JP6108469B2

JP6108469B2 - ラット脳内光誘発けいれんモデル

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Publication number: JP6108469B2
Application number: JP2013533503A
Authority: JP
Inventors: 伸一郎大沢; 真樹岩崎; 元虫明; 寛八尾; 悌二冨永; 義人古澤; 浩史冨田; 隆一重本
Original assignee: Tohoku University NUC
Current assignee: Tohoku University NUC
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: WO2013038666A1; JPWO2013038666A1

Description

本発明は、脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物のけいれんモデル動物としての使用に関するものである。更に詳細には、本発明は、前記モデル動物を用いたけいれんの評価方法、および抗てんかん薬等のけいれんの予防または治療薬のスクリーニング方法に関するものである。

てんかんは、人口の約1％が罹患する比較的多い神経疾患であるが、その生物学的成因は長い間不明であった。てんかんは大脳の神経細胞が自発的に異常同期して発火することによりその部分の脳活動が障害されて症状が出現するが、その原因は多岐にわたり、さらに焦点部位によっても異常のメカニズムが異なっており、根本的なメカニズムの解明は困難であった。

てんかんの診断法や治療方法の開発ならびに発展のための手段として、いわゆる「てんかんモデル動物」が使用されている。後天的なてんかん原性獲得のメカニズム解明に重要な役割を果たす動物モデルとしては多くの種類が報告されているが、脳内の電気刺激のように作成に数週間〜数ヶ月の長時間を要するもの（文献１）やけいれん重積状態が持続してしまい、間欠的かつ数分以内に終結するようなヒトにおけるてんかん発作を再現できていないもの（文献２）、死亡率が高いもの（文献２）、同様の作成手技によっても大半が発作出現せずモデル作成効率が悪いもの（文献２）などがあり、発作の再現性、誘発の任意性には大きな制限がある。具体的には、（i）神経毒（カイニン酸など）や金属（アルミナゲルなど）の投与、もしくは物理的刺激（脳挫傷など）で脳の特定部位と機能を破壊、（ii）間歇的な電気刺激による興奮（キンドリングモデルなど）、（iii）遺伝子改変、などがあるが、何れも上記のような欠点が存在しており、その欠点を改善した新たなモデル開発についても現在まで様々に研究がなされている。

一方で近年、遺伝子工学を駆使した光感受性陽イオンチャネルを用いた研究が盛んである。トランスジェニック動物、もしくはウィルスベクターを用いた遺伝子導入により標的細胞に光受容性タンパク質を発現させ、脳内留置した光ファイバーから特定の波長で刺激することにより、細胞選択性、空間選択性、時間選択性などが従来より飛躍的に高く、さらに電気的アーチファクトが小さい実験系を構築することが可能となった。パーキンソン病モデル動物に対する脳深部刺激（文献３、文献４）や脳スライス上での電気刺激によるけいれん活動を光刺激で抑制することができる（文献５）、といった報告が出ているが、てんかんに関する研究は殆ど無い。

Fujiwara A， Watanabe Y， Takechi K， Ishikawa T， Kaida Y， Akagi M，et al． The usefulness of olfactory bulb kindling as amodel for evaluation of antiepileptics． Epilepsia． 2009 Oct 20． Williams PA， White AM， Clark S， Ferraro DJ， Swiercz W， Staley KJ， et al． Development of spontaneous recurrentseizures after kainate-induced status epilepticus． JNeurosci． 2009 Feb 18；29(7)：2103-12． Kravitz AV， Freeze BS， Parker PR， Kay K，Thwin MT， Deisseroth K， et al． Regulation of parkinsonian motor behaviours by optogenetic controlof basal ganglia circuitry． Nature． 2010 Jul 7． Gradinaru V， Mogri M， Thompson KR， Henderson JM， Deisseroth K． Optical deconstruction ofparkinsonian neural circuitry． Science． 2009 Apr 17；324(5925)：354-9． Tonnesen J， Sorensen AT， Deisseroth K， Lundberg C， Kokaia M． Optogenetic control ofepileptiform activity． Proc Natl Acad Sci U S A． 2009 Jul 21；106(29)：12162-7．

