JP6097286B2

JP6097286B2 - Ｃｄ４７とトロンボスポンジンファミリーに属する蛋白質との結合に対するアンタゴニストペプチド

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Publication number: JP6097286B2
Application number: JP2014517900A
Authority: JP
Inventors: ドゥデュー，ステファヌ; フロケ，ニコラ; マルティニ，ロラン; シュネデール，クリストフ; ジャンヌ，アルバン; シック，エミリ; ドシェ，マニュエル
Original assignee: Universite de Reims Champagne Ardenne URCA
Current assignee: Universite de Reims Champagne Ardenne URCA
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: ES2681572T3; JP2014525740A; FR2977587A1; CA2840719A1; US20140296477A1; CA2840719C; FR2977587B1; EP2729495A1; DK2729495T3; US9605025B2; WO2013007933A1; EP2729495B1

Description

本発明は、二つの蛋白質間の分子相互作用の分野に関する。より具体的には、本発明は、トロンボスポンジンファミリーに属する細胞外蛋白質と細胞膜の表面上に位置する受容体であるＣＤ４７との間の相互作用に関する。
本発明は、主に腫瘍、血栓性および心血管疾患の分野で潜在的な応用を有することになるであろう。より具体的には、本発明は、トロンボスポンジンファミリーに属する蛋白質のＣＤ４７結合ドメインに、二つの物の間の結合を防ぐように特異的に結合する能力を有するペプチドに関する。

トロンボスポンジン（ＴＳＰ）及び特にＴＳＰ１とＴＳＰ２は、ＣＤ４７受容体に結合して、細胞の一部に対する細胞応答を誘導するシグナルを生成する能力を有することが知られている蛋白質である。このような相互作用が、アポトーシスや炎症としても知られているプログラム化細胞死の制御などの基本的な細胞プロセスに特に重要な役割を果たしていると思われている。
例えば、本発明者によって最近なされた仕事により、ＦＴＣ細胞としても知られるヒト濾胞性甲状腺癌細胞に対するＴＳＰ１の抗アポトーシスの役割が明らかになった（Ｒａｔｈｅｔａｌ．，２００６）。また、他の研究により、ＴＰＳ１発現の減少は、アンチセンスストラテジーの使用による扁平上皮癌表現型の可逆性を導くことが示された。

しかしながら、乳癌細胞の発生におけるＴＰＳ１の役割を試して証明するために行われた更なる研究は矛盾する結果となり、実際に、いくつかの研究により、ＴＳＰ１はプロアポトーシス効果を有すると結論付けされ、すなわち、ＴＳＰ１が乳腺腫瘍の成長を阻害することが示唆されている（Ｅｓｅｍｕｅｄｅｅｔａｌ．，２００４；ＭａｎｎａａｎｄＦｒａｚｉｅｒ２００４）。しかしながら、それに反して、他の研究により、ＴＳＰ１は抗アポトーシスの役割を果たし、及び／又は、これらの腫瘍細胞の浸潤特性を高めると見られる逆の概念が擁護されている（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９６ａ，１９９６ｂ）。

したがって、トロンボスポンジンファミリーに属する蛋白質とそれらの受容体との間の相互作用に至る分子メカニズの理解ならびにその後の細胞応答の検出が、癌細胞の発生及び増殖を阻害するように設計された治療ストラテジーを考案する上で重要なステップを構成する。

特定の先行技術文献は、癌性か否かに拘わらず細胞のアポトーシスの割合を減少もしくは上昇させるストラテジーを開発するためには、トロンボスポンジンとその受容体、特にＣＤ４７と間の相互作用の特性を使用することを勧めている。
かくして、従来技術、例えば米国特許第７５８２７２５号明細書においては、ＣＤ４７受容体又はトロンボスポンジン−１のいずれかに結合する薬剤が、前記ＴＳＰ１と前記ＣＤ４７受容体との間の結合を阻害するために使用できることが知られている。この相互作用を防止することが、重要な役割を果たしている特に治癒過程に関与している線維芽細胞や上皮細胞などの特定の細胞のアポトーシスの割合を有意に低下させると考えられている。好ましくは、ＴＳＰ１蛋白質により誘導されるアポトーシスの割合を減少させる目的で、一般構造式：Ｒ−Ａ１−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍのアミノ酸配列を有するペプチドが使用される。

しかしながら、本発明の場合には、標的化される細胞と到達すべき目標は全く異なる。実際、我々の場合の目的は、アポトーシスを停止させようとすることではなく、逆に、癌細胞の死（アポトーシス及び／又は壊死）を促進することである。したがって、前記文献で提案されたペプチドは、当該問題を解決するには、すなわち、特にアポトーシスへの参入を促進することにより癌細胞の浸潤能を阻害するためには適していない。
また、従来技術には、ＴＳＰ蛋白質又はＣＤ４７受容体のいずれかに特異的なモノクローナル抗体の使用が含まれる。これは、これら二つの蛋白質間の相互作用を防止する、したがって、その後の細胞応答を阻害する結果を有する。

しかしながら、この技術の主な欠点は、蛋白質の一方又は他方に対するモノクローナル抗体がＴＳＰとＣＤ４７との間の正確な結合部位に特異的に結合しないことである。かくして、二つの蛋白質間の相互作用のブロックは最適ではなく、ＴＳＰ又はＣＤ４７のいずれかに抗体が固定することが、それら蛋白質とそれらの他の天然のリガンドとの相互作用を防ぐことができる。その結果、体内に必須であって前記の蛋白質の一方又は他方を使用する他の細胞プロセスを阻害又は防止することができる。さらに、このようなストラテジーの別の主要な欠点は、抗ＣＤ４７抗体が特定の場合には受容体のアゴニストとして作用し、すなわち、それが相互作用により受容体を活性化することができるという事実に在る。

