JP6099121B2 - Viral vector with improved gene transfer efficiency and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターに関する。また、本発明は、当該ウイルスベクターを用いた、遺伝子治療用の医薬組成物に関する。 The present invention relates to a viral vector having improved gene transfer efficiency for cells (particularly cancer cells). The present invention also relates to a pharmaceutical composition for gene therapy using the viral vector.
子宮体癌は、世界的にも発生患者数が増加しており、術後に有効な補助療法が必要とされる一方、若年者や未産婦に対しては手術以外の治療法の開発も望まれている。妊孕性の温存希望の患者の場合には、黄体ホルモン剤が使用され、十分な治療効果が得られるケースが多くないが、腫瘍が消失してその後に出産し再発も見られず経過した患者では、黄体ホルモン投与中の子宮体癌組織にがん抑制遺伝子産物ｐ５３が増加していることが確認されている。ｐ５３の生体内でのメカニズムについては十分に解明されておらず、ｐ５３が抗腫瘍効果に直接的に関与しているか、或いはｐ５３によって黄体ホルモンの作用が抗腫瘍効果を奏しやすいものに変化したのかは、明らかではないが、ｐ５３の発現が癌の治療効果に関わっていると考えられている。 Endometrial cancer is increasing in the number of patients worldwide, and effective adjuvant therapy is required after surgery. On the other hand, the development of treatments other than surgery is also desired for young people and premature women. It is rare. In patients who are fertile and want to preserve, progesterone is used, and there are not many cases where sufficient therapeutic effect is obtained, but the patient who passed after the tumor disappeared and gave birth and no recurrence It has been confirmed that the tumor suppressor gene product p53 is increased in endometrial cancer tissues during administration of luteinizing hormone. The mechanism of p53 in vivo has not been fully elucidated, and whether p53 is directly involved in the antitumor effect, or has p53 changed the action of lutein hormone to easily exhibit an antitumor effect? Although it is not clear, expression of p53 is thought to be related to the therapeutic effect of cancer.
黄体ホルモンが、エストロゲンの作用で増殖した正常の子宮内膜組織を分泌期の状態に変化させて細胞増殖を止める役割を果たすことが知られているが、子宮内膜細胞が癌化してできたと考えられる子宮体癌が黄体ホルモンによって増殖を停止する程度に影響を受ける場合は、培養細胞でも実際の症例検討でも稀である。黄体ホルモンの正常子宮内膜に対する増殖抑制と分泌期への移行作用には、エストロゲンが先に作用している条件下で現れることからも、ホルモンだけの作用でなく、細胞周期の制御を担っているｐ５３も関与していると考えられている。 It is known that progesterone plays a role in stopping normal cell growth by changing normal endometrial tissue proliferated by the action of estrogen into a secretory state. When the possible endometrial cancer is affected by progestational hormones, it is rare in cultured cells or in actual case studies. Lutein hormone suppresses the growth of normal endometrium and shifts to the secretory phase because it appears under conditions where estrogen is acting first, it is responsible not only for the hormone but also for the control of the cell cycle. P53 is also considered to be involved.
一方、癌の治療の試みとして遺伝子治療が１９９０年代からなされている。特に、アデノウイルスベクターを使用することにより、挿入遺伝子の発現量が他のベクターに比べて多く、また細胞の染色体に組み込まれないため安全性が高いと評価されている（非特許文献１−３参照）。しかしながら、遺伝子治療は、癌の治療への臨床的応用では期待されたほど効果が得られ難く、抗癌剤による化学療法との併用効果が報告されているものの（非特許文献４参照）、単独療法として確立するに至っていないのが現状である。有効な遺伝子治療が確立されていない要因として、癌細胞に対する遺伝子導入効率が低く、治療有効量の導入遺伝子を細胞内で発現できないことが挙げられる。このような従来技術を背景として、細胞内への遺伝子導入効率に優れ、遺伝子治療に有効なベクターを開発することが切望されている。 On the other hand, gene therapy has been performed since the 1990s as an attempt to treat cancer. In particular, by using an adenovirus vector, the expression level of the inserted gene is larger than that of other vectors, and since it is not integrated into the cell chromosome, it is evaluated that the safety is high (Non-patent Documents 1-3). reference). However, gene therapy is not as effective as expected in clinical application to cancer treatment, and although a combined effect with chemotherapy using an anticancer drug has been reported (see Non-Patent Document 4), it is a monotherapy. The current situation is that it has not been established. Factors for which effective gene therapy has not been established include low gene transfer efficiency for cancer cells and the inability to express a therapeutically effective amount of the transgene in the cells. Against the background of such conventional technology, it has been eagerly desired to develop a vector that is excellent in gene transfer efficiency into cells and is effective for gene therapy.
なお、従来、エストロゲン応答配列をアデノウイルスベクターに組み込むことにより、挿入遺伝子の発現をコントロールできることが報告されている。例えば、非特許文献５には、エストロゲン応答配列を含むプロモーターを導入したアデノウイルスベクターを使用することにより、エストロゲンレセプターを発現する細胞において挿入遺伝子の転写活性を向上できることが報告されている。また、特許文献１には、エストロゲン応答配列を組み込んだベクターを利用することによってベクターに挿入されたレポータータンパク質の発現量からエストロゲンの量を定量評価できることが報告されている。しかしながら、これらの技術において、エストロゲン応答配列は、挿入遺伝子の発現を制御するプロモーターの上流に配置されており、ベクター内で挿入遺伝子に付加された状態で存在するものではない。また、これらの技術は、あくまでエストロゲンレセプターの存在下でエンハンサーとして機能させる目的でエストロゲン応答配列を使用しているに過ぎず、エストロゲンレセプターの有無に拘わらず遺伝子導入効率を高めるために、エストロゲン応答配列を使用できるか、或いはどのような態様で使用できるかを示唆するものではない。 Conventionally, it has been reported that the expression of an inserted gene can be controlled by incorporating an estrogen response element into an adenovirus vector. For example, Non-Patent Document 5 reports that the use of an adenoviral vector into which a promoter containing an estrogen responsive element has been introduced can improve the transcriptional activity of the inserted gene in cells that express the estrogen receptor. Patent Document 1 reports that the amount of estrogen can be quantitatively evaluated from the expression level of a reporter protein inserted into a vector by using a vector incorporating an estrogen response element. However, in these techniques, the estrogen response element is located upstream of the promoter that controls the expression of the inserted gene, and does not exist in a state of being added to the inserted gene in the vector. In addition, these technologies only use an estrogen response element for the purpose of functioning as an enhancer in the presence of an estrogen receptor. In order to increase gene transfer efficiency regardless of the presence or absence of an estrogen receptor, an estrogen response element is used. It is not implied whether or not it can be used.
本発明は、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率を高めたウイルスベクターを提供することを目的とする。更に、本発明は、当該ウイルスベクターを使用し、癌をはじめとする各種疾患の遺伝子治療に有効な医薬組成物を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a viral vector having improved gene transfer efficiency for cells (particularly cancer cells). Furthermore, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition that uses the viral vector and is effective for gene therapy of various diseases including cancer.
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべくことに、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、細胞（特に、癌細胞）に対する遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。また、前記外来遺伝子として、ｐ５３遺伝子又はその変異体を使用する場合には、コドン７２がプロリンであればエストロゲン受容体を発現している細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に向上し、またコドン７２がアルギニンであればエストロゲン受容体を発現していない細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have surprisingly found that viral vectors incorporating a foreign gene to which an estrogen response element has been added are effective for gene transfer into cells (particularly cancer cells). Has been found to be significantly improved. In addition, when the p53 gene or a variant thereof is used as the foreign gene, if the codon 72 is proline, the gene transfer efficiency for cells expressing the estrogen receptor is significantly improved. It was found that arginine significantly improves gene transfer efficiency for cells that do not express estrogen receptors. The present invention has been completed by further studies based on this finding.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする、ウイルスベクター。
項２．外来遺伝子が癌抑制遺伝子である、項１に記載のウイルスベクター。
項３．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体である、項１又は２に記載のウイルスベクター。
項４．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしている、項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項５．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしている、項１乃至３のいずれかに記載のウイルスベクター。
項６．アデノウイルスベクターである、項１乃至５のいずれかに記載のウイルスベクター。
項７．外来遺伝子の５’末端にエストロゲン応答配列の３’末端に直接結合している、項１乃至６のいずれかに記載のウイルスベクター。
項８．項１乃至７のいずれかに記載のウイルスベクターを含む、医薬組成物。
項９．遺伝子治療に使用される、項８に記載の医薬組成物。
項１０．外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を含有するウイルスベクターを含み、癌の治療に使用される、項８又は９に記載の医薬組成物。
項１１．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がプロリンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有する癌患者に対して適用される、項１０に記載の医薬組成物。
項１２．外来遺伝子がｐ５３遺伝子又はその変異体であって、ｐ５３遺伝子又はその変異体のコドン７２がアルギニンをコードしており、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者を保有する癌患者に対して適用される、項１０に記載の医薬組成物。
項１３．エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる、融合遺伝子。
That is, this invention provides the invention of the aspect hung up below.