本発明の目的は、けいれん発作を即時に、かつ高い信頼性で誘発できるモデル動物を提供することにある。

上記目的を達成するため、発明者らは、光刺激を用いたけいれんモデルを作製することにより、その発作活動の観察が容易なモデル動物実験系を確立するべく研究を行い、珪藻類クラミドモナスから採取した光受容性タンパク質であるチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）を導入したトランスジェニックラットの海馬に光刺激を与えることにより、該ラットにけいれん発作を誘発できることを発見した。さらに、発明者らは、アデノ随伴ウイルス−５ベクターを用いた遺伝子導入により海馬にＣｈＲ２遺伝子を導入したラットの海馬に光刺激を与えることにより、該ラットにけいれん発作を誘発できることを発見した。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物のけいれんモデル動物としての使用。
（２）海馬に光照射することにより、けいれんが誘発されることを特徴とする、（１）に記載の使用。
（３）光受容性タンパク質が光感受性陽イオンチャネルである、（１）または（２）に記載の使用。
（４）光感受性陽イオンチャネルがチャネルロドプシン２である、（３）に記載の使用。
（５）動物がげっ歯動物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の使用。
（６）動物がウイルスベクターの感染により光受容性タンパク質の遺伝子が導入された動物である、（１）〜（５）のいずれかに記載の使用。
（７）動物が光受容性タンパク質の遺伝子が導入されたトランスジェニック動物である、（１）〜（５）のいずれかに記載の使用。
（８）動物が受領番号NITE ABP-1417として受精卵が寄託されているトランスジェニックラット、または光の照射によりけいれんを呈するその変異体である、（７）に記載の使用。
（９）脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物を使用し、該動物の海馬に光を照射する工程を含む、けいれん発作の評価方法。
（１０）脳波をモニターする工程をさらに含む、（９）に記載の方法。
（１１）光受容性タンパク質が光感受性陽イオンチャネルである、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）光感受性陽イオンチャネルがチャネルロドプシン２である、（１１）に記載の方法。
（１３）光の波長が４２０〜５２０ｎｍである、（１２）に記載の方法。
（１４）光の強度が１０〜１２０ｍＷである、（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５）光の周波数が５〜４０Ｈｚである、または光を連続照射することを特徴とする、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）光のパルス幅が０．５ｍｓ〜連続である、（１２）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）オン／オフ比が０．０２〜０．９となるように、光が間欠的に照射される、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）動物がげっ歯動物である、（９）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）動物がウイルスベクターの感染により光受容性タンパク質の遺伝子が導入された動物である、（９）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）動物が光受容性タンパク質の遺伝子が導入されたトランスジェニック動物である、（９）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２１）動物が受領番号NITE ABP-1417として受精卵が寄託されているトランスジェニックラット、または光の照射によりけいれんを呈するその変異体である、（２０）に記載の方法。
（２２）受領番号NITE ABP-1417として受精卵が寄託されているけいれんモデル非ヒト哺乳動物、または光の照射によりけいれんを呈するその変異体。
（２３）脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物を用いた、てんかんを含むけいれんの予防または治療薬をスクリーニングする方法。
（２４）動物に被験物質を投与し、光照射により誘発されるけいれんの誘発率および／またはけいれんの持続時間を、被験物質を投与していない場合と比較および評価することを特徴とする、（２３）に記載のスクリーニングする方法。

本発明で用いられる脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびウイルスベクターの感染により脳神経細胞に光受容性タンパク質の遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物は、光照射に応答して、けいれん発作を即時に、かつ高い信頼性で誘発する。それゆえ、該動物は、てんかんをはじめとするけいれん発作のモデル動物として使用することができる。また、該モデル動物を用いて、抗てんかん薬等のけいれんの予防または治療薬をスクリーニングすることができる。

図１Ａは、ラットに導入するＤＮＡフラグメントを模式的に示す図である。図１Ｂは、導入された遺伝子の発現パターンを示す。図２は、本発明の方法を模式的に示す図である。図３は、電気刺激中および光刺激中の、神経活動を示すチャートである。図４は、間欠的光刺激法を模式的に示す図である。図５は、光刺激中および光刺激後のけいれんモデルラットにおいて測定された脳波を示すチャートである。図６は、オン／オフ比および周波数が、けいれん誘発率に与える影響を調べた結果を示す。図７は、海馬、扁桃体、視床前核、および感覚運動皮質に光刺激を与えたときの、それぞれのけいれん誘発率を示す図である。図８Ａは、ジアゼパムを投与した場合のけいれん誘発率およびけいれん持続時間の変化を示す図である。図８Ｂは、ジアゼパムを投与した場合のけいれん活動の変化を示す図である。図９Ａは、ウイルスベクターを用いてチャネルロドプシン遺伝子を導入したラットの海馬に光刺激を与えるという実験プロトコールを示す模式図である。図９Ｂは、導入したＣｈＲ２Ｖの発現を確認した顕微鏡写真である。図９Ｃは、光刺激中および光刺激後のけいれんモデルラットにおいて測定された脳波を示すチャートである。

本発明は、脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物のけいれんモデル動物としての使用に関する。更に詳細には、本発明は、前記モデル動物を用いたけいれんの評価方法、および抗てんかん薬等のけいれんの予防または治療薬のスクリーニング方法に関する。

１．定義
「光受容性タンパク質」とは、特定の波長の光を吸収することによって何らかの応答を示すタンパク質であり、光感受性イオンチャネルおよびシグナル伝達に関わるセンサリーロドプシンなどがある。ここで「光感受性イオンチャネル」とは、特定の波長の光刺激によってチャネルが開閉し、イオン移動によって脱分極もしくは過分極が起こる、光感受性のチャネルタンパク質である。光感受性陽イオンチャネルまたは陰イオンチャネルは、光受容体としての機能と陽イオンチャネルまたは陰イオンチャネルの機能を単一の分子において併せ持っており、光の明暗情報を電気的な情報に変換することができる。

