JP6095889B2 - 染色体２１ｑ、６ｑ、および１５ｑの遺伝子変異およびこれらを使用して１型糖尿病を診断および治療する方法 - Google Patents

Description

本願は、２００８年５月１６日付け出願済み米国仮特許出願第６１／０５４，０４０号（参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする）の優先権を主張するものである。

本発明は、糖尿病、特に１型糖尿病に関連するグルコース代謝、遺伝学、および病理学の分野に関する。より具体的にいうと、本発明は、これまでこの疾患に関連付けられてこなかった一塩基多型などの遺伝子変異を含む遺伝子パネルを提供する。これにより識別される配列を診断および治療措置のため使用する方法およびキットも提供され、また糖尿病を管理する治療薬の組成も提供される。

本発明の関連分野における技術水準について説明するため、本明細書の全体にわたり数件の刊行物および特許文献を引用している。これらの各引用文献については、参照によりその全体を記載したものとして本明細書に組み込むものとする。

１型糖尿病（ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ、略称Ｔ１Ｄ）は、自己免疫により膵β細胞（膵ベータ細胞）が破壊される結果起こり、この過程は、複数の遺伝子および環境要因に強く影響されると考えられている。Ｔ１Ｄは欧米諸国で増えており、米国では過去３０年で２倍を超える増加を呈している。この疾患は、強い家族性要因を示し、患者の第一度近親者がＴ１Ｄを発症するリスクは、一般集団から無作為に選択した者より１５倍高く、一卵性双生児におけるＴ１Ｄの一致率は約５０％である。しかし、遺伝的証拠は強力である一方、後者のデータは、環境要因との相互作用もＴ１Ｄの転帰（アウトカム）に影響を及ぼす重要な役割を果たすことを示唆している。

Ｔ１Ｄの家族集積性は、複数の遺伝子に影響される。Ｔ１Ｄの家族集積性は、４つの遺伝子座の変異により有意に高まることがすでにわかっている。その４つの遺伝子座としては、６ｐ２１の主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ、略称ＭＨＣ）領域（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、−ＤＱＡ１、および−ＤＲＱ１遺伝子を含む^１）と、１１ｐ１５のインスリン／インスリン様成長因子２遺伝子複合体（ＩＮＳ−ＩＧＦ２）^２−４と、１ｐ１３のタンパク質チロシンホスファターゼ−２２（ＰＴＰＮ２２）遺伝子と^５，６、２ｑ３１の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）^７，８をコードする遺伝子とがある。１０ｐ１５のインターロイキン２受容体α（ＣＤ２５）遺伝子座^９も、Ｔ１Ｄの発症機序において示唆されているが、依然として他の独立した研究での確認が待たれる。また、Ｔ１Ｄを自然発症するマウスモデルの研究では、複製研究で確認された他の多くの領域が示唆された^１０。Ｔ１Ｄのヒト関連解析では他のいくつかの遺伝子座も示唆されているが、これら示唆された遺伝子の作用は現在も盛んに議論されており、十分な標本サイズを利用した独立研究による確認が必要とされている。総合すると、これらの研究では、今後もより多くのＴ１Ｄ感受性遺伝子が発見されることが示唆されている。

本発明によれば、Ｔ１Ｄ発症リスクの増加または減少を示すＴ１Ｄ関連ＳＮＰ（一塩基多型）が特定された。これにより、一態様において、表１、表２、表４、および表５で特定された少なくとも１つの遺伝子変異を有する核酸が提供される。そのような核酸と、それによりコードされたタンパク質とは、１型糖尿病（ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ、略称Ｔ１Ｄ）の診断および管理において実用性を有する。

本発明の別の態様では、Ｔ１Ｄ発症感受性を評価する方法が提供される。例示的な方法は、正常な集団において所定の配列を有する標的核酸を患者試料から提供する工程と、少なくとも１つの遺伝子変異、例えばＴ１Ｄ発症リスクの増加または減少を示す一塩基多型の存在の有無について前記標的核酸を評価する工程とを伴う。そのような遺伝子変異としては、前記配列における少なくとも１つのヌクレオチドの逆位、欠失、重複、および挿入などがある（これに限定されるものではないが）。

前記遺伝子変異は、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２、およびＥＤＧ７をコードする核酸と、それに関連する遺伝子領域に存在する一塩基多型であることが好ましい。そのような遺伝子領域には、表３に提供された連鎖不平衡ブロックが含まれ、前記方法は、そのようなブロック内で糖尿病に関連する任意の変異体を検出する工程を伴う。前記ＳＮＰは、第２１染色体のＵＢＡＳＨ３Ａ遺伝子で座位４２７０９４５９に存在するｒｓ９９７６７６７、第６染色体のＢＡＣＨ２遺伝子で座位９１０１４１８４に存在するｒｓ３７５７２４７、または第１５染色体のＲＡＳＧＲＰ１遺伝子で座位３６６９４３３３に存在するｒｓ７１７１１７１であることが好ましい。

本発明の方法には、Ｔ１Ｄの診断用に表１、２、４、または５に記載された一塩基多型を有するＴ１Ｄ関連遺伝子変異のいずれかを検出する工程も含まれる。その代替態様または追加態様として、表３に記載された連鎖不平衡ブロックに存在するＴ１Ｄ関連遺伝子変異を検出することができる。上記の方法を実施するためのキットおよびマイクロアレイも提供される。

さらに別の実施形態では、Ｔ１Ｄを管理する方法が提供され、この方法は、治療薬を必要とする患者に当該治療薬を投与する工程を伴う。前記治療薬は、小分子、抗体、タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡ分子であってよい。

本発明の別の態様では、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２、およびＥＤＧ７を結合し、および／またはこれらの機能的活性を調節する薬剤を特定する方法と、生物学的に許容される基剤中に前記薬剤を有する医薬組成物とが提供される。

ＨａｐＭａｐの欧州データに基づいたＲＡＳＧＲＰ１ ＳＮＰのＬＤプロット（連鎖不平衡マッピング）。頂部パネルは、２９の真獣類哺乳類のＤＮＡ配列のアラインメントについて、制約された要素と保持スコア（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）とを示している（Ｅｎｓｅｍｂｌ、ワールドワイドウェブ（ウェブサイト）ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）。ＣｏｏｐｅｒらＧｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５、１５：９０１−９１３を参照。このＬＤマップ（連鎖不平衡マッピング）は、ワールドワイドウェブｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｅｒｓｏｎａｌ／ｊｃｂａｒｒｅｔ／ｈａｐｌｏｖｉｅｗから利用できるＨａｐｌｏｖｉｅｗバージョン４．０ソフトウェアにより作製したものである。Ｄ’値（％）は各ボックス内に示されており、ｒ^２値はグレースケールで表されている。赤い矢印は、この研究で遺伝子型が決定されたＳＮＰを示している。赤い円の内側は、実施例Ｉで説明しているＳＮＰである。

１型糖尿病（ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ、略称Ｔ１Ｄ）は、一般的で遺伝性の強い疾患であり、ほとんどの場合、小児期に発症する。近年のゲノムワイド関連解析（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、略称ＧＷＡ）により、この疾患に関連する新たな遺伝子がいくつか明らかになった。我々は、新たなＴ１Ｄリスク遺伝子座を発見する試みとして、Ｔ１ＤのＧＷＡ解析に関する追跡調査戦略を実施した。これに際し、Ｐ値が少なくとも名目上有意な（ただし、主要組織適合遺伝子複合体領域内のものを除く）９８２の一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、略称ＳＮＰ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ ＢｅａｄＣｈｉｐを使って、５６３名のＴ１Ｄ発端者および１，１４６名の対照群、さらに祖先が同じである４８３組の完全なＴ１Ｄトリオ（患者とその父母）について生成したデータの組み合わせから選択した。次に、モントリオール（カナダ、ケベック州）のＴ１Ｄ核家族９３９組からなる独立したコホートと、Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（１型糖尿病遺伝学コンソーシアム）とにより、これらのＳＮＰの遺伝子型を決定した。次いで上記３つのコホート全体と、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ウェルカムトラストケースコントロールコンソーシアム）のＴ１Ｄに関するデータセットとを調べ、これまでに説明されておらず、かつ、全コホートにわたり名目上有意な遺伝子座におけるＳＮＰを特定した。さらに調査する対象として５つの遺伝子座を選択し、フィラデルフィア（米国ペンシルバニア州）の糖尿病に罹患していない者からなる独立した対応対照群データセット（１ＭおよびＨｕｍａｎＨａｐ５５０Ｋ ＳＮＰ ＢｅａｄＣｈｉｐｓでそれぞれ遺伝子型を決定済み）を使って、１，３０３名のＴ１Ｄ患者を含む、ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ研究のＴ１Ｄ発端者に問診を行なった。また、このコホートでは５つの変異体のうち２つ（ｒｓ９９７６７６７およびｒｓ３７５７２４７）がＴ１Ｄに有意に関連していた。これらのＳＮＰは、自己免疫に生物学的に関連するＵＢＡＳＨ３Ａ遺伝子（オッズ比１．１６、５つのコホートを合わせてＰ＝２．３３×１０^−８）およびＢＡＣＨ２遺伝子（オッズ比１．１３、合わせてＰ＝１．２５×１０^−６）にそれぞれ常駐する。結果を要約すると、欧州人子孫からなる５つの異なるコホートにわたり、Ｔ１Ｄに関連する遺伝子座が新たに２１ｑおよび６ｑに２つ特定された。