また、カナダ特許出願公開第２４４６３９１号明細書では、ＣＤ４７受容体とそのリガンドであるＴＳＰ１蛋白質との間の結合特性が使用されている。より具体的には、結合特性は、免疫応答において、特に利用される炎症応答において、これら二つの分子の役割である。したがって、この特許は、特にサプレッサーＴ細胞の活性を阻害するためにＣＤ４７受容体に対するモノクローナル抗体の使用を開示している。このような阻害は、様々な細胞プロセス、特に感染性病原体の中和、アレルギー反応、自己免疫疾患、炎症性疾患などにおいて有益な役割を果たしていると考えられている。
しかしながら、前記で説明したように、二つの蛋白質の一方又は他方に対するモノクローナル抗体の使用は、満足のいく解決策を構成しない。

また、国際公開第２０１０／０１７３３２号は、ＣＤ４７受容体とトロンボスポンジンとの間の相互作用の阻害に関する。特に、この特許は、腫瘍の外科的除去を容易にするために、放射線療法による患者の治療前にこの相互作用を阻害する非常に多様な薬剤の使用を提供している。実際、ＴＳＰ１／ＣＤ４７の相互作用の防止が、放射線への暴露によって引き起こされる損傷に対する免疫系における細胞の保護に有利に働くと考えられている。その結果、腫瘍細胞に対する免疫応答がかなり上昇すると考えられている。
しかしながら、使用される薬剤は、ＴＳＰのＣＤ４７受容体への結合を特異的にブロックするためには適していない。

本発明は、トロンボスポンジンファミリーに属する蛋白質、特にＴＳＰ１及びＴＳＰ２との間のＣＤ４７の相互作用のアンタゴニストペプチドを提案することにより、従来技術の様々な欠点を少なくとも部分的に克服する可能性を提供する。特に有利な面では、ＣＤ４７受容体と相互作用するＴＳＰのドメイン上にのみにペプチドが固定し、それによって、ＴＳＰの他のドメインとＣＤ４７の全細胞外ドメインをフリーにして、それらがそれらの天然のリガンドに結合できるようにする。本発明の本質、すなわちアンタゴニストペプチドは、活性物質の送達を容易にし、免疫原性を制限しながら標的細胞におけるそのバイオアベイラビリティを改善すると考えられる。別の利点は、アンタゴニストペプチドは、ＣＤ４７とＴＳＰ１との結合及びＴＳＰ２との結合を一度に阻害することができるという事実に在る。

この趣旨で、本発明は、ＣＤ４７受容体とトロンボスポンジンファミリー又はＴＳＰに属する蛋白質との間の結合に対するアンタゴニストペプチドに関する。
本発明によるペプチドは、特に以下の配列Ｓ１を有する。
Ｓ１：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６

特に有利な面では、前記ペプチドは、前記ＣＤ４７受容体とＴＳＰとの間の相互作用を防止するように、ＴＳＰと前記ＣＤ４７受容体との間の結合部位でＴＳＰのＣ−末端と特異的に相互作用する。

一つの実施形態では、基Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、それぞれイソロイシン（Ｉ）及び／又はロイシン（Ｌ）及び／又はバリン（Ｖ）及び／又はアラニン（Ａ）から選択される一つの非極性アミノ酸に対応する。

他の一つの興味ある実施形態では、基Ｒ２及びＲ４は、それぞれグルタミン酸（Ｅ）及び／又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択される負荷電極性アミノ酸に対応する。
有利には、Ｒ６は、セリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）から選択されるヒドロキシ基を含む非荷電極性アミノ酸に対応する。
明らかに、これらの実施形態は本発明を限定するものではない。実際に、前記したように、ペプチドの環化を可能にするように基Ｒ１及びＲ６はシステイン（Ｃ）に対応することができる。

特に有利な面では、本発明によるペプチドの配列Ｓ１は、Ｓ２として同定される以下の配列に等しいものである。
Ｓ２：Ｉ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｓ
特に好ましい実施形態では、前記の式の本発明によるペプチドは環化される。
さらにより優先的には、前記ペプチドの環化は、システインタイプ（Ｃ）の二つのアミノ酸の間のジスルフィド架橋によって達成される。

かくして、特に有利な面では、本発明によるペプチドは、配列Ｓ３として同定される以下の配列に等しい配列Ｓ１を有する。
Ｓ３：Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｃ

有利な一つの実施形態では、本発明によるペプチドは、組換え製造によって得られる。
さらにより優先的には、前記ペプチドは化学合成により得られる。

また、本発明は癌の治療におけるペプチドの使用に関する。
より詳細には、該ペプチドは、特に濾胞性甲状腺癌、乳癌又は黒色腫の治療に使用することができる。
しかしながら、この例は網羅的なものではなく、本発明によるペプチドは、また、例えば、膵臓癌又は結腸癌などの他のタイプの癌を治療するのに有用であると見出すこともできる。

また、本発明は、トロンボスポンジン−１とＣＤ４７受容体との間の相互作用を防止し、そしてこの相互作用の癌細胞に対する抗アポトーシス効果を阻害するためのペプチドの使用に関する。

また、本発明は、トロンボスポンジン−２とＣＤ４７受容体との間の相互作用を防止し、そしてこの相互作用の癌細胞に対する抗アポトーシス効果を阻害するためのペプチドの使用に関する。

