JP6107244B2 - Fluorescent dye labeling resin particles, production method thereof, and tissue immunostaining kit containing the particles - Google Patents
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本発明は蛍光色素標識用樹脂粒子及びその製造方法並びに該粒子を含む組織免疫染色用キットに関する。特に、本発明は、組織切片中の特定の物質を検出するための蛍光色素標識用樹脂粒子及びその製造方法並びに該樹脂を含む組織免疫染色用キットに関する。 The present invention relates to a fluorescent dye-labeled resin particle, a method for producing the same, and a tissue immunostaining kit containing the particle. In particular, the present invention relates to a fluorescent dye-labeled resin particle for detecting a specific substance in a tissue section, a method for producing the same, and a tissue immunostaining kit containing the resin.
医学的診断の１つとして、病理診断が行なわれている。病理医は人体から採取した組織片から病気を診断し、治療や手術の要不要を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針を、外科系医師は手術を行うか否かを決定する。 As one of medical diagnoses, pathological diagnosis is performed. The pathologist diagnoses the disease from a piece of tissue collected from the human body and tells the clinician whether treatment or surgery is necessary. Depending on the patient's condition and pathological diagnosis, the medical doctor determines the drug treatment policy, and the surgical doctor determines whether or not to perform the operation.
病理診断では、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織標本を作成し、様々な所見を得るために光学顕微鏡を用いて拡大観察することが広く行われている。多くの場合、標本は、採取した組織を固定するため脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。 In pathological diagnosis, tissue specimens obtained by organ excision and needle biopsy are sliced to a thickness of several microns to create tissue specimens, and they are widely observed with an optical microscope to obtain various findings. It has been broken. In many cases, a specimen is prepared by dehydrating and collecting a paraffin block to fix the collected tissue, then slicing it to a thickness of several μm, and removing the paraffin.
病理診断では、免疫染色と呼ばれる、標本の分子情報の発現を確認するための分子標的染色を施し、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察が行なわれている。免疫染色には、例えば、酵素を用いた色素染色法（ＤＡＢ染色等）が用いられる（特許文献１）。ＤＡＢ染色は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を基質として発色させることのできるペルオキシダーゼで修飾された抗体を用いて、観察対象となる抗原を当該発色により染色して観察することで抗原量を測るものである。しかしながら、ＤＡＢ染色のような酵素標識による染色は、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗体等の量を見積もることが難しいという課題がある。そのため、病理診断における免疫観察では、酵素標識による染色の代わりに、蛍光標識体を用いる蛍光標識法も行なわれている。この方法はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある（非特許文献１）。蛍光標識法は、蛍光色素が修飾された抗体を用いて対象となる抗原を染色して観察することで抗原量を測るものである。 In the pathological diagnosis, immunological observation called immunostaining is performed, in which molecular target staining for confirming the expression of molecular information of a specimen is performed and functional abnormalities such as abnormal expression of genes and proteins are diagnosed. For immunostaining, for example, a dye staining method using an enzyme (DAB staining or the like) is used (Patent Document 1). DAB staining measures the amount of antigen by staining and observing the antigen to be observed using the peroxidase-modified antibody that can develop color using diaminobenzidine (DAB) as a substrate. . However, staining with an enzyme label such as DAB staining has a problem that it is difficult to estimate the actual amount of antibody or the like from the staining concentration because the staining concentration greatly depends on environmental conditions such as temperature and time. Therefore, in immunological observation in pathological diagnosis, a fluorescent labeling method using a fluorescent label is performed instead of staining with an enzyme label. This method is characterized in that it has better quantitativeness than DAB staining (Non-Patent Document 1). In the fluorescent labeling method, the amount of antigen is measured by staining and observing an antigen of interest using an antibody modified with a fluorescent dye.
なお、標本は光を殆ど吸収および散乱せず無色透明に近いため、観察に先立って、形態観察のために、色素による染色を施されることがある。染色手法としては種々のものが提案されている。特に組織標本に関しては、標本の形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が標準的に用いられている（非特許文献１）。ヘマトキシリン染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色され、エオジン染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される。病理医は、染色された組織標本の顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化などの形態学的な情報、染色情報、をもとに診断を行っている。なお、この他の形態観察染色としては、例えば細胞診に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等がある。一つの切片に対して形態染色と免疫染色の両方を行なうことにより、標本の形態観察と免疫観察を同時に行うこともできる。 Since the specimen hardly absorbs and scatters light and is nearly colorless and transparent, it may be stained with a dye for morphological observation prior to observation. Various dyeing techniques have been proposed. Particularly for tissue specimens, hematoxylin and eosin staining (HE staining) using two pigments of hematoxylin and eosin is used as a standard for morphological observation for observing the morphology of the specimen (Non-patent Document 1). . Hematoxylin staining stains cell nuclei, lime, cartilage tissue, bacteria, and mucus blue-blue to light blue, and eosin staining stains cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes, and keratinocytes red to dark red. . The pathologist makes a diagnosis based on morphological information such as changes in the size and shape of the cell nucleus and changes in the pattern of the tissue in the microscopic image of the stained tissue specimen, and staining information. ing. Examples of other morphological observation staining include Papanicolaou staining (Pap staining) used for cytology. By performing both morphological staining and immunostaining on one section, it is possible to simultaneously perform morphological observation and immunological observation of the specimen.
蛍光標識体としては、蛍光色素や無機ナノ粒子（半導体ナノ粒子、量子ドット等と称されることもある）、それらの集積体の利用が知られている（非特許文献２、特許文献２）。蛍光色素や無機ナノ粒子と、それらの集積体では、集積体の方が耐光性能が向上することが報告されている（特許文献３）。従って、耐光性の観点から集積体の方がより好ましいが、蛍光顕微鏡観察において要求される耐光性能には、集積化だけでは十分ではない。なお、色素１個と集積体１個では１個あたりの輝度が集積体の方が高くなるので、シグナルの観点から、集積体の方がより好ましい。 As fluorescent labels, use of fluorescent dyes, inorganic nanoparticles (sometimes referred to as semiconductor nanoparticles, quantum dots, etc.), and their aggregates is known (Non-patent Document 2, Patent Document 2). . Among fluorescent dyes and inorganic nanoparticles and their aggregates, it has been reported that the aggregates have improved light resistance (Patent Document 3). Therefore, the integrated body is more preferable from the viewpoint of light resistance, but integration alone is not sufficient for the light resistance performance required in the fluorescence microscope observation. In addition, since the brightness | luminance per unit becomes higher with one pigment | dye and one integration body, the integration body is more preferable from a viewpoint of a signal.
標本作製において、染色後の病理切片を封入するための封入剤としては、水系封入剤および油系封入剤が知られている。水系封入剤は標本との屈折率差が大きく、標本を透明としにくい、永久標本としにくい、という課題がある。一方、油系封入剤は標本との屈折率差が小さく、標本を透明とできる、形態染色の色味や発色が良い、永久標本用として標準的に用いられている、という特徴がある。このため、油系封入剤の方が標本作製に好適に用いられる。 In the preparation of specimens, aqueous encapsulants and oil-based encapsulants are known as encapsulants for encapsulating stained pathological sections. The water-based encapsulant has a problem that the refractive index difference from the specimen is large, and the specimen is difficult to make transparent or permanent. On the other hand, oil-based encapsulants have the characteristics that they have a small difference in refractive index from the specimen, can make the specimen transparent, have good morphological dyeing and coloring, and are used as standard for permanent specimens. For this reason, the oil-based encapsulant is preferably used for specimen preparation.
このような永久標本の作製では、形態染色や免疫染色の後、上記の封入を行う前に、鮮明な染色像を得るために、組織切片中のエタノールをキシレンで置換する透徹を行うことが一般的である。しかし、従来の蛍光色素標識用樹脂粒子を用いた場合には、組織切片をキシレンに浸漬させたときに、免疫染色により組織切片中の検出対象物質上で一旦固定化した蛍光色素がキシレンによってにじみ出てしまい、輝点の位置及び強度にバラツキを生じ、蛍光顕微鏡観察を行った場合、鮮明な染色像が得られず、判定精度が悪化するという問題があった（後記の比較例を参照）。 In the preparation of such a permanent specimen, after morphological staining or immunostaining, it is generally performed to replace ethanol in tissue sections with xylene in order to obtain a clear stained image before the above-described encapsulation. Is. However, when conventional resin particles for fluorescent dye labeling are used, when the tissue section is immersed in xylene, the fluorescent dye once immobilized on the detection target substance in the tissue section is exuded by xylene by immunostaining. As a result, there is a variation in the position and intensity of the bright spot, and when a fluorescence microscope observation is performed, there is a problem that a clear stained image cannot be obtained and the determination accuracy is deteriorated (see a comparative example described later).
本発明の課題は、組織切片の永久標本を作製のためのキシレンによる透徹を行った場合に、組織切片中の検出対象物質上で固定化されている蛍光色素の溶出が防止された蛍光色素標識用樹脂粒子を提供することである。また、本発明の課題は、該蛍光色素標識用樹脂粒子の製造方法及び該蛍光色素標識用樹脂粒子を含む組織免疫染色用キットを提供することである。 An object of the present invention is to provide a fluorescent dye label in which elution of a fluorescent dye immobilized on a detection target substance in a tissue section is prevented when penetration with xylene for producing a permanent specimen of a tissue section is performed. Resin particles for use. Another object of the present invention is to provide a method for producing the fluorescent dye-labeled resin particles and a tissue immunostaining kit containing the fluorescent dye-labeled resin particles.
本発明者らは、蛍光色素標識用樹脂粒子の樹脂の溶剤耐性及び樹脂と色素の結合力に着目して検討して結果、樹脂の構成単位を形成するモノマー、樹脂の架橋度、樹脂と蛍光色素の結合に関与する置換基を特定の条件とすることで、キシレンによる蛍光色素の溶出が抑制された蛍光色素標識樹脂粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の項に示すものである。 As a result of studying the solvent resistance of the resin for fluorescent dye labeling resin particles and the binding force between the resin and the dye, the present inventors have examined the monomer, the degree of crosslinking of the resin, the degree of crosslinking of the resin, the resin and the fluorescence. The inventors have found that fluorescent dye-labeled resin particles in which elution of the fluorescent dye by xylene is suppressed can be obtained by setting the substituents involved in the dye binding to specific conditions, and the present invention has been completed. That is, this invention is shown to the following items.