本発明の理解を助けるため、以下の定義を提供する。

本発明の目的上、冠詞「ａ」および「ａｎ」をつけて表記した実体は、１若しくはそれ以上の当該実体をいう。例えば「ａ ｃＤＮＡ」は、１若しくはそれ以上のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）または少なくとも１つのｃＤＮＡを意味する。したがって、「１つの（ａまたはａｎ）」、「１若しくはそれ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という表現は、本明細書で同義的に使われる場合がある。また、「を有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という表現も同義的に使われる場合があることに注意すべきである。さらに、「からなる群から選択される」化合物という表現は、それに続くリストに含まれる化合物のうち１若しくはそれ以上をいい、これには、当該化合物のうち２若しくはそれ以上の混合物（組み合わせ）が含まれる。本発明によれば、単離された分子または生物学的に純粋な分子とは、その本来の環境から取り出された化合物である。そのため、「単離された（単離した）」および「生物学的に純粋な」という表現は、必ずしも当該化合物の純度を反映したものではない。本発明の単離された化合物は、その自然源から得られたものであっても、研究室で合成技術を使って生成されたものであっても、またはそのようないかなる化学合成経路で生成されたものであってもよい。

「一塩基多型」（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、略称ＳＮＰ）とは、ＤＮＡ内の単一塩基が、その位置における通常の塩基と異なっていることをいう。これら単一塩基の変化は、ＳＮＰまたは「スニップ」と呼ばれる。これまで、数百万ものＳＮＰがヒト遺伝子カタログに収録されてきている。鎌状細胞を生じるＳＮＰなど、一部のＳＮＰは疾患の原因である。他のＳＮＰは、ゲノムの正常な変異による。

本明細書における用語「遺伝子変異」は、１若しくはそれ以上の核酸分子の野生型または参照配列からの変化をいう。遺伝子変異としては、既知の配列の核酸分子における少なくとも１つのヌクレオチドの塩基対の置換、挿入、および欠失などがある（これに限定されるものではないが）。

用語「１型糖尿病」（ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ、略称Ｔ１Ｄ）とは、膵臓が血糖レベルを適切に調節する上で十分な量のインスリンを生成しない場合に生じる慢性的な（生涯にわたる）疾患をいう。Ｔ１Ｄは、若年性糖尿病またはインスリン依存性糖尿病と呼ばれることが多く、炭水化物（グルコースなどの糖を含む）、タンパク質、および脂肪の代謝が改変される結果起こる。１型糖尿病では、グルコースが体細胞に進入できるようにするホルモンであるインスリンを、膵臓のβ（ベータ）細胞がほとんど、またはまったく生成しない。細胞に入ったグルコースは、燃料として使用される。インスリンが不十分であると、グルコースは、細胞に入らず血流内に蓄積する。身体は、血流中のグルコースレベルが高いにもかかわらず、このグルコースを使ってエネルギーを生成することができないため、空腹感が高まる。また、血中のグルコースレベルが高い患者は排尿の頻度が高まり、過度の口渇を覚える。診断後５〜１０年以内に、膵臓のインスリン産生β細胞は完全に破壊され、インスリンは生成されなくなってしまう。

「Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰまたはＴ１Ｄ特異的マーカー」とは、Ｔ１Ｄ発症リスクの増減に関連するＳＮＰまたはマーカーのうち、Ｔ１Ｄに罹患していない正常な患者には見られないものをいう。そのようなマーカーとしては、核酸、それがコードするタンパク質、または他の小分子などがある（これに限定されるものではないが）。１型糖尿病はすべての年齢で発症する可能性があるが、通常は３０歳未満で発症する。症状は、通常重篤で、急激に起こる。１型糖尿病の原因は、正確にはわかっていない。１型糖尿病は、毎年新たに発症する糖尿病のうち３％を占める。また、毎年７，０００人の子どもに１件の割合で発症する。２０歳を超えた成人に新たに発症することは、比較的少ない。

本明細書における用語「固体マトリックス」とは、ビーズ、マイクロ粒子、マイクロアレイ、マイクロ滴定ウェルまたは試験管の表面、ディップスティック、またはフィルターなど、すべての形態をいう。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースであってよい。「試料」、「患者試料」、または「生体試料」とは、一般に、特定の分子、好ましくは以降の表に示したマーカーなどＴ１Ｄに特異的なマーカー分子について、試験・検査の対象とできる試料をいう。試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、胸膜液などを含む細胞や体液などがある（これに限定されるものではないが）。

特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に言及した表現「から本質的に成る」は、所与のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ（配列ＩＤ番号）の特徴を有した配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用する場合、この表現には、当該配列の機能的特徴および新規性のある特徴に影響を及ぼさない配列自体および分子修飾が含まれる。

「連鎖」は、遺伝子、対立遺伝子（アレル）、遺伝子座、または遺伝子マーカーが、同じ染色体における各々の位置が原因となり、ともに継承される傾向をいう用語で、２つの遺伝子間、対立遺伝子間、遺伝子座間、または遺伝子マーカー間の組み換え率（別称「組み換え割合」またはθ）により表現される。染色体上で物理的に近い２つの遺伝子座ほど、組み換え割合は低くなる。通常、病原遺伝子内の多形部位を疾患との連関について試験すると、組み換え割合はゼロになり、当該疾患および病原遺伝子は必ずともに受け継がれることが示される。まれに、遺伝子が非常に大きなゲノム分節にわたり、遺伝子の一端で多形部位間の組み換えを、他端では疾患の原因となる突然変異を検出できる場合もある。ただし、疾患の原因となる突然変異がその疾患との連鎖に関する試験対象の多型である場合、組み換えは見られないことになる。

「センチモルガン」は、２つの遺伝子マーカー間、対立遺伝子間、遺伝子間、または遺伝子座間の連鎖を示す遺伝学的な距離の単位であり、１センチモルガンは、１回の減数***につき、２つのマーカー間または遺伝子座間で１％組み換えが起こる確率に対応する。

「連鎖不平衡」または「対立遺伝子の関連」とは、一定の染色***置付近において、特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子、または遺伝子マーカーと、特定の対立遺伝子、遺伝子座、遺伝子、または遺伝子マーカーとが、集団内の任意の特定対立遺伝子に期待される確率より高い頻度で選択的に関連することを意味する。

本明細書における「標的核酸」とは、複雑な核酸混合物に含まれている、これまでに定義済みの核酸領域をいい、その定義済みの野生型領域には、Ｔ１Ｄに関連する可能性があり、またはその可能性がない、少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異が含まれる。その核酸分子は、ｃＤＮＡクローニング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、または手作業での合成により、自然源から単離することができる。前記核酸分子は、トリエステル合成法により、または自動ＤＮＡ合成装置を使って、手作業で合成できる。

本発明で使用する核酸に関しては、用語「単離された核酸（単離した核酸）」を使用する場合がある。ＤＮＡに対して使用する場合、この用語は、ＤＮＡ分子源である生物の天然ゲノムにおいて（５’および３’の方向で）隣接している配列から分離したＤＮＡ分子をいう。例えば「単離された核酸」は、プラスミドベクターやウイルスベクターなどのベクターに挿入され、または原核生物や真核生物のゲノムＤＮＡに統合されたＤＮＡ分子を有してよい。「単離された核酸」分子は、ｃＤＮＡ分子を有してもよい。また本明細書において、単離された核酸分子をベクターに挿入したものを、組み換え核酸分子と呼ぶ場合もある。

ＲＮＡ分子に関する場合、用語「単離された核酸」は、主に上記で定義済みの単離されたＤＮＡ分子でコードされたＲＮＡ分子をいう。あるいは、この用語は、ＲＮＡ分子が「実質的に純粋な」形態で存在するよう、自然状態（細胞内または組織内）で関連している他のＲＮＡ分子から十分に分離されたＲＮＡ分子をいう場合もある。核酸に関する用語「濃縮された」は、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が、関心のある細胞中または溶液中に存在する全ＤＮＡまたは全ＲＮＡに対し、正常な細胞中または配列取得元の細胞中よりも有意に高い画分（２〜５倍）を占めることを意味する。この状態は、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡの量を人が選択的に低減し、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の量を人が選択的に増加させ、またはこれら２つを組み合わせることにより、起こすことができる。ただし、「濃縮された」は、他のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が存在しないことを示唆するわけではなく、関心のある配列の相対量が有意に高まったことを示唆するので注意すべきである。

また、目的によっては、ヌクレオチド配列が純化された形態であることが有利である。核酸に関する用語「純化された（純化した）」は、必ずしも絶対的な純度（均一な製剤などの）を要求するものではなく、代わりに当該配列が自然な環境より比較的純粋であることを示す（自然なレベルと比べ、このレベルは、例えばｍｇ／ｍｌ単位で、少なくとも２〜５倍高くなければならない）。ｃＤＮＡライブラリーから単離した個々のクローンは、電気泳動による均一性まで純化されたものであってよい。これらのクローンから得られたＤＮＡ分子のうち本明細書の特許請求の範囲に記載されたものは、全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから直接取得できる。ｃＤＮＡクローンは自然発生するものではなく、部分的に純化された自然発生物（メッセンジャーＲＮＡ（略称ｍＲＮＡ））を操作して得られることが好ましい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築するには、合成物（ｃＤＮＡ）を生成する必要があり、純粋な各ｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライブラリーを含む細胞のクローン選択により合成ライブラリーから単離することができる。このように、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリー構築と、区別可能なｃＤＮＡクローンの単離とを含む工程により、ネイティブなメッセージ（自然状態の情報）を約１０^−６倍に純化することが可能になる。そのため、少なくとも１０倍増、好ましくは１０^２倍増または１０^３倍増、より好ましくは１０^４倍増または１０^５倍増の純化が、明示的に意図される。したがって、用語「実質的に純粋な」は、関心のある化合物（核酸やオリゴヌクレオチドなど）を少なくとも５０〜６０重量％有する製剤を指していう。この場合、製剤は関心のある化合物を少なくとも７５重量％有することがより好ましく、９０〜９９重量％有することが最も好ましい。純度は、関心のある各化合物に適した方法で測定される。