また、本発明は、５０未満のいくつかのアミノ酸を含み、本発明による配列Ｓ２と少なくとも６０％の相同性、好ましくは８０％の相同性、さらに好ましくは９５％の相同性を有するペプチドを含むポリペプチドに関する。

さらに、本発明は、本発明によるペプチドをコードする単離された核酸に関する。

本明細書では、アミノ酸についての国際的な一文字コードが使用される。したがって、Ａはアラニン（Ａｌａ）に、Ｃはシステイン（Ｃｙｓ）に、Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）に、Ｅはグルタミン酸（Ｇｌｕ）に、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｇにグリシン（Ｇｌｙ）に、Ｈはヒスチジン（Ｈｉｓ）に、Ｉはイソロイシン（Ｉｌｅ）に、Ｋはリシン（Ｌｙｓ）に、Ｌはロイシン（Ｌｅｕ）に、Ｍはメチオニン（Ｍｅｔ）に、Ｎはアスパラギン（Ａｓｎ）に、Ｐはプロリン（Ｐｒｏ）に、Ｑはグルタミン（Ｇｌｎ）に、Ｒはアルギニン（Ａｒｇ）に、Ｓはセリン（Ｓｅｒ）に、Ｔはスレオニン（Ｔｈｒ）に、Ｖはバリン（Ｖａｌ）に、Ｗはトリプトファン（Ｔｒｐ）に、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）に対応する。

本発明は多くの利点を有する。アンタゴニストペプチドは、一方では、ＣＤ４７受容体と相互作用するＴＳＰのドメイン上にのみ固定して、それによって、ＴＳＰの他のドメインとＣＤ４７の全細胞外ドメインをフリーにして、それらがそれらの天然のリガンドに結合できるようにする。これによって、活性物質、本明細書ではアンタゴニストペプチドの送達が容易にされ、免疫原性を制限しながら、標的細胞におけるそのバイオアベイラビリティを改善する。他方、アンタゴニストペプチドはまた、ＣＤ４７とＴＳＰ１との結合及びＴＳＰ２との結合を一度に阻害する。実際に、大部分のことはＴＳＰ１上で行われているが、ＴＰＳ１はＴＳＰ２と高度の相同性を示す。

さらに、ＴＳＰ１とＴＳＰ２との間の相同性の割合は、特にそれらのカルボキシ末端（Ｃ−末端）において高く、より具体的には、一方ではＣＤ４７受容体に関してＴＳＰ１と同様の方法でＴＳＰ２は作用し、他方では本発明によるペプチドはＴＳＰ２蛋白質とＤ４７受容体との間の相互作用を阻害すると信じるように導く問題の配列において、高い。

本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、本発明の非限定的な実施形態についての以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。

図１は、蛋白質（ｙ軸）１μｇにつき１時間当たりに放出されるパラ−ニトロアニリンの量を測定して得られた、アポトーシスのマーカーであるカスパーゼ−３活性を示す。カスパーゼ−３活性は、アポトーシスを誘導する抗癌分子であるカンプトテシン（Ｃｐｔ）又はドキソルビシン（Ｄｏｘ）の存在下で、ＴＳＰ１の存在下又は非存在下で、濾胞性甲状腺癌細胞で測定される。図２は、ＴＳＰ１のＣ末端ドメインに由来するペプチド４Ｎ１（Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ）及びＣＤ４７受容体の、カンプトテシン（Ｃｐｔ）又はドキソルビシン（Ｄｏｘ）により誘導されるアポトーシスの制御に対する役割を示している。これを達成するために、甲状腺癌細胞（ＦＴＣ−１３３）を、薬剤の一方又は他方の５μＭ及びテストペプチド４Ｎ１の１００μＭと共に、ＣＤ４７受容体をブロックするＢ６Ｈ１２抗体（１００μｇ／ｍＬ）有りもしくは無しで、インキュベートした。同じ実験を、ＣＤ４７に結合することができない対照ペプチド４ＮＧＧ（Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｍ−Ｗ−Ｋ）を用いて行った。図３は、そのアミノ酸がより濃い着色の丸で示されるペプチド４Ｎ１（Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ）を示すＴＳＰ１蛋白質のＣ末端ドメインのオープニングダイナミクスの表示である。図４は、ＴＳＰ１のＣ末端ドメイン（図の左側）とＣＤ４７受容体の細胞外ドメイン（明るい灰色で示した細胞膜に結合している）と間の分子相互作用のモデルを示す。このモデルは、蛋白質−蛋白質ドッキング法により得られる。二つの蛋白質の間に見える矢印は、分子相互作用の領域に相当する。図５は、ＴＳＰ１とＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のＣＤ４７受容体との間の生体分子相互作用の阻害を示す。細胞は、本発明によるアンタゴニストペプチドの１００μＭと共に（Ｃｔｒｌ）もしくは無し（ｐｅｐｔ．）で２時間インキュベートする。次いで、ＴＳＰ１／ＣＤ４７複合体を抗ＣＤ４７抗体を用いて免疫沈降し、その後に、ＴＳＰ１及びＣＤ４７の存在をウエスタンブロット法を用いて分析する。図６は、マウスメラノーマ細胞に対する環化アンタゴニストペプチドの作用を示す。同系Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの２５０，０００Ｂ１６−Ｆ１マウスメラノーマ細胞の皮下注射の後、３日目、５日目及び７日目に、アンタゴニストペプチドを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。次いで、マウスを犠牲にし、２０日目に腫瘍を撮影した。図７は、未処置の腫瘍（左側）及び目的の１２日目の環化アンタゴニストペプチドで処理した腫瘍のＭＲＩ分析に対応する。矢印は壊死領域を指摘している。図８は、１００倍に拡大した位相差顕微鏡下で観察した細胞の写真に対応する。ＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、抗有糸***分子であるマイトマイシン（１０μｇ／ｍＬ）で、３７℃で２時間、前処理し、次いでコンフルエントな細胞層に創傷を施す。次いで、細胞を、本発明に記載のペプチドと共に３７℃で９時間インキュベートする。左側の写真は「コントロール」細胞に対応し、右側の写真が目的のペプチド（１００μＭ）で処理された細胞を示す。