（本発明）
[項１]
樹脂からなる樹脂粒子に蛍光色素が共有結合以外で結合された蛍光色素標識用樹脂粒子であって、
（１）前記樹脂がスチレン、メタクリル酸アルキル及びアクリロニトリルからなる群より選ばれる少なくとも１つの単官能モノマーから形成される構成単位を含み、かつその構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられていること、又は、前記樹脂が単官能モノマーとしてのメタクリル酸から形成される構成単位を含んでいること、
（２）前記樹脂の架橋度が５０％以上であること、及び
（３）前記蛍光色素が前記樹脂の有する電荷を持つ置換基の電荷とは反対の電荷を持つ置換基を有すること
を特徴とする蛍光色素標識用樹脂粒子。
(Invention)
[Section 1]
Resin particles for fluorescent dye labeling in which a fluorescent dye is bonded to resin particles made of resin other than covalent bonds,
(1) The resin includes a structural unit formed of at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of styrene, alkyl methacrylate and acrylonitrile, and at least a part of hydrogen contained in the structural unit has a charge. Substituted with a substituent, or the resin contains a structural unit formed from methacrylic acid as a monofunctional monomer,
(2) The degree of crosslinking of the resin is 50% or more, and (3) the fluorescent dye has a substituent having a charge opposite to that of the substituent having the charge of the resin. Resin particles for fluorescent dye labeling.
[項２]
前記樹脂が、メタクリル酸グリシジルの単官能モノマーから形成される構成単位を更に有する項１に記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 2]
Item 2. The resin particle for fluorescent dye labeling according to Item 1, wherein the resin further comprises a structural unit formed from a monofunctional monomer of glycidyl methacrylate.
[項３]
前記樹脂が正電荷を持つ置換基を有しており、前記蛍光色素が負電荷を持つ置換基を有しており、前記蛍光色素１分子中の前記負電荷を持つ置換基の数が分子量４００当たり１以上である項１又は２に記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 3]
The resin has a positively charged substituent, the fluorescent dye has a negatively charged substituent, and the number of the negatively charged substituents in one molecule of the fluorescent dye is a molecular weight of 400. Item 3. The fluorescent dye labeling resin particle according to Item 1 or 2, wherein the number is 1 or more per unit.
[項４]
前記樹脂が正電荷を持つ置換基を有しており、前記蛍光色素が負電荷を持つ置換基を有しており、前記蛍光色素１分子中の前記負電荷を持つ置換基の数が２以上である項１又は２に記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 4]
The resin has a positively charged substituent, the fluorescent dye has a negatively charged substituent, and the number of the negatively charged substituents in one molecule of the fluorescent dye is 2 or more. Item 3. The resin particle for fluorescent dye labeling according to Item 1 or 2, wherein
[項５]
前記樹脂の電荷を持つ置換基がアミノ基を含む項１〜４のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 5]
Item 5. The fluorescent dye labeling resin particle according to any one of Items 1 to 4, wherein the substituent having a charge of the resin contains an amino group.
[項６]
前記蛍光色素の電荷を持つ置換基がスルホ基を含む項１〜５のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 6]
Item 6. The fluorescent dye labeling resin particle according to any one of Items 1 to 5, wherein the substituent having a charge of the fluorescent dye contains a sulfo group.
[項７]
前記蛍光色素が、ボディーピー（ＢＯＤＩＰＹ）系色素、ローダミン系色素、スクアリリウム系色素又は芳香族炭化水素系色素である項１〜６のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 7]
Item 7. The fluorescent dye labeling resin particle according to any one of Items 1 to 6, wherein the fluorescent dye is a body pea (BODIPY) dye, a rhodamine dye, a squarylium dye, or an aromatic hydrocarbon dye.
[項８]
前記樹脂がポリスチレンを主鎖とするものであり、前記蛍光色素がローダミン系色素である項１〜７のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 8]
Item 8. The resin particle for fluorescent dye labeling according to any one of Items 1 to 7, wherein the resin has polystyrene as a main chain, and the fluorescent dye is a rhodamine dye.
[項９]
前記樹脂がポリスチレンを主鎖とするものであり、前記蛍光色素が芳香族炭化水素系色素である項１〜７のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 9]
Item 8. The resin particle for fluorescent dye labeling according to any one of Items 1 to 7, wherein the resin has polystyrene as a main chain, and the fluorescent dye is an aromatic hydrocarbon dye.
[項１０]
アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが更に結合された項１〜９のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子。
[Section 10]
Item 10. The resin particle for fluorescent dye labeling according to any one of Items 1 to 9, wherein avidin, streptavidin or biotin is further bound thereto.
[項１１]
（１）単官能モノマーとしてメタクリル酸グリシジル及び４−アミノスチレン並びに多官能ポリマーとしてジビニルベンゼンを用いて重合させて樹脂を得る工程であって、メタクリル酸グリシジルの重量（Ａ）と４−アミノスチレンの重量（Ｂ）及びジビニルベンゼンの重量（Ｃ）が、
（ｉ）ＡとＢとＣの合計に対してＢとＣの合計が、３３〜６７％、かつ
（ｉｉ）ＢとＣの合計に対してＣが、２０％〜８０％
である工程、及び
（２）前記（１）の工程で得られる樹脂が有するアミノ基と蛍光色素が有する負電荷を持つ置換基とを共有結合以外で結合させる工程
を含む項１〜９のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子の製造方法。
[Section 11]
(1) A step of polymerizing glycidyl methacrylate and 4-aminostyrene as monofunctional monomers and divinylbenzene as a polyfunctional polymer to obtain a resin, wherein the weight (A) of glycidyl methacrylate and 4-aminostyrene The weight (B) and the weight (C) of divinylbenzene are
(I) The sum of B and C is 33 to 67% with respect to the sum of A, B and C, and (ii) C is 20% to 80% with respect to the sum of B and C
And (2) any one of Items 1 to 9 including a step of bonding the amino group of the resin obtained in the step of (1) and a negatively charged substituent of the fluorescent dye other than by a covalent bond A method for producing a resin particle for fluorescent dye labeling according to claim 1.
[項１２]
前記（１）及び（２）の工程に、更に
（３）前記（２）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子のメタクリル酸グリシジル由来のエポキシ基をアミノ基へ変換する工程、
（４）前記（３）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子のアミノ基にポリエチレングリコールリンカーを結合する工程、及び
（５）前記（４）の工程で結合したポリエチレングリコールリンカーにアビジン、ストレプトアビジン又はビオチンを結合する工程
を含む項１０に記載の色素標識用樹脂粒子の製造方法。
[Section 12]
The step of (1) and (2), further (3) the step of converting the epoxy group derived from glycidyl methacrylate of the resin particle for fluorescent dye labeling obtained in the step of (2) to an amino group,
(4) a step of binding a polyethylene glycol linker to the amino group of the fluorescent dye-labeling resin particles obtained in the step (3), and (5) avidin and streptoid to the polyethylene glycol linker bound in the step (4). Item 11. The method for producing resin particles for dye labeling according to Item 10, comprising a step of binding avidin or biotin.
[項１３]
検出対象物質認識用抗体及び項１０に記載の蛍光色素標識用樹脂粒子を含む組織免疫染色用キット。
[Section 13]
A tissue immunostaining kit comprising a detection target substance recognizing antibody and the fluorescent dye labeling resin particles according to Item 10.
項１〜１０の蛍光色素標識用樹脂粒子を用いて組織切片の免疫染色を行えば、キシレンで透徹を行っても、組織切片中の検出対象物質上で固定化されている蛍光色素の溶出を防止することができる。その結果、輝点の位置及び強度にバラツキがなく、蛍光顕微鏡観察を行った場合、鮮明な染色像が得られ、良好な判定精度が得られる。 When immunostaining a tissue section using the fluorescent dye-labeled resin particles of Items 1 to 10, elution of the fluorescent dye immobilized on the detection target substance in the tissue section is performed even if the tissue section is cleared with xylene. Can be prevented. As a result, there is no variation in the position and intensity of the bright spot, and when a fluorescence microscope observation is performed, a clear stained image is obtained and good determination accuracy is obtained.
また、項１１〜１２の製造方法によれば、上記の効果を有する蛍光色素標識用樹脂粒子を製造することができ、項１３の組織免疫染色用キットによれば、組織切片の検出対象物質が鮮明に染色され、良好な判定精度の永久標本を得ることができる。 Moreover, according to the manufacturing method of claim | items 11-12, the resin particle for fluorescent dye label | markers which has said effect can be manufactured, and according to the tissue immunostaining kit of claim | item 13, the detection target substance of a tissue slice is It is possible to obtain a permanent specimen that is vividly stained and has a good determination accuracy.
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されな
い。
１．本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子は、
『樹脂からなる樹脂粒子に蛍光色素が共有結合以外で結合された蛍光色素標識用樹脂粒子であって、
（１）前記樹脂がスチレン、メタクリル酸アルキル及びアクリロニトリルからなる群より選ばれる少なくとも１つの単官能モノマーから形成される構成単位を含み、かつその構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられていること、又は、前記樹脂が単官能モノマーとしてのメタクリル酸から形成される構成単位を含んでいること、
（２）前記樹脂の架橋度が５０％以上であること、及び
（３）前記蛍光色素が前記樹脂の有する電荷を持つ置換基の電荷とは反対の電荷を持つ置換基を有すること』
を特徴とする蛍光色素標識用樹脂粒子。
である。
Hereinafter, although the form for implementing this invention is demonstrated, this invention is not limited to these.
1. Resin particle for fluorescent dye labeling of the present invention The resin particle for fluorescent dye labeling of the present invention is
“Fluorescent dye labeling resin particles in which a fluorescent dye is bonded to resin particles made of resin other than covalent bonds,
(1) The resin includes a structural unit formed of at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of styrene, alkyl methacrylate and acrylonitrile, and at least a part of hydrogen contained in the structural unit has a charge. Substituted with a substituent, or the resin contains a structural unit formed from methacrylic acid as a monofunctional monomer,
(2) The degree of crosslinking of the resin is 50% or more, and (3) the fluorescent dye has a substituent having a charge opposite to that of the substituent having the charge of the resin.
Fluorescent dye labeling resin particles characterized by
It is.
（樹脂）
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子を構成する樹脂は、スチレン、メタクリル酸アルキル及びアクリロニトリルからなる群より選ばれる少なくとも１つの単官能モノマーから形成される構成単位を含み、かつその構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられているものである。又は、前記樹脂は、単官能モノマーとしてのメタクリル酸から形成される構成単位を含んでいるものである。
(resin)
The resin constituting the resin particle for fluorescent dye labeling of the present invention includes and is included in at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of styrene, alkyl methacrylate and acrylonitrile. At least a part of hydrogen is replaced by a charged substituent. Or the said resin contains the structural unit formed from the methacrylic acid as a monofunctional monomer.
スチレン、メタクリル酸アルキル、アクリロニトリルは、それぞれ、１分子中に重合に関与するビニル基（Ｃ＝Ｃ結合）を１個持つ単官能モノマーである。メタクリル酸アルキルの例としては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル等がある。本発明における樹脂は、これらの少なくとも１つの単官能モノマーから形成される構成単位を有し、かつその構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられている。 Styrene, alkyl methacrylate, and acrylonitrile are monofunctional monomers each having one vinyl group (C═C bond) involved in polymerization in one molecule. Examples of alkyl methacrylates include methyl methacrylate and ethyl methacrylate. The resin in the present invention has a structural unit formed from at least one monofunctional monomer, and at least a part of hydrogen contained in the structural unit is replaced with a substituent having a charge.