Item 1. A viral vector, wherein a foreign gene to which an estrogen response element is added is operably linked to a promoter.
Item 2. Item 2. The viral vector according to Item 1, wherein the foreign gene is a tumor suppressor gene.
Item 3. Item 3. The viral vector according to Item 1 or 2, wherein the foreign gene is p53 gene or a mutant thereof.
Item 4. Item 4. The viral vector according to any one of Items 1 to 3, wherein the foreign gene is the p53 gene or a variant thereof, and the codon 72 of the p53 gene or the variant encodes proline.
Item 5. Item 4. The viral vector according to any one of Items 1 to 3, wherein the foreign gene is the p53 gene or a variant thereof, and the codon 72 of the p53 gene or the variant encodes arginine.
Item 6. Item 6. The virus vector according to any one of Items 1 to 5, which is an adenovirus vector.
Item 7. Item 7. The viral vector according to any one of Items 1 to 6, which is directly linked to the 5 ′ end of the foreign gene and directly to the 3 ′ end of the estrogen responsive element.
Item 8. Item 8. A pharmaceutical composition comprising the viral vector according to any one of Items 1 to 7.
Item 9. Item 9. The pharmaceutical composition according to Item 8, which is used for gene therapy.
Item 10. Item 10. The pharmaceutical composition according to Item 8 or 9, comprising a viral vector containing the p53 gene or a variant thereof as a foreign gene, and used for the treatment of cancer.
Item 11. The foreign gene is p53 gene or a variant thereof, and the codon 72 of the p53 gene or variant thereof encodes proline and is applied to a cancer patient having a cancer cell expressing an estrogen receptor. Item 11. The pharmaceutical composition according to Item 10.
Item 12. The foreign gene is the p53 gene or a variant thereof, and the codon 72 of the p53 gene or the variant encodes arginine, and possesses cancer patients who do not have cancer cells expressing the estrogen receptor. Item 11. The pharmaceutical composition according to Item 10, which is applied to a cancer patient.
Item 13. A fusion gene comprising a p53 gene or a variant thereof to which an estrogen response element is added directly or via a linker sequence.
本発明のウイルスベクターによれば、外来遺伝子を効率的に細胞内に導入できるので、細胞の形質転換効率を向上させ、ひいては細胞内での外来遺伝子の発現量を増加させることができる。 According to the virus vector of the present invention, since a foreign gene can be efficiently introduced into a cell, the transformation efficiency of the cell can be improved, and consequently the expression level of the foreign gene in the cell can be increased.
とりわけ、本発明のウイルスベクターは、癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に優れており、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子等の癌抑制遺伝子を使用することにより、癌の遺伝子治療に好適に用いられる。また、本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を使用する場合、コドン７２がプロリンであればエストロゲン受容体を発現している癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に高く、またコドン７２がアルギニンであればエストロゲン受容体を発現していない癌細胞に対する遺伝子導入効率が顕著に高い。そのため、本発明のウイルスベクターにおいて外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を組み込んで癌の治療剤として使用する場合、癌患者の病因となっている癌細胞におけるエストロゲン受容体の発現の有無に応じて、ｐ５３遺伝子のコドン７２がコードするアミノ酸の種類を設定することにより、癌細胞のタイプに応じた最適な癌治療の方策を講じることが可能になる。 In particular, the viral vector of the present invention is remarkably excellent in gene transfer efficiency to cancer cells, and is suitably used for cancer gene therapy by using a tumor suppressor gene such as p53 gene as a foreign gene. In the virus vector of the present invention, when the p53 gene is used as a foreign gene, if the codon 72 is proline, the gene transfer efficiency to cancer cells expressing the estrogen receptor is remarkably high, and the codon 72 is arginine. Then, the gene transfer efficiency for cancer cells not expressing the estrogen receptor is remarkably high. Therefore, when the p53 gene is incorporated as a foreign gene in the viral vector of the present invention and used as a therapeutic agent for cancer, the p53 gene is expressed depending on the presence or absence of expression of the estrogen receptor in the cancer cell causing the cancer patient. By setting the type of amino acid encoded by codon 72, it is possible to take an optimal cancer treatment strategy according to the type of cancer cell.
１．ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列を付加した外来遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されていることを特徴とする。以下に、本発明のウイルスベクターについて、詳細に説明する。
1. Viral vector The viral vector of the present invention is characterized in that a foreign gene added with an estrogen response element is operably linked to a promoter. Hereinafter, the virus vector of the present invention will be described in detail.
本発明において、エストロゲン応答配列は、ＥＲＥ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）とも称される塩基配列であり、エストロゲンレセプターによって転写活性が調節される標的遺伝子の転写調節領域に存在し、エストロゲンとエストロゲンレセプターとの複合体が、該配列を認識することにより、エストロゲン依存的に標的遺伝子の転写を促進する機能を有している。本発明で使用されるエストロゲン応答配列としては、具体的には、ＰＳ２、ビテロゲニンA2、補体3遺伝子、ラクトフェリン等の遺伝子の５’上流領域に存在するＥＲＥが挙げられる。本発明で使用されるエストロゲン応答配列は、コンセンサス配列（５’−ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ−３’、ｎはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。；配列番号１）を１回以上含む塩基配列である。これらのエストロゲン応答配列は、野生型であってもよく、また遺伝子導入の促進作用を保持していることを限度として変異型であってもよい。本発明で使用されるエストロゲン応答配列の好適一例として、配列番号２に示す塩基配列（５’−ＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣ−３’）が挙げられる。また、本発明で使用されるエストロゲン応答配列の例として、配列番号１又は２に示す塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ外来遺伝子に対する導入促進作用を有する塩基配列が例示される。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列とは、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で４２℃でハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄する条件、又はこれと等価の条件を含む。 In the present invention, the estrogen responsive element is a base sequence also called ERE (Estrogen response element), exists in the transcriptional regulatory region of the target gene whose transcriptional activity is regulated by the estrogen receptor, and is a complex of estrogen and estrogen receptor. The body has a function of promoting transcription of a target gene in an estrogen-dependent manner by recognizing the sequence. Specific examples of the estrogen response element used in the present invention include ERE present in the 5 ′ upstream region of genes such as PS2, vitellogenin A2, complement 3 gene, and lactoferrin. The estrogen response element used in the present invention is a base sequence containing a consensus sequence (5′-GGTCAnnnTGACC-3 ′, n represents A, G, C, or T; SEQ ID NO: 1) one or more times. These estrogen responsive elements may be wild-type or mutated as long as they retain the gene transfer promoting action. A preferred example of the estrogen response element used in the present invention is the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (5′-GGTCATATAGGACC-3 ′). In addition, as an example of an estrogen responsive sequence used in the present invention, it hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and has an effect of promoting introduction into a foreign gene A base sequence is exemplified. Here, the base sequence that hybridizes under stringent conditions is 5 × SSPE (43.8 g / L NaCl, 6.9 g / L NaH 2 PO 4 .H 2 O and 1.85 g / L EDTA, NaOH. pH adjusted to 7.4) Hybridization at 42 ° C. in a solution containing 2 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 0.1 mg / ml salmon testis DNA, followed by 0.1 × SSPE, 1.0% SDS In the solution containing, the conditions of washing | cleaning at 42 degreeC or the conditions equivalent to this are included.