用語「相補的」は、複数の好適な相互作用が可能な２つのヌクレオチドを説明する。例えば、アデニンはチミンに対し相補的であり、これら双方は２つの水素結合を形成する。同様に、グアニンとシトシンは互いに相補的で、３つの水素結合を形成する。そのため、ある核酸配列がチミン、アデニン、グアニン、およびシトシンの塩基配列をこの順で含む場合、この核酸分子の「補体」は、チミンの座位にアデニンを含み、アデニンの座位にチミンを含み、グアニンの座位にシトシンを含み、シトシンの座位にグアニンを含む分子である。補体は、親核酸分子と最適に相互作用する核酸配列を含むことができるため、そのような補体と、その親分子とは、高い親和性で結合できる。

一本鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドに関し、用語「特異的にハイブリダイズする」は、当該技術分野で一般に使用されており（「実質的に相補的」と呼ばれる場合もある）、所定の条件下で当該ハイブリダイゼーションを可能にする上での、十分に相補的な配列の２つの一本鎖ヌクレオチド分子間の関連をいう。特に、この用語は、オリゴヌクレオチドと、それに実質的に相補的な配列を有する本発明の一本鎖のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子内に含まれるものとのハイブリダイゼーションをいい、オリゴヌクレオチドと、それに相補的でない配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションは実質的に除外される。例えば、特異的なハイブリダイゼーションは、任意のＴ１Ｄに特異的なマーカー遺伝子または核酸にハイブリダイズしても、他のヒトヌクレオチドにはハイブリダイズしない配列を参照していう。また、「特異的にハイブリダイズする」ポリヌクレオチドは、表１〜３に示したＴ１Ｄ特異マーカーなど、Ｔ１Ｄに特異的なマーカーだけにハイブリダイズする種々の相補性を有する一本鎖核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする適切な条件は、当該技術分野でよく知られている。

例えば、指定された配列相同性を有する核酸分子間でハイブリダイゼーションを起こすために必要なストリンジェンシー条件（条件の厳しさ）を計算する一般的な式の１つを次に示す（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）。
Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（ホルムアミド％）−６００／二本鎖の塩基対数
上式の例として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを使って、ＧＣ含有量４２％および平均プローブサイズ２００塩基とすると、Ｔ_ｍは５７℃となる。ＤＮＡ二本鎖のＴ_ｍは、相同性が１％下がると１〜１．５℃下がる。そのため、配列同一性が約７５％を超える標的であれば、４２℃のハイブリダイゼーション温度で検出される。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、プローブとその標的のアニーリング率を最大限に伸ばすには、通常、算出されたハイブリッド温度Ｔ_ｍより２０〜２５℃低い塩・温度条件でハイブリダイゼーションを行なう。洗浄条件は、標的用プローブの同一性の度合いに応じて、できるだけ厳しくすべきである。一般に、洗浄条件は、ハイブリッドのＴ_ｍより約１２〜２０℃低く選択される。本発明の核酸に関して、ストリンジェンシーが中程度のハイブリダイゼーションとは、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（デンハルト溶液）、０．５％ ＳＤＳ、およびＤＮＡ １００μｇ／ｍｌの変性サケ***中における４２℃でのハイブリダイゼーションおよび２Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳによる５５℃での１５分間の洗浄と定義される。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ ＳＤＳ、およびＤＮＡ １００μｇ／ｍｌの変性サケ***中における４２℃でのハイブリダイゼーションおよび１Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳによる６５℃での１５分間の洗浄と定義される。非常に高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションとは、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ ＳＤＳ、およびＤＮＡ １００μｇ／ｍｌの変性サケ***中における４２℃でのハイブリダイゼーションおよび０．１Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳによる６５℃での１５分間の洗浄と定義される。

本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」とは、短い配列のＤＮＡまたはＤＮＡ誘導体を意味し、通常８〜３５ヌクレオチド長のプライマーまたはプローブである。オリゴヌクレオチドは、クローニングまたは増幅により合成して得ることができる。オリゴとは、２若しくはそれ以上、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから成る核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、種々の要因と、各オリゴヌクレオチドの用途とに依存する。用語「誘導体」については、上述した変異体のうち、通常これら分子の一部ではない化学的部分を追加で有するものをすべて含むよう意図している。これらの化学的部分は、溶解性・吸収性・生物学的半減期の改善、毒性の低減、および望ましくない副作用の排除または低減を含め、種々の目的を有したものであってよい。

本明細書における用語「プローブ」とは、純化された制限酵素の分解生成物のように自然発生するか、合成されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）のうち、当該プローブに対し相補的な配列を伴った核酸とアニーリングでき、またはこれと特異的にハイブリダイズできるものをいう。プローブは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、プローブ源、および当該方法の用途を含む多くの要因に依存する。例えば、診断用途の場合、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、通常、１５〜２５若しくはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少数のヌクレオチドを含んでもよい。本明細書におけるプローブは、特定の標的核酸配列の種々の鎖に対し相補的であるよう選択される。これは、プローブが、一式の所定条件下で各々の標的鎖と「特異的にハイブリダイズ」し、またはこれとアニーリングするよう、十分に相補的でなければならないことを意味している。そのため、プローブ配列は、標的の厳密な相補配列を反映したものである必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプローブの５’端または３’端に結合し、そのプローブ配列の残りの部分が標的鎖に対し相補的であってもよい。あるいは、プローブ配列が標的核酸の配列に対し十分相補性があり特異的にアニーリングするのであれば、非相補的塩基またはより長い配列を当該プローブ内に散在させることもできる。

本明細書における用語「プライマー」とは、オリゴヌクレオチドのうち、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、一本鎖または二本鎖であり、生体系から得られ、制限酵素分解により生成され、または合成されたものであり、適切な環境に置かれた場合、鋳型（テンプレート）に依存する核酸合成の開始剤として機能的に作用できるものをいう。適切な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、および適切な温度やｐＨなどの条件が揃うと、ポリメラーゼ作用または類似活性により、プライマーの３’端にヌクレオチドが加わり、プライマー伸長生成物が得られる。プライマーの長さは、各用途の条件および要件に応じて異なる。例えば、診断用途の場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常、１５〜２５若しくはそれ以上の長さのヌクレオチドである。プライマーは、望ましい伸長生成物の合成を準備するよう、すなわちプライマーの３’ヒドロキシル部分を適切な並列状態で十分に提供してポリメラーゼまたは類似酵素での合成を開始できる態様で望ましい鋳型鎖とアニーリングできるよう、望ましい鋳型と十分な相補性がなければならない。プライマー配列は、望ましい鋳型の厳密な補体を提供する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列であっても、相補的なプライマーの５’端に結合させることができる。あるいは、望ましい鋳型鎖の配列と十分な相補性がプライマー配列にあり、伸長生成物を合成するための鋳型−プライマー複合体を機能的に提供できるのであれば、オリゴヌクレオチドプライマー配列内に非相補的塩基を散在させることもできる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、略称ＰＣＲ）については、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号、第４，９６５，１８８号に説明されており、これらの開示は参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。

「ｓｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子の配列との相同性を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、略称ｓｉＲＮＡ）を提供することによる、配列に特異的な転写後遺伝子サイレンシングまたは遺伝子ノックダウンのＲＮＡ干渉過程に係わる分子をいう。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で合成でき、またはより長いｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡの略称）のリボヌクレアーゼＩＩＩによる開裂で生成でき、配列に特異的なｍＲＮＡ分解のメディエーターである。本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトと、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置とを使って化学的に合成されることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、２つの別個の相補的ＲＮＡ分子として、または２つの相補的領域を伴った単一ＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬を市販する供給業者（サプライヤ）としては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツＨａｍｂｕｒｇ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅの一部門、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州Ａｓｈｌａｎｄ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国Ｇｌａｓｇｏｗ）などがある。ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２、およびＥＤＧ７ ｍＲＮＡを阻害する特異的なｓｉＲＮＡコンストラクトは、１５〜３５ヌクレオチド長であってよく、より一般には、約２１ヌクレオチド長であってよい。上記の遺伝子標的を下方制御（ダウンレギュレーション）する例示的なｓｉＲＮＡ分子を、表６〜１０に示す。

用語「ベクター」は、細胞に導入して感染させ、トランスフェクトし、またはこれを形質転換する一本鎖または二本鎖の環状核酸分子に関するもので、独立して、または宿主細胞ゲノム内で自己複製する。環状の二本鎖核酸分子は、制限酵素での治療時、切断して線状化することができる。各種ベクター、制限酵素、および制限酵素の標的であるヌクレオチド配列に関する知識は、当業者であれば容易に利用でき、これには、別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を結合させて結合させた配列または要素の複製を起こすことのできる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなどの任意のレプリコンも含まれる。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断しその２片をライゲーションすることにより、当該ベクターに挿入できる。

当業者であれば、原核生物または真核生物に対し、発現コンストラクトによる形質転換、トランスフェクション、または形質導入を容易にする多くの技術が利用できる用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「形質導入」とは、核酸および／または発現コンストラクトを細胞または宿主生物に挿入する方法をいう。これらの方法は、高濃度の塩、電場、または洗浄剤で細胞を処理して、関心のある核酸分子、マイクロインジェクション、ペプチドテザー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）融合などに対し、宿主細胞の外膜または細胞壁を透過性にするなど種々の技術を伴う。

用語「プロモーター要素」とは、ベクターに組み込まれているヌクレオチド配列であって、適切な細胞内に入ると転写因子の作用および／またはポリメラーゼ結合を促進したのち、当該ベクターＤＮＡの一部がｍＲＮＡに容易に転写されるよう作用するものをいう。一実施形態において、本発明のプロモーター要素は、Ｔ１Ｄに特異的なマーカー核酸分子の５’端より前にあり、これにより前記マーカー核酸分子がｍＲＮＡに転写される。次いで、宿主細胞の機構がｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。