本発明において使用し得る光受容性タンパク質としては、光感受性陽イオンチャネルであるチャネルロドプシン類がある。また光感受性陽イオンチャネルとしては、クラミドモナス類やその他の生物に見出される光感受性陽イオンチャネルおよびその遺伝子改変体であるならば特に限定されるものではなく、例えばチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）（配列番号１）、チャネルロドプシン１、および改変されたチャネルロドプシンが挙げられる。とくにその細胞内ドメインに神経細胞の特定箇所へ集積する性質を有する特性を付加することにより、光パルスによる活動電位を引き起こす効率を高めた改変体の利用も十分可能である。また、イオン透過性の異なる改変体、たとえば、Ｃａ²⁺透過性を高めた改変体や、Ｋ⁺選択的、あるいは陰イオン選択的な透過性を有し、光刺激により膜電位をマイナス変位（過分極）させるような改変体の利用も考えられる。他に、吸収スペクトルの異なる改変体の利用もあり得る。

なお、ＣｈＲ２遺伝子によりコードされるＣｈＲ２タンパク質としては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、配列番号１に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＣｈＲ２タンパク質と同等以上の生物学的活性を有するもの、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列と実質的に同一の配列相同性を有し、かつ配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＣｈＲ２タンパク質と同等以上の生物学的活性を有するもの（以下、「ＣｈＲ２変異型ポリペプチド」ともいう）を含む。

本明細書において、ＣｈＲ２変異型ポリペプチドの関連で使用する「数個」とは、１０以下の整数、例えば２〜９、２〜７、２〜５の整数である。

また「実質的に同一の配列相同性」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有することをいう。なお、相同性の％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。

本明細書において、「同等の生物学的活性」とは、例えば光感受性、チャネル機能といった生物学的な活性の強さが実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の生物学的活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の生物学的活性とは、光感受波長や、例えばイオン透過活性の性質が同一であることをいう。

また、ＣｈＲ２遺伝子としては、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＣｈＲ２タンパク質と同等以上の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「ＣｈＲ２変異型ポリヌクレオチド」ともいう）を含む。当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

「てんかん」とは、大脳の神経細胞の過剰な同期的発射活動が起こることによって、同一個人の中では同じ型の臨床発作（全身強直−間代発作、欠神発作、幻聴発作、四肢の一部の強直発作等）を繰り返す病態をいう。てんかんは生物学的成因が不明の神経疾患であり、けいれんを伴う。

ここで、「けいれん」とは、特徴的な脳波変化を伴う全身または身体の一部の筋群の不随意かつ発作性の収縮をいう。本明細書においては、けいれんが自発的に、反復して惹起される状態をてんかんと定義し、また、発作、けいれん発作、けいれん活動、およびてんかん発作の用語は、いずれもけいれんを呈している状態をいうものとする。

本明細書において、「光を間欠的に照射する」とは、図４に示すように、光を一定の時間間隔（刺激間隔またはオフ期間）を空けて連続的に一定時間（パルス幅またはオン期間）ずつ照射する時間（刺激期間）、および、刺激期間の後の光を照射しない時間（非刺激期間）を繰り返すことを意味し、そのような光照射法を間欠的光刺激法と定義する。刺激期間においては、刺激間隔（オフ期間）を空けてパルス幅（オン期間）の光照射が繰り返され、該繰り返しを、パルス幅の照射と刺激間隔とを一サイクルとした周波数（Ｈｚ）（１秒間あたりのサイクル数）を用いて表す。さらに、一サイクル中のパルス幅の割合（パルス幅／パルス幅＋刺激間隔）を「オン／オフ比」と定義する。

２．けいれんモデル非ヒト哺乳動物
（１）モデル動物の作製
（ａ）トランスジェニック動物の作製
本発明においては、脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる。そのような動物は、当業者に周知のトランスジェニック動物の作出方法に従い、非ヒト哺乳動物に光受容性タンパク質の遺伝子を導入して、脳神経細胞特異的に該遺伝子を発現させることにより作製することができる。

具体的には、限定するものではないが、例えば以下に示すような工程により、トランスジェニック動物を作製することができる。光受容性タンパク質の遺伝子を非ヒト哺乳動物の脳神経細胞内で機能する発現制御配列を有する非ヒト哺乳動物細胞用発現ベクターに導入する。この遺伝子発現ベクターをリニアライズした、導入遺伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントを、ラット等の非ヒト哺乳動物由来の分化全能性細胞に導入し、導入後仮親に移植する。移植した分化全能性細胞から個体を発生させ、その個体の組織から抽出したＤＮＡを用いたＰＣＲ法等により、導入遺伝子が体細胞染色体中に組み込まれた個体を選別することによって、本発明において使用するトランスジェニック動物を得ることができる。ＤＮＡフラグメントの分化全能性細胞への導入としては、マイクロインジェクション法を好ましく例示することができる。トランスジェニック動物を作製するために用いる分化全能性細胞としては、受精卵、初期胚の他、多分化能を有するＥＳ細胞等の培養細胞を例示することができる。

上記の「非ヒト哺乳動物の脳神経細胞内で機能する発現制御配列」としては、非ヒト哺乳動物の脳神経細胞で機能する発現制御配列である限り特に制限されないが、非ヒト哺乳動物の脳神経細胞で特異的に機能する発現制御配列であることが好ましく、非ヒト哺乳動物の脳神経細胞で特異的に機能するプロモーターであることがより好ましい。非ヒト哺乳動物中で機能する神経細胞特異的プロモーターとしては、例えばＴｈｙ１、２領域、ＣａＭＫＩＩ、ＰＶ等を用いることができる。