トロンボスポンジンファミリーに属する蛋白質及び特にトロンボスポンジン−１及びトロンボスポンジン−２、すなわちそれぞれＴＳＰ１及びＴＳＰ２は、細胞外マトリックスのマクロ分子である。それらは、該マトリックスと細胞との間及び細胞自体の間の多数の相互作用の調節に関与する。
より具体的には、トロンボスポンジンは、マルチドメイン構造を有する糖蛋白質であり、各ドメインは、非常に多くの細胞表面受容体に結合するその能力の結果として様々な機能に関与している。

トロンボスポンジンファミリーは、五つの蛋白質であるＴＳＰ１からＴＳＰ５を含み、二つのサブグループに分類される。ＴＳＰ１とＴＳＰ２は、どちらも同様の構造を持っているので、これら二つのグループの最初のグループに属しており、それらは三つの同一のサブユニットからなるホモ三量体である。これらの三つのモノマーはそれぞれおよそ１５０，０００ダルトンの分子量を有し、ジスルフィド架橋によってそれぞれ連結されている。ＴＳＰ１モノマーとＴＳＰ２モノマーは、Ｎ−末端（３２％の相同性）からＣ−末端（８２％の相同性）に向かって徐々に増加する相同性を有している。さらに、ＴＳＰ１の接着配列のほとんどは、またＴＳＰ２に見出される。その結果として、前記で指摘したように、ＴＳＰ２はＴＳＰ１と同様の機能を有する可能性が高い。

ＴＳＰ３からＴＳＰ５については、それらはホモ五量体である。したがって、それらの構造及び配列はＴＳＰ１及びＴＳＰ２とは異なっている。

既に分るように、トロンボスポンジンは細胞外マトリックス中に見られる蛋白質である。かくして、これらの蛋白質、特にＴＳＰ１は、それらが確立することができる相互作用による細胞表現型のみならず細胞外マトリックスの構造及び組成に影響を及ぼす。

インビトロでは、培養した血管壁の細胞、内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞は、ＴＳＰ１を合成して分泌し、それらは、また、細胞外マトリックス中で統合される。インビボでは、ＴＳＰ１は、胚形成の初期段階で、次いで細胞遊走領域における胚発生の間に検出される。

成人では、ＴＳＰ１は、組織修復プロセスの開始時の損傷組織もしくは炎症組織において高濃度での発現で特に見出される。また、ＴＳＰ１は、血小板、単球、肺胞マクロファージなどの免疫応答に関与する細胞によって合成及び分泌されることができる。

トロンボスポンジン、特にＴＳＰ１は、様々な基本的な細胞プロセスに関与している。かくして、ＴＳＰ１は、血小板活性化、血管新生、創傷治癒、プログラム細胞死、腫瘍進行などの多くの細胞機能に影響を及ぼす（Ｓｉｄｅｔａｌ．，２００４）。ＴＳＰ２は、ＴＳＰ１と同様のドメイン構造を有し、結果として、ＴＳＰ２によって発揮される機能のいくつかはＴＳＰ１の機能と同様である。特に、これらの二つの蛋白質は、既存の血管からの新たな血管の成長を可能にするプロセスである血管新生を阻害する（Ｍｉｒｏｃｈｎｉｋｅｔａｌ．，２００８）。

より具体的には、本発明者らの研究により、ヒト濾胞性甲状腺癌細胞に対するＴＳＰ１の抗アポトーシスの役割が明らかになった（Ｒａｔｈｅｔａｌ．，２００６）。この点では、本発明者らは、化学療法剤、特にドキソルビシン及びカンプトテシンに対する腫瘍細胞の耐性においてＴＳＰ１が重要な役割を果たしていることを証明した。これら二つの薬剤は、多数の細胞型においてアポトーシスを誘導することによって細胞毒性効果を発揮する。

図１を参照すると、アポトーシスに入る細胞の良好なマーカーと考えられカスパーゼ−３活性は、ドキソルビシン又はカンプトテシンの存在下でしかしＴＳＰ１の非存在下での同じ活性と比較して、ＴＳＰ１の存在下ではかなり阻害されることを見ることができる。したがって、ＴＳＰ１は、抗癌療法の対象となる甲状腺癌細胞のアポトーシスの割合を低下させる。

また、著者らによって、ＴＳＰ１の発現レベルは、異なる侵襲能力を有する（Ｓｉｄｅｔａｌ．，２００８）二つの癌細胞株（ＦＴＣ−１３８及びＦＴＣ−１３３）を用いて、甲状腺癌細胞の浸潤能と相関することが示された。

その後、Ｋ−Ｒ−Ｆ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ配列を有するペプチド４Ｎ１の使用により、ＴＳＰ１のＣ末端が抗アポトーシス効果の原因として同定されることができた。実際に、このペプチドは、細胞の一部で応答を引き起こすＣＤ４７受容体との分子相互作用を確立することができる。