又、メタクリル酸も、１分子中に重合に関与するビニル基（Ｃ＝Ｃ結合）を１個持つ単官能モノマーである。この場合、メタクリル酸から形成される構成単位は、下記で説明する電荷を持つ置換基の一つであるカルボキシル基を有している。 Methacrylic acid is also a monofunctional monomer having one vinyl group (C═C bond) involved in polymerization in one molecule. In this case, the structural unit formed from methacrylic acid has a carboxyl group which is one of substituents having a charge described below.
ここで電荷を持つ置換基とは、水と接触させたときに電荷を持つという意味である。正電荷を持つ置換基の例としては、アミノ基（水と接触させたときに、−ＮＨ3 +）が代表的であり、他の例として、芳香族アミノ基、含窒素複素環（ピリジニル基、トリアゾリル基等）、ヒドラジニル基等（いずれも水と接触させたときに、窒素原子が正電荷を持つ）が挙げられる。負電荷を持つ置換基の例としては、スルホ基（水と接触させたときに、−ＳＯ3 -）が代表的であり、他の例として、フォスフォリル基、フェノール性水酸基、カルボキシル基等（いずれも、水と接触させたときに、酸素原子が負電荷を示す）が挙げられる。 Here, the substituent having a charge means that it has a charge when brought into contact with water. As an example of the positively charged substituent, an amino group (-NH 3 + when contacted with water) is typical, and as another example, an aromatic amino group, a nitrogen-containing heterocyclic ring (pyridinyl group). , Triazolyl group, etc.), hydrazinyl group, etc. (all nitrogen atoms have a positive charge when brought into contact with water). A typical example of a negatively charged substituent is a sulfo group (—SO 3 − when contacted with water), and other examples include a phosphoryl group, a phenolic hydroxyl group, a carboxyl group, etc. And oxygen atoms show a negative charge when brought into contact with water).
また、「その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられている」とは、前記の単官能モノマーから形成される構成単位の中の水素原子の１個以上が電荷を持つ置換基に置き換えられていることを意味する。そして、本発明における樹脂は、樹脂を構成する構成単位の内の一部の構成単位が、前記の「その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられている」構成単位であればよく、他に、そのような電荷を持つ置換基に置き換えられていない構成単位を含んでいてもよいことは言うまでもない。 In addition, “at least a part of hydrogen contained in the structural unit is replaced by a charged substituent” means that one or more hydrogen atoms in the structural unit formed from the monofunctional monomer are It means being replaced by a charged substituent. In the resin according to the present invention, a part of the structural units constituting the resin has the above-mentioned “at least a part of hydrogen contained in the structural unit is replaced with a charged substituent”. Needless to say, it may be a structural unit, and may contain a structural unit that is not replaced by such a charged substituent.
このような他の構成単位の例としては、メタクリル酸グリシジル（１分子中に重合に関与するビニル基（Ｃ＝Ｃ結合）を１個持つ）から形成される構成単位である。この場合、末端にエポキシ基を有する樹脂が得られ、それを更にアミノ基へ変換することによって、市販のポリエチレングリコールリンカー等を付けることができ好適である。 Examples of such other structural units are structural units formed from glycidyl methacrylate (having one vinyl group (C = C bond) involved in polymerization in one molecule). In this case, a resin having an epoxy group at the terminal is obtained, and by converting it to an amino group, a commercially available polyethylene glycol linker or the like can be attached.
本発明における樹脂の製造方法は特に限定されないが、通常、「スチレン、メタクリル酸アルキル及びアクリロニトリルからなる群より選ばれる少なくとも１つの単官能モノマー」の水素原子が前記の電荷を持つ置換基に置き換えられた単官能モノマーを含むモノマーを重合させて得られる。この場合の少なくとも１つの水素原子が前記の電荷を持つ置換基に置き換えられた単官能モノマーとしては、例えばスチレンの場合はベンゼン環の水素原子がこのように置き換えられたもの、例えばアミノスチレン、例えばメタクリル酸アルキルの場合はエステル結合しているアルキル基の水素原子がこのように置き換えられたもの、例えばメタクリル酸2-アミノエチル、メタクリル酸2-(ジメチルアミノ)エチル、例えばアクリロニトリルの場合はビニル基（Ｃ＝Ｃ結合）に結合している水素原子がこのように置き換えられたもの、例えば３‐アミノアクリロニトリル等があり、これらは市販されている。この場合、他のモノマーを加えて重合させてもよく、例えば、適切な架橋度を得るために、多官能モノマー（１分子中に重合に関与するビニル基（Ｃ＝Ｃ結合）を２個以上持つ）を加えてもよい。この場合の多官能モノマーとしては、例えば、ジビニル化合物（ジビニルベンゼン、１，５−ヘキサジエン−３−イン、ヘキサトリエン、ジビニルエーテル、ジビニルスルホン、等）、ジアリル化合物（フタル酸アリル、２，６−ジアクリルフェノール、ジアリルカルビノール）等がある。重合方法は特に制限はなく、例えば、ラジカル重合、イオン重合（アニオン重合、他）、その他、合目的的な方法であればよい。 The method for producing the resin in the present invention is not particularly limited. Usually, the hydrogen atom of “at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of styrene, alkyl methacrylate and acrylonitrile” is replaced with the above-mentioned substituent having a charge. It is obtained by polymerizing a monomer containing a monofunctional monomer. In this case, the monofunctional monomer in which at least one hydrogen atom is replaced with the above-mentioned charged substituent is, for example, in the case of styrene, the one in which the hydrogen atom of the benzene ring is replaced in this way, such as aminostyrene, for example, In the case of alkyl methacrylate, the hydrogen atom of the alkyl group having an ester bond is replaced in this way, for example, 2-aminoethyl methacrylate, 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate, such as vinyl group in the case of acrylonitrile. There are those in which the hydrogen atom bonded to (C═C bond) is replaced in this way, such as 3-aminoacrylonitrile, which are commercially available. In this case, another monomer may be added and polymerized. For example, in order to obtain an appropriate degree of cross-linking, two or more polyfunctional monomers (two or more vinyl groups (C═C bonds) involved in the polymerization in one molecule) are used. You may add). Examples of the polyfunctional monomer in this case include divinyl compounds (divinylbenzene, 1,5-hexadiene-3-yne, hexatriene, divinyl ether, divinylsulfone, etc.), diallyl compounds (allyl phthalate, 2,6- Diacrylphenol, diallylcarbinol) and the like. The polymerization method is not particularly limited, and may be any suitable method such as radical polymerization, ionic polymerization (anionic polymerization, etc.), and the like.
本発明における樹脂を構成する主鎖の好ましい例としては、ポリスチレン、すなわち少なくともスチレン又はアミノスチレンが原料モノマーとして用いられている重合体が挙げられる。前記ポリスチレンの具体例としては、メタクリル酸グリシジル、４−アミノスチレンおよびジビニルベンゼンの架橋共重合体、好ましくはそれらの原料モノマーを後述する製造方法において規定されているような割合で用いることにより得られる架橋共重合体が挙げられる。 Preferable examples of the main chain constituting the resin in the present invention include a polymer in which polystyrene, that is, at least styrene or aminostyrene is used as a raw material monomer. A specific example of the polystyrene is obtained by using a crosslinked copolymer of glycidyl methacrylate, 4-aminostyrene and divinylbenzene, preferably using such raw material monomers in a proportion as defined in the production method described later. A crosslinked copolymer is mentioned.
本発明における樹脂を構成する主鎖の他の好ましい例としては、ポリアクリロニトリルおよびポリメタクリル酸メチルが挙げられる。
なお、前記に従って得られる本発明の樹脂は、多くの場合、熱可塑性樹脂である。
Other preferred examples of the main chain constituting the resin in the present invention include polyacrylonitrile and polymethyl methacrylate.
In many cases, the resin of the present invention obtained according to the above is a thermoplastic resin.
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子の粒径は、目的とする組織切片の免疫染色に適した粒径であれば特に限定されないが、通常１０〜５００ｎｍであり、好ましくは、５０〜２００ｎｍである。また、粒径のはらつきを示す変動係数も特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。このような粒径の樹脂は、上記のモノマーの重合（共重合）を行って樹脂を製造する際に、撹拌条件で反応を行う等の方法によって得ることができ、遠心分離等の方法によって回収することができる（後記の実施例を参照）。なお、蛍光色素標識用樹脂粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、蛍光色素標識用樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。蛍光色素標識用樹脂粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば１０００個）の蛍光色素標識用樹脂粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。 The particle size of the fluorescent dye-labeled resin particles of the present invention is not particularly limited as long as it is a particle size suitable for immunostaining of a target tissue section, but is usually 10 to 500 nm, preferably 50 to 200 nm. . Further, the coefficient of variation indicating the variation in particle diameter is not particularly limited, but is usually 20% or less, preferably 5 to 15%. The resin having such a particle size can be obtained by a method such as performing a reaction under stirring conditions when the resin is produced by polymerizing (copolymerizing) the above monomers, and recovered by a method such as centrifugation. (See Examples below). In addition, the particle diameter of the resin particles for fluorescent dye labeling is obtained by taking an electron micrograph using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of the resin particles for fluorescent dye labeling, and calculating the corresponding value. It can be measured as the diameter (area circle equivalent diameter). The average (average particle diameter) and coefficient of variation of the particle size of the group of resin particles for fluorescent dye labeling are as described above for a sufficient number (for example, 1000) of resin particles for fluorescent dye labeling. Then, the average particle diameter is calculated as its arithmetic average, and the coefficient of variation is calculated by the formula: 100 × standard deviation of particle diameter / average particle diameter.
（架橋度）
本発明における樹脂は、架橋度が５０％以上であり、更に、より適切な強度の樹脂を得るという点から、好ましくは架橋度が６０％〜１００％である。ここで架橋度とは、キシレン溶解試験で溶解されなかった樹脂量の比率（％）であり、具体的には、次の通りである。
(Crosslinking degree)
The resin in the present invention has a crosslinking degree of 50% or more, and preferably has a crosslinking degree of 60% to 100% from the viewpoint of obtaining a resin having a more appropriate strength. Here, the degree of cross-linking is the ratio (%) of the amount of resin not dissolved in the xylene dissolution test, and is specifically as follows.