導入遺伝子の存在が確認された個体を交配することにより、本発明において使用する光受容性タンパク質を脳神経細胞で安定的に発現可能なように染色体の一部に組み込んだトランスジェニック動物を効率よく作出することができる。

本発明において使用される非ヒト哺乳動物はヒト以外の哺乳動物であればよく、例えばラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等が挙げられる。好ましくは、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯動物が使用され、より好ましくはラット、マウスが使用される。

導入した光受容性タンパク質遺伝子の発現を確認するため、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を一緒に導入してもよい。本発明においては当業者に周知の蛍光タンパク質を使用することができ、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＤＳＲｅｄ、およびＶｅｎｕｓ等を使用してもよい。これによって光刺激に応答する神経細胞を組織での蛍光を確認することによって識別する事が可能となる。

本発明において使用するトランスジェニック動物を作製するために、非ヒト哺乳動物の脳神経細胞で機能する発現制御配列の制御下に、光受容性タンパク質をコードする遺伝子の配列、および任意に蛍光タンパク質をコードする遺伝子の配列を機能しうる態様で連結した非ヒト哺乳動物細胞用発現ベクターを使用する。非ヒト哺乳動物細胞用発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（クローンテック社製）、ｐＧＢＴ−９(クローンテック社製)、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＥＦ−ＢＯＳ(Nucleic Acids Res．， 18， 5322， 1990)、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology， 3， 133， 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature， 329， 840， 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３（J．Blochem．， 101， 1307， 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。

上記トランスジェニック動物の好適な一例として、後述する受領番号NITE ABP-1417で特定されるトランスジェニックラットを挙げることができる。

（ｂ）ウイルスベクターによる遺伝子導入
本発明においては、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入によって脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物を用いることもできる。ウイルスベクターを用いた動物への遺伝子導入は、当業者に周知の方法に従って行うことができる。

具体的には、限定するものではないが、例えば以下に示すような工程により、ｉｎｖｉｖｏで遺伝子を導入することができる。まず、発現制御配列の制御下に、光受容性タンパク質をコードする遺伝子の配列、および任意に蛍光タンパク質をコードする遺伝子の配列を機能しうる態様で連結した配列を有するウイルスベクターを作製する。

本発明において「ウイルスベクター」とは、特に制限されず、ウイルスの細胞へ感染する機構や細胞に維持される機構を利用した遺伝子導入用のベクターをいい、公知の任意のウイルスベクターを含む。本発明において、例えば、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ））ベクター等が使用されうる。また、本発明において「発現制御配列」とは、特に限定されるものではなく、当業者に周知のエンハンサーおよび／またはプロモーター配列を使用することができる。例えばカルモジュリンキナーゼＩＩ、パルブアルブミンプロモーター等が使用されうる。

蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、導入した光受容性タンパク質遺伝子の発現を確認するために、任意に導入してもよい。本発明においては当業者に周知の蛍光タンパク質を使用することができ、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＤＳＲｅｄ、およびＶｅｎｕｓ等を使用してもよい。これによって光刺激に応答する神経細胞を組織での蛍光を確認することによって識別する事が可能となる。

光受容性タンパク質遺伝子の配列を含むウイルスベクターを、標的細胞、標的組織または標的臓器（以下、「標的細胞等」とする。）にインジェクションする。本発明において「標的細胞」、「標的組織」、および「標的臓器」とは、それぞれ、脳内に存在する任意の細胞、脳内の任意の部位、および脳をいう。本発明において、好ましくは海馬にウイルスベクターが注入される。標的細胞等にウイルスベクターを注入することによりウイルスが感染し、光受容性タンパク質遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が当該細胞に導入される。

（２）けいれんの誘発（光照射工程）
本発明においては、上記トランスジェニック動物およびウイルスベクターを用いて遺伝子導入された動物においてけいれんを誘発するため、該動物を開頭し、脳、特に海馬に、間欠的に光を照射して光刺激を行う。光照射のオン／オフ比は、０．０２〜０．９もしくは連続刺激、好ましくは０．０５〜０．５、より好ましくは０．０５〜０．１である。また、パルス幅は、０．５ｍｓ〜連続であってよく、好ましくは０．１〜１００ｍｓ、より好ましくは０．１〜５０ｍｓである。本発明において、上記トランスジェニック動物に対して、間欠的ではなく持続的に光を照射することによっても、低頻度ではあるが、けいれんを誘発することが可能である。

本発明に係る方法において照射する光の波長は、光受容性タンパク質の応答波長±５０ｎｍ程度、好ましくは±３５ｎｍ、より好ましくは±２０ｎｍ程度である。したがって、光受容性タンパク質として、最適波長４７０ｎｍの光により脱分極するチャネルロドプシン２を使用する場合には、４２０〜５２０ｎｍ程度、好ましくは４３５ｎｍ〜５０５ｎｍ程度、より好ましくは４５０〜４９０ｎｍ程度の波長の光を照射する。