また、「インテグリン関連蛋白質」のＩＡＰとしても知られているＣＤ４７は、大部分の細胞に発現される免疫グロブリンファミリーに属する膜貫通受容体である。ＣＤ４７の細胞外ドメインは、ＴＳＰ１又はＴＳＰ２のＣ末端部分に結合後に、ヒト細胞及び組織の応答において中心的な役割を果たす。
したがって、本発明者らは、癌細胞、特にヒト甲状腺癌のＦＴＣ−１３３細胞のアポトーシスの阻害におけるペプチド４Ｎ１及びＣＤ４７受容体の役割を理解しようと努めた（Ｒａｔｈｅｔａｌ．，２００６）。

図２から分るように、外因性ペプチド４Ｎ１の存在下での腫瘍細胞の生存率は、二つの薬物であるカンプトテシン及びドキソルビシンの一方又は他方のみで処理した細胞又は対照ペプチド４ＮＧＧで処理した細胞のそれよりも大きい。
したがって、ＴＳＰ１のＣ末端に由来するペプチド４Ｎ１は、カンプトテシン及びドキソルビシンタイプの抗癌分子に対する甲状腺癌細胞の耐性を誘導する抗アポトーシス特性を有する。しかしながら、対照ペプチド４ＮＧＧは、これら二つの薬物により誘導される腫瘍細胞の数の減少に対しては何ら効果を有しない。

さらに、目的のペプチド４Ｎ１の存在下で、ＣＤ４７をブロックするＢ６Ｈ１２抗体が添加されたときには、前記ペプチドはもはや使用された抗癌薬に対して腫瘍細胞を保護できない。

したがって、得られた異なる結果は、トロンボスポンジ、特にＴＳＰ１は、受容体であるＣＤ４７へＣ末端を介して結合することによって腫瘍細胞と相互作用することを証明している。したがって、ＣＤ４７受容体は、ＴＳＰ１のＣ末端に位置するペプチド４Ｎ１による腫瘍細胞のアポトーシスの負の調節において「リレー（ｒｅｌａｙ）」として作用する膜蛋白質を演じている。

また、これらの結果は、ペプチド４Ｎ１のものと同一又は非常に類似の、従来技術で提案された多数のペプチド配列は、明らかにこの場合の用途には適していないことを示している。実際に、このペプチドは効果的にＣＤ４７受容体へ固定する能力を有し、その結果、ＣＤ４７受容体とＴＳＰ１もしくはＴＳＰ２タイプの蛋白質との間の結合の阻害を引き起こす。しかしながら、前記の結果は、ペプチド４Ｎ１とＣＤ４７受容体との間のこのような結合は、腫瘍細胞の生存率及び特定の薬物に対する耐性を増加させることを証明している。したがって、ペプチド４Ｎ１はＣＤ４７受容体のアゴニストとして作用する。

次いで、独創的で発明的なステップの一部として、本発明者らは、前記した生物学的効果、特に腫瘍細胞に対する抗アポトーシス効果の原因であるＣＤ４７受容体とＴＳＰ１との間の分子相互作用について更に見出すように努めた。
したがって、ＴＳＰ１のＣ末端の分子モデリング、より具体的には、４Ｎ１配列を含む領域とＣＤ４７受容体との間の相互作用のモデリングを行った。

次いで、ＴＳＰ１のＣ末端部分の動きを同定するために、通常の分析技術を使用した（Ｆｌｏｑｕｅｔｅｔａｌ．，２００８）。この技術は、古典的分子動力学シミュレーションのみと実験生物物理学的方法では満足な結果が得られないので、普遍的に好まれた。さらに、ＣＤ４７受容体とＴＳＰ１との間の相互作用は、蛋白質データバンク（ＰＤＢ）で利用可能なＴＳＰ１の結晶構造だけでは説明できない。実際に、Ｘ線回折によって得られる利用可能なＴＳＰ１構造によって、４Ｎ１配列はＴＳＰ１蛋白質の疎水性ポケット内に完全に埋め込まれ、それにより前記配列とリガンドとのいずれの相互作用も不可能となると説明できることのみが可能となる。

図３に示されるＦｌｏｑｕｅｔら（２００８）によって得られた結果により、ペプチド４Ｎ１とＣＤ４７受容体との間の相互作用に導くメカニズムが説明できる。実際に、分析により、静電的「ベルクロ（ｖｅｌｃｒｏ）」効果によりＴＳＰ１蛋白質がＣＤ４７受容体に近づくと、ＴＳＰ１蛋白質の疎水性ポケットが開くことが具体的に示された。次いで、このオープニングが現れて、ペプチド４Ｎ１の生物学的に活性な配列が接近可能となり、前記ペプチドの仲介により、ＴＳＰ１とＣＤ４７受容体との間の相互作用が起こることができる。

次いで、疎水性ポケットのオープニングの動きをより詳細に調査し、これにより、様々な程度に開いたＴＳＰ１蛋白質の異なる構造が生成されることが可能になった。

並行して、ＣＤ４７受容体の細胞外部分のいくつかのモデルが、相同性モデリング技術を用いて生成された。
さらに、蛋白質−蛋白質ドッキング法を用いて実施した分析により、開いたＴＳＰ１構造とＣＤ４７受容体との間の相互作用の潜在的な領域を予測することも可能となった。得られた結果は図４に見ることができる。