当業者であれば、プロモーター要素とＴ１Ｄ特異マーカー遺伝子核酸分子と以外の核酸要素を核酸ベクターに含められることが理解できるであろう。それら他の核酸要素としては、複製起点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナルか局在化シグナルかポリペプチドの純化に有用なシグナルかをコードする核酸配列などがある（これに限定されるものではないが）。

「レプリコン」とはすべての遺伝要素をいい、例えばプラスミド、コスミド、バクミド、色素体（プラスチド）、ファージ、またはウイルスのうち、おおむね自律的に複製できるものをいう。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。

「発現オペロン」とは、核酸の一部であって、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（ＡＴＧコドンまたはＡＵＧコドンなど）、ポリアデニル化シグナル、終止コドンなど、転写および翻訳の制御配列を有し、宿主細胞または宿主生物内でポリペプチドコード配列の発現を促進するものをいう。

本明細書における用語「レポーター」、「レポーターシステム（レポーター系）」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」とは、産物をコードする遺伝子を核酸が有する作用可能な遺伝システムであって、前記遺伝子が発現すると、バイオアッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイなどにより、または比色法、蛍光検出法、化学発光法その他の方法で容易に測定できるレポーターシグナルを発するものを意味する。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、線状または環状であり、一本鎖または二本鎖であり、アンチセンス極性またはセンス極性を有し、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素に作用可能に結合する。その必要な制御要素は、レポーターシステムの性質と、レポーター遺伝子の形態がＤＮＡかＲＮＡかに応じて異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終了シグナルなどの要素を含んでよい（これに限定されるものではないが）。

導入された核酸は、受容細胞または受容生物の核酸に統合される（共有結合的に結合する）場合とそうでない場合がある。例えば細菌、酵母、植物、および哺乳類の細胞では、導入された核酸は、エピソーム要素として、またはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持される。あるいは、導入された核酸は、受容細胞または受容生物の核酸へと統合され、その細胞内または生物内で安定した状態で維持されて、さらに受け継がれ若しくは前記受容細胞または受容生物の子孫細胞または子孫生物へと継承される。最後に、導入された核酸は、受容細胞内または宿主生物内で、単に過渡的に存在することができる。

用語「選択可能なマーカー遺伝子」とは、発現した場合、抗生物質に対する耐性などの選択可能な表現型を形質転換細胞にもたらす遺伝子をいう。

用語「作用可能に結合される（結合する）」とは、コード配列が発現するよう、そのコード配列の発現に必要な調節配列が、当該ＤＮＡ分子内でそのコード配列に対して適切な位置に配置されることを意味する。これと同じ定義が、発現ベクターにおいて、転写単位その他の転写制御要素（エンハンサーなど）の配置に適用される場合もある。

用語「遺伝子組み換え生物」または「トランスジェニック生物」とは、遺伝子または核酸分子の新たな組み合わせを有する生物をいう。遺伝子または核酸分子の新たな組み合わせは、当業者が利用できる多様な核酸操作技術を使って生物に導入できる。用語「生物」（ｏｒｇａｎｉｓｍ）は、少なくとも１つの細胞から成るすべての生物に関する。生物は、真核単細胞のように単純なものから、哺乳類のように複雑なものまである。そのため「遺伝子組み換え生物」という表現は、遺伝子組み換え細胞だけでなく、遺伝子を組み換えた真核生物および原核生物も包含する。

本明細書では、用語「単離された（単離した）タンパク質」または「単離および純化された（単離および純化した）タンパク質」を使用する場合がある。この用語は、主に本発明の単離された核酸分子の発現により生成されたタンパク質をいう。あるいは、この用語は、あるタンパク質を「実質的に純粋な」形態で存在させるため、自然状態で関連する他のタンパク質から十分に分離したものをいう。「単離された（単離した）」という用語は、他の化合物または材料（物質）との人工混合物または合成混合物を除外するよう意図したものではなく、また基本的な活性に干渉しない不純物であって、例えば不完全な純化、安定剤の付加、または免疫原性製剤や薬学的に許容される製剤などへの配合により存在しうる不純物の存在を除外するよう意図したものでもない。

「特異的結合ペア」は、特定の相互特異性を有し、通常条件では他の分子より優先的に相互結合する特異的結合メンバー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ、略称ｓｂｍ）および結合パートナー（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ、略称ｂｐ）を含む。特異的結合ペアの例は、抗原および抗体、リガンドおよび受容体、互いに相補的なヌクレオチド配列などである。当業者であれば、他の例も多数認識しているであろう。さらに、用語「特異的結合ペア」は、特異的結合メンバーの一方または双方と、その結合パートナーとが、大分子の一部を有する場合にも適用される。特異的結合ペアが核酸配列を有する実施形態において、それらの核酸配列は、アッセイ条件下で互いにハイブリダイズする長さになり、好ましくは１０ヌクレオチド長を超え、より好ましくは１５ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長を超える。「試料」、「患者試料」、または「生体試料」とは、一般に、特定の分子、好ましくは表１〜４に示したマーカーなどＴ１Ｄに特異的なマーカー分子について、試験・検査の対象とできる試料をいう。試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、胸膜液などを含む細胞や体液などがある（これに限定されるものではないが）。

用語「剤（薬剤）」（ａｇｅｎｔ）および「試験化合物」は本明細書で同義的に使われ、化合物、化合物の混合物、生物高分子、あるいは生物材料（細菌、植物、菌類、または動物（特に哺乳類）の細胞や組織など）で生成された抽出物を示す。生物高分子としては、本明細書で説明するＳＮＰ含有核酸またはその各々がコードするタンパク質の活性を調節する能力を呈するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ。ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡまたはｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡの略称）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子、抗体、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および任意の核酸ベース分子（例えばオリゴ）などがある。薬剤は、本明細書で後述するスクリーニングアッセイに含めることにより、潜在的な生物活性について評価される。

本明細書における用語「調節する」（ｍｏｄｕｌａｔｅ）とは、増減させることをいう。例えば、用語「調節する」とは、化合物または試験薬剤（検査薬）が本発明の遺伝子またはタンパク質のシグナリングまたは活性と干渉する能力をいう。したがって、本明細書に開示する標的遺伝子（ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２、およびＥＤＧ７）を介してシグナリングを調節するとは、これら遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を、薬剤または化合物が阻害または増強することを意味する。これには、ナチュラルキラー細胞の活性を改変し、自己免疫β細胞の破壊を防ぐことが含まれる。

Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰを使ってＴ１Ｄ検出アッセイを行なう方法
本発明によれば、表１〜５に掲げたものを含む（これに限定されるものではないが）Ｔ１Ｄ ＳＮＰ含有核酸は、種々の目的に使用できる。Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの断片は、Ｔ１Ｄ特異的マーカーの存在および／または発現を検出するプローブとして使用することができる。Ｔ１Ｄに特異的なマーカー核酸をそのようなアッセイのプローブとして利用できる方法としては、（１）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、および（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、略称ＰＣＲ）などの各種増幅反応などがある（これに限定されないが）。

さらに、Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰを検出するアッセイは、体液（血液、尿、血清、胃洗浄液を含む）を含む（これに限定されるものではないが）全タイプの生体試料、全タイプの細胞（白血球、単核細胞など）、または体内組織について行なうことができる。

上記の説明から、本発明のＴ１Ｄ関連ＳＮＰ含有核酸と、これを発現するベクターと、Ｔ１Ｄ ＳＮＰ含有マーカータンパク質と、抗Ｔ１Ｄ特異的マーカー抗体とを使用すると、体内組織、体細胞、または体液に含まれるＴ１Ｄ関連ＳＮＰを検出し、Ｔ１Ｄ ＳＮＰ含有マーカーのタンパク質発現を改変することにより、Ｔ１Ｄに係わる遺伝的相互作用およびタンパク質の相互作用を評価できることがわかるであろう。

Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰをスクリーニングする実施形態の大半では、まず試料に含まれるＴ１Ｄ関連ＳＮＰ含有核酸をＰＣＲなどで増幅させて、その試料中に存在する他の配列と相対的に鋳型の量を増やす。これにより、標的配列が試料に含まれていれば、それを高い感度で検出できるようになる。この最初の工程を省略可能にするのが高感度アレイ技術で、高感度アレイ技術は当該技術分野でいっそう重要性を増している。あるいは、新たな検出技術でこの制限が克服され、合計でもわずか１μｇのＲＮＡしか含まない少量試料の分析が可能になることも考えられる。従来の蛍光技術と比べ、共鳴光散乱（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、略称ＲＬＳ）技術を使うと、ビオチンで標識しハイブリダイズさせた標的と抗ビオチン抗体とを使って少量のｍＲＮＡを複数のリード（読み枠）で検出できる。ＰＣＲ増幅に代わるもう１つの態様では、平面導波路（ｐｌａｎａｒ ｗａｖｅ ｇｕｉｄｅ、略称ＰＷＧ）技術を使って信号対雑音比を高め、背景干渉を低減するどちらの技術もＱｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（米国）の市販製品で利用できる。

このように、上述の技術のいずれを使っても、Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰマーカーの発現を検出または定量化することができ、したがって患者のＴ１Ｄ発症感受性も検出することができる。

キットおよび製造品
上記製品のいずれも、Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰ特異的マーカーポリヌクレオチドまたは１若しくはそれ以上の当該マーカーをＧｅｎｅＣｈｉｐに固定したもの、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、標識、マーカー、またはレポーター、薬学的に許容される基剤、生理学的に許容される基剤、取扱説明書、容器、投与用管（ｖｅｓｓｅｌ ｆｏｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、アッセイ用基板、またはこれらの任意の組み合わせを含めることのできるキットへの組み込みが可能である。

Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰを使って治療薬を開発する方法
本明細書で特定したＳＮＰはＴ１Ｄの病因に関連付けたものであるため、当該ＳＮＰを含む遺伝子およびその各々がコードする産物の活性を調節する薬剤を特定する方法から、この疾患に伴う種々の障害を治療する有効な治療薬が生成されるはずである。

染色体２１、６、１５、９、および１は、これらの配列によりコードされたタンパク質の活性を調節する治療薬の合理的設計に適切な標的を提供する領域を含む。これらの領域に対応する小さい核酸分子またはペプチドは、コードされたタンパク質の活性を効果的に調節する治療薬を設計する上で、有利に使用することができる。

分子をモデル化すると、機能に必要な立体構造または重要なアミノ酸残基に基づき、ＳＮＰ含有核酸でコードされたタンパク質の活性部位に結合する能力のある特異的な有機分子を容易に特定できるはずである。コンビナトリアルケミストリーのアプローチを使って最も活性の高い分子を特定したのち、さらなるスクリーニングサイクル用にこれらの分子を反復させたものを開発することになる。特定の実施形態では、合成化合物または天然化合物の大規模なライブラリーから薬剤候補をスクリーニングすることができる。その一例は、ヒトに使用できる化合物のＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認ライブラリーである。また、化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（英国Ｃｏｒｎｗａｌｌ、Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（米国ニュージャージー州Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（米国コネチカット州Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏｒｄ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＡＫｏｓ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（スイスＢａｓｅｌ）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（フランスＰａｒｉｓ）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ａｕｒｏｒａ（オーストリアＧｒａｚ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ（スイス）、Ｂｉｏｎｅｔ（英国Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ）、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ（米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣｈｅｍＤｉｖ、（米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｌｏｃｋ Ｌｔ、（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、ＣｈｅｍＳｔａｒ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｌｔｄ（ロシアＯｂｎｉｎｓｋ）、Ｅｎａｍｉｎｅ（ウクライナＫｉｅｖ）、Ｅｖｏｔｅｃ（ドイツＨａｍｂｕｒｇ）、Ｉｎｄｏｆｉｎｅ（米国ニュージャージー州Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ）、Ｉｎｔｅｒｂｉｏｓｃｒｅｅｎ（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランスＭｏｎｔｌｕｃｏｎ）、Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（米国コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｔｄ．（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｏｔａｖａ、（カナダ、オンタリオ州Ｔｏｒｏｎｔｏ）、ＰｈａｒｍＥｘ Ｌｔｄ．（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ（米国ニュージャージー州Ｍｏｎｍｏｕｔｈ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｘｃｈａｎｇｅ（Ｃｅｎｔｅｒ Ｏｓｓｉｐｅｅ、ＮＨ）、Ｓｐｅｃｓ（オランダＤｅｌｆｔ）、ＴｉｍＴｅｃ（米国デラウェア州Ｎｅｗａｒｋ）、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（カナダ、オンタリオ州Ｎｏｒｔｈ Ｙｏｒｋ）、ＵｋｒＯｒｇＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ウクライナＫｉｅｖ）、Ｖｉｔａｓ−Ｍ、（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、Ｚｅｌｉｎｓｋｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、（ロシアＭｏｓｃｏｗ）、およびＢｉｃｏｌｌ（中国上海）を含む（これに限定されるものではないが）数社から商業的に利用可能である。

細菌抽出物、菌体抽出物、植物抽出物、および動物抽出物の形態をした天然化合物のライブラリーは、商業的に利用でき、または当該技術分野で周知の方法により容易に作成できる。葉、樹皮、海洋試料を含む、動物源、細菌源、菌類源、植物源などの自然源から単離した化合物を、潜在的に有用な薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）を内在させる候補として化学分析することが提案されている。また、スクリーニングすべき薬剤は、化学組成物または人工化合物から誘導または合成したものであってもよいことが理解されるであろう。スクリーニングでは、商業的に利用可能ないくつかのライブラリーを使用できる。

薬物スクリーニング（ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）アッセイに使用されるポリペプチドまたは断片は、自由溶液の形態でも、固体支持物に固定した形態でも、細胞内にある形態でもよい。薬物スクリーニング法の１つでは、前記ポリペプチドまたは前記断片を発現する組み換えポリヌクレオチドにより安定した状態で形質転換された真核宿主細胞または原核宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイで利用する。あるいは、本明細書で説明するＴ１Ｄ関連ＳＮＰのマイナーアレルまたはメジャーアレルを発現するドナーから初代細胞を単離することもできる。そのような細胞は、生存細胞であっても固定細胞であっても標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、前記ポリペプチドまたは断片と、被検薬剤との複合体形成について決定し、前記ポリペプチドまたは断片と、既知の基質との複合体形成が被検薬剤により妨げられる度合いを調べることが可能である。

別の薬物スクリーニング技術では、コードされたポリペプチドと適切な結合親和性を有した化合物のハイスループットスクリーニングを行なうことができ、この化合物については１９８４年９月１３日付けで公開されたＧｅｙｓｅｎのＰＣＴ公開出願第ＷＯ８４／０３５６４号で詳述されている。簡潔に説明すると、上述のものを含む種々多数の小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンその他の何らかの固体基板上で合成する。そのペプチド試験化合物を標的ポリペプチドと反応させて洗浄する。そして、結合したポリペプチドを、当該技術分野でよく知られた方法で検出する。

さらに別の薬物スクリーニング技術では、非機能的な若しくは改変したＴ１Ｄ関連遺伝子を有する真核細胞株または真核細胞（上述したものなど）を宿主として使用する。これらの宿主細胞株または宿主細胞は、ポリペプチドレベルで不完全である。これら宿主細胞株または宿主細胞を、薬物化合物の存在下で培養する。前記宿主細胞の細胞代謝率を測定して、当該化合物が欠損細胞で細胞代謝を調節できるか決定する。本発明での使用が意図されている宿主細胞としては、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、および植物細胞などがある（これに限定されるものではないが）。Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰをコードするＤＮＡ分子を、前記宿主細胞に単独で若しくは組み合わせて導入すると、その発現によりもたらされる細胞の表現型を評価することができる。あるいは、本明細書で説明する対立遺伝子を発現するドナー細胞を使用することもできる。また、ＤＮＡ分子の導入方法は、当業者によく知られている。そのような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌらの編によるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ、ＮＹ，Ｎ．Ｙ．、１９９５に記載されている（参照によりその開示内容を本明細書に組み込むものとする）。

ＳＮＰをコードする核酸がグルコース代謝に及ぼす作用を調べる上で適した細胞および細胞株と、それを使用して創薬を行なう方法とが提供される。そのような細胞および細胞株は、すでにＳＮＰを発現する状態であるか、または本明細書で説明するＳＮＰをコードする核酸がトランスフェクトされて、グルカゴン分泌、インスリン分泌、および／またはβ細胞アポトーシスへの作用を決定することが可能になる。また、そのような細胞および細胞株については、本明細書で提供されるｓｉＲＮＡ分子と接触させることにより、グルカゴン分泌、インスリン分泌、および／またはβ細胞アポトーシスに及ぼす作用が評価される。ｓｉＲＮＡ分子は、単独で、および２つ、３つ、４つ、および５つのｓｉＲＮＡの組み合わせで試験され、これにより少なくとも１つの標的遺伝子（ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２、ＥＤＧ７など）の下方制御（ダウンレギュレーション）に最も有効な組み合わせが特定される。これらの目的に適した細胞としては、ＩＮＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１６０５）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７２１）、ＭＩＮ６細胞、α−ＴＣ６細胞、およびＩＮＳ−１ ８３２／１３細胞（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４００〜４１１）などがある（これに限定されるものではないが）。膵島細胞は、Ｊｏｓｅｐｈ，Ｊ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：５１０４９）に説明されているように単離および培養することができる。Ｄｉａｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００５）２８０：３３４８７−３３４９６）は、本明細書で説明するＳＮＰをコードする核酸および／またはｓｉＲＮＡが、グルカゴン分泌およびインスリン分泌に及ぼす作用を評価する方法論を提供している。Ｐａｒｋ，Ｊ．ら（Ｊ．ｏｆＢｉｏｃｈ．ａｎｄＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００７）４０：１０５８−６８）は、これらの核酸分子が、膵島細胞でグルコサミンにより誘発されるβ細胞アポトーシスに及ぼす効果を評価する方法論を提供している。

発現ベクターとしては、本発明の新規性のあるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を発現するよう改変した多種多様なものが利用できる。本明細書に例示する具体的なベクターは、単に例示的なものであって、本発明の範囲を限定するよう意図されたものではない。発現方法は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子クローニング：分子生物学における研究室マニュアルまたは現行プロトコール）１６．３−１７．４４（１９８９）に説明されている。また、サッカロミセス属（サッカロマイセス属）における発現方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現行のプロトコール）（１９８９）に説明されている。

本発明を実施するための使用に適したベクターとしては、ｐＮＨベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．、１１０９９ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｄ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、５６５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）、およびｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ０８８５４）などの原核ベクターがある。本発明の実施に有用な真核ベクターの例としては、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、およびｐＲＥＰベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１５８８ Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５&Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、またはｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのバキュロウイルス用ベクター、ＹＲＰ１７、ＹＩＰ５、およびＹＥＰ２４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）やｐＲＳ４０３およびｐＲＳ４１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）などの酵母用ベクター、ｐＨＩＬ−Ｄ１（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ ７４００４）などのピチア属用ベクター、ＰＬＮＣＸおよびｐＬＰＣＸ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などのレトロウイルス用ベクター、そしてアデノウイルス用ベクター、アデノ随伴ウイルス用ベクターなどのベクターがある。