照射する光の強度は、約１０〜１２０ｍＷ、好ましくは約３０〜１００ｍＷ、より好ましくは約５０〜８０ｍＷである。

照射する光の周波数は、約５〜４０Ｈｚ、好ましくは約１０〜２０Ｈｚである。

トランスジェニック動物およびウイルスベクターを用いて遺伝子導入された動物は、その海馬に光刺激、特に間欠的光刺激法に従い光刺激を受けると、けいれんを呈する。光刺激によって光感受性陽イオンチャネルを発現する神経細胞に脱分極が引き起こされることにより、トランスジェニック動物およびウイルスベクターを用いて遺伝子導入された動物がけいれんを呈するものと考えられる。

本発明では、光受容性タンパク質遺伝子を組み込んだトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびウイルスベクターを用いて遺伝子導入された非ヒト哺乳動物にけいれんを誘発するために、（ａ）光源、（ｂ）光源に結合された光伝導導線、および（ｃ）脳波を測定する手段を含む装置を用いる。該装置は、さらに（ｄ）測定した脳波をデータ処理する手段、および／または（ｅ）測定した脳波を表示する手段を含んでもよい。

前記装置において使用し得る光源としては、光受容性タンパク質の応答波長の光を発するものであれば特に限定されないが、例えば、レーザー光源が使用される。

前記装置において使用し得る光伝導導線は、例えば光ファイバーのような、ある位置から別の位置へ光または光エネルギーを伝導するための手段である。

前記装置において使用し得る脳波を測定する手段としては、当該技術分野において公知の脳波計を用いることができる。

上記装置は、本発明に係るモデル動物とともに、後述するけいれんの評価、けいれんの予防または治療薬のスクリーニングに使用される。

（３）けいれんの評価（動物の観察工程または脳波のモニタリング工程）
けいれんは、トランスジェニック動物およびウイルスベクターを用いて遺伝子導入された動物の観察および脳波の測定により検出することができる。例えば、ひげ、四肢、体幹、もしくは尾に振動が生じた場合、または異常脳波を観測した場合に、けいれんが起こったと判断する。本明細書において、異常脳波とは、自発的な連続する鋭波・棘波を特徴とする活動で、間欠的光刺激により誘発されるものの、一つ一つの誘発電位とは独立して発生する活動である。

光刺激を受けたトランスジェニック動物およびウイルスベクターを用いて遺伝子導入された動物は、光を照射されてもけいれんを呈さない潜伏期間と、その後けいれんを呈するけいれん（Ｓｚ）期間とを示す（図４および図５参照）。けいれん期間は、光刺激を終了しても一定時間継続するが、やがて自発的に終息する。本明細書においては、潜伏期間とけいれん期間とを合わせて、１セッションと定義する。

かくして、本発明では、脳波を測定することにより、より容易かつ正確に、モデル動物におけるけいれん発作誘発の有無を判断することができる。

脳波のモニタリングは、当該技術分野において公知の方法に従って、実施することができる。具体的には、モデル動物の脳内に深部電極を刺入し、該電極を脳波計に接続して脳波を測定する。よって、本発明の方法では、深部電極は海馬に刺入されることが好ましい。けいれん発作が誘発されている間、脳波所見は刺激初期に刺激毎の誘発電位のみが計測されるが、徐々にその波形が変化していき、ある点から自発的なけいれん活動が発生する。刺激終了時には連続的に自律的けいれん活動へ移行する。この活動はアーチファクトが少ない当モデルにおいては誘発時終始において観察可能である（図３および図５参照）。

３．けいれんモデルラット
本発明においては、脳神経細胞に光受容性タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる。本発明の一態様では、クラミドモナス由来のチャネルロドプシン２を脳神経細胞特異的に発現しているトランスジェニックラットを使用することができる。

（１）受精卵の寄託
本発明において使用し得る、チャネルロドプシン２を導入したトランスジェニックラットの受精卵は、微生物の識別の表示Thy1．2-ChR2-Venusで、平成２４（２０１２）年９月４日（受領日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託された。受領番号はNITE ABP-1417である。

（２）特性
寄託を行ったトランスジェニックラットには、Ｔｈｙ１．２−ＣｈＲ２−Ｖｅｎｕｓが導入されている。該トランスジェニックラットは、間欠的光刺激法に従って海馬に光が照射されると、けいれんを呈する。しかし、該トランスジェニックラットにおいて、従来刺激によってけいれん誘発が起こりやすいとされてきた皮質および扁桃体、ならびにてんかんの発作活動のネットワークに重要な役割を果たすとされる視床前核に対して、同様に光刺激を加えても、けいれん発作は誘発されない（図７）。

（３）繁殖・飼育条件
寄託を行ったトランスジェニックラットは、近交系動物の繁殖に通常用いられているように、兄妹交配によって増殖を行って、必要なラット数を確保することができる。また、飼育条件は特に制限はなく、慣用の飼育法に従って飼育することができる。

（４）子孫、コンジェニック系、および変異体
本発明において使用し得るトランスジェニックラットとしては、寄託を行ったトランスジェニックラットだけでなく、導入した遺伝子、すなわちＣｈＲ２遺伝子（配列番号２）を保有して上記の特性を示す、該トランスジェニックラットと実験用ラットを交配させて得られる交雑ラットや、コンジェニック系ラットも含まれる。また、ＣｈＲ２変異型ポリペプチドを脳神経細胞特異的に発現して上記の特性を示す、該トランスジェニックラットの変異体も含まれる。なお、コンジェニック系ラットは、導入した遺伝子以外についての遺伝的背景が、任意の実験用ラットのものとなっているものであり、このようなコンジェニック系ラットは、寄託を行ったトランスジェニックラットであってＣｈＲ２遺伝子についてヘテロまたはホモ接合体であるトランスジェニックラットと、任意の実験用ラットとを公知の戻し交雑育種法にしたがって戻し交配を進めることにより、作出することができる。