また、本発明で使用されるエストロゲン応答配列の一例として、配列番号２に示す塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、２つの塩基配列の間の最適アライメントを決定、比較することによって算定される。塩基配列の最適アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０））の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８））の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は検分によって、Ｓｍｉｔｈら（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１））の局所相同性アルゴリズムを用いて行うことができる。配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））ｏｙｏｂｉＳｈｐａｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３８：１７９−１９１（１９９６））に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｗｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に入手可能である。 Further, as an example of the estrogen responsive sequence used in the present invention, it is, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Examples include nucleotide sequences having identity. The identity of base sequences is calculated by determining and comparing the optimal alignment between two base sequences. Optimal alignment of the base sequence was determined by the homology alignment algorithm of Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)) by Pearson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)). Computer implementation of these algorithms by searching for similarity methods (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI by GAP, BESTFIT, FASTA, and TFAST), Smith et al. (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). This can be done using a homology algorithm. A suitable algorithm for measuring sequence similarity is the BLAST algorithm, which is described in Altschul (J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) oobiShpaer (Genomics 38: 179-191 (1996)). Has been. Software for performing BLAST analyzes is publicly available at the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
また、本発明において、エストロゲン応答配列が付加される外来遺伝子としては、タンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡが好適に使用され、当該外来遺伝子の種類については本発明のウイルスベクターの用途に応じて適宜設定される。例えば、本発明のウイルスベクターを医薬用途で使用する場合には、目的の疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡを使用すればよい。また、例えば、本発明のウイルスベクターを、薬効又は機能の評価、或いは薬剤スクリーニングの目的で使用する場合には、評価対象又はスクリーニングの候補物質となるタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡを使用すればよい。 In the present invention, as a foreign gene to which an estrogen responsive element is added, DNA encoding a protein or peptide is preferably used, and the type of the foreign gene depends on the use of the virus vector of the present invention. Set as appropriate. For example, when the virus vector of the present invention is used for pharmaceutical purposes, DNA encoding a protein or peptide effective for treating the target disease may be used. In addition, for example, when the viral vector of the present invention is used for the purpose of drug efficacy or function evaluation or drug screening, DNA encoding a protein or peptide that is an evaluation target or a candidate substance for screening should be used. That's fine.
本発明のウイルスベクターは、癌細胞に対する外来遺伝子の導入に適しているので、挿入される外来遺伝子としては、癌抑制遺伝子が好適に使用される。癌抑制遺伝子としては、具体的には、ｐ５３遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、インターロイキン−１２遺伝子、Ｂ７遺伝子、ＲＢ遺伝子(ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅ)、ＢＲＣＡ２遺伝子、ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）遺伝子等が挙げられる。これらの中でも、とりわけｐ５３遺伝子は、本発明のウイルスベクターによって癌細胞に対する導入効率が格段に向上するので、上記外来遺伝子として特に好適に使用される。ｐ５３遺伝子の塩基配列としては、具体的には、塩基配列３に示す塩基配列を含むものが挙げられる。 Since the viral vector of the present invention is suitable for introducing a foreign gene into cancer cells, a tumor suppressor gene is preferably used as the foreign gene to be inserted. Specific examples of the tumor suppressor gene include p53 gene, interferon γ gene, interleukin-2 gene, interleukin-12 gene, B7 gene, RB gene (retinoblastoma gene), BRCA2 gene, PTEN (phosphate phase and tensin homolog deleted). on-chromosome ten) gene and the like. Among these, the p53 gene is particularly preferably used as the foreign gene because the introduction efficiency into cancer cells is remarkably improved by the virus vector of the present invention. Specific examples of the base sequence of the p53 gene include those containing the base sequence shown in base sequence 3.
本発明のウイルスベクターにおいて、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子であっても、また野生型遺伝子に変異を加えられた変異型遺伝子であってもよい。例えば、導入する遺伝子が、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡである場合には、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個、或いは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。具体的には、変異遺伝子産物がアミノ酸の置換及び／又は挿入の変異を伴う場合であれば、その置換及び／又は挿入されたアミノ酸の数としては、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個が挙げられる。また、変異遺伝子産物がアミノ酸の欠失の変異を伴う場合であれば、その欠失されたアミノ酸の数としては、例えば、例えば１〜９０個、好ましくは１〜８５個、更に好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜７５個が挙げられる。変異遺伝子産物がアミノ酸の欠失の変異を伴う場合の好適な例として、Ｎ末端及びＣ末端側の少なくとも一方が末端欠失されているものが挙げられる。遺伝子産物であるタンパク質又はペプチドのＮ末端側を末端欠失させる場合、必要に応じて、当該タンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡの５’末端に開始コドンを挿入しておくことが望ましい。 In the viral vector of the present invention, the foreign gene to be inserted may be a wild type gene or a mutant gene obtained by adding a mutation to the wild type gene. For example, when the gene to be introduced is DNA encoding a protein or peptide effective for treatment of a disease, several or a plurality of amino acids in the amino acid sequence of the gene product are substituted, deleted, and It may be a mutant gene that is inserted and / or encodes a mutant gene product having a function equivalent to that of a wild-type gene product. Specifically, if the mutated gene product is accompanied by amino acid substitution and / or insertion mutation, the number of substituted and / or inserted amino acids is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 6. The number is more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2. Further, if the mutant gene product is accompanied by an amino acid deletion mutation, the number of deleted amino acids is, for example, 1 to 90, preferably 1 to 85, and more preferably 1 to 85, for example. 80, more preferably 1 to 75. Preferable examples in which the mutant gene product is accompanied by an amino acid deletion mutation include those in which at least one of the N-terminal and C-terminal is deleted. When the N-terminal side of a protein or peptide that is a gene product is deleted, it is desirable to insert a start codon at the 5 'end of the DNA encoding the protein or peptide, if necessary.
本発明において外来遺伝子としてｐ５３の変異型遺伝子を使用する場合、その好適な例として、配列番号３に示される塩基配列における１〜１６５位のｐ５３Ｎ末端側をコードしている領域、及び１１４４〜１１８２位のｐ５３Ｃ末端側をコードしている領域の内、少なくとも何れか一方、好ましくはこれらの双方を欠失している遺伝子が例示される。当該ｐ５３の変異型遺伝子として、配列番号３に示される塩基配列における１〜１６５位のｐ５３Ｎ末端側をコードしている領域を欠失させる場合には、１６６位の塩基の５’末端に開始コドンを付加しておくことが望ましい。 When a mutant gene of p53 is used as a foreign gene in the present invention, preferred examples thereof include a region encoding the p53 N-terminal side at positions 1 to 165 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and 1144 to 1182. Examples include genes lacking at least one of the regions encoding the p53C terminal side of the position, preferably both of them. In the case of deleting the region encoding p53 N-terminal side of positions 1 to 165 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 as the mutant gene of p53, the initiation codon is located at the 5 ′ end of the base at position 166. It is desirable to add.
また、本発明のウイルスベクターにおいて、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子の塩基配列に相補する塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ野生型遺伝子と同等の活性を有する遺伝子産物（タンパク質又はペプチド）をコードしているＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、前述する条件と同様である。更に、挿入される外来遺伝子は、野生型遺伝子の塩基配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、且つ野生型遺伝子と同等の活性を有する遺伝子産物（タンパク質又はペプチド）をコードしているＤＮＡであってもよい。ここで、塩基配列の「同一性」については、前述する算定法により求めることができる。 In the virus vector of the present invention, the inserted foreign gene hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene and has an activity equivalent to that of the wild-type gene. It may be a DNA encoding a product (protein or peptide). Here, the “stringent conditions” are the same as the conditions described above. Furthermore, the inserted foreign gene has, for example, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more identity to the base sequence of the wild-type gene, and It may be a DNA encoding a gene product (protein or peptide) having an activity equivalent to that of a wild type gene. Here, the “identity” of the base sequence can be determined by the aforementioned calculation method.
本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子を使用する場合、コドン７２（配列番号３における２１４〜２１６位の塩基配列）は野生型であるプロリンをコードしているもの（例えば、ＣＣＣ）であってもよく、また多型として高い頻度で認められるアルギニンをコードしているものであってもよい。本発明のウイルスベクターに組み込まれたｐ５３遺伝子のコドン７２がプロリンをコードしている場合、エストロゲン受容体を発現している癌細胞に対して、格段に優れた遺伝子導入効率を実現することができる。また、本発明のウイルスベクターに組み込まれたｐ５３遺伝子のコドン７２がアルギニンをコードしている場合、エストロゲン受容体を発現していない癌細胞に対して、格段に優れた遺伝子導入効率を実現することができる。 In the virus vector of the present invention, when the p53 gene is used as a foreign gene, codon 72 (base sequence at positions 214 to 216 in SEQ ID NO: 3) encodes wild-type proline (for example, CCC). It may also be one that encodes arginine that is frequently found as a polymorphism. When the codon 72 of the p53 gene incorporated in the virus vector of the present invention encodes proline, it is possible to achieve a particularly excellent gene transfer efficiency for cancer cells expressing the estrogen receptor. . In addition, when the codon 72 of the p53 gene incorporated in the virus vector of the present invention encodes arginine, a gene transfer efficiency that is extremely excellent for cancer cells that do not express the estrogen receptor can be realized. Can do.