次いで、得られた相互作用モデルにより、ＴＳＰ１蛋白質との相互作用に関与するＣＤ４７受容体配列を模倣するペプチドフラグメントの提案が可能となった。
したがって、提案されたペプチドは、ＴＳＰ１が利用可能になると、具体的には、ＣＤ４７膜受容体に近づくと、ＴＳＰ１のＣ末端上に、具体的には、ペプチド４Ｎ１によって構成される相互作用の領域に有利に固定することができる。換言すれば、本発明によるペプチドは、これらの二つ蛋白質間の結合部位でＴＳＰ１に非常に特異的に固定することによって、ＴＳＰ１／ＣＤ４７相互作用に拮抗することができる。

この方法においては、ＣＤ４７細胞受容体は、フリーのままで、ＴＳＰ１のみならず通常のリガンドと自由に相互作用することができる。さらに、ＴＳＰ１蛋白質の他のドメインは、また、それらの結合能力を保持できる。したがって、これら二つの蛋白質ＴＳＰ１及びＣＤ４７が多くの基本的な細胞プロセスにいかに重要であるかを知るとき、本発明によるペプチドは特に有利である。

特に興味ある実施形態では、ＴＳＰ１蛋白質とＣＤ４７受容体との間の結合を拮抗するために選択されたペプチドは、前記受容体の細胞外ドメイン内の短い配列に対応し、特に以下の配列Ｓ１を有するドデカペプチドに対応する。
Ｓ１：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６

優先的には、Ｒ１は非極性アミノ酸基に属するアミノ酸に対応する、すなわち、イソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）又はバリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）に対応する。同様のことが、Ｒ３とＲ５にも適用される。

興味ある実施形態では、Ｒ２のアミノ酸は負荷電極性アミノ酸基に属し、すなわち、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）である。同様のことが、Ｒ４に適用される。

有利には、Ｒ６のアミノ酸は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）を有する非荷電極性アミノ酸基に属する。したがって、Ｒ６はセリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）のいずれかに対応する。

式：Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇを有するセントラルヘキサペプチドは、ＴＳＰ１のＣ末端ドメインに対する本発明によるペプチドの結合を可能にするために特に有利である。配列Ｓ１においてそれに先行するかもしくは後に来るアミノ酸は修飾することができるが、ＴＳＰ１蛋白質との最適な結合のためにこのヘキサペプチドを保持することが好ましい。

特に有利な実施形態では、本発明によるドデカペプチドは、Ｓ２として同定される以下の配列に対応する配列Ｓ１を有する。
Ｓ１：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６

実際に、この特定の配列Ｓ２は、ＴＳＰ１蛋白質のＣＤ４７受容体との相互作用を拮抗するために最適である。

本発明者らによって行われた以前の研究の結果によって、ＴＳＰ１／ＣＤ４７結合のブロックがヒト甲状腺癌の癌細胞のアポトーシス阻害の解除を導くことを我々は知っている（Ｒａｔｈｅｔａｌ．，２００６）。その結果、本発明によるペプチドの使用は、特にしかし限定的でなく、甲状腺癌の腫瘍細胞による組織浸潤の阻害を可能にする。

次いで、他のタイプの癌からの腫瘍細胞を用いて、これらの結果を確認するための仕事が行われた。かくして、乳癌からの細胞に対応するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、本発明によるドデカペプチドと共にもしくは無しで、２４時間インキュベートした。具体的には、用いた配列は、配列Ｓ２：Ｉ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｓを有するものである。

ＣＤ４７に対する抗体との複合体の免疫沈降、次いでウエスタンブロット法によるＴＳＰ１及びＣＤ４７蛋白質の分析を行った。結果を図５に示す。図５から分かるように、本発明によるアンタゴニストペプチドと共に癌細胞をインキュベートしたときの免疫沈降後のウェスタンブロット分析によっては、ＴＳＰ１はもはや検出されない。これは、該ペプチドを用いた治療は、ＴＳＰ１蛋白質とＣＤ４７受容体との間の分子相互作用を妨げることを意味する。

また、本発明は、５０未満のいくつかのアミノ酸を含み、本発明による配列Ｓ２と少なくとも６０％の相同性、好ましくは８０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチドを含むポリペプチドに関する。
実際に、６０％の相同性に対応する、１２個の全部のうち７個のアミノ酸の割合が、ＴＳＰ１とＣＤ４７受容体との間の結合を阻害するのに十分な最小活性配列を構成する。

本発明による配列の非ペプチド構造類似体の使用もＴＳＰ１／ＣＤ４７結合を阻害することを想定できる。

特に興味ある実施形態では、本発明によるペプチドは環化する。実際に、本発明のペプチドに対応するＣＤ４７のセグメントが受容体内のループを形成することが見出された。かくして、そのような環化は、該ペプチドとＴＳＰ１蛋白質のＣ末端との間の相互作用を安定化させることができ、それが該ペプチドの生物学的活性と有効性を向上させる効果を有するため、有利である。さらに、異なるペプチドについての分子動力学計算により、前記ペプチドの環化を行うことで局所的な構造を安定化させることが可能であることが示された。

本発明によるアンタゴニストペプチドの環化は、この目的に適合し、当業者に公知のいずれの手段によっても行うことができる。特に、アミド結合によって環化を行うことが有利である。

さらにより優先的には、目的のペプチドの環化は、システイン（Ｃ）タイプの二つのアミノ酸のチオール基（−ＳＨ）を連結する強力な共有結合であるジスルフィド架橋により行われる。

シクロペプチドを得るためにジスルフィド架橋を選択することは、それがペプチドを生理的ｐＨで両性イオンの形態で維持することを可能にするので、特に有利である。両性イオン形態の分子は、正電荷を有するアミノ基と負電荷を有するカルボキシル基を有する。両性イオン形態は、分子が水溶液中で良好な溶解性を保持することを可能にするため、有利である。