（５）有用性および利点
本発明のけいれんモデル動物は、従来のてんかんモデル動物に比べて以下の点で秀でている。
・光刺激後そのままけいれん活動に移行するので、けいれん発作誘発に時間を要しない
・光ファイバーおよび電極留置後は即時にけいれん発作を誘発できるので、例えばキンドリングモデル等のようにモデル作製に長時間を要しない
・数分から数時間以内に複数回にわたって任意にけいれん発作を高確率に誘発することができ、個体内、もしくは個体間で非常に再現性が高い
・光刺激は電気的な計測のアーチファクトが少ないため、電気的活動の異常であるてんかん活動を計測、解析するのに便利である
・本発明のけいれんモデル動物は、従来のモデル動物に比べて死亡率が低い
・本発明において使用する受領番号NITE ABP-1417のトランスジェニックラット、ならびにその子孫、コンジェニック系ラット、および変異体は、繁殖、および表現形の識別（ジェノタイピング）が容易である。タイピングは体細胞（尾）のサンプルを用いて組換え遺伝子の一部であるＶｅｎｕｓ（野性型（ＷｉｌｄＷｉｓｔｅｒｒａｔ）の遺伝子には存在しない）をＰＣＲ法によって検出する
・本発明において使用する受領番号NITE ABP-1417のトランスジェニックラット、ならびにその子孫、コンジェニック系ラット、および変異体は、ヘテロであるかホモであるかにかかわらず、１００％けいれんを呈する

４．けいれんモデル非ヒト哺乳動物を用いた、薬剤のスクリーニング方法および深部脳刺激療法
（１）薬剤のスクリーニング方法
本発明のけいれんモデル非ヒト哺乳動物は、てんかんモデル非ヒト哺乳動物として使用することができる。したがって、本発明のけいれんモデル非ヒト哺乳動物に、被験物質を投与することにより、てんかんを含むけいれんを予防または治療するための薬物をスクリーニングすることができる。

例えば、本発明のモデル動物に被験物質を投与し、該モデル動物又はその一部においてけいれんと相関関係を有する指標値を測定し、被験物質を投与していない対照動物の結果と比較し、この比較結果に基づいて、けいれんを軽減または消滅させるか否かを確認することで、てんかんを含むけいれんの予防または治療薬をスクリーニングすることができる。

モデル動物又はその一部とは、動物の生体の全身、及び限定された組織又は器官の両者を含む。限定された組織又は器官の場合は、動物から摘出されたものも含む。

指標値としては、例えば、けいれんの持続時間や誘発率の変化を用いることができる。本明細書において、「けいれんの持続時間」とは、光刺激を受けたけいれんモデル動物がけいれんを呈する時間のことをいい、けいれん期間とも記載する。また、本明細書において「けいれんの誘発率」とは、光刺激を受けたけいれんモデル動物においてけいれんが発生する発生頻度をいい、光刺激を行った回数に対して該モデル動物がけいれんを呈した回数を百分率で表す。

例えば、被験物質の投与により、けいれんの持続時間および／または誘発率の低下が観察された場合、使用した被験物質をてんかんを含むけいれんの予防または治療薬として選択することができる。

また、ひげ、四肢、体幹、もしくは尾における振動の変化、または異常脳波の変化も、指標値として使用し得る。例えば、被験物質の投与により、けいれんの消失若しくは軽減、または異常脳波の正常化が観察された場合、使用した被験物質をてんかんを含むけいれんの予防または治療薬として選択することができる。

被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよく、被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸など）や塩基（例えば、有機酸など）などとの塩が用いられる。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが挙げられる。

被験物質の投与方法は、当該物質の性質などに応じて当業者が適宜選択することができ、例えば、経口投与、静脈注射、経皮投与、皮下投与、皮内投与、腹腔投与などが用いられる。また、被験物質の投与量は、投与方法および当該物質の性質に応じて、当業者が適宜設定することができる。

（２）深部脳刺激療法
上記のとおり、本発明のけいれんモデル非ヒト哺乳動物は、てんかんモデル非ヒト哺乳動物としても使用することができる。よって、本発明のけいれんモデル非ヒト哺乳動物の脳に、深部脳刺激療法（ｄｅｅｐｂｒａｉｎｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ＤＢＳ）を模して電気等の物理的刺激を与えることにより、てんかんを含むけいれんを予防または治療するために物理的刺激が有効に作用する脳内の部位や刺激のパラメータ等を同定することができる。ここで、深部脳刺激療法とは、脳の深部に設置した電極から電気刺激を与えることにより、脳内の活動に何らかの変化を起こす方法であり、てんかんやパーキンソン病等の症状を治療するための外科的処置ともなりうる。