本発明のウイルスベクターにおいて、外来遺伝子は、その５’末端（開始コドンの５’末端）にエストロゲン応答配列が付加されていればよい。外来遺伝子の５’末端とエストロゲン応答配列の３’末端が直接連結されていることが望ましいが、外来遺伝子の５’末端とエストロゲン応答配列の３’末端がリンカー配列（例えば、１〜２０塩基程度からなる塩基配列）を介して連結されていてもよい。ここで、リンカー配列とは、外来遺伝子とエストロゲン応答配列とを連結するために使用される任意の塩基配列であればよく、プロモーターやエンハンサー等の機能性を有する塩基配列は含まれない。外来遺伝子とエストロゲン応答配列とを連結するには、プライマー配列に含めPCRで増幅する方法等の公知の手法で行うことができる。 In the viral vector of the present invention, the foreign gene only needs to have an estrogen response element added to its 5 'end (5' end of the start codon). It is desirable that the 5 ′ end of the foreign gene and the 3 ′ end of the estrogen response element are directly linked, but the 5 ′ end of the foreign gene and the 3 ′ end of the estrogen response element are linker sequences (for example, about 1 to 20 bases) May be linked via a base sequence consisting of Here, the linker sequence may be any base sequence used for linking a foreign gene and an estrogen responsive sequence, and does not include a base sequence having functionality such as a promoter or an enhancer. Ligation between the foreign gene and the estrogen responsive element can be carried out by a known technique such as a method of amplification by PCR which is included in the primer sequence.
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子を、当該ウイルスベクターのプロモーターに作動可能に連結されていればよい。ここで、「作動可能」とは、プロモーターと外来遺伝子との間の機能的関係をいい、当該プロモーターによって外来遺伝子の転写がコントロールされる状態といえる。一般に、作動可能に連結している塩基配列は互いに隣接している。エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子をウイルスベクターに組み込むには、当該技術分野で公知の組み換え技術を使用して行うことができる。使用するウイルスベクターにマルチクローニングサイトが存在するのであれば、当該マルチクローニングサイトにエストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子を挿入すればよい。 The viral vector of the present invention only needs to be operably linked to a foreign gene promoter to which the estrogen response element has been added. Here, “operable” means a functional relationship between a promoter and a foreign gene, and it can be said that the transcription of the foreign gene is controlled by the promoter. In general, base sequences that are operably linked are adjacent to each other. Incorporation of a foreign gene to which an estrogen response element has been added into a viral vector can be performed using recombinant techniques known in the art. If the viral vector to be used has a multicloning site, a foreign gene with an estrogen response element added may be inserted into the multicloning site.
本発明のウイルスベクターは、エストロゲン応答配列が付加された外来遺伝子、及びプロモーター以外に、複製開始点、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー等を含んでいてもよい。 The viral vector of the present invention may contain a replication origin, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, a selectable marker, etc., in addition to a foreign gene to which an estrogen response element is added and a promoter. .
本発明のウイルスベクターの種類については、特に制限されず、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０等のウイルスベクターが挙げられる。これらのウイルスベクターの中でも、アデノウイルスベクターは、細胞内への外来遺伝子の導入効率が高く、ヒトの遺伝子治療に使用する場合であっても安全性が高いため、本発明において好適に使用される。 The type of the virus vector of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, and symbis virus vectors. And virus vectors such as Sendai virus vector and SV40. Among these viral vectors, adenoviral vectors are preferably used in the present invention because they have high efficiency of introducing foreign genes into cells and are highly safe even when used for human gene therapy. .
アデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１領域が欠失しているアデノウイルスベクター、Ｅ１及びＥ３領域が欠失しているアデノウイルスベクター、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４領域が欠失しているアデノウイルスベクター、又はヘルパー依存性アデノウイルスベクターであってもよい。 In the case of an adenovirus vector, an adenovirus vector in which the E1 region is deleted, an adenovirus vector in which the E1 and E3 regions are deleted, an adenovirus vector in which the E1, E2, E3, and E4 regions are deleted It may be a viral vector or a helper-dependent adenoviral vector.
本発明のウイルスベクターは、外来遺伝子の導入対象となる細胞に接触させることにより、細胞内に外来遺伝子を導入することができる。 The viral vector of the present invention can introduce a foreign gene into a cell by bringing it into contact with a cell to which a foreign gene is to be introduced.
本発明のウイルスベクターの適用対象となる細胞の種類は、特に制限されず、いかなる由来であってもよく、また正常細胞であっても、癌細胞であってもよい。とりわけ、本発明のウイルスベクターは、癌細胞内に外来遺伝子を導入するのに好適である。本発明のウイルスベクターの適用対象となる癌細胞としては、特に制限されないが、例えば、子宮体癌細胞、子宮頸癌細胞、大腸癌細胞、皮膚癌細胞等が挙げられる。これらの癌細胞の中でも、子宮体癌細胞は、外来遺伝子の導入効率を一層向上させ得るので、本発明において特に好適な適用対象細胞である。 The type of cell to which the viral vector of the present invention is applied is not particularly limited and may be derived from any source, and may be a normal cell or a cancer cell. In particular, the viral vector of the present invention is suitable for introducing foreign genes into cancer cells. The cancer cells to which the virus vector of the present invention is applied are not particularly limited, and examples thereof include endometrial cancer cells, cervical cancer cells, colon cancer cells, and skin cancer cells. Among these cancer cells, endometrial cancer cells are particularly suitable cells for application in the present invention because they can further improve the efficiency of introduction of foreign genes.
本発明のウイルスベクターを医薬用途で使用する場合には、遺伝子治療ベクターとして、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで細胞または組織に導入され得る。 When the viral vector of the present invention is used for pharmaceutical use, it can be introduced into a cell or tissue in vivo, in vitro, or ex vivo as a gene therapy vector.
本発明のウイルスベクターを細胞内に導入する方法としては、導入形式（インビボ、インビトロ、又はエクスビボ）、適用対象となる細胞の種類等に応じて適宜設定すればよく、通常のウイルスベクターと同じ条件を採用することができる。 The method for introducing the viral vector of the present invention into a cell may be appropriately set according to the introduction format (in vivo, in vitro, or ex vivo), the type of cell to be applied, etc., and the same conditions as those of a normal viral vector Can be adopted.
本発明のウイルスベクターは、組み込まれている外来遺伝子の種類に応じた各種の用途に使用される。例えば、疾患の治療に有効な外来遺伝子を使用している場合には、遺伝子治療用医薬として使用される。また、例えば、薬効又は機能の評価が求められている外来遺伝子を使用している場合には、薬効又は機能の評価のための試験材料として使用される。また、例えば、薬剤スクリーニングの候補物質をコードしている外来遺伝子を使用している場合には、薬剤スクリーニングのためのスクリーニングツールとして使用される。 The viral vector of the present invention is used for various purposes depending on the type of foreign gene incorporated. For example, when a foreign gene effective for treatment of a disease is used, it is used as a drug for gene therapy. In addition, for example, when a foreign gene for which evaluation of drug efficacy or function is required is used, it is used as a test material for evaluation of drug efficacy or function. For example, when a foreign gene encoding a candidate substance for drug screening is used, it is used as a screening tool for drug screening.
２．融合遺伝子
本発明は、更に、エストロゲン応答配列が直接又はリンカー配列を介して付加されたｐ５３遺伝子又はその変異体からなる融合遺伝子を提供する。当該融合遺伝子は、ウイルスベクターに挿入され、癌の遺伝子治療に使用することができる。当該融合遺伝子に使用されるエストロゲン配列、ｐ５３遺伝子又はその変異体、リンカー配列等については、前述する通りである。また、当該融合遺伝子が挿入されるウイルスベクターの種類等についても、前述する通りである。
2. Fusion gene The present invention further provides a fusion gene comprising a p53 gene or a variant thereof to which an estrogen response element is added directly or via a linker sequence. The fusion gene can be inserted into a viral vector and used for cancer gene therapy. The estrogen sequence, p53 gene or variant thereof, linker sequence and the like used for the fusion gene are as described above. The type of virus vector into which the fusion gene is inserted is also as described above.
３．医薬組成物
上記ウイルスベクターが、外来遺伝子として、疾患の治療に有効な外来遺伝子（例えば、疾患の治療に有効なタンパク質又はペプチドをコードしているＤＮＡ、或いは疾患の治療に有効なｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに転写されるＤＮＡ等）を含む場合には、上記ウイルスベクターは、医薬組成物として提供することができる。即ち、当該医薬組成物は遺伝子治療の用途で使用される。
3. Pharmaceutical composition The viral vector is a foreign gene effective as a foreign gene (eg, a DNA encoding a protein or peptide effective in treating a disease, or a miRNA or pre-effective in treating a disease). When it contains miRNA or DNA transcribed into pri-miRNA), the viral vector can be provided as a pharmaceutical composition. That is, the pharmaceutical composition is used for gene therapy.