サンプルの一定量（ｗ１）（例えば、０．１ｇ）をあらかじめ質量を測定した４００メッシュのステンレス金網（ｗ２）で包み、キシレン１００ｍｌ中で１２０℃２４時間抽出する。その後、ステンレス金網を取り出し、８０℃１６時間真空乾燥して質量（ｗ３）を測定し、以下の計算式で架橋度を算出する（後記の実施例を参照）。
架橋度（％）＝[（ｗ３−ｗ２）／ｗ１]×１００
A certain amount (w1) (for example, 0.1 g) of the sample is wrapped in a 400-mesh stainless wire mesh (w2) whose mass has been measured in advance, and extracted in 100 ml of xylene at 120 ° C. for 24 hours. Thereafter, the stainless steel wire mesh is taken out, vacuum-dried at 80 ° C. for 16 hours, the mass (w3) is measured, and the degree of crosslinking is calculated by the following calculation formula (see Examples described later).
Crosslinking degree (%) = [(w3-w2) / w1] × 100
（蛍光色素）
本発明における蛍光色素は、本発明における樹脂の有する電荷を持つ置換基の電荷とは反対の電荷を持つ置換基を有している。ここで電荷を持つ置換基の定義は前記で述べた通りである。本発明における樹脂と蛍光色素は、これらの反対の電荷を持つ置換基によって静電結合していると考えられ、共有結合以外で結合している。ここで、共有結合以外で結合しているとは、樹脂と蛍光色素が実質的に共有結合以外で結合しているということを意味し、樹脂と蛍光色素の結合の一部に共有結合による結合が含まれている場合を除外するものではない。すなわち、本発明における樹脂と蛍光色素との結合は、全ての結合が上記の反対の電荷を持つ置換基による静電結合である場合だけでなく、これらの静電結合に加え、その結合の一部に共有結合、その他の静電結合以外の結合が含まれていてもよい。異なる分子を混合・反応させた場合に、意図した混合生成物・反応生成物以外にも副次的な少量の生成物が意図せずに生じてしまうことは、化学的実験において起こりうると一般的に考えられているとおりである。本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子では、通常、樹脂１分子に結合する蛍光色素分子の８０％以上、好ましくは９０％以上が上記の反対の電荷を持つ置換基によって静電結合している。なお、この値は、樹脂の原料（単官能モノマー、多官能モノマー、等）の化学構造、蛍光色素の化学構造から、両者を反応させた場合に、静電結合が導入される数、共有結合、その他の結合が導入される数を理論的に導き出した割合である。本願実施例１〜５の場合は、理論的には、樹脂１分子に結合する蛍光色素分子の１００％が上記の静電結合である。
(Fluorescent dye)
The fluorescent dye of the present invention has a substituent having a charge opposite to the charge of the substituent having the charge of the resin of the present invention. Here, the definition of the substituent having a charge is as described above. The resin and fluorescent dye in the present invention are considered to be electrostatically bonded by substituents having the opposite charges, and are bonded by other than a covalent bond. Here, being bonded by means other than covalent bonds means that the resin and the fluorescent dye are substantially bonded by means other than covalent bonds, and covalent bonding is part of the bond between the resin and the fluorescent dye. It does not exclude the case where is included. That is, the bond between the resin and the fluorescent dye in the present invention is not limited to the case where all the bonds are electrostatic bonds due to the above-mentioned substituent having the opposite charge, but in addition to these electrostatic bonds, The part may contain a bond other than a covalent bond and other electrostatic bonds. It is common in chemical experiments that when a different molecule is mixed and reacted, a small amount of byproduct other than the intended mixed product / reaction product may unintentionally occur. As expected. In the fluorescent dye-labeled resin particles of the present invention, usually 80% or more, preferably 90% or more of the fluorescent dye molecules bonded to one resin molecule are electrostatically bonded by the above-mentioned substituent having the opposite charge. This value is based on the chemical structure of the resin raw material (monofunctional monomer, polyfunctional monomer, etc.) and the chemical structure of the fluorescent dye. It is the ratio that theoretically derived the number of other bonds introduced. In the case of Examples 1 to 5 of the present application, theoretically, 100% of the fluorescent dye molecules that bind to one resin molecule are the above-described electrostatic bonds.
樹脂の重合体と蛍光色素の分子の上記置換基による結合の実施方法（反応方法）は特に限定されるものではなく、樹脂の原料であるモノマーに蛍光色素を結合させた後にモノマーを重合させる方法、重合体を製造した後に該重合体に蛍光色素を結合させる方法、モノマーと蛍光色素とを混合して重合と蛍光色素の結合を同時に行う方法、その他合目的的な方法を用いればよい（後記の実施例を参照）。 The method (reaction method) for bonding the polymer of the resin and the molecule of the fluorescent dye with the above substituents is not particularly limited, and the method of polymerizing the monomer after binding the fluorescent dye to the monomer that is the raw material of the resin A method of bonding a fluorescent dye to the polymer after the polymer has been prepared, a method of mixing a monomer and a fluorescent dye and simultaneously combining the polymerization and the fluorescent dye, and other suitable methods may be used (described later). See Examples).
（蛍光色素の例）
本発明における蛍光色素は、その分子中に前記の電荷を持つ置換基を有する蛍光色素であれば特に制限をうけず、一般に入手又は作製できるものが使用可能である。このような蛍光色素の分子は、例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子、等の中から選択することができる。あるいはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子等の中から選択することができる。このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
(Example of fluorescent dye)
The fluorescent dye in the present invention is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye having a substituent having the above charge in the molecule, and those which can be generally obtained or produced can be used. Such fluorescent dye molecules include, for example, rhodamine dye molecules, squarylium dye molecules, cyanine dye molecules, aromatic hydrocarbon dye molecules, oxazine dye molecules, carbopyronine dye molecules, pyromesene dye molecules, etc. You can choose from. Alternatively, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, Cy (registered trademark, manufactured by GE Healthcare) dye molecule, DY dye molecule (registered trademark) , DYOMICS), HiLyte (registered trademark, manufactured by Anaspec) dye molecule, DyLight (registered trademark, manufactured by Thermo Scientific) dye molecule, ATTO (registered trademark, manufactured by ATTO-TEC) dye molecule MFP (registered trademark, manufactured by Mobitec) type dye molecule, and the like. The generic names of such dye molecules are named based on the main structure (skeleton) in the compound or the registered trademark, and the range of fluorescent dyes belonging to each is appropriate for those skilled in the art without undue trial and error. Can be grasped.
本発明では、上記のような色素分子の中から電荷を有する置換基を持つ特定の色素分子を選定し使用することができ、また、これらの色素分子の中の特定の色素分子に電荷を有する置換基を導入して使用することもできる。中でも、ボディーピー（ＢＯＤＩＰＹ）系色素、ローダミン系色素、スクアリウム系色素または芳香族炭化水素系色素が好ましく、たとえば樹脂がポリスチレンである場合は、ローダミン系色素または芳香族炭化水素系色素が特に好ましい。 In the present invention, a specific dye molecule having a charged substituent can be selected from the dye molecules as described above, and a specific dye molecule in these dye molecules has a charge. It can also be used by introducing a substituent. Of these, body pea (BODIPY) dyes, rhodamine dyes, squalium dyes, and aromatic hydrocarbon dyes are preferable. For example, when the resin is polystyrene, rhodamine dyes or aromatic hydrocarbon dyes are particularly preferable.
電荷を有する置換基の導入方法は特に制限はなく、一般に用いられている方法、例えば、スルホ基を導入する場合には、硫酸、発煙硫酸、クロロ硫酸等をスルホン化剤に用いて蛍光色素分子をスルホン化する方法、その他が使用可能である。 There is no particular limitation on the method for introducing a substituent having a charge, and a commonly used method, for example, when introducing a sulfo group, sulfuric acid, fuming sulfuric acid, chlorosulfuric acid or the like is used as a sulfonating agent to form a fluorescent dye molecule. A method of sulfonating, etc. can be used.
ローダミン系色素分子の具体例としては、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、テキサスレッド、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、ＬＤ７００ ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、などが挙げられる。 Specific examples of rhodamine dye molecules include 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, Texas Red, Spectrum Red, LD700 PERCHLORATE. , Etc.
スクアリリウム系色素分子の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ ６８０−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ， ｂｉｓ、１，３−Ｂｉｓ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］−２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ， ｂｉｓ、２−（４−（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（４−（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−４−（４−（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，５−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、２−（８−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１，２，３，５，６，７−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ−９−ｙｌ）−４−（８−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１，７，７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，３，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ−９（５Ｈ）−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ−１−ｅｎｏｌａｔｅ、などが挙げられる。 Specific examples of the squarylium-based dye molecule include SRfluor 680-Carboxylate, 1,3-Bis [4- (dimethylamino) -2-hydroxyphenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydride, bis, 1,3-Bis dimethylyl)) phenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 2- (4- (Diethylamino) -2-hydroxyphenyl) -4- (4- (dithylimino) -2-hydroxy-hydroxy) -2-hydroxypropyl oxocyclobut-1-enolat 2- (4- (Dibutylamino) -2-hydroxyphenyl) -4- (4- (dibutylimino) -2-hydroxycyclohexa-2,5-dienylidene) -3-oxycyclobut-1-enolate, 2- (8-Hydroxy- 1,1,7,7-tetramethyl-1,2,3,5,6,7-hexahydropyrido [3,2,1-ij] quinolin-9-yl) -4- (8-hydroxy-1,1, 7,7-tetramethyl-2,3,6,7-tetrahydro-1H-pyrido [3,2,1-ij] quinolinium-9 (5H) -ylidene) -3-oxocyclobut-1-enolate That.
シアニン系色素分子の具体例としては、１−Ｂｕｔｙｌ−２−［５−（１−ｂｕｔｙｌ−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３ｅｉｔｉ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１−Ｂｕｔｙｌ−２−［５−（１−ｂｕｔｙｌ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｃｈｌｏｒｏ−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３−Ｅｔｈｙｌ−２−［５−（３−ｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）−ｐｅｎｔａ−１，３−ｄｉｅｎｙｌ］−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−３−ｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、などが挙げられる。 Specific examples of the cyanine dye molecule include 1-Butyl-2- [5- (1-butyl-1,3-dihydro-3,3-dimethyl-2H-indol-2-ylidene) -penta-1,3. -Dienyl] -3,3-dimethyl-3 eiti-indolium hexafluorophosphate, 1-Butyl-2- [5- (1-butyyl-3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) -3- chloro-penta-1,3-dienyl] -3,3-dimethyl-3H-indolelium hexafluorophosphate, 3-Ethyl-2- [5- (3-ethyl-3H-benzothiazol-2-ylidene) ) -Penta-1,3-dienyl] -benzothiazol-3-ium iodide, and the like.
