジニトロフェニルヒドラジン / 2 M HClを添加し、37℃で15分間の反応を行った。750 μL の3.75 M NaOH を添加し、20,000× g、4 ℃で10分間遠心した。200 μL の上清を96 well プレートに移し、プレートリーダー（PowerWaveTM XS：Bio-Tek 社）を用いて、基質の代わりに滅菌水を添加したサンプルをブランクとして445 nmの吸光度を測定した。
Compound: Acyclovir was purchased from Wako and dissolved in 100% (v / v) dimethyl sulfoxide.
上記試験法におけるヒドラジンを用いた2-オキソ酸の比色定量は以下に示す原理による。すなわち、無色のジニトロフェニルヒドラジンが、D-アミノ酸の分解により生じた2-オキソ酸と反応して、赤褐色のジニトロフェニルヒドラゾンを生成し、これは445 nmの光に吸収を示す。 The colorimetric determination of 2-oxo acid using hydrazine in the above test method is based on the following principle. That is, colorless dinitrophenylhydrazine reacts with 2-oxoacid generated by the decomposition of D-amino acid to produce reddish brown dinitrophenylhydrazone, which absorbs light at 445 nm.
結果
アシクロビルを試験化合物とし、ヒトDAO の酵素活性に対する用量依存的な阻害作用を解析した結果を図１に示す。
Results FIG. 1 shows the results of analyzing the dose-dependent inhibitory effect on the enzyme activity of human DAO using acyclovir as the test compound.
図１のＡは、ヒトDAO とアシクロビルを０℃で一定時間（０ｈ、２ｈ、４ｈ、５ｈまたは６ｈ）前処理し、その後基質を添加して酵素活性を測定した結果を示す。縦軸は、アシクロビル非存在下で得られた酵素活性を100 ％とした相対活性を示す。 FIG. 1A shows the results of pretreatment of human DAO and acyclovir at 0 ° C. for a certain period of time (0 h, 2 h, 4 h, 5 h or 6 h), after which a substrate was added and enzyme activity was measured. The vertical axis shows the relative activity with the enzyme activity obtained in the absence of acyclovir as 100%.
図１のＢは、ヒトDAO とアシクロビルを一定温度（０℃、５℃、１０℃、２０℃または３７℃）で５時間前処理し、その後基質を添加して酵素活性を測定した結果を示す。縦軸は、アシクロビル非存在下で得られた酵素活性を100 ％とした相対活性を示す。 FIG. 1B shows the results of pretreatment of human DAO and acyclovir at a constant temperature (0 ° C., 5 ° C., 10 ° C., 20 ° C. or 37 ° C.) for 5 hours, and then adding a substrate to measure enzyme activity. . The vertical axis shows the relative activity with the enzyme activity obtained in the absence of acyclovir as 100%.
これらの結果より、アシクロビルによるDAO の阻害は、阻害剤と酵素の結合・解離が非常にゆっくりとした速度で平衡に至るタイプである「遅延結合性阻害」であることが明らかになった。また、アシクロビルとDAO の結合・解離が平衡に達するまでの時間が温度に依存することも明らかになった。
（試験例２）アシクロビルの阻害作用の持続性
前処理を次のように行った以外は、試験例１と同様の方法でアシクロビルのヒトDAO に対する阻害作用を測定し、阻害作用の持続性を解析した：１００μM のアシクロビルをヒトDAO と０℃で５時間前処理し、次いでアシクロビルの濃度が１μM になるように希釈し、引き続き、０℃で０分、１５分、３０分または６０分の前処理を行った。その後、基質を添加して酵素活性を測定した（図２における右側４本のバー）。また、対照実験として、ヒトDAO を０μM 、１μM または１００μM のアシクロビルと０℃で５時間前処理し、希釈の操作をせずに基質を添加して酵素活性を測定した（図２における左側３本のバー）。縦軸は、アシクロビル非存在下（０μM ）で得られた酵素活性を100 ％とした相対活性を示す。
From these results, it was clarified that the inhibition of DAO by acyclovir is “late binding inhibition”, a type in which the binding and dissociation of the inhibitor and the enzyme reach equilibrium at a very slow rate. It was also clarified that the time required for the binding / dissociation of acyclovir and DAO to reach equilibrium was dependent on temperature.
(Test Example 2) Persistence of inhibitory action of acyclovir Except that pretreatment was performed as follows, the inhibitory action of acyclovir on human DAO was measured in the same manner as in Test Example 1, and the sustainability of the inhibitory action was analyzed. : 100 μM acyclovir pretreated with human DAO at 0 ° C. for 5 hours, then diluted to acyclovir concentration of 1 μM, followed by 0, 15, 30, or 60 minutes pretreatment at 0 ° C. Went. Thereafter, the substrate was added and the enzyme activity was measured (four bars on the right side in FIG. 2). As a control experiment, human DAO was pretreated with 0 μM, 1 μM or 100 μM acyclovir at 0 ° C. for 5 hours, and the enzyme activity was measured by adding the substrate without dilution operation (the left three in FIG. 2). Bar). The vertical axis shows the relative activity with the enzyme activity obtained in the absence of acyclovir (0 μM) as 100%.
図２より、アシクロビルによるDAO の阻害が可逆的であること、また、アシクロビルのDAO に対する阻害活性が持続性に優れていることが明らかになった。 From FIG. 2, it was revealed that the inhibition of DAO by acyclovir is reversible and that the inhibitory activity of acyclovir on DAO is excellent in sustainability.
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