特に、上記ウイルスベクターは癌細胞に対する導入効率が高いことを鑑みれば、当該医薬組成物は、癌の治療用途に好適に使用される。癌の治療用途に使用する場合には、外来遺伝子として癌抑制遺伝子を含む上記ウイルスベクターを使用すればよい。癌抑制遺伝子としては、ｐ５３遺伝子又はその変異体が特に好適に使用される。また、当該医薬組成物を癌の治療用途に使用する場合、その対象となる癌については、特に制限されず、例えば、子宮体癌、子宮頸癌、大腸癌、皮膚癌等が挙げられる。これらの癌の中でも、好ましくは子宮体癌が例示される。 In particular, in view of the high introduction efficiency of the viral vector into cancer cells, the pharmaceutical composition is suitably used for cancer treatment. When used for cancer treatment, the above viral vector containing a tumor suppressor gene as a foreign gene may be used. As the tumor suppressor gene, the p53 gene or a mutant thereof is particularly preferably used. Moreover, when using the said pharmaceutical composition for the treatment use of cancer, it does not restrict | limit especially about the cancer used as the object, For example, endometrial cancer, cervical cancer, colon cancer, skin cancer etc. are mentioned. Among these cancers, preferably endometrial cancer is exemplified.
また、外来遺伝子としてｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用する場合、コドン７２がコードするアミノ酸の種類と導入対象となる癌細胞のタイプによって遺伝子導入効率が変わり得るので、癌の治療効果を高めるために、癌患者が保有する癌細胞のエストロゲン受容体の発現の有無に応じて、５３遺伝子又はその変異体におけるコドン７２がプロリンをコードしているアミノ酸の種類を設定することが望ましい。 In addition, when the above viral vector incorporating the p53 gene or a variant thereof as a foreign gene is used for cancer treatment, gene introduction efficiency may vary depending on the type of amino acid encoded by codon 72 and the type of cancer cell to be introduced. Therefore, in order to enhance the therapeutic effect of cancer, depending on the presence or absence of expression of estrogen receptor in cancer cells possessed by cancer patients, the type of amino acid in which codon 72 in 53 genes or variants thereof encodes proline is selected. It is desirable to set.
即ち、先ず、癌患者から癌組織の一部を採取して、当該癌組織に含まれる癌細胞において、エストロゲン受容体の発現の有無を測定する。エストロゲン受容体の発現の有無は、例えば、細胞内ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を作用させてcDNAを作製し、エストロゲン受容体遺伝子を検出するためのＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲに供してエストロゲン受容体遺伝子の増幅が認められるか否かで判定できる。次いで、癌患者が保有する癌細胞がエストロゲン受容体を発現している場合、コドン７２がプロリンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用することが好ましい。また、癌患者が保有する癌細胞がエストロゲン受容体を発現していない場合、コドン７２がアルギニンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを癌の治療に使用することが好ましい。従来、エストロゲン受容体を発現している癌細胞を保有していない癌患者は、通常の抗癌剤が十分な薬効を示さない傾向がみられていたが、コドン７２がアルギニンをコードしているｐ５３遺伝子又はその変異体を組み込んだ上記ウイルスベクターを利用することにより、当該患者に対して有効な癌治療を行うことが可能になる。 That is, first, a part of a cancer tissue is collected from a cancer patient, and the presence or absence of estrogen receptor expression is measured in cancer cells contained in the cancer tissue. The presence or absence of estrogen receptor expression can be determined by, for example, extracting intracellular RNA, preparing cDNA by acting reverse transcriptase, and subjecting it to real-time PCR using TaqMan probe and primers for detecting estrogen receptor gene. Thus, it can be determined by whether or not amplification of the estrogen receptor gene is observed. Subsequently, when cancer cells possessed by cancer patients express an estrogen receptor, the above viral vector incorporating the p53 gene in which codon 72 encodes proline or a variant thereof may be used for the treatment of cancer. preferable. In addition, when a cancer cell possessed by a cancer patient does not express an estrogen receptor, the above viral vector incorporating the p53 gene in which codon 72 encodes arginine or a variant thereof may be used for the treatment of cancer. preferable. Conventionally, cancer patients who do not have cancer cells expressing an estrogen receptor have been apt to show sufficient efficacy of normal anticancer drugs, but the p53 gene in which codon 72 encodes arginine. Alternatively, by using the above-described viral vector incorporating the mutant, effective cancer treatment can be performed on the patient.
当該医薬組成物を用いて上記ウイルスベクターを細胞に導入するには、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで細胞又は組織に上記ウイルスベクターを接触させればよい。より具体的には、インビボで上記ウイルスベクターを細胞に導入するのであれば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所注入、腹腔内投与、経皮又は経粘膜投与等により、当該医薬組成物を投与すればよい。 In order to introduce the viral vector into a cell using the pharmaceutical composition, the viral vector may be brought into contact with the cell or tissue in vivo, in vitro, or ex vivo. More specifically, if the viral vector is introduced into cells in vivo, intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, local injection, intraperitoneal administration, transdermal or transmucosal administration, etc. The pharmaceutical composition may be administered.
当該医薬組成物は、上記ウイルスベクターの他に、薬学的に許容される担体や添加剤を含むことができる。遺伝子治療に使用される医薬組成物の好適な製剤としては、水性又は非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。 The pharmaceutical composition can contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive in addition to the virus vector. Suitable formulations of pharmaceutical compositions for use in gene therapy include aqueous or non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants, buffers, antibacterial agents, isotonic agents. Etc. may be included.
当該医薬組成物の投与量は、対象となる疾患の種類やその重篤度、患者の年齢や体重等に応じて、目的の治療効果を奏させるのに適した量を適宜設定すればよく、動物実験の結果に基づいて適宜設定することが望ましい。また、当該医薬組成物の投与回数は、目的の治療効果を奏させるのに十分な回数であればよい。例えば、１回の投与であってもよいが、組み込まれる外来遺伝子のコピー数を増加させ、より広範囲の細胞に導入させるために、複数回投与してもよい。 The dosage of the pharmaceutical composition may be set appropriately according to the type and severity of the target disease, the age and weight of the patient, etc. It is desirable to set appropriately based on the results of animal experiments. Moreover, the frequency | count of administration of the said pharmaceutical composition should just be sufficient frequency to show the target therapeutic effect. For example, it may be administered once, but it may be administered multiple times in order to increase the copy number of the incorporated foreign gene and introduce it into a wider range of cells.
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、本明細書及び図面において、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子をｐ５３Ｒｃ又はｐ５３Ｒ；コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子をｐ５３Ｐｃ又はｐ５３Ｐ；コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているものをＥＲＥｐ５３Ｒｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒ；コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているものをＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｐと略記することもある。 Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples and the like, but the present invention is not limited thereto. In the present specification and drawings, a fragmented p53 gene in which codon 72 is arginine is designated as p53Rc or p53R; a fragmented p53 gene in which codon 72 is proline is designated as p53Pc or p53P; and a fragmented p53 gene in which codon 72 is designated as arginine. EREp53Rc or EREp53R in which an estrogen response element is added; a fragmented p53 gene in which codon 72 is proline may be abbreviated as EREp53Pc or EREp53P.