本発明の発現ベクターに使用するプロモーターとしては、原核細胞または真核細胞において作用可能なプロモーターなどがある。原核細胞で作用可能なプロモーターとしては、ラクトース（ｌａｃ）制御要素、バクテリオファージλ（ｐＬ）制御要素、アラビノース制御要素、トリプトファン（ｔｒｐ）制御要素、バクテリオファージＴ７制御要素、およびこれらのハイブリッドなどがある。真核細胞で作用可能なプロモーターとしては、エプスタインバーウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、略称ＣＭＶ）プロモーター、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターなどのバキュロウイルスプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーターなどのピチア属プロモーター、Ｇａｌ４誘導プロモーターなどのサッカロミセス属プロモーター、およびＰＧＫ構成的プロモーター、さらに神経細胞特異的血小板由来成長因子プロモーターおよびＴｈｙ−１プロモーターなどがある。

また、本発明のベクターには、形質転換する宿主細胞の選択を容易にする種々のマーカーをいずれか１つ含めることができる。そのようなマーカーとしては、温度感受性、薬剤耐性に関連する遺伝子、または宿主生物の表現型の特徴に関連する酵素などがある。

本発明のＴ１Ｄ関連ＳＮＰを発現する宿主細胞またはその機能的断片は、Ｔ１Ｄの発症を調節する能力を有する可能性のある化合物または薬剤をスクリーニングするシステムを提供する。そのため、一実施形態では、本発明の核酸分子を使うと、糖尿病表現型の態様を調節する薬剤を特定するためのアッセイに使用する遺伝子組み換え細胞株を生成することができる。本明細書では、後述のＳＮＰ含有核酸によりコードされたタンパク質の機能を調節することのできる化合物をスクリーニングする方法も提供される。

別のアプローチでは、前記ＳＮＰ含有核酸によりコードされたポリペプチドの断片をファージ表面に発現するよう設計されたファージディスプレイライブラリーを使用する。次に、そのようなライブラリーをコンビナトリアルケミカルライブラリーと接触させ、その際、発現したペプチドと前記ケミカルライブラリーの成分との結合親和性が検出可能であることを条件とする。米国特許第６，０５７，０９８号および第５，９６５，４５６号では、そのようなアッセイを行う方法および装置を提供している。

合理的ドラッグデザインの目標は、関心のある生物活性ポリペプチドの、またはそれらと相互作用する小分子（作用薬、拮抗薬、阻害剤など）の構造的類似体（アナログ）を生成して、薬物（医薬品）を構築することであり、その薬物とは、例えば、より高活性の若しくは安定した形態のポリペプチド、またはポリペプチドの機能をｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）で高め若しくは妨げるものである。その例としては、Ｈｏｄｇｓｏｎ、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１を参照。上述したアプローチの１つでは、関心のあるタンパク質の３次元構造、または例えばタンパク質−基質複合体の３次元構造について調べる際、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、コンピュータモデル化、または最も一般的には諸アプローチの組み合わせを用いる。それより頻度は落ちるが、相同タンパク質の構造に基づいたモデル化により、ポリペプチドの構造に関する有用な情報を得ることもできる。合理的ドラッグデザインの例は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、通称エイズウイルス）プロテアーゼ阻害剤の開発に見られる（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５２７−５３３）。また、アラニンスキャンによりペプチドを分析することもできる（Ｗｅｌｌｓ、（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３９０−４１１）。この技術では、アミノ酸残基をＡｌａ（アラニン）で置換し、それが当該ペプチドの活性に及ぼす作用を決定する。このように前記ペプチドの各アミノ酸残基を分析して、そのペプチドの重要な領域を決定する。

また、標的に特異的な抗体を機能的アッセイで選択し、これを単離して、その結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチではファーマコフォア（薬理作用団）が得られ、これを基盤としてドラッグデザインを後続することができる。

機能的な薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄ）を生成すると、タンパク質の結晶解析をすべて不要にすることができる。ａｎｔｉ−ｉｄの結合部位は、鏡像の鏡像として、元の分子の類似体であることが予測される。次に、そのａｎｔｉ−ｉｄを使って、化学的または生物学的に生成されたペプチドのバンクからペプチドを特定し、これを単離する。選択されたペプチドは、ファーマコフォアとして作用するであろう。

このように、ポリペプチドの活性または安定性が改善され、またはポリペプチド活性の阻害剤、作用薬、拮抗薬などとして作用する薬物（医薬品）を開発することができる。本明細書で説明するＳＮＰ含有核酸配列が利用可能になると、Ｘ線結晶解析などの解析的研究を行う上で十分な量のコードされたポリペプチドを利用できるようになる。また、本明細書で提供するタンパク質配列の知識は、Ｘ線結晶解析の代わりに、またはそれに加えて、コンピュータモデル化技術を使用する者の指針となるであろう。

別の実施形態では、Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰ含有核酸が利用できることにより、本発明のＴ１Ｄ関連ＳＮＰを有する実験用マウス系統の生成が可能になる。できるようになる。本発明のＴ１Ｄ関連ＳＮＰを発現するトランスジェニックマウスは、Ｔ１Ｄの発症においてＳＮＰ含有核酸によりコードされたタンパク質の役割を調べる際のモデルシステムを提供する。実験用マウスに遺伝子を導入する方法は、当業者に知られている。一般的な方法としては、（１）関心のある外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの、初期胚への統合、（２）新たに受精させた卵の前核へのＤＮＡ注入、および（３）遺伝子操作された胚性幹細胞の、初期胚への組み込みの３つがある。上述したトランスジェニックマウスを作製することにより、異常な脂質沈着、細胞代謝の改変、およびグルコース調節を含む種々の細胞代謝過程において標的タンパク質が果たす役割の分子的解明が容易になる。そのようなマウスは、動物全体のモデルで推定治療薬剤を研究する際のｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）スクリーニングツールを提供するものであり、本発明により包含される。

本明細書において、用語「動物」は、ヒト以外の脊椎動物をすべて含むよう使用される。また、胚および胎児の段階を含め、発生・成長の全段階にある個々の動物も含む。「トランスジェニック動物」とは、標的組み換え、マイクロインジェクション、または遺伝子組み換えウイルスでの感染といった細胞内レベルの意図的な遺伝子操作により、直接的または間接的に改変され若しくは受容された遺伝情報を含有する細胞を１若しくはそれ以上含んだすべての動物をいう。用語「トランスジェニック動物」は、古典的な異種交配または体外受精を包含するよう意図したものではなく、組み換えＤＮＡ分子により若しくはそれを受容することにより１若しくはそれ以上の細胞が改変された動物を包含するよう意図したものである。この分子は、定義された遺伝子座を特異的に標的としたものであっても、染色体内で無作為に統合したものであっても、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。用語「生殖細胞系列トランスジェニック動物」とは、生殖系列細胞に遺伝子変異または遺伝情報が導入されたことにより、遺伝情報を子孫に受け渡す能力が与えられたトランスジェニック動物をいう。そのような子孫が実際に変異または遺伝情報の一部または全部を所有する場合は、その子孫もトランスジェニック動物である。

遺伝情報の変異は、受容動物が属する種にとって外来性のものであっても、特定の受容個体のみに外来性のものであっても、または受容動物がすでに有する遺伝情報であってもよい。上記最後のケースでは、改変または導入された遺伝子が、天然遺伝子と異なる態様で発現する可能性がある。そのような改変された若しくは外来性の遺伝情報は、Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰ含有ヌクレオチド配列の導入も包含する。

標的遺伝子の改変に使用するＤＮＡは、ゲノム源からの単離、単離されたｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ調製、直接的な合成、またはこれらの組み合わせを含む（これに限定されるものではないが）多種多様な技術により得られる。

遺伝子導入に好適なタイプの標的細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、略称ＥＳ細胞）である。ＥＳ細胞は、体外培養された着床前胚から得られる（Ｅｖａｎｓら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６。Ｂｒａｄｌｅｙら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８。Ｇｏｓｓｌｅｒら、（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９０６５−９０６９）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションやレトロウイルスを介した形質導入などの標準的な技術により、ＥＳ細胞へ効率的に導入できる。その結果得られた形質転換ＥＳ細胞は、ヒト以外の動物の胚盤胞と組み合わせることができる。導入されたＥＳ細胞は、前記胚にコロニーを形成し、その結果もたらされるキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する。

個々の遺伝子と各々の発現産物の寄与を決定する問題へのアプローチの１つでは、単離したＴ１Ｄ関連ＳＮＰ遺伝子を挿入カセットとして使って全能性ＥＳ細胞（上記のものなど）に含まれる野生型遺伝子を選択的に不活性化したのち、トランスジェニックマウスを作製する。遺伝子標的破壊（ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的破壊ＥＳ細胞の使用については、他の文献で説明およびレビューされている（Ｆｒｏｈｍａｎら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：１４５−１４７。Ｂｒａｄｌｅｙら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４−５３９）。

標的相同組み換えを使って染色体の対立遺伝子に特異的変化を挿入することにより、任意の遺伝子領域を不活性化または改変して望ましい変異を生じさせる技術は、利用可能である。ただし、１００％に近い頻度で起こる染色体外相同組み換えと比較し、プラスミド−染色体相同組み換えは、当初１０^−６〜１０^−３の頻度で検出されると報告されていた。プラスミドと染色体との非相同相互作用は、それと同等の相同挿入の１０^５倍〜１０^２倍高いレベルでより頻繁に起こる。