かくして、本発明の特に好ましい実施形態では、ドデカペプチドは、Ｓ３：Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｃとして同定される配列に対応する配列Ｓ１を有する。両末端に存在するＲ１及びＲ６基は、それぞれ、システインで置換されている。ペプチドの両端の二つシステイン（Ｃ）アミノ酸により、それらのそれぞれのチオール基間のジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）の形成が可能となる。

前記配列Ｓ３のペプチドは、抗ＣＤ４７抗体を用いて実施したＴＳＰ１／ＣＤ４７複合体免疫沈降実験に関する限り、配列Ｓ２を有する非環化ペプチドと同じ結果を有する。結論として、シクロペプチドもＴＳＰ１蛋白質とＣＤ４７受容体との間の分子相互作用を防ぐことができる。

配列Ｓ３：Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｃの環化ドデカペプチドの作用も、同系Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに注射したＢ１６−Ｆ１マウスメラノーマモデルで生体内で直接試験した。その結果を図６および図７に示す。

図６は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへのメラノーマ細胞の注射後２０日目、及び目的の環化ペプチドを用いた動物の可能な処置後、腫瘍の出現を示している。前記ペプチドで処置した（図の右側）マウスの半分（４／８）は、腫瘍内に位置する大きな壊死領域を示し、他方、「対照」マウスのいずれも、そのような壊死を示さなかった。

図７では、磁気共鳴画像（ＲＭＩ）分析により、未処置動物から採取した腫瘍と、腫瘍細胞注射後１２日目のジスルフィド架橋による環化ペプチド処置動物から採取した腫瘍との比較が可能である。

この図では、本発明による環化ペプチドを用いた処置動物からの腫瘍は、矢印で表示した壊死領域を有することが分る。これに反して、処理されていない動物からの同じ腫瘍は、いかなる壊死領域も有していない。したがって、前記ペプチドは抗腫瘍活性を有する。
したがって、本発明によるペプチド、特に環化ペプチドは、濾胞性甲状腺癌、乳癌又は黒色腫の治療に使用することができる。しかしながら、このような用途は限定されるものではなく、本発明によるペプチドが前記のもののみならず多数の異なる癌を治療するために使用できることは容易に想像できる。

図８に示された本発明の別の利点は、目的のペプチドが腫瘍血管新生を阻害することである。血管新生は、例えば胚成長中に起こる正常な生理的過程である。しかしながら、血管新生はまた、悪性腫瘍の生長及び腫瘍転移において必須の病理学的過程に対応する。実際に、悪性細胞が成長するために酸素と栄養が必要とされる。それらを得るために、悪性細胞は、隣接する健康な組織における既存の血管を使用して、新しい血管の形成を誘導する。これらの新しい血管が形成されるとき、一方では、それらは腫瘍の生長だけでなく、遠隔器官への癌細胞の拡散を容易にする。

血管新生は、三つのフェーズで起こるプロセスである。すなわち、
−最初は基底膜及び周囲の細胞外マトリックスへの損傷を引き起こす細胞の活性化に対応し、次いで、内皮細胞の遊走に対応する萌芽である。細胞は増殖し、血管を形成するために毛細管様構造に分化する；
−既に形成された血管が拡大して分離される間の細胞壁の生長；及び
−内皮細胞が、別の管チャンネルを作る管の内側で成長する間の隔壁形成。

トロンボスポンジン、特にＴＳＰ１は、血管新生の調節において、特に腫瘍において、役割を果たすことが知られている。特に、ＣＤ４７受容体とＴＳＰ１との間の相互作用は、抗血管新生効果を有することが知られている。したがって、本発明によるペプチドの腫瘍の場合での使用は、先験的には、この抗血管新生効果の阻害により危険となり、腫瘍の潜在的な血管新生のリスクとなることがある。しかしながら、本発明者らによって行われた研究により、予想できることに反してそして非常に驚くべきことに、本発明によるペプチドは、試験した細胞に対して抗血管新生効果を有することが示された。

実際に、ＴＳＰ１はＣＤ４７受容体と相互作用するのみならず、ＣＤ３６受容体と結合することもできる。したがって、ＴＳＰ１／ＣＤ３６相互作用は、腫瘍及び／又は内皮細胞に対する抗血管新生効果を有すると見られる。本発明のペプチドにより、そして我々はすでに見てきたように、ＴＳＰ１／ＣＤ４７の相互作用が防止される。しかしながら、ＴＳＰ１とＣＤ３６受容体との間の結合は、ＴＳＰ１が他のリガンドと結合することを防ぐことはできない、目的のペプチドの非常な特異性によって、依然として起きることができる。さらに、ＴＳＰ１はもはやＣＤ４７受容体に結合することができないことを考慮すれば、多くの割合のＴＳＰ１はＣＤ３６上に固定することができ、それが腫瘍血管新生のより大きな阻害を導くであろう。

図８の写真には、ＨＵＶＥＣ細胞がその輪郭が点線で示されている創傷に供された後の、アンタゴニストペプチドの存在下及び非存在下でのＨＵＶＥＣ細胞の遊走が示されている。結果は四つの別々の実験の代表であり、それらは、血管形成のプロセスの最初の段階、すなわち細胞遊走は、本発明によるアンタゴニストペプチドの存在下で阻害されることを示している。