実施例１：エストロゲン応答配列が付加されたｐ５３遺伝子を含むウイルスベクターの感染試験（１）
１．実験材料及び方法
（１）プラスミド
ヒト絨毛膜組織由来の全ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってヒトｃＤＮＡを得た。ＰｆｕＵｌｔｒａ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、フォワードプライマー（ＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号４）及びリバースプライマー（ＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号５）を利用して、断片化ｐ５３の遺伝子（配列番号３における第１６６〜１１４３位の塩基配列からなる遺伝子（但し、２１４〜２１６位の塩基はＣＧＣである））を増幅させた。得られた断片化ｐ５３の遺伝子に対して、ＥｃｏＲ１サイト、エストロゲン応答配列、及び５’末端での開始コドンを付加するために、５’末端での開始コドンを付加し、更にＥｃｏＲ１サイトを結合させるために、フォワードプライマー（ＧＡＡＴＴＣＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号６）、及びリバースプライマー（ＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号７）を用いて増幅を行い、エストロゲン応答配列結合の断片化ｐ５３遺伝子（配列番号３における第１６６〜１１４３位の塩基配列の３’末端に開始コドンが付加され、且つＥｃｏＲ１サイトが連結されている遺伝子）を調製した。また、別途、得られた断片化ｐ５３の遺伝子に対して、ＥｃｏＲ１サイト及び５’末端での開始コドンを付加するために、フォワードプライマー（ＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴ：配列番号８）、及びリバースプライマー（ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴ：配列番号９）を用いて増幅を行いエストロゲン応答配列未結合の断片化ｐ５３遺伝子を調製した。得られた各ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により生成し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲートし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αにトランスフェクトした。増幅させたプラスミドをＥｃｏＲ１で消化し、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（ＨＡタグとｈｒＧＦＰの付いたシャトルベクター）にライゲートし、当該シャトルベクターの発現カセットに目的遺伝子をサブクローニングした。なお、断片化ｐ５３遺伝子のコドン７２がアルギニン（ＣＧＣ）であったため、ｐ５３のコドン７２の変種を作製するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、プライマー（ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣ：配列番号１０、及びＣＧＴＧＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴ：配列番号１１）で、絨毛膜組織由来のｃＤＮＡ中の対応するアルギニン変種（ＣＧＣ）をプロリン変種（ＣＣＣ）に変換したものも作製した。
Example 1: Infection test of a viral vector containing the p53 gene to which an estrogen response element was added (1)
1. Experimental Materials and Methods (1) Plasmid Human cDNA was obtained by RT-PCR using total RNA derived from human chorionic tissue. Using PfuUltra high fidelity DNA polymerase (manufactured by Agilent Technologies) and using a forward primer (GAAGACCCAGGTCGCAGAT: SEQ ID NO: 4) and a reverse primer (TTTATGGCGGGGAGGT: SEQ ID NO: 5), the fragment number p53 gene in SEQ ID NO: 616 A gene consisting of a nucleotide sequence at positions ˜1143 (provided that the bases at positions 214 to 216 are CGC) was amplified. In order to add an EcoR1 site, an estrogen response element, and an initiation codon at the 5 ′ end to the fragmented p53 gene, an initiation codon at the 5 ′ end is added, and the EcoR1 site is further bound. For this purpose, amplification was performed using a forward primer (GAATTCGGTCATAGTGACCATATGGAAGACCCAGGTCCCAGAT: SEQ ID NO: 6) and a reverse primer (AGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCTTTATGGCGGGGGGT: SEQ ID NO: 7), fragment number 3 in the p53 sequence of the estrogen response sequence binding number 3 of p5316 A gene in which an initiation codon was added to the 3 ′ end of the base sequence and the EcoR1 site was linked was prepared. Separately, in order to add an EcoR1 site and a start codon at the 5 ′ end to the obtained fragmented p53 gene, a forward primer (AGGAATTCATGGGAAGACCCGGTCCAGAT: SEQ ID NO: 8) and a reverse primer (CAGAATTCTTTATGGCGGGAGGT: SEQ ID NO: 9) was used to prepare a fragmented p53 gene that was not bound to an estrogen response element. Each PCR product obtained was generated by agarose gel electrophoresis, ligated into pGEM-T easy vector (manufactured by Promega), and transfected into Escherichia coli DH5α. The amplified plasmid was digested with EcoR1, ligated into pIRES-hrGFP II (manufactured by Agilent Technologies) (shuttle vector with HA tag and hrGFP), and the target gene was subcloned into the expression cassette of the shuttle vector. In addition, since the codon 72 of the fragmented p53 gene was arginine (CGC), a primer (GCCCAGGCGCCTCT sequence: Agilent Technologies) was used to produce a variant of codon 72 of p53 using a QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies). No. 10 and CGTGCAAGTCCACAGATT: SEQ ID NO: 11) were also produced by converting the corresponding arginine variant (CGC) in the chorionic tissue-derived cDNA into a proline variant (CCC).
（２）組み換えアデノウイルス
ＡｄＥａｓｙTMＸＬアデノウイルスベクターシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、エストロゲン応答配列結合又は未結合の断片化ｐ５３遺伝子を含むシャトルベクターと、ｐＡｄＥａｓｙ−１ベクターを大腸菌（ＢＪ５１８３株）に同時に形質転換し、相同性組換えを誘発することにより、目的遺伝子を含む発現カセットをアデノウイルスのゲノム内へ移行させ、組み換えアデノウイルスを調製した。
(2) Using a recombinant adenovirus AdEasy ™ XL adenovirus vector system (manufactured by Agilent Technologies), a shuttle vector containing an estrogen responsive element-bound or unbound fragmented p53 gene and a pAdEasy-1 vector were transformed into E. coli (BJ5183 strain). The expression cassette containing the target gene was transferred into the adenovirus genome by inducing homologous recombination at the same time to prepare a recombinant adenovirus.
（３）ＰＣＲによるアデノウイルスの定量
培養細胞に感染するアデノウイルスは、Ａｄ ｐｒｅｐを用いた遠心分離にて精製した。次いで、０．６％ ＳＤＳなどを加えてタンパクを可溶化し、５Ｍ ＮａＣｌによる沈殿後に冷エタノールによる沈殿、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び０．２％ＳＤＳを含む溶液での消化、及びフェノール／クロロホルムでの抽出により、ＤＮＡを分離した。
(3) Quantification of adenovirus by PCR Adenovirus infecting cultured cells was purified by centrifugation using Ad prep. Subsequently, 0.6% SDS or the like is added to solubilize the protein, precipitation with cold ethanol after precipitation with 5M NaCl, digestion with a solution containing 0.2 mg / ml proteinase K and 0.2% SDS, and phenol DNA was separated by extraction with / chloroform.
アデノウイルスＤＮＡのＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを行うために、フォワードプライマー（ＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡ：配列番号１２）、リバースプライマー（ＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＴ：配列番号１３）、及びＴａｑＭａｎプローブが結合したＤＮＡ配列（ＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡ：配列番号１４）を準備した。これらは、それぞれｐ５３遺伝子の３’末端結合領域、及びシャトルベクターのＸｈｏクローニングサイトに対応している。 To perform TaqMan real-time PCR of adenovirus DNA, a forward primer (GAATTGCTATTATTTGTCGTCATCA: SEQ ID NO: 12), a reverse primer (AGGTTAGACTGACCCTTTTGGAACTT: SEQ ID NO: 13), and a DNA sequence (CCTTGTAGTCCTCGGATTTA prepared by binding a TaqMan probe): SEQ ID NO: 14 . These correspond to the 3'-end binding region of the p53 gene and the Xho cloning site of the shuttle vector, respectively.
（４）癌細胞株の培養、及び組み換えアデノウイルスの感染
子宮体癌細胞株としてＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞を用いた。また、結腸癌としてＳＷ４８細胞を用いた。
(4) Culture of cancer cell line and infection with recombinant adenovirus HHUA cells and KLE cells were used as endometrial cancer cell lines. SW48 cells were used as colon cancer.
ＨＨＵＡ細胞は、Ｉｓｈｉｗａｔａ等によって樹立された子宮体癌細胞株であり、理化学研究所から入手した。当該ＨＨＵＡ細胞は、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）を発現することが分かっている（Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９８４； Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。また、ＫＬＥ細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。当該ＫＬＥ細胞は、エストロゲン受容体を発現しないことが分かっている。ＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞は、１５％ ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加したＦ−１２／ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養した。 HHUA cells are endometrial cancer cell lines established by Ishiwata et al. And were obtained from RIKEN. The HHUA cells are known to express estrogen receptor β (ERβ) (Ishiwata et al., 1984; Zhi et al., 2007). KLE cells were obtained from DS Pharma Biomedical Co., Ltd. The KLE cells have been found not to express estrogen receptors. HHUA cells and KLE cells were F-12 / minimum essential medium (1: 1) (CO 2 of Invitrogen) at 37 ° C., 5%, supplemented with 15% charcoal-striped fetal bovine serum (manufactured by HyClone Laboratories). Cultured under conditions.
ＳＷ４８細胞は、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から入手した。当該ＳＷ４８細胞は、ＥＲβを発現することが分かっている。１５％ ＦＢＳを添加したｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍで、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養した。 SW48 cells were obtained from DS Pharma Biomedical Co., Ltd. The SW48 cells are known to express ERβ. The cells were cultured in a minimal essential medium supplemented with 15% FBS under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
癌細胞に対する前記組み換えアデノウイルスの感染は、１×１０5/ｃｍ2の癌が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。 Infection of the cancer cells with the recombinant adenovirus is carried out by adding a certain amount less than the recombinant adenovirus 10 MOI (multiplicity of infection) to the culture medium of the petri dish in which 1 × 10 5 / cm 2 of cancer is engrafted on the bottom surface. was added, it was performed by culturing in a 37 ℃ 5% CO 2 condition.