このようにマウスＥＳ細胞における標的組み換え率が低いという問題を克服するため、まれな相同組み換えを検出または選択する種々の戦略が開発されてきた。相同変異事象を検出するアプローチの１つでは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って形質転換細胞のプールをスクリーニングし、相同挿入を検出したのち、個々のクローンをスクリーニングする。あるいは、正の遺伝子選択アプローチが開発されており、その場合、相同挿入が起こった場合のみ活性化してその組み換えが直接選択されるようにするマーカー遺伝子が構築される。相同組み換え選択用に開発された最も強力なアプローチの１つとしては、直接的な変異選択が存在しない遺伝子用に開発されたポジティブ−ネガティブセレクション（。ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、略称ＰＮＳ）法がある。このＰＮＳ法は、マーカー遺伝子が独自のプロモーターを有するため、高レベルで発現しない遺伝子を標的とする場合に、より効率的である。非相同組み換え体の選択には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、略称ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使い、非相同挿入体として、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）または（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などの効果的なヘルペス治療薬を選択する。この対抗選択により、生存する形質転換体における相同組み換え数を増やすことができる。Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰ含有核酸を標的挿入カセットとして利用すると、例えばＴ１Ｄ関連ＳＮＰ核酸によりコードされたポリペプチドに対し免疫学的に特異的な抗体への免疫反応性の獲得により、良好な挿入を可視化して検出する手段が得られるため、望ましい遺伝子型を伴ったＥＳ細胞のスクリーニングまたは選択が容易になる。

本明細書における「ノックイン動物」とは、例えば、内因性マウス遺伝子が、本発明のヒトＴ１Ｄ関連ＳＮＰ含有遺伝子で置換されたものをいう。そのようなノックイン動物は、Ｔ１Ｄの発症を研究するための理想的なモデルシステムをもたらす。

本明細書における「Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰ含有核酸の発現」、「その断片」、または「Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰ融合タンパク質」は、コードされたタンパク質の発現を特定の組織または細胞型において促進する調節配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）に、Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰの全部または一部をコードする核酸配列を作用可能に結合したベクターを使って、「組織に特異的な態様」または「細胞型に特異的な態様」で標的とすることができる。そのような調節因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（体外）およびｉｎ ｖｉｖｏ（体内）のどちらの応用でも有利に使用することができる。組織に特異的なタンパク質発現を指示するプロモーターは、当該技術分野でよく知られており、本明細書でも説明している。

本発明のＴ１Ｄ関連ＳＮＰをコードする核酸配列は、多種多様なプロモーター配列と作用可能に結合して、トランスジェニック動物で発現させることができる。そのようなプロモーターとしては、ハムスターおよびマウスのプリオンプロモーター（ＭｏＰｒＰ）などのプリオン遺伝子プロモーター（米国特許第５，８７７，３９９号およびＢｏｒｃｈｅｌｔらのＧｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１３（６）（１９９６）ページ１５９〜１６３で説明されている）、ラット神経特異的エノラーゼプロモーター（米国特許第５，６１２，４８６号および第５，３８７，７４２号）、血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモーター（米国特許第５，８１１，６３３号）、脳特異的ジストロフィンプロモーター（米国特許第５，８４９，９９９号）、Ｔｈｙ−１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、神経特異的血小板由来成長因子Ｂ遺伝子プロモーター、およびグリア細胞での導入遺伝子発現に寄与するグリア繊維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、略称ＧＦＡＰ）プロモーターなどがある（これに限定されるものではないが）。

本発明のトランスジェニックマウスを使用する方法についても、本明細書で提供する。Ｔ１Ｄ関連ＳＮＰまたはそのコードされたタンパク質を含んだ核酸を導入したトランスジェニックマウスは、例えばＴ１Ｄの発症を調節できる治療薬を特定するための治療薬スクリーニング方法を開発する上で有用である。

医薬品及びペプチド治療法
本明細書に記載された細胞代謝におけるＴ１Ｄ関連ＳＮＰｓによって担われる役割の解明は、Ｔ１Ｄの治療及び診断に有用な薬学的組成物の開発を容易にする。これらの組成物は、上述した物質の１つに加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、安定剤、或いは本分野の当業者にはよく知られている他の物質を有する。そのような物質は、非毒性であるべきで、有効成分の有効性を妨害すべきでない。

それが、個人へ投与される本発明に従ったポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子或いは他の薬学的に有用な化合物のいずれであっても、「予防的に有効な量」或いは「薬学的に有効な量」（場合によっては、予防が治療法と見なされる）で投与されることが好ましく、これは個人に対して利益を示すのに十分な量である。

現在理解されているように、ＲＮＡ干渉は、多段階プロセスが関与している。二本鎖ＲＮＡｓは、エンドヌクレアーゼダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって切断され、ヌクレオチド断片（ｓｉＲＮＡ）を生じる。そのｓｉＲＮＡ二本鎖は、２つの一本鎖ＲＮＡｓへ分解され、その一本鎖は、標的ＲＮＡの切断へと導くガイドＲＮＡとして機能するタンパク質含有複合体へ取り込まれ（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．１０：５３７−５４８（２００２），Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １０１：２５ ３３（２０００））、特異的な遺伝的メッセージを発現抑制（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）する（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：９７７９（２００３）を参照のこと）。

本発明は、哺乳類におけるＴ１Ｄを治療する方法を含む。例示的な方法としては、ＵＢＡＳＨ３Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿０１８９６１；配列ＩＤ番号：１）、ＧＬＩＳ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００１０４２４１３；配列ＩＤ番号：２）、ＲＡＳＧＲＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００５７３９；配列ＩＤ番号：３）、ＢＡＣＨ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿０２１８１３；配列ＩＤ番号：４）、及びＥＤＧ７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．番号：ＡＹ３２２５４７；配列ＩＤ番号：５）からなる群から選択された遺伝子標的へ向けられたｓｉＲＮＡ分子の薬学的に有効な量を哺乳類へ投与する工程を必要とする。そのｓｉＲＮＡは、上述した遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、哺乳類はヒトである。本明細書で用いられたように、「患者」という用語はヒトを意味するものである。

送達方法と同様に、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２及びＥＤＧ７の発現を阻害するように向けられた特異的ｓｉＲＮＡ調製は、Ｔ１Ｄを治療するための新規治療法として提供される。表６から１０を参照のこと。ｓｉＲＮＡは、以下で議論するように、担体と共に全身性に或いは局所性にｉｎ ｖｉｖｏで患者へ送達され得る。本発明の組成物は、単独で、或いはその組成物の有効性を増強するような他の薬剤或いは遺伝子コード化タンパク質との組み合わせで使用される。

「膜透過性ペプチド配列」とは、細胞膜を横切ってｓｉＲＮＡが透過し移行するのを促進することができるペプチド配列を意味する。例示的なペプチドには、これに限定されることなく、本明細書で例示されたカポジ（Ｋａｒｐｏｓｉ）線維芽細胞増殖因子、ＨＩＶ ｔａｔペプチド（Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１６０１０−１６０１７，１９９７）、プロタミンからの非毒性膜転位（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ペプチド（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９（１１）：１５５５−７，２００５）、ＣＨＡＲＩＯＴ（登録商標）導入試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ；米国特許第６，８４１，５３５号）及び抗菌ペプチドＢｕｆｏｒｉｎ ２が含まれる。

本発明の１実施形態において、ｓｉＲＮＡｓは治療的利益のために送達される。これに限定されるものではないが、ネイキッドｓｉＲＮＡ送達、ｓｉＲＮＡ共役及び送達、リポソーム担体−仲介性送達、ポリマー担体送達、ナノ粒子組成物、プラスミド−ベース法、及びウイルスの使用を含む、Ｔ１Ｄを治療するために本発明のｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで投与するためのいくつかの方法がある。

本発明のｓｉＲＮＡ組成物は、対象へ投与するためのリポソーム含む送達媒体、担体及び希釈剤、及びそれらの塩類を有するものである、及び／若しくは薬学的に許容可能な処方で存在し得る。核酸分子を送達するための方法は、Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２において記載されており、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許番号第６，３９５，７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公報第ＷＯ９４／０２５９５号ではさらに、核酸分子を送達するための一般的な方法が記載されている。これらのプロトコールは、実質的にあらゆる核酸分子を送達するのに利用され得る。

患者へのｓｉＲＮＡの投与の頻度はさらに、これに限定されるものではないが、治療されるＴ１Ｄのタイプ及び重症度、投与経路、個人の年齢と健康全般、ｓｉＲＮＡの性質、及びそれらと同様のことを含むいくつかの因子に依存して変わるであろう。患者へのｓｉＲＮＡの投与の頻度は、数ヶ月毎に約１回から１ヶ月に約１回、１週間に約１回、１日約１回、一日に数回と変えられることが考慮される。

本発明の方法において有用な薬学的組成物は、非経口、経口固形及び液体処方、点眼、坐薬、エアロゾル、外用薬或いは他の類似処方で全身性に投与される。適切なｓｉＲＮＡに加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、及び薬剤投与を増強し促進すると知られている他の成分を含む。従ってそのような組成物は任意に、例えば、アルミニウム及び水酸化マグネシウムの水性懸濁液などのアジュバントのような他の構成成分、及び／若しくは生理食塩水などの他の薬学的に許容可能な担体を含む。ナノ粒子、リポソーム、再シール赤血球（ｒｅｓｅａｌｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）、及び免疫学的に基づいたシステムなどの他の可能な処方も、本発明の方法に従って、患者へ適切なｓｉＲＮＡを投与するために使用される。ｓｉＲＮＡを送達するためのナノ粒子、さらには使用され得る細胞膜透過性ペプチド担体の使用は、Ｃｒｏｍｂｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｖ３５：ｐ４４（２００７）に記載されている。

Ｔ１Ｄを治療するための本発明の方法は、薬学的組成物における少なくとも１つのＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２及びＥＤＧ７のｓｉＲＮＡの投与に関連している。そのｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物として個人へ投与される。薬学的に許容可能な担体は、本分野ではよく知られており、生理学的緩衝食塩水などの水性溶液、グリコール、グリセロール、オリーブオイルなどのオイル、若しくは注射可能な有機エステルなどの他の溶媒或いは媒体が含まれる。