例えば、深部脳刺激療法を模して、本発明のモデル動物の脳内に刺激電極を留置し、電気刺激等のような物理的刺激を与え、該モデル動物又はその一部においてけいれんと相関関係を有する指標値を測定する。物理的刺激を与えていない対照動物または物理的刺激を与える前のモデル動物の結果と比較し、この比較結果に基づいて、けいれんを軽減または消滅させるか否かを確認することで、てんかんを含むけいれんの予防または治療に物理的刺激が有効に作用する脳内の部位および刺激パラメータを同定することができる。

例えば、物理的刺激としては電気刺激および電気的、化学的焼灼術を用いることができる。また、指標値としては、上記（１）薬物スクリーニング方法と同様に、例えば、けいれんの持続時間や誘発率の変化、ならびにひげ、四肢、体幹、もしくは尾における振動の変化、または異常脳波の変化を用いることができる。例えば、電気刺激により、けいれんの持続時間および／または誘発率の低下が観察された場合、またはけいれんの消失若しくは軽減、または異常脳波の正常化が観察された場合、てんかんを含むけいれんの予防または治療に物理的刺激が有効に作用する脳内の部位および刺激パラメータを同定することができる。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2011-198126号（2011年9月12日出願）の明細書および図面に記載の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。

以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。

１．系の構築
（１）トランスジェニックラット
Ｗｉｓｔｅｒｒａｔへ遺伝子組換え技術を用いてマウスＴｈｙ１．２プロモーター下にＣｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２（ＣｈＲ２）及びＶｅｎｕｓを組み入れ作成されたＴｈｙ１．２−ＣｈＲ２−Ｖｅｎｕｓトランスジェニックラットを用いる。なおＴｈｙ１．２プロモーターは胸腺間質細胞、神経細胞において選択的に発現するプロモーター領域であり、ＣｈＲ２は前述の光受容性陽イオンチャネル、Ｖｅｎｕｓは蛍光タンパク質である。本ラット神経細胞にはＣｈＲ２−Ｖｅｎｕｓ融合タンパク質が発現しており、Ｖｅｎｕｓの蛍光を見る事によってＣｈＲ２の発現分布を評価する事ができる。

なお本実験で用いているトランスジェニックラットは東北大学医学系研究科八尾寛教授および自然科学研究機構生理学研究所重本隆一教授の研究によって作製されたものであり、受領番号NITE ABP-1417である。

（２）実験デザイン
（ａ）装置
使用した装置は、ラット固定装置、脳波測定装置、光刺激装置よりなる。
（ｂ）開頭手術
トランスジェニックラットを麻酔下に開頭し、電極を脳波を測定したい脳内の任意の部位に、ならびに光ファイバーを海馬内に光が到達する部位および方向に、留置する（図２参照）。
（ｃ）神経活動可視化
脳内留置された電極により脳波が記録される（図３参照）。
（ｄ）間欠的光刺激法
光刺激は前述の間欠的刺激を用いる。刺激頻度、オン／オフ比は任意に変更できる（図４参照）。

（３）光誘発けいれん活動
脳波測定下に光刺激を行うと、脳波上に光刺激による光電流が計測されるが徐々に自発的なけいれん活動が発生し、成長する。またひげや四肢など身体所見としても間代けいれんが認められるようになる。この活動は光刺激終了後も連続して自発的なけいれん活動へ移行し、やがて終息する。一部始終は脳波の記録が可能である（図５参照）。

（４）けいれん誘発の至適条件
海馬において、５−４０Ｈｚ、オン／オフ比０．０２−０．９、加えて連続刺激の条件でけいれんの誘発頻度を測定したところ、１０−２０Ｈｚ、オン／オフ比０．０５−０．１の刺激条件で誘発頻度は最大（１０／１０）回となった（図６参照）。また、１０Ｈｚ、オン／オフ比０．１の刺激条件で、海馬、扁桃体、視床前部、および感覚運動皮質に光刺激を与えてけいれんの誘発を試みると、海馬外の部分では殆ど誘発はなされなかった（図７参照）。

２．ジアゼパム投与による、けいれん誘発の変化
（１）実験デザイン
トランスジェニックラットを、ジアゼパム投与群及びリン酸緩衝食塩水投与群（コントロール）の２群に分け、ジアゼパム投与群にはジアゼパム１０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ体重（０．２−０．４ｍｌ）を、対照群にはリン酸緩衝食塩水１ｍｌ／ｋｇ体重を腹腔内投与した。投与前後に各々５分おきに１０回ずつ、海馬への光刺激によるけいれん誘発を行い、誘発頻度（誘発率）及びけいれん持続時間を比較した。光刺激条件は、光の強度５０ｍＷ、周波数１０Ｈｚ、パルス幅１０ｍｓ、総刺激時間１０秒とした。

（２）結果
ジアゼパム投与群、リン酸緩衝食塩水投与群の誘発頻度はそれぞれ（投与前、投与後）でジアゼパム投与群（７０％、２０％）、リン酸緩衝食塩水投与群（９０％、９０％）だった（図８Ａ参照）。またけいれんが起こった際の平均持続時間［秒］（投与前、投与後）はジアゼパム投与群（４２．３、６．６）、リン酸緩衝食塩水投与群（５４．０、６１．１）だった（図８Ａ参照）。