芳香族炭化水素系色素分子の具体例としては、Ｎ, Ｎ−Ｂｉｓ−（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）−ｐｅｒｙｌｅｎ−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄ ｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４：９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４，９，１０−ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ−３,４,９,１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'−[（８，１６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−８,１６−ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−２,１０−ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc ａｃｉｄ、２，１０−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−８,１６−ｄｉｏｎｅ、２，１０−Ｂｉｓ（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ−８,１６−ｄｉｏｎｅ, ３，３'−[（８，１６−Ｄｉｈｙｄｒｏ−８,１６−ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ−２,１０−ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７−ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２−ｃｄｅ−］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ−５−１０−Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−５,１０−ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２−ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ−１６,１７−ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ４，４'，４''，４'''−[[２，９−ｂｉｓ[２，６−ｂｉｓ(１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]−１,２,３,８,９,１０−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１,３,８,１０−ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、 ４，４'，４''，４'''−［［２，９−ｂｉｓ［２，６−ｂｉｓ（１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−１,２,３,８,９,１０−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１,３,８,１０−ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−］、などが挙げられる。 Specific examples of the aromatic hydrocarbon dye molecule include N, N-Bis- (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12- (4-tert-butylphenoxy) -perylene-3,4,9. , 10-tetracarbodiimide, N, N′-Bis (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12-tetraphenylperylene-3, 4: 9,10-tetracarbodiimide, N, N′-Bis (2,6 -Diisopropylphenyl) perylene-3,4,9,10-bis (dicarbide), 16, N, N'-Bis (2,6-dimethylphenyl) perylene-3,4,9,10-tetracarb xylic diimide, 4,4 '-[(8,16-Dihydro-8,16-dioxodibenzo [a, j] perylene-2,10-diyl) dioxy] dibutylic acid, 2,10-Dihydroxy-dibenzo [a, j ] perylene-8,16-dione, 2,10-Bis (3-aminopropoxy) dibenzo [a, j] perylene-8,16-dione, 3,3 '-[(8,16-Dihydr-8,16- dioxodibenzo [a, j] perylene-2,10-diyl) dioxy] dipropylamine, 17-BIS (Octyloxy) Anthra [9,1,2-cde-] Benzo [RST] Pentaphene-5-10-Dione, Octade canoicacid, 5,10-dihydro-5,10-dioxoanthra [9,1,2-cde] benzo [rst] pentaphene-16,17-diylester, Dihydroxydibenzanthrone, Benzenesulfonic acid, 4,4 ', 4' ''-[[2,9-bis [2,6-bis (1-methylethyl) phenyl] -1,2,3,8,9,10-hexahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra [2, 1,9-def: 6,5,10-d'e'f '] diisoquinoline-5,6,12,13-tetrayl] tetrakis (oxy)] tetrakis-, Benzenethanamine, 4, 4', 4 '', 4 '' '-[[2,9-bis [2, 6-bis (1-methylethyl) phenyl] -1,2,3,8,9,10-hexahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra [2,1,9-def: 6,5,10-d 'e'f'] diisoquinoline-5,6,12,13-tetrayl] tetrakis (oxy)] tetrakis [N, N, N-trimethyl-] and the like.
オキサジン系色素分子の具体例としては、Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ、Ｏｘａｚｉｎｅ１７０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、Ｎｉｌｅ Ｂｌｕｅなどが挙げられる。
カルボピロニン系色素分子の具体例としては、ＣＡＲＢＯＰＹＲＯＮＩＮ １４９などが挙げられる。
Specific examples of the oxazine dye molecule include Cresyl violet, Oxazine 170, EVOblue 30, Nile Blue and the like.
Specific examples of the carbopyronine dye molecule include CARBOPPYRONIN 149.
ピロメセン系色素分子の具体例としては、ＰＹＲＲＯＭＥＴＨＥＮＥ６５０などが挙げられる。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系色素分子の具体例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０など（以上インビトロジェン社製）が挙げられる。
Specific examples of the pyromesene dye molecule include PYRROMETHENE650.
Specific examples of the Alexa Fluor dye molecule include Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 635 , Alexa Fluor 750 and the like (manufactured by Invitrogen).
ＢＯＤＩＰＹ系色素分子の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）などが挙げられる。 Specific examples of the BODIPY dye molecules include BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, 3061 , BODIPY 650/665 (manufactured by Invitrogen) and the like.
Ｃｙ系色素分子の具体例としては、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（以上ＧＥヘルスケア社製）などが挙げられる。
ＤＹ系色素分子の具体例としては、ＤＹ−５９０、ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３４（以上ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、などが挙げられる。
Specific examples of the Cy-based dye molecule include Cy3.5, Cy5, and Cy5.5 (manufactured by GE Healthcare).
Specific examples of the DY dye molecule include DY-590, DY-610, DY-615, DY-630, DY-631, DY-632, DY-633, DY-634 (manufactured by DYOMICS). Can be mentioned.
ＨｉＬｙｔｅ系色素分子の具体例としては、ＨｉＬｙｔｅ５９４、ＨｉＬｙｔｅＦｌｕｏｒ ＴＲ（以上アナスペック社製）などが挙げられる。
ＤｙＬｉｇｈｔ系色素分子の具体例としては、ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ６３３（以上サーモサイエンティフィック社製）などが挙げられる。
Specific examples of the HiLyte dye molecule include HiLyte 594, HiLyte Fluor TR (manufactured by Anaspec).
Specific examples of the DyLight type dye molecule include DyLight 594, DyLight 633 (manufactured by Thermo Scientific).
ＡＴＴＯ系色素分子の具体例としては、ＡＴＴＯ５９０、ＡＴＴＯ６１０、ＡＴＴＯ６２０、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６５５など（以上ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）が挙げられる。 Specific examples of the ATTO dye molecule include ATTO590, ATTO610, ATTO620, ATTO633, ATTO655, and the like (manufactured by ATTO-TEC).
ＭＦＰ系色素分子の具体例としては、ＭＦＰ５９０、ＭＦＰ６３１（以上Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）などが挙げられる。
その他色素としては、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＡＰＣ−ＸＬ、ＮｏｒｔｈｅｒｎＬｉｇｈｔｓ６３７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、等が挙げられる。
また、これらの誘導体（蛍光色素として機能しうるもの、例えば、公知の誘導体）を挙げることができる。
Specific examples of MFP dye molecules include MFP590, MFP631 (manufactured by Mobitec) and the like.
Examples of other dyes include C-Phycocyanin, Phycocyanin, APC (Allophycocyanin), APC-XL, and NorthernLights 637 (manufactured by R & D Systems).
Moreover, these derivatives (what can function as a fluorescent dye, for example, a well-known derivative) can be mentioned.
上記の色素分子は、電荷を持つ置換基を有している場合はそのまま使用することができる。また、電荷を持つ置換基を有しない場合や更に電荷を持つ置換基を増やす場合には、前記の通り、必要な置換基を導入して使用する。この場合、本発明における樹脂と蛍光色素は、キシレンで透徹を行った場合に蛍光色素の溶出が防止される程度に強く結合している必要がある。従って、例えば、樹脂が正電荷を持つ置換基を有しており、蛍光色素が負電荷を持つ置換基を有しているものを用いる場合には、蛍光色素１分子中の前記負電荷を持つ置換基の数が分子量４００当たり１以上（蛍光色素１分子中の負電荷を持つ置換基の数を蛍光色素の分子量で割った値が１／４００以上）であることが好ましく、又は、蛍光色素１分子中の前記負電荷を持つ置換基の数が２以上であることが好ましい。このような好ましい蛍光色素の例として、蛍光色素テキサスレッド（「スルホローダミン１０１」、シグマアルドリッチ社）（分子式Ｃ31Ｈ30Ｎ2Ｏ7Ｓ2、分子量６０６．７１）が挙げられる。この色素は、負電荷を持つスルホ基を１分子中に２個有しており、その数は分子量４００当たり１．３２と算出される。 The dye molecule can be used as it is when it has a charged substituent. When there is no charged substituent or when the number of charged substituents is increased, necessary substituents are introduced and used as described above. In this case, it is necessary that the resin and the fluorescent dye in the present invention are strongly bonded to such an extent that the elution of the fluorescent dye is prevented when it is permeated with xylene. Therefore, for example, when the resin has a positively charged substituent and the fluorescent dye has a negatively charged substituent, the resin has the negative charge in one molecule of the fluorescent dye. The number of substituents is preferably 1 or more per 400 molecular weight (a value obtained by dividing the number of substituents having a negative charge in one molecule of the fluorescent dye by the molecular weight of the fluorescent dye is 1/400 or more), or the fluorescent dye The number of the negatively charged substituents in one molecule is preferably 2 or more. An example of such a preferred fluorescent dye is the fluorescent dye Texas Red (“sulforhodamine 101”, Sigma-Aldrich) (molecular formula C 31 H 30 N 2 O 7 S 2 , molecular weight 606.71). This dye has two negatively charged sulfo groups in one molecule, and the number is calculated to be 1.32 per 400 molecular weight.
（免疫染色）
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子は、組織切片の検出対象物質の免疫染色に用いることができる。例えば、特定の抗原（検出対象物質）に対して免疫染色を行う際には、蛍光色素標識用樹脂粒子と１次抗体を直接結合した標識（コンジュゲート）を作製し、抗原を染色する方法（１次抗体法）、蛍光色素標識用樹脂粒子と２次抗体を直接結合した標識を作製し、抗原に１次抗体を結合したものを染色する方法（２次抗体法）、蛍光色素標識用樹脂粒子とビオチン（あるいはアビジン又はストレプトアビジン）を直接結合した標識を作製し、抗原に１次抗体とアビジン又はストレプトアビジン（あるいはビオチン）修飾した２次抗体を結合したものを染色する方法（ビオチン−アビジン法またはサンドイッチ法）等を用いることができる。
(Immunostaining)
The fluorescent dye-labeled resin particles of the present invention can be used for immunostaining of a substance to be detected on a tissue section. For example, when immunostaining is performed on a specific antigen (substance to be detected), a label (conjugate) in which a fluorescent dye-labeled resin particle and a primary antibody are directly bound is prepared, and the antigen is stained ( Primary antibody method), a method in which a fluorescent dye-labeled resin particle and a secondary antibody are directly bound, and a method in which a primary antibody bound to an antigen is stained (secondary antibody method), a fluorescent dye-labeled resin A method of preparing a label in which particles and biotin (or avidin or streptavidin) are directly bound, and staining a antigen-bound primary antibody and a secondary antibody modified with avidin or streptavidin (or biotin) (biotin-avidin) Method or sandwich method).
従って、本発明では、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが更に結合された蛍光色素標識用樹脂粒子を含むものである。
免疫染色に用いる１次抗体はいかなるものでも構わず、免疫染色を行ないたい対象によって変わる。例えばＨＥＲ２を抗原とする免疫染色を行なう場合には、抗ＨＥＲ２抗体を用いる。また、２次抗体は如何なるものを用いても構わず、１次抗体によって変わる。例えば抗マウス・ウサギ（ラビット）・牛・ヤギ・羊・犬・チキン抗体が挙げられる。
Therefore, the present invention includes fluorescent dye labeling resin particles to which avidin, streptavidin or biotin is further bound.