（５）フローサイトメトリー
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから４８時間後に、癌細胞を０．２５％トリプシン溶液に分散させて、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｋｉｎｓｏｎ社製）と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
(5) Flow cytometry 48 hours after infecting cancer cells with adenovirus, the cancer cells were dispersed in a 0.25% trypsin solution and incubated with fluorescein-conjugated annexin V (manufactured by Becton-Dickinson). Thereafter, the cancer cells were washed and analyzed by flow cytometry using FACScan.
アデノウイルスで癌細胞を感染させてから７２時間後に、癌細胞を０．２５％トリプシン溶液に分散させて、５μｇ／ｍｌのＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）と共にインキュベートした。その後、癌細胞を洗浄して、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。 72 hours after the cancer cells were infected with adenovirus, the cancer cells were dispersed in a 0.25% trypsin solution and incubated with 5 μg / ml of PI (propidium iodide). Thereafter, the cancer cells were washed and analyzed by flow cytometry using FACScan.
（６）ＲＴ-ＰＣＲ分析
（ ）を用いて、アデノウイルス感染後７２時間の細胞からＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡについてＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲに供して、ｐ５３遺伝子量を測定することにより、細胞に感染したアデノウイルス量を定量した。ｐ５３遺伝子量は、予め、既知のコピー数を持つｐ５３遺伝子を用いてコピー数とＰＣＲのサイクル数との関係を示す検量線を作製することにより、サンプルの増幅曲線からコピー数を算出することにより行った。
ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて、アデノウイルス感染後７２時間の細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを逆転写した後に、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより、ｐ５３ｍＲＮＡ量を分析した。ｐ５３ｍＲＮＡ量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量に対するｐ５３Ｒｃが挿入されたアデノウイルスを感染させた細胞の1検体における該当ｍＲＮＡ量比を１とした場合の相対値として算出した。
(6) RT-PCR analysis Using (), DNA was extracted from cells 72 hours after adenovirus infection. The extracted DNA was subjected to real-time PCR using a TaqMan probe, and the amount of adenovirus infecting cells was quantified by measuring the amount of p53 gene. The amount of p53 gene is calculated in advance by calculating the copy number from the amplification curve of the sample by preparing a calibration curve showing the relationship between the copy number and the PCR cycle number using the p53 gene having a known copy number. went.
RNA was extracted from cells 72 hours after adenovirus infection using RNeasy kit (Qiagen). After reverse transcription of RNA, the amount of p53 mRNA was analyzed by real-time PCR using a TaqMan probe. The amount of p53 mRNA is calculated as a relative value when the corresponding mRNA amount ratio in one sample of a cell infected with adenovirus into which p53Rc is inserted is expressed with respect to the expression level of 18S ribosomal RNA that is considered to be present at a constant concentration in the cell. did.
２．結果
図１に、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｒｃ）、コドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子（ｐ５３Ｐｃ）、コドン７２がアルギニンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｒｃ）、又はコドン７２がプロリンである断片化ｐ５３遺伝子にエストロゲン応答配列が付加されているもの（ＥＲＥｐ５３Ｐｃ）が挿入されたアデノウイルスをＨＨＵＡ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図１から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ＧＦＰの蛍光を示す細胞が顕著に多く、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、及びＥＲＥｐ５３Ｒｃに比してアデノウイルスの感染率が高いことが確認された。この結果から、ＥＲβを発現しているＨＨＵＡ細胞に対して、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。
2. Results FIG. 1 shows that an estrogen response element is added to a fragmented p53 gene (p53Rc) in which codon 72 is arginine, a fragmented p53 gene (p53Pc) in which codon 72 is proline, and a fragmented p53 gene in which codon 72 is arginine. Infecting HHUA cells with adenovirus inserted with an estrogen response element (EREp53Pc) added to the fragmented p53 gene (EREp53Rc) having a proline at codon 72 (EREp53Pc), and GFP fluorescence 48 hours later The result of having observed the cell which shows is shown. As is clear from FIG. 1, when an adenovirus containing EREp53Pc was used, the number of cells exhibiting GFP fluorescence was remarkably increased, and it was confirmed that the infection rate of adenovirus was higher than that of p53Rc, p53Pc, and EREp53Rc. It was done. From this result, it was confirmed that the infection rate of adenovirus containing EREp53Pc was remarkably high with respect to HHUA cells expressing ERβ.
また、図２に、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ、及びＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスをＫＬＥ細胞に感染させて、４８時間後にＧＦＰ蛍光を示す細胞を観察した結果を示す。図２から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ＧＦＰの蛍光を示す細胞が顕著に多かった。即ち、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスは、ＥＲβを発現していないＫＬＥ細胞に対して、アデノウイルスの感染率が顕著に高いことが確認された。 FIG. 2 shows the result of observing cells showing GFP fluorescence after 48 hours after infecting KLE cells with adenovirus into which p53Rc, p53Pc, EREp53Rc, and EREp53Pc have been inserted. As is clear from FIG. 2, when an adenovirus containing EREp53Rc was used, the number of cells exhibiting GFP fluorescence was remarkably large. That is, it was confirmed that the adenovirus containing EREp53Rc has a remarkably high infection rate of adenovirus with respect to KLE cells not expressing ERβ.
図１及び２に示す結果から、エストロゲン受容体を発現している細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が高く、また、エストロゲン受容体を発現していない細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスの感染率が高いことが明らかとなった。 From the results shown in FIGS. 1 and 2, the infection rate of adenovirus containing EREp53Pc is high for cells expressing estrogen receptor, and EREp53Rc is used for cells not expressing estrogen receptor. It became clear that the infection rate of adenovirus containing was high.
図３に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞の内、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。図２から分かるようにＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスで感染させたＨＨＵＡ細胞では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が顕著に高い値を示していた。 FIG. 3 shows the results of measuring the percentage (%) of GFP-positive cells among HHUA cells 72 hours after infection with adenovirus. As can be seen from FIG. 2, in the HHUA cells infected with adenovirus containing EREp53Pc, the ratio of GFP positive cells was remarkably high.
図４に、アデノウイルスの感染から４８時間後のＨＨＵＡ細胞の内、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。また、図５に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞の内、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖはアポトーシスの初期段階の検出指標、PIはアポトーシスの後期段階の指標となるマーカーである。図４及び５から明らかなように、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。この結果は、図１に示す結果とも整合しており、エストロゲン受容体を発現している細胞に対してはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスの感染率が高く、導入された遺伝子が感染細胞内で機能発現していることの証左となっている。 FIG. 4 shows the results of measuring the ratio (%) of Annexin V positive cells among HHUA cells 48 hours after infection with adenovirus. FIG. 5 shows the results of measurement of the percentage (%) of PI (Propidium iodide) positive cells in HHUA cells 72 hours after infection with adenovirus. Annexin V is a detection index for an early stage of apoptosis, and PI is a marker for an index for a later stage of apoptosis. As apparent from FIGS. 4 and 5, when an adenovirus containing EREp53Pc was used, the ratio of annexin V positive cells and PI positive cells was high, and it was confirmed that apoptosis was efficiently induced. This result is consistent with the result shown in FIG. 1, and the infection rate of adenovirus containing EREp53Pc is high for cells expressing the estrogen receptor, and the introduced gene is functionally expressed in the infected cells. It is a proof of what you are doing.
図６に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞、ＳＷ４８細胞、及びＫＬＥ細胞について、アデノウイルス感染量（ｐ５３遺伝子量）を測定した結果を示す。この結果からも、ＨＨＵＡ細胞及びＳＷ４８細胞では、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを感染させた場合に、感染率が顕著に高くなっていた。また、ＫＬＥ細胞では、ＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染させた場合に、感染率が顕著に高くなっていた。また、図７に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞及びＫＬＥ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の測定結果も、図５に示す結果と同じ傾向になっていた。即ち、図６及び７の結果から、エストロゲン受容体を発現している細胞に対する感染にはＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスが有効であり、エストロゲン受容体を発現していない細胞に対する感染にはＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスが有効であることが裏付けられた。 FIG. 6 shows the results of measuring the amount of adenovirus infection (p53 gene amount) for HHUA cells, SW48 cells, and KLE cells 72 hours after adenovirus infection. Also from this result, when HHUA cells and SW48 cells were infected with adenovirus containing EREp53Pc, the infection rate was remarkably increased. Moreover, in KLE cells, the infection rate was remarkably increased when infected with an adenovirus containing EREp53Rc. FIG. 7 shows the results of measuring the amount of p53 mRNA in HHUA cells and KLE cells 72 hours after infection with adenovirus. The measurement result of the expression level of p53 mRNA also had the same tendency as the result shown in FIG. That is, from the results of FIGS. 6 and 7, an adenovirus containing EREp53Pc is effective for infection of cells expressing estrogen receptor, and an adenovirus containing EREp53Rc is effective for infection of cells not expressing estrogen receptor. It was confirmed that the virus was effective.