（３）ジアゼパム投与の効果
ジアゼパム投与群で、脳波から計算されたけいれん活動の平均パワー［ｍＶ²／ｓｅｃ］を投与前後で比較すると、投与前（０．５５±０．７）、投与後（０．１１±０．２１）であり、両者には有意差があった（図８Ｂ参照）。ここで、図８Ｂにおけるパワースコアとは脳波の振幅を２乗したものであり、けいれん活動の強さを表す指標である。この結果より、ジアゼパムの投与によってけいれん活動が抑制されたと考えられた。

３．ｒＡＡＶ−ＣｈＲ２−Ｖｅｎｕｓベクターによりトランスフェクトされた海馬への光刺激後のけいれん誘発
（１）ＣｈＲ２遺伝子コンストラクトを有するＡＡＶベクターの調製
ＣｈＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ４６１３９７）のＮ末端フラグメント（残基１−３１５）を、ＣｈＲ２−コーディングフラグメント（ＣｈＲ２Ｖ）の末端においてインフレームで、蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに融合させた。ＣｈＲ２遺伝子は、６Ｐ１プラスミドのＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入された。シナプシンプロモーターを、ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターに交換し、ＡＡＶ−ＣｈＲ２Ｖを構築した。ＡＡＶ−ＲＣおよびｐ−ヘルパープラスミドはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ、ＵＳＡ）より得た。高力価（１−１０ｘ１０１２粒子／ｍｌ）ｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ−ＣｈＲ２Ｖ）は、以前に報告されている方法（Gene Therapy， 2011；
18(3)：266-74）を用いて精製した。

（２）けいれんの誘発
ｒＡＡＶ−ＣｈＲ２−Ｖｅｎｕｓベクターによりトランスフェクトされた野生型Ｗｉｓｔｅｒラットの海馬に、繰返し光刺激を与えた（図９Ａ）。ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターによってドライブされるＣｈＲ２Ｖ融合タンパク質をコードする遺伝子を持つＡＡＶを、通常のラットの中隔海馬（septal hippocampus）の歯状回門（dentate hilus）に注入した。４〜６週間後、海馬ニューロンにおけるＣｈＲ２Ｖの強い発現が確認された（図９Ｂ）。ハイブリッド電極を用いたＬＦＰの同時レコーディング下、周波数（５，１０，２０Ｈｚ）とデューティ比（duty ratio）（０．０５，０．１，０．２）のパラメーターと組み合わせた繰返しのパルス光刺激を与えた。繰返しの光刺激は、再現可能な方法で成功裡にけいれんを誘導した（図９Ｃ）。

本発明の方法に従って作製したモデル動物は、けいれんのメカニズム解明や、抗けいれん薬および抗てんかん薬のスクリーニング・治療効果判定に有用である。

Claims

海馬の脳神経細胞に光感受性陽イオンチャネルを発現する非ヒト哺乳動物のけいれんモデル動物としての使用であって、前記けいれんモデル動物が海馬に光照射することにより、けいれんが誘発されることを特徴とする前記使用。
光感受性陽イオンチャネルがチャネルロドプシン２である、請求項１に記載の使用。
動物がげっ歯動物である、請求項１または２に記載の使用。
動物がウイルスベクターの感染により光感受性陽イオンチャネルの遺伝子が導入された動物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
動物が光感受性陽イオンチャネルの遺伝子が導入されたトランスジェニック動物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
トランスジェニック動物が受領番号NITEABP-1417として受精卵が寄託されているトランスジェニックラット、または光の照射によりけいれんを呈するその変異体である、請求項５に記載の使用。
脳神経細胞に光感受性陽イオンチャネルを発現する非ヒト哺乳動物を使用し、該動物の海馬に光を照射する工程を含む、けいれん発作の評価方法。
脳波をモニターする工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
光感受性陽イオンチャネルがチャネルロドプシン２である、請求項７に記載の方法。
光の波長が４２０〜５２０ｎｍである、請求項９に記載の方法。
光の強度が１０〜１２０ｍＷである、請求項９または１０に記載の方法。
光の周波数が５〜４０Ｈｚである、または光を連続照射することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
光のパルス幅が０．５ｍｓ〜連続である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
オン／オフ比が０．０２〜０．９となるように、光が間欠的に照射される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
動物がげっ歯動物である、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
動物がウイルスベクターの感染により光感受性陽イオンチャネルの遺伝子が導入された動物である、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
動物が光感受性陽イオンチャネルの遺伝子が導入されたトランスジェニック動物である、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の方法。
動物が受領番号NITEABP-1417として受精卵が寄託されているトランスジェニックラット、または光の照射によりけいれんを呈するその変異体である、請求項１７に記載の方法。
受領番号NITEABP-1417として受精卵が寄託されているけいれんモデル非ヒト哺乳動物、または海馬への光の照射によりけいれんを呈するその子孫。
脳神経細胞に光感受性陽イオンチャネルを発現する非ヒト哺乳動物を用いた、てんかんを含むけいれんの予防または治療薬をスクリーニングする方法。
動物に被験物質を投与し、光照射により誘発されるけいれんの誘発率および／またはけいれんの持続時間を、被験物質を投与していない場合と比較および評価することを特徴とする、請求項２０に記載のスクリーニングする方法。