Any primary antibody may be used for immunostaining, and it varies depending on the subject to be immunostained. For example, when performing immunostaining using HER2 as an antigen, an anti-HER2 antibody is used. In addition, any secondary antibody may be used, and varies depending on the primary antibody. Examples include anti-mouse, rabbit (rabbit), cow, goat, sheep, dog, and chicken antibodies.
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子と抗体やビオチンの結合は既存の如何なる方法を用いても構わない。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を用いることができる。 Any existing method may be used for binding the fluorescent dye-labeled resin particles of the present invention to an antibody or biotin. For example, amidation by reaction of amine and carboxylic acid, sulfidation by reaction of maleimide and thiol, imination by reaction of aldehyde and amine, amination by reaction of epoxy and amine can be used.
なお、上記の免疫染色は、組織染色に限定されるものではなく、細胞染色に適用するこ
とも可能である。また、検出の対象とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存
在するものであれば特に限定されるものではない。典型的には、上記のように抗原および
抗体の組み合わせが用いられるが、例えば、核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレ
オチド）およびそれに相補的に結合しうる配列を有する核酸分子の組み合わせを用いるこ
とも可能である。
The immunostaining described above is not limited to tissue staining, and can also be applied to cell staining. Further, the biological substance to be detected is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to the biological substance exists. Typically, a combination of an antigen and an antibody is used as described above. For example, a combination of a nucleic acid molecule (oligonucleotide, polynucleotide) and a nucleic acid molecule having a sequence capable of complementary binding thereto can be used. It is.
２．本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子の製造方法
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子は、前記の通り特に製造方法は制限されないが、好ましい製造方法の一例は次の通りである。すなわち、
『（１）単官能モノマーとしてメタクリル酸グリシジル及び４−アミノスチレン並びに多官能ポリマーとしてジビニルベンゼンを用いて重合させて樹脂を得る工程であって、メタクリル酸グリシジルの重量（Ａ）と４−アミノスチレンの重量（Ｂ）及びジビニルベンゼンの重量（Ｃ）が、
（ｉ）ＡとＢとＣの合計に対してＢとＣの合計が、３３〜６７％、かつ
（ｉｉ）ＢとＣの合計に対してＣが、２０％〜８０％
である工程、及び
（２）前記（１）の工程で得られる樹脂が有するアミノ基と蛍光色素が有する負電荷を持つ置換基とを共有結合以外で結合させる工程
を含む本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子の製造方法』
である。
2. Method for Producing Fluorescent Dye Labeling Resin Particles of the Present Invention The production method of the fluorescent dye labeling resin particles of the present invention is not particularly limited as described above, but an example of a preferred production method is as follows. That is,
[(1) A step of obtaining a resin by polymerizing glycidyl methacrylate and 4-aminostyrene as monofunctional monomers and divinylbenzene as a polyfunctional polymer, wherein the weight (A) of glycidyl methacrylate and 4-aminostyrene Weight (B) and divinylbenzene weight (C),
(I) The sum of B and C is 33 to 67% with respect to the sum of A, B and C, and (ii) C is 20% to 80% with respect to the sum of B and C
And (2) the fluorescent dye label of the present invention comprising the step of binding the amino group of the resin obtained in the step (1) and the negatively charged substituent of the fluorescent dye other than by a covalent bond Manufacturing method for resin particles ”
It is.
前記（１）の工程で、（ｉ）及び（ｉｉ）の条件の割合で架橋共重合させることによって、架橋度が５０％以上、好ましくは６０％〜１００％となり、本発明の効果（キシレンで透徹を行っても、組織切片中の検出対象物質上で固定化されている蛍光色素の溶出を防止することができる）を達成するために、適切な強度の樹脂が得られる。前記（１）の工程の架橋共重合は、例えば、通常用いられているラジカル重合、イオン重合（アニオン重合、他）、その他、合目的的な方法で行うことができる。 In the step (1), by performing cross-linking copolymerization at a ratio of the conditions (i) and (ii), the degree of cross-linking is 50% or more, preferably 60% to 100%. Even if the penetration is performed, it is possible to prevent elution of the fluorescent dye immobilized on the detection target substance in the tissue section), and thus a resin having an appropriate strength can be obtained. The cross-linking copolymerization in the step (1) can be performed by, for example, a generally used radical polymerization, ionic polymerization (anionic polymerization, etc.), and other appropriate methods.
また、前記（２）の工程は、単官能モノマーに含まれる４−アミノスチレンの正電荷を持つアミノ基と蛍光色素に含まれる負電荷を持つ置換基を結合させる工程である。前記（２）の工程は、前記（１）の工程と別の工程として実施してもよいし、前記（１）の工程と一体的な工程として同時に実施してもよい。前者の場合、前記（２）の工程は通常、前記（１）の工程が完了した後に、得られた重合体樹脂（その粒子の分散液）と負電荷を持つ置換基を有する蛍光色素（その水溶液）とを混合する実施形態をとる。後者の場合、前記（２）の工程は、負電荷を持つ置換基を有する蛍光色素を前記（１）の工程に用いられる原料モノマーにあらかじめ添加しておくような実施形態をとることもできるし、前記（１）の工程の途中で、重合体樹脂の粒子が形成されつつある反応液に負電荷を持つ置換基を有する蛍光色素を添加するような実施形態をとることもできる。なお、後者の場合、一部または全部の４−アミノスチレンと前記蛍光色素とが、重合体樹脂の生成前に共有結合以外の結合で結合してもよい（そのような場合であっても「前記（１）の工程で得られる重合体樹脂が有するアミノ基と蛍光色素が有する負電荷を持つ置換基とを共有結合以外の結合で結合させる」ことが行われていることになると解する）。 The step (2) is a step of bonding a positively charged amino group of 4-aminostyrene contained in the monofunctional monomer and a negatively charged substituent contained in the fluorescent dye. The step (2) may be performed as a step separate from the step (1), or may be performed simultaneously as a step integrated with the step (1). In the former case, the step (2) is usually performed after the step (1) is completed, and the obtained polymer resin (dispersion liquid of the particles) and a fluorescent dye having a negatively charged substituent (therefore) An aqueous solution) is taken. In the latter case, the step (2) can take an embodiment in which a fluorescent dye having a negatively charged substituent is added in advance to the raw material monomer used in the step (1). In the middle of the step (1), an embodiment may be adopted in which a fluorescent dye having a substituent having a negative charge is added to a reaction solution in which particles of a polymer resin are being formed. In the latter case, a part or all of 4-aminostyrene and the fluorescent dye may be bonded with a bond other than a covalent bond before the production of the polymer resin (even in such a case, “ (It is understood that "the amino group of the polymer resin obtained in the step (1) and the negatively charged substituent of the fluorescent dye are bonded by a bond other than a covalent bond"). .
本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子の更に好ましい製造方法の一例は、
『前記（１）及び（２）の工程に加え、更に
（３）前記（２）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子のグリシジルメタクリレート由来のエポキシ基をアミノ基へ変換する工程、
（４）前記（３）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子のアミノ基にポリエチレングリコールリンカーを結合する工程、及び
（５）前記（４）の工程で結合したポリエチレングリコールリンカーにアビジン、ストレプトアビジン又はビオチンを結合する工程
を含む色素標識用樹脂粒子の製造方法』
である。この製造方法によれば、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが結合した好ましい色素標識用樹脂粒子が得られる。この場合、前記（３）の工程のエポキシ基のアミノ基への変換は、通常用いられている方法、例えば、前記（２）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子にアンモニア水を添加することにより行われる。また、前記（４）及び（５）の工程で使用するポリエチレングリコールリンカーは、例えば、サーモサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific K.K.）、その他から種々のものが市販されており、目的にあったものを用いることができ、その使用方法も市販されているポリエチレングリコールリンカーの説明書を参照することができる（後記の実施例を参照）。
An example of a more preferable method for producing the fluorescent dye labeling resin particles of the present invention is as follows:
“In addition to the steps (1) and (2), (3) a step of converting an epoxy group derived from glycidyl methacrylate of the resin particle for fluorescent dye labeling obtained in the step (2) to an amino group,
(4) a step of binding a polyethylene glycol linker to the amino group of the fluorescent dye-labeling resin particles obtained in the step (3), and (5) avidin and streptoid to the polyethylene glycol linker bound in the step (4). Method for producing dye-labeling resin particles including a step of binding avidin or biotin ”
It is. According to this production method, preferred dye-labeling resin particles to which avidin, streptavidin or biotin is bound can be obtained. In this case, the conversion of the epoxy group into the amino group in the step (3) is performed by a commonly used method, for example, adding ammonia water to the resin particles for fluorescent dye labeling obtained in the step (2). Is done. The polyethylene glycol linker used in the steps (4) and (5) is commercially available from Thermo Fisher Scientific KK and others. Can be used, and the instructions for use thereof can also be referred to the instructions of commercially available polyethylene glycol linkers (see Examples below).
３．本発明の組織免疫染色用キット
本発明の組織免疫染色用キットは、
『検出対象物質認識用抗体及びアビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが結合された本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子を含む組織免疫染色用キット』
である。
3. Kit for tissue immunostaining of the present invention Kit for tissue immunostaining of the present invention comprises
“Tissue immunostaining kit comprising antibody for recognizing detection target substance and resin particle for fluorescent dye labeling of the present invention to which avidin, streptavidin or biotin is bound”
It is.
キットに含まれるアビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが結合された本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子は前記で説明した通りである。検出対象物質認識用抗体は、試料とする組織切片等で検出対象とする物質を認識する抗体であり、該抗体には前記の本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子と結合するアジピン、ストレプトアジピン又はビオチンが結合している。また、本発明のキットは２次抗体法を用いたものでもよく、この場合は、キットには、検出対象物質認識用の１次抗体、これに結合する２次抗体でアジピン、ストレプトアジピン又はビオチンが結合しているもの、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが結合された本発明の蛍光色素標識用樹脂粒子（２次抗体に結合するもの）が含まれる。 The resin particles for fluorescent dye labeling of the present invention to which avidin, streptavidin or biotin contained in the kit is bound are as described above. The detection target substance recognizing antibody is an antibody that recognizes a substance to be detected in a tissue section or the like as a sample, and the antibody includes adipine, streptadipine or the like that binds to the fluorescent dye-labeled resin particles of the present invention. Biotin is bound. In addition, the kit of the present invention may use a secondary antibody method. In this case, the kit includes a primary antibody for recognizing a substance to be detected, a secondary antibody that binds thereto, adipine, streptadipine or biotin. And the fluorescent dye-labeled resin particles of the present invention to which avidin, streptavidin or biotin is bound (which binds to the secondary antibody).