実施例２：エストロゲン応答配列が付加されたｐ５３遺伝子を含むウイルスベクターの感染試験（２）
１．実験材料及び方法
（１）組み換えアデノウイルス
実施例１と同様の方法で、ｐ５３Ｒｃ、ｐ５３Ｐｃ、ＥＲＥｐ５３Ｒｃ、又はＥＲＥｐ５３Ｐｃが挿入されたアデノウイルスを作製した。
Example 2: Infection test of a viral vector containing the p53 gene to which an estrogen response element has been added (2)
1. Experimental Materials and Methods (1) Recombinant Adenovirus An adenovirus into which p53Rc, p53Pc, EREp53Rc, or EREp53Pc was inserted was prepared in the same manner as in Example 1.
（２）癌細胞株の培養、及び組み換えアデノウイルスの感染
実施例１と同様の方法で、ＨＨＵＡ細胞を培養した。
(2) Cancer cell line culture and recombinant adenovirus infection HHUA cells were cultured in the same manner as in Example 1.
培養したＨＨＵＡ細胞を下記３群に分けて、組み換えアデノウイルスの感染を行った。
未処置群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液（に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
エストラジオール添加群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、１×１０9Ｍのエストラジオール（和光純薬工業株式会社）を添加し、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養することにより行った。
Ｘ線照射群
１×１０5/ｃｍ2のＨＨＵＡ細胞が底面に生着しているシャーレの培養液に、前記組み換えアデノウイルス１０ ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）未満の一定量を添加して、３７℃５％ＣＯ2の条件で培養し、アデノウイルス添加から２４時間後に、１５０ｋＶで１０ＧｙのＸ線を照射して、引き続き培養を行った。
The cultured HHUA cells were divided into the following 3 groups and infected with recombinant adenovirus.
A non-treated group 1 × 10 5 / cm 2 HHUA cells were engrafted on the bottom of the culture medium (to the recombinant adenovirus 10 MOI (multiplicity of infection)) was added at a constant volume of 37 ° C. The culture was performed under conditions of 5% CO 2 .
Estradiol addition group 1 × 10 9 M estradiol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to a culture medium of a petri dish with 1 × 10 5 / cm 2 HHUA cells engrafted on the bottom, and the recombinant adenovirus It was carried out by adding a certain amount less than 10 MOI (multiplicity of effect) and culturing under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
X-irradiation group 1 × 10 5 / cm 2 HHUA cells are engrafted on the bottom surface of a Petri dish culture medium, and a certain amount less than the recombinant adenovirus 10 MOI (multiplicity of infection) is added at 37 ° C. Culturing was performed under conditions of 5% CO 2 , and 24 hours after adenovirus addition, 10 Gy X-rays were irradiated at 150 kV, followed by culturing.
（３）フローサイトメトリー
各群のアデノウイルス感染後４８時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを用いた染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。
(3) Flow cytometry HHUA cells 48 hours after each group of adenovirus infections were stained with fluorescein-conjugated annexin V in the same manner as in Example 1, and flow cytometry using FACScan. analyzed.
また、各群のアデノウイルス感染後７２時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、ＰＩを用いた染色を行い、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーにて分析した。 Further, HHUA cells 72 hours after adenovirus infection in each group were stained with PI in the same manner as in Example 1 and analyzed by flow cytometry using FACScan.
（４）ＲＴ-ＰＣＲ分析
各群のアデノウイルス感染後７２時間のＨＨＵＡ細胞について、実施例１と同様の方法で、細胞内ｐ５３ｍＲＮＡ量及びｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した。ｐ５３ｍＲＮＡ量及びｐ３００ｍＲＮＡ量は、細胞内で一定濃度存在すると考えられる１８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡの発現量に対するｐ５３Ｒｃが挿入されたアデノウイルスを感染させた未処置群の細胞の1検体における該当ｍＲＮＡ量比を１とした場合の相対値として算出した。
(4) RT-PCR analysis About the HHUA cell 72 hours after the adenovirus infection of each group, the intracellular p53 mRNA amount and p300 mRNA amount were measured by the same method as Example 1. The amount of p53 mRNA and the amount of p300 mRNA are expressed as follows. The ratio of the amount of mRNA in one sample of cells in the untreated group infected with adenovirus into which p53Rc is inserted relative to the expression level of 18S ribosomal RNA, which is considered to be present at a constant concentration in the cell, is 1. The relative value was calculated.
２．実験結果
図８に、アデノウイルスの感染から４８時間後の各群のＨＨＵＡ細胞について、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。また、図９に、アデノウイルスの感染から７２時間後の各群のＨＨＵＡ細胞について、ＰＩ陽性細胞の割合（％）を測定した結果を示す。この結果から、実施例１での結果と同様に、ＥＲＥｐ５３Ｐｃを含むアデノウイルスを使用した場合は、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合が高く、アポトーシスが効率的に誘導されていることが確認された。また、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞及びＰＩ陽性細胞の割合については、有意な差がなかったことから、本発明のウイルスベクターによる感染と感染細胞内での機能発現は、感染時のエストロゲンやＸ線照射の有無には影響されないことが分かった。
2. Experimental Results FIG. 8 shows the results of measuring the ratio (%) of Annexin V positive cells for each group of HHUA cells 48 hours after infection with adenovirus. Moreover, the result of having measured the ratio (%) of PI positive cell about HHUA cell of each group 72 hours after adenovirus infection in FIG. 9 is shown. From this result, similarly to the result in Example 1, when an adenovirus containing EREp53Pc was used, it was confirmed that the ratio of annexin V positive cells and PI positive cells was high and apoptosis was efficiently induced. It was done. In addition, since there was no significant difference in the ratio of Annexin V positive cells and PI positive cells among the untreated group, the estradiol added group, and the X-ray irradiation group, infection and infection with the virus vector of the present invention It was found that the functional expression in the cells was not affected by the presence or absence of estrogen or X-ray irradiation at the time of infection.
また、図１０に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞内のｐ５３ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ５３ｍＲＮＡの発現量の測定結果も、図９に示す結果と同様に、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では、ｐ５３ｍＲＮＡ量については、有意な差は認められなかった。 FIG. 10 shows the results of measuring the amount of p53 mRNA in HHUA cells 72 hours after infection with adenovirus. Similarly to the results shown in FIG. 9, the measurement result of the expression level of p53 mRNA showed no significant difference in the amount of p53 mRNA among the untreated group, the estradiol-added group, and the X-ray irradiation group.
また、図１１に、アデノウイルスの感染から７２時間後のＨＨＵＡ細胞内のｐ３００ｍＲＮＡ量を測定した結果を示す。ｐ３００は、ｐ５３の分解に寄与することが知られているタンパク質である。ＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染した場合には、ｐ５３Ｐｃ又はｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスを感染した場合と比較して、ｐ３００ｍＲＮＡ量が少なくなっていた。また、ｐ３００ｍＲＮＡ量も、未処置群、エストラジオール添加群、及びＸ線照射群の間では有意な差は認められなかった。即ち、本結果から、ＥＲＥｐ５３Ｐｃ又はＥＲＥｐ５３Ｒｃを含むアデノウイルスは、感染時のエストロゲンやＸ線照射の有無には影響されず、感染した細胞内でｐ５３が有効に機能していることが明らかとなった。 FIG. 11 shows the results of measuring the amount of p300 mRNA in HHUA cells 72 hours after infection with adenovirus. p300 is a protein known to contribute to the degradation of p53. When the adenovirus containing EREp53Pc or EREp53Rc was infected, the amount of p300 mRNA was reduced as compared with the case where the adenovirus containing p53Pc or p53Rc was infected. Further, the p300 mRNA level was not significantly different among the untreated group, the estradiol added group, and the X-ray irradiation group. That is, from this result, it became clear that adenovirus containing EREp53Pc or EREp53Rc is not affected by the presence or absence of estrogen or X-ray irradiation at the time of infection, and p53 functions effectively in infected cells. .
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