かくして、本発明によるアンタゴニストペプチドの非常な特異性により、ＴＳＰ１蛋白質は、依然としてＣＤ３６受容体に結合することができる。しかしながら、ＴＳＰ１及び／又はＣＤ４７と膜又は可溶性蛋白質との間の他の相互作用もまた可能である。具体的には、ＨＳＰＧ（ヘパリン硫酸プロテオグリカン）、ＳＩＲＰ（シグナル調節タンパク質）タイプなどのインテグリンの膜蛋白質との相互作用は、アンタゴニストペプチドの抗腫瘍効果及び／又は抗血管新生効果におそらく関与し強化することができる。

本発明による目的のペプチドの合成に関する限り、特にしかし限定的ではないが、組換え製造により行うことができる。この趣旨で、前記ペプチドをコードする核酸配列、優先的にはＤＮＡを、優先的にはベクターにより宿主細胞に導入することができる。
かくして、さらに本発明は、本発明によるペプチドをコードする単離された核酸に関する。優先的には、これはＤＮＡであろうが、しかし、それはまた、ＲＮＡでもあり得る。

さらにより優先的には、また、前記ペプチドは当業者に公知の古典的な化学合成技術によって取得することもできる。

したがって、本発明によるペプチドは多種多様な利点を有する。例えば、その短い配列は、特に古典的な化学合成技術により得ることが容易である。

しかしながら、最も大きな利点は、該ペプチドが特異的にＴＳＰ１／ＣＤ４７結合をブロックするという事実にある。より具体的には、ブロックされるのはＴＳＰ１のＣ末端であることである。かくして、ＴＳＰ１蛋白質の他のドメインは、そのそれぞれのリガンドと相互作用し続けることができる。具体的には、Ｉ型繰り返しドメイン（プロペリジン相同ドメイン）を含むＴＳＰ１ドメインは、ＣＤ３６細胞受容体と相互作用することができ、それが血管新生の阻害を導く。かくして、我々は、腫瘍の血管新生の減少、そして結果として、癌細胞浸潤の阻害を得る。また、ＣＤ４７受容体はフリーのままで、そしてその天然リガンドに結合することができる。さらに、ＴＳＰ１／ＣＤ４７の相互作用をブロックするために既に従来技術で使用された抗ＣＤ４７抗体又はペプチド４Ｎ１などの分子があり得るように、本発明によるペプチドがＣＤ４７受容体のアゴニストであることの危険性がない。

かくして、該アンタゴニストペプチドは、種々の疾患、特に腫瘍そして濾胞性甲状腺癌、乳癌又は黒色腫のために多くの潜在的な応用を有し、そこでは該アンタゴニストペプチドは腫瘍の発生及び／又は癌細胞の転移を制限しなければならない。例えば、前記ペプチドは、特定の種類の癌細胞においてアポトーシスを誘導する化学療法の効果の増強を可能にすると考えられ、実際に、目的のペプチドは、これらの治療に対する癌細胞の抵抗を減少するのに貢献するであろう。

最後に、多くの参照文献が、ＴＳＰ蛋白質は高い血管収縮能があるとみなしていること、そして本発明によるペプチドは血管新生促進ストラテジーの開発に影響を与えることを考慮すると、心血管や脳疾患の分野での潜在的な応用がまた想定される。

参照文献

Claims

以下の配列Ｓ１のみを有することを特徴とする、ＣＤ４７受容体とトロンボスポンジン又はＴＳＰファミリーに属する蛋白質との間の結合に対するアンタゴニストペプチド。
Ｓ１：Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６
（ここで、Ｒ１からＲ６はアミノ酸である。）
基Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、それぞれイソロイシン（Ｉ）及び／又はロイシン（Ｌ）及び／又はバリン（Ｖ）及び／又はアラニン（Ａ）から選択される一つの非極性アミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
基Ｒ２及びＲ４は、それぞれグルタミン酸（Ｅ）及び／又はアスパラギン酸（Ｄ）から選択される負荷電極性アミノ酸であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のペプチド。
Ｒ６は、セリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）から選択されるヒドロキシ基を含む非荷電極性アミノ酸であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド。
前記ペプチドの配列Ｓ１は、配列Ｓ２として同定される以下の配列に等しいことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチド。
Ｓ２：Ｉ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｓ
前記ペプチドは環化されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチド。
前記ペプチドは、システイン（Ｃ）の二つのアミノ酸の間のジスルフィド架橋によって環化されており、配列Ｓ３として同定される以下の配列Ｓ１を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
Ｓ３：Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｃ
前記ペプチドは組み換え製造により得られることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド。
前記ペプチドは化学合成により得られることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド。
癌の治療のための、請求項１から９のいずれか１項に記載のペプチド。
濾胞性甲状腺癌の治療のための、請求項１０に記載のペプチド。
乳癌の治療のための、請求項１０に記載のペプチド。
黒色腫の治療のための、請求項１０に記載のペプチド。
トロンボスポンジン−１とＣＤ４７受容体との間の相互作用を防止し、そしてこの相互作用の癌細胞に対する抗アポトーシス効果を阻害するための、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド。
トロンボスポンジン−２とＣＤ４７受容体との間の相互作用を防止し、そしてこの相互作用の癌細胞に対する抗アポトーシス効果を阻害するための、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のペプチド。
５０未満のいくつかのアミノ酸を含み、請求項５による配列Ｓ２と少なくとも９５％の同一性を有し、ＣＤ４７受容体とトロンボスポンジン又はＴＳＰファミリーに属する蛋白質との間の結合に対するアンタゴニスト活性を有するポリペプチドを含む、ＣＤ４７受容体とトロンボスポンジン又はＴＳＰファミリーに属する蛋白質との結合阻害剤。
請求項１から８のいずれか１項に記載のペプチドをコードする単離された核酸。