本発明のキットを用いることによって、試料とする組織切片等で検出対象とする物質を蛍光免疫染色することができ、その組織切片等をキシレンで透徹する場合でも蛍光色素の溶出が防止され、検出対象物質が鮮明に染色され、良好な判定精度の永久標本を得ることができる。 By using the kit of the present invention, a substance to be detected can be fluorescently immunostained in a tissue section or the like as a sample, and even when the tissue section or the like is permeated with xylene, elution of the fluorescent dye is prevented and detected. The target substance is vividly stained, and a permanent specimen with good determination accuracy can be obtained.
［実施例１］Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素結合ポリスチレンナノ粒子
蛍光色素としてＴｅｘａｓ Ｒｅｄが結合されたポリスチレンナノ粒子を、以下のようなソープフリー乳化重合法により作製した。
[Example 1] Texas Red dye-bonded polystyrene nanoparticles Polystyrene nanoparticles to which Texas Red was bound as a fluorescent dye were prepared by the following soap-free emulsion polymerization method.
アルゴンバブリングした純水中５ｍＬにグリシジルメタクリレート（メタクリル酸グリシジル）（東京化成工業社製）０．１８ｇ、ジビニルベンゼン０．０５ｇ、蛍光色素Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１（シグマアルドリッチ製、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ色素）０．００２ｇおよび４−アミノスチレン（東京化成工業社製）０．０５ｇを加えた。撹拌しながら７０℃に昇温し、水溶性アゾ重合開始剤であるＶ−５０（和光純薬社性）を０．０１２ｇ加え、１２時間反応させた。反応液を１００００Ｇで２０分遠心分離し、粒子を回収した。回収した粒子を純水に分散し再度遠心分離で回収する事で精製を行なった。得られた粒子を過剰のアンモニア水に加え、粒子末端（グリシジルメタクリレート由来）のエポキシ基をアミノ基へと変換し、末端にアミノ基を持つＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素結合ポリスチレンナノ粒子を得た。 0.12 g of glycidyl methacrylate (glycidyl methacrylate) (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 0.05 g of divinylbenzene, fluorescent dye Sulforhodamine 101 (manufactured by Sigma Aldrich, Texas Red dye) 0.002 g and 4 -0.05 g of aminostyrene (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added. While stirring, the temperature was raised to 70 ° C., 0.012 g of water-soluble azo polymerization initiator V-50 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and reacted for 12 hours. The reaction solution was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes to collect particles. Purification was performed by dispersing the collected particles in pure water and collecting them again by centrifugation. The obtained particles were added to excess ammonia water, and the epoxy group at the end of the particle (derived from glycidyl methacrylate) was converted to an amino group to obtain Texas Red dye-bonded polystyrene nanoparticles having an amino group at the end.
得られた色素結合ナノ粒子を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｏｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基が付いた色素内包ナノを得た。 The obtained dye-binding nanoparticles were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM (PEG) was added to this solution to a final concentration of 10 mM. ) 12 (manufactured by Thermo Scientific, succinimidyl-[(N-maleidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester) was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. By performing washing by the same procedure three times, a dye-encapsulated nano with a maleimide group at the end was obtained.
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、色素結合ナノ粒子が有するマレイミド基に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。 On the other hand, streptavidin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was subjected to a thiol group addition treatment using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA), followed by filtration through a gel filtration column to form a maleimide group contained in the dye-binding nanoparticles. A bindable streptavidin solution was obtained.
上記の末端にマレイミド基が付いた色素結合ナノ粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去して、最終的にストレプトアビジンが結合したＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素結合ポリスチレンナノ粒子を得た。 The dye-binding nanoparticles having a maleimide group at the end and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM EDTA and allowed to react for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. After the obtained solution was concentrated with a centrifugal filter, unreacted streptavidin and the like were removed using a gel filtration column for purification, and finally Texas Red dye-bonded polystyrene nanoparticles bound with streptavidin were obtained.
［実施例２］ローダミン色素結合ポリアクリロニトリルナノ粒子
蛍光色素としてスルホローダミンBが結合されたポリアクリロニトリルナノ粒子を、実施例１と同様にソープフリー乳化重合法により作製した。すなわち、実施例１で用いたＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１に変えて、スルホローダミンB ナトリウム塩（シグマアルドリッチ製）を使用し、さらにアクリロニトリル０．１０ｇを添加するとともに、グリシジルメタクリレートの添加量を０．１０ｇに変更して作成した。
[Example 2] Rhodamine dye-bound polyacrylonitrile nanoparticles Polyacrylonitrile nanoparticles to which sulforhodamine B was bound as a fluorescent dye were prepared by the soap-free emulsion polymerization method in the same manner as in Example 1. That is, sulforhodamine 101 used in Example 1 was replaced with sulforhodamine B sodium salt (manufactured by Sigma Aldrich), acrylonitrile 0.10 g was further added, and the addition amount of glycidyl methacrylate was changed to 0.10 g. Created.
上記のようにして得られた色素結合ナノ粒子について、実施例１と同様にして、マレイミド基が結合した色素結合ナノ粒子を得て、最終的にストレプトアビジンが結合したローダミン色素結合ポリアクリロニトリルナノ粒子を得た。 For the dye-bonded nanoparticles obtained as described above, dye-bonded nanoparticles having maleimide groups bonded thereto were obtained in the same manner as in Example 1, and finally rhodamine dye-bonded polyacrylonitrile nanoparticles to which streptavidin was bonded. Got.
［実施例３］芳香族炭化水素系色素結合ポリアクリロニトリルナノ粒子
蛍光色素として芳香族炭化水素系色素（ペリレンジイミドスルホン酸誘導体）を次の通り準備した。N,N'-Bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3,4:9,10-tetracarboxdiimideを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。
[Example 3] Aromatic hydrocarbon dye-bonded polyacrylonitrile nanoparticles An aromatic hydrocarbon dye (perylene diimide sulfonic acid derivative) was prepared as a fluorescent dye as follows. N, N'-Bis (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3,4: 9,10-tetracarboxdiimide was treated with concentrated sulfuric acid to prepare a perylene diimide sulfonic acid derivative.
上記ペリレンジイミドスルホン酸誘導体が結合されたポリアクリロニトリルナノ粒子を、実施例１と同様にソープフリー乳化重合法により作製した。すなわち、実施例１で用いたＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１に変えて、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を使用し、さらにアクリロニトリル０．１０ｇを添加するとともに、グリシジルメタクリレートの添加量を０．１０ｇに変更して作成した。 The polyacrylonitrile nanoparticles to which the perylene diimide sulfonic acid derivative was bound were prepared by the soap-free emulsion polymerization method in the same manner as in Example 1. That is, instead of Sulforhodamine 101 used in Example 1, a perylene diimide sulfonic acid derivative was used, and 0.10 g of acrylonitrile was further added, and the addition amount of glycidyl methacrylate was changed to 0.10 g.
上記のようにして得られた色素結合ナノ粒子について、実施例１と同様にして、マレイミド基が結合した色素結合ナノ粒子を得て、最終的にストレプトアビジンが結合した芳香族炭化水素系色素結合ポリアクリロニトリルナノ粒子を得た。 With respect to the dye-bonded nanoparticles obtained as described above, dye-bonded nanoparticles having maleimide groups bonded thereto were obtained in the same manner as in Example 1, and finally aromatic hydrocarbon dye bonds to which streptavidin was bonded. Polyacrylonitrile nanoparticles were obtained.
［実施例４］芳香族炭化水素系色素結合ポリメタクリル酸ナノ粒子
N,N'-Bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3,4:9,10-tetracarboxdiimideを、既報のAngew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1528に従ってアミノエチルベンゼンで修飾し、ペリレンジイミドアンモニウム誘導体を作製した。
[Example 4] Aromatic hydrocarbon dye-bonded polymethacrylic acid nanoparticles
N, N'-Bis (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3,4: 9,10-tetracarboxdiimide was used in the previously published Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1528. Then, it was modified with aminoethylbenzene to prepare a perylene diimidoammonium derivative.
上記ペリレンジイミドアンモニウム誘導体が結合されたポリメタクリル酸ナノ粒子を、実施例３と同様にソープフリー乳化重合法により作製した。すなわち、実施例３で用いたペリレンジイミドスルホン酸誘導体に変えて、ペリレンジイミドアンモニウム誘導体を使用し、４−アミノスチレンに変えてメタクリル酸を使用し、アクリロニトリルに変えてメタクリル酸メチルを使用した。 The polymethacrylic acid nanoparticles to which the perylene diimidoammonium derivative was bound were prepared by a soap-free emulsion polymerization method in the same manner as in Example 3. That is, instead of the perylene diimide sulfonic acid derivative used in Example 3, a perylene diimide ammonium derivative was used, methacrylic acid was used instead of 4-aminostyrene, and methyl methacrylate was used instead of acrylonitrile.
上記のようにして得られた色素結合ナノ粒子について、実施例１と同様にして、マレイミド基が付いた色素内包ナノを得て、最終的にストレプトアジピンが結合した芳香族炭化水素系色素結合ポリメタクリル酸ナノ粒子を得た。 For the dye-bonded nanoparticles obtained as described above, a dye-encapsulated nano with a maleimide group was obtained in the same manner as in Example 1, and finally an aromatic hydrocarbon-based dye-bonded poly with a streptadipine bonded thereto. Methacrylic acid nanoparticles were obtained.
［実施例５］ローダミン色素結合ポリメタクリル酸メチルナノ粒子
蛍光色素としてスルホローダミンBが結合されたポリアクリロニトリルナノ粒子を、実施例１と同様にソープフリー乳化重合法により作製した。すなわち、実施例１で用いたＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１に変えて、スルホローダミンB ナトリウム塩（シグマアルドリッチ製）を使用し、４−アミノスチレンに変えて、メタクリル酸 2−（ジメチルアミノ）エチルエステル（東京化成工業）を使用した。
[Example 5] Rhodamine dye-bound polymethyl methacrylate nanoparticles Polyacrylonitrile nanoparticles bound with sulforhodamine B as a fluorescent dye were prepared by the soap-free emulsion polymerization method in the same manner as in Example 1. Specifically, sulforhodamine 101 used in Example 1 was replaced by sulforhodamine B sodium salt (manufactured by Sigma Aldrich), and 4-aminostyrene was used instead of methacrylic acid 2- (dimethylamino) ethyl ester (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). )It was used.
上記のようにして得られた色素結合ナノ粒子について、実施例１と同様にして、マレイミド基が結合した色素結合ナノ粒子を得て、最終的にストレプトアビジンが結合したローダミン色素結合ポリメタクリル酸メチルナノ粒子を得た。 For the dye-bonded nanoparticles obtained as described above, dye-bonded nanoparticles having maleimide groups bonded thereto were obtained in the same manner as in Example 1. Finally, rhodamine dye-bonded polymethyl methacrylate nanoparticles to which streptavidin was bonded were obtained. Particles were obtained.
［比較例］蛍光色素含有ポリスチレンナノ粒子
FluoSpheres（登録商標） Amine-Modified Microspheres, 0.2 μm, Red Fluorescent (580/605), 2% solids（インビトロジェン社製、型番F-8763）を用いて、実施例１と同様にして、マレイミド基が結合した色素結合ナノ粒子を得て、最終的にストレプトアビジンが結合した蛍光色素含有ポリスチレンナノ粒子を得た。なお、上記のFluoSpheres（登録商標） Amine-Modified Microspheres, 0.2 μm, Red Fluorescent (580/605), 2% solids（インビトロジェン社製、型番F-8763）は、ローダミン系色素を含有していると推測される。
[Comparative Example] Fluorescent dye-containing polystyrene nanoparticles
FluoSpheres (registered trademark) Amine-Modified Microspheres, 0.2 μm, Red Fluorescent (580/605), 2% solids (manufactured by Invitrogen, model number F-8763) was used to bind the maleimide group in the same manner as in Example 1. The dye-bonded nanoparticles were obtained, and finally, the fluorescent dye-containing polystyrene nanoparticles bound with streptavidin were obtained. The above FluoSpheres (registered trademark) Amine-Modified Microspheres, 0.2 μm, Red Fluorescent (580/605), 2% solids (manufactured by Invitrogen, model number F-8763) is presumed to contain a rhodamine dye. Is done.
［架橋度の測定］
サンプル約0.1 g（w1）をあらかじめ質量を測定した400メッシュのステンレス金網（w2）で包み，キシレン100 ml 中で120 ℃ 24 時間抽出する。その後ステンレス金網を取り出し，80 ℃ 16 時間真空乾燥して質量（w3）を測定し，以下の計算式で架橋度を算出した。
架橋度（％）＝[（w3 −w2）／w1]×100
[Measurement of degree of crosslinking]
About 0.1 g (w1) of the sample is wrapped in a 400-mesh stainless steel mesh (w2) that has been weighed in advance, and extracted in 100 ml of xylene at 120 ° C for 24 hours. After that, the stainless steel wire mesh was taken out and vacuum-dried at 80 ° C for 16 hours, and the mass (w3) was measured.
Crosslinking degree (%) = [(w3−w2) / w1] × 100
［免疫組織染色］
実施例１〜５で調製した蛍光色素結合ナノ粒子を用いて、ヒト***組織の免疫染色を行なった。染色切片はコスモ・バイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ−Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドをＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いて湿潤箱中で１時間ブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに希釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）（ベンタナ社製）を組織切片と２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で希釈したビオチン標識抗ウサギ抗体と３０分反応させた。さらに、実施例１〜５で調製した蛍光色素結合ナノ粒子と２時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系バッファ溶液中に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。
蛍光観察の写真を図１に示す。比較例と比較して、シャープな輝点が得られた。
[Immunohistochemical staining]
Immunostaining of human breast tissue was performed using the fluorescent dye-binding nanoparticles prepared in Examples 1-5. As a stained section, a tissue array slide (CB-A712) manufactured by Cosmo Bio was used. The tissue array slide was deparaffinized, washed with water, and autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 15 minutes to activate the antigen. The tissue array slide after the antigen activation treatment was washed with a PBS buffer, and then subjected to a blocking treatment in a wet box for 1 hour using a PBS buffer containing 1% BSA. After blocking treatment, anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (4B5) (manufactured by Ventana) diluted to 0.05 nM with PBS buffer containing 1% BSA was reacted with the tissue section for 2 hours. After washing with PBS, the mixture was reacted for 30 minutes with a biotin-labeled anti-rabbit antibody diluted with 1% BSA-containing PBS buffer. Furthermore, immunohistochemically stained sections were obtained by reacting with the fluorescent dye-binding nanoparticles prepared in Examples 1 to 2 for 2 hours and then washing. The obtained immunohistochemically stained section was immersed in a 4% neutral paraformaldehyde aqueous buffer solution for 10 minutes for fixation.
A photograph of fluorescence observation is shown in FIG. Compared with the comparative example, a sharp bright spot was obtained.
［形態染色］
上記のようにして固定処理した免疫組織化学染色切片に対してヘマトキシリン染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬し風乾させることにより透徹を行ったところ、二重染色切片が得られた。ヘマトキシリン染色は、後述の評価において影響は無かった。また、形態染色を行わない場合はエタノール浸漬とキシレン浸漬による透徹のみ行うことができ、形態染色を行う場合にさらにエオシン染色を追加することもできた。
[Morphological staining]
The immunohistochemically stained sections fixed as described above are stained with hematoxylin, and the stained sections are dehydrated by immersing them in ethanol, and the dehydrated sections are further immersed in xylene and air-dried. As a result, a double-stained section was obtained. Hematoxylin staining had no effect in the evaluation described below. Further, when morphological staining was not performed, only penetration by ethanol immersion and xylene immersion could be performed, and when morphological staining was performed, eosin staining could be further added.
[1細胞あたりの輝点数]
蛍光観察の写真を画像ソフトImageJで解析し、写真上の輝点をカウントした。一方、形態染色で得られた写真から、目視で細胞の数をカウントした。輝点のカウント数を細胞のカウント数で除して、1細胞あたりの輝点数を算出した。
[Number of bright spots per cell]
The photograph of fluorescence observation was analyzed with image software ImageJ, and the bright spots on the photograph were counted. On the other hand, the number of cells was counted visually from a photograph obtained by morphological staining. The number of bright spots per cell was calculated by dividing the count of bright spots by the count of cells.
[評価]
実施例１〜５で調製した蛍光色素結合ナノ粒子及び比較例で調製した蛍光色素含有ポリスチレンナノ粒子を用いて、上記の免疫組織染色を実施した結果を評価すると次の通りであった。
[Evaluation]
The results of performing the above immunohistological staining using the fluorescent dye-containing nanoparticles prepared in Examples 1 to 5 and the fluorescent dye-containing polystyrene nanoparticles prepared in Comparative Examples were as follows.
図１−１に示す通り、実施例1は比較例に比べて輝点が鮮明になった。すなわち実施例1は、輝点と輝点を見分けることができ、リング状に局在している様子が観察できており、比較例は輝点がにじんで他の輝点とを見分けることができなくなっている。乳がんとの関連性が知られているＨＥＲ2たんぱく質は、細胞膜に発現する。実施例1の輝点のリング状局在は、細胞の端にＨＥＲ2たんぱく質が存在していることを意味しており、診断上の有用な情報となる。一方、比較例（図1−2）は輝点がにじんでいるので、こうした判断ができなかった。課題であった「免疫染色により組織切片中の検出対象物質上で一旦固定化した蛍光色素がキシレンによってにじみ出てしまい、輝点の位置及び強度にバラツキを生じて判定精度が悪化する」という点が、明確に改善できたと考察する。
実施例２〜５は、実施例1と同様の輝点が観察された。
As shown in FIG. 1-1, the bright spot was clearer in Example 1 than in the comparative example. That is, in Example 1, the bright spot can be distinguished from the bright spot, and the appearance of being localized in a ring shape can be observed, and in the comparative example, the bright spot is blurred and can be distinguished from other bright spots. It is gone. HER2 protein, which is known to be associated with breast cancer, is expressed on the cell membrane. The ring-like localization of the bright spot in Example 1 means that the HER2 protein is present at the end of the cell, which is useful information for diagnosis. On the other hand, in the comparative example (FIGS. 1-2), such a judgment could not be made because the bright spot was blurred. The problem was that the fluorescent dye once immobilized on the detection target substance in the tissue section by immunostaining oozes out with xylene, resulting in variations in the position and intensity of the bright spot, and the judgment accuracy deteriorates. Think of it as a clear improvement.
In Examples 2 to 5, bright spots similar to those in Example 1 were observed.
Claims (13)
（１）前記樹脂がスチレン、メタクリル酸アルキル及びアクリロニトリルからなる群より選ばれる少なくとも１つの単官能モノマーから形成される構成単位を含み、かつその構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を持つ置換基に置き換えられていること、又は、前記樹脂が単官能モノマーとしてのメタクリル酸から形成される構成単位を含んでいること、
（２）前記樹脂の架橋度が５０％以上であること、及び
（３）前記蛍光色素が前記樹脂の有する電荷を持つ置換基の電荷とは反対の電荷を持つ置換基を有すること
を特徴とする蛍光色素標識用樹脂粒子。 Resin particles for fluorescent dye labeling in which a fluorescent dye is bonded to resin particles made of resin other than covalent bonds,
(1) The resin includes a structural unit formed of at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of styrene, alkyl methacrylate and acrylonitrile, and at least a part of hydrogen contained in the structural unit has a charge. Substituted with a substituent, or the resin contains a structural unit formed from methacrylic acid as a monofunctional monomer,
(2) The degree of crosslinking of the resin is 50% or more, and (3) the fluorescent dye has a substituent having a charge opposite to that of the substituent having the charge of the resin. Resin particles for fluorescent dye labeling.
（ｉ）ＡとＢとＣの合計に対してＢとＣの合計が、３３〜６７％、かつ
（ｉｉ）ＢとＣの合計に対してＣが、２０％〜８０％
である工程、及び
（２）前記（１）の工程で得られる樹脂が有するアミノ基と蛍光色素が有する負電荷を持つ置換基とを共有結合以外で結合させる工程
を含む請求項１〜９のいずれかに記載の蛍光色素標識用樹脂粒子の製造方法。 (1) A step of polymerizing glycidyl methacrylate and 4-aminostyrene as monofunctional monomers and divinylbenzene as a polyfunctional polymer to obtain a resin, wherein the weight (A) of glycidyl methacrylate and 4-aminostyrene The weight (B) and the weight (C) of divinylbenzene are
(I) The sum of B and C is 33 to 67% with respect to the sum of A, B and C, and (ii) C is 20% to 80% with respect to the sum of B and C
And (2) the step of binding the amino group of the resin obtained in the step of (1) and the negatively charged substituent of the fluorescent dye other than by a covalent bond. The manufacturing method of the resin particle for fluorescent dye labels in any one.
（３）前記（２）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子のメタクリル酸グリシジル由来のエポキシ基をアミノ基へ変換する工程、
（４）前記（３）の工程で得られる蛍光色素標識用樹脂粒子のアミノ基にポリエチレングリコールリンカーを結合する工程、及び
（５）前記（４）の工程で結合したポリエチレングリコールリンカーにアビジン、ストレプトアビジン又はビオチンを結合する工程
を含む請求項１０に記載の色素標識用樹脂粒子の製造方法。 The step of (1) and (2), further (3) the step of converting the epoxy group derived from glycidyl methacrylate of the resin particle for fluorescent dye labeling obtained in the step of (2) to an amino group,
(4) a step of binding a polyethylene glycol linker to the amino group of the fluorescent dye-labeling resin particles obtained in the step (3), and (5) avidin and streptoid to the polyethylene glycol linker bound in the step (4). The method for producing resin particles for dye labeling according to claim 10, comprising a step of binding avidin or biotin.
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