薬学的に許容可能な担体は、例えば、ｓｉＲＮＡを安定化する、或いは薬剤の吸収を増加するように作用する生理学的に許容可能な化合物が含まれ得る。そのような薬学的に許容可能な化合物には、例えば、グルコース、スクロース或いはデキストランなどの糖類、アスコルビン酸或いはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、若しくは他の安定剤或いは賦形剤が含まれる。本分野の当業者は、生理学的に許容可能な化合物を含む薬学的に許容可能な担体の選択は、例えばｓｉＲＮＡの投与の経路に依存していることを理解するものである。

本分野の当業者は、ｓｉＲＮＡを有する薬学的組成物は、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内、皮下、眼窩内、関節内、腹腔内（ｉ．ｐ．）、大槽内、気管内（ｉ．ｔ．）或いは関節内など、経口的或いは非経口的に様々な経路によって、若しくは受動的或いは促進性吸収によって、対象へ投与され得ることを理解する。投与の同じ経路は、例えば、以上で議論されたような小分子、核酸分子、ペプチド、抗体及びポリペプチドなどの他の薬学的に有用な化合物でも使用され得る。

ｓｉＲＮＡ阻害剤を有する薬学的組成物も、必要に応じて、リポソーム、微粒子、微小気泡、或いは他のポリマーマトリックスへ取り込まれ得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ｔｏ ＩＩＩ，２ｎｄ ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌａ．（１９９３））。例えば、リン脂質或いは他の脂質から成るリポソームは、製造し投与するのが比較的に単純である、非毒性で生理学的に許容可能で、代謝可能な担体である。

薬学的調合は、本明細書に記載された配列を含むＳＮＰを標的にしたｓｉＲＮＡ、或いはｓｉＲＮＡをコード化した発現ベクターを有する。そのような薬学的調合は、Ｔ１Ｄを治療するために患者へ投与され得る。

ｓｉＲＮＡ分子の発現用の発現ベクターは好ましくは、構成的或いは制御された強力プロモーターを利用する。そのようなプロモーターは、本分野でよく知られており、これに限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６及びＨ１が含まれる（例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２５０２ ０９を参照のこと）。

処方されたｓｉＲＮＡ組成物は、１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡ分子、或いは、１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡ分子をコード化したベクターを、単独で或いは陽イオン性脂質、中性脂質及び／若しくはポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）或いはＰＥＧ−コレステロール（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）共役体との組み合わせで有する組成物であり得る。限定されない発現ベクターの例としては、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５：Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ａｎｔ Ｔａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００−５０５に記載されている。

脂質ナノ粒子組成物は、１若しくはそれ以上の生物学的活性分子を、単独で或いは陽イオン性脂質、中性脂質、及び／若しくはポリエチレングリコール−ジアシルグリセロール（すなわち、ポリエチレングリコールジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−コレステロール、或いはＰＥＧ−ＤＭＢ）共役体との組み合わせで有する組成物である。１実施形態において、生物学的活性分子は、本発明の生物学的活性分子（すなわちｓｉＲＮＡ）を有する水性溶液を提供する工程、脂質ナノ粒子を有する有機溶液を提供する工程、２つの溶液を混合する工程、その溶液をインキュベートする工程、希釈し限外濾過する工程の結果として脂質ナノ粒子に被包され、その結果ナノ粒子組成物を産生するのに適した濃度を生じさせる。

核酸分子は、生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公報番号第ＷＯ ０３／４７５１８号及び第ＷＯ ０３／４６１８５号を参照のこと）、生分解性ナノカプセル、及び生物接着性微粒子などの他の媒体への取り込みによって、若しくはタンパク質性ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎｄ、国際公報第ＷＯ ００／５３７２２号）によって細胞へ投与され得る。

陽イオン性脂質及びポリマーは、２つのクラスの非ウイルス性ｓｉＲＮＡ送達であり、これは負に電荷したｓｉＲＮＡと複合体を形成できる。自己組織化ＰＥＧ−化（ｙｌａｔｅｄ）ポリカチオンポリエチレンイミン（ＰＥＩ）も、ｓｉＲＮＡを縮合し保護するために使用されていた（Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：１４１−１１０）。ｓｉＲＮＡ複合体は、ナノ粒子へ縮合され、エンドサイトーシスを通じてそのｓｉＲＮＡの有効な取り込みが可能となる。さらに、プロタミンの核酸−縮合特性は、特異的抗体と組み合わされてｓｉＲＮＡｓを送達し、本発明において使用され得る（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：７０９−７１７）。

Ｔ１Ｄを患った個人を治療し、疾患の徴候或いは症状を軽減するために、ｓｉＲＮＡは、有効な用量で投与されなくてはならない。総治療用量は、単一用量で対象へ投与され得る、若しくは、分割された治療プロトコールを用いて投与され、ここにおいて複数回投与とは、例えば１日以上かけて１日投与量を投与するなどのより長期間かけて投与される、若しくは、望ましい期間以上で用量を投与するためにより長い期間をかけて投与されることである。本分野の当業者は、対象において有効な用量を得るために必要とされるｓｉＲＮＡの量は、対象の年齢、体重及び健康全般、さらには投与の経路及び投与される治療数を含む多くの因子に依存していることを理解しているものである。これらの因子を考慮して、当業者は、Ｔ１Ｄを患った個人を治療するのに有効な用量を得るように特定の用量を調節する。

ｓｉＲＮＡの有効な用量は、投与のモード、及び治療される個人の体重に依存するであろう。本明細書に記載された投与量は一般的に平均成人に対する投与量であるが、小児の治療用に調節され得る。用量は一般的に、約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲である。

特定の処方におけるｓｉＲＮＡの濃度は、投与のモード及び頻度に依存するであろう。所定の１日投与量は、処方におけるｓｉＲＮＡ濃度が望ましい１日投与量を満たす限り、単一用量で或いは複数回用量で投与され得る。本分野の当業者は、処方におけるｓｉＲＮＡの量を調節し、所定の期間でｓｉＲＮＡの望ましい濃度を提供するような単一用量或いは複数回用量の投与が可能である。

Ｔ１Ｄを患った個人において、特により重症型の疾患において、ｓｉＲＮＡの投与は、例えばそのような疾患を治療するための従来の薬剤との組み合わせで投与された場合、特に有用となり得る。当業者は、単独で或いは組み合わせでｓｉＲＮＡを投与し、膵ベータ細胞機能定量、放射線学的方法、免疫学的方法、或いは望ましい場合は病理組織学的方法などの日常的な方法を用いてそのような治療の有効性をモニタリングする。糖尿病の治療用の他の従来の薬剤には、インスリン投与、グルカゴン投与、若しくはこれらの２つの分子のレベルを変える薬剤が含まれる。Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）、Ａｖａｎｄｉａ（登録商標）、Ａｃｔｏｓ（登録商標）、Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）及びＧｌｕｃｏｖａｎｃｅ（登録商標）はそのような薬剤の一例である。

薬学的調製の投与は、好ましくは個人に利益を示すのに十分である「有効な量」である。この量は、患者におけるＴ１Ｄ症状の重症度を予防、軽減、寛解或いは減少させる。

薬学的調製は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与量単位形態で処方される。本明細書で用いられたように、投与量単位形態とは、治療を受ける患者に適切な薬学的調製の物理学的に分離した単位を意味する。各投与量は、選択された薬学的担体と関連した望ましい効果を生じるように計算された有効成分の量を含むべきである。適切な投与量単位を決定するための手順は、本分野の当業者にはよく知られている。

投与量単位は、患者の体重に基づいて、比例して増加或いは減少される。特定の病態を軽減するために適切な濃度は、本分野では既知である投与量濃度曲線計算によって決定される。

以下に説明した方法は、本発明の実行を容易にするために提供される。

シグナル蒸留（Ｓｉｇｎａｌ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）
本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ ＢｅａｄＣｈｉｐを用いて、５６３のＴ１Ｄ発端者（ｐｒｏｂａｎｄｓ）、及び１，１４６のコントロール＋４８３の完全Ｔ１Ｄ家族トリオからの白人に対して作成された本発明者らのゲノムワイド遺伝子型データから、少なくとも名目上有意な組み合わせＰ−値（主要組織適合抗原領域は除外される）を有するＳＮＰｓを選択した。本発明者らは次に、モントリオールからの９３９の核Ｔ１Ｄ家族及び１型糖尿病遺伝子コンソーシアム（Ｔ１ＤＧＣ）の独立したコホートにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ ｐｌａｔｆｏｒｍを用いて、これらのＳＮＰｓの遺伝子型を同定した。その後、本発明者らは、以前記載されていなく全コホートを通じて名目上有意であった、遺伝子座におけるＳＮＰｓをＴ１Ｄに対して同定するために、全てのコホート＋ワールドワイドウェブであるｗｔｃｃｃ．ｏｒｇ．ｕｋ^１７上で公的に利用可能なＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＷＴＣＣＣ）データセットを検討した。本発明者らは、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａ １Ｍ及びＨｕｍａｎＨａｐ５５０Ｋ ＢｅａｄＣｈｉｐｓ上に遺伝子型を同定された、フィラデルフィアからの独立マッチドコントロールデータセットを用いてＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ研究からＴ１Ｄ発端者においてクエリーし、更なる研究のために５つの遺伝子座を選択した。

対象
１．カナダからの１型糖尿病コホート：
カナダ人のコホートは、モントリオール、トロント、オタワ及びウィニペグにおける小児糖尿病クリニックで集められた、１，１２０核家族トリオ（１人の患児と２人の親）及び２６７の独立したＴ１Ｄケースから構成されていた。発症時の年齢中央値は、４．６歳と１１歳の上位及び下位四分位点を伴った、８歳であった。全ての患者は、１８歳未満で診断され、診断以来インスリンで治療されており、それ以降どんな理由でも治療をやめていない。疾患診断は、あらゆるラボテストではなく、これらの臨床判断基準に基づいていた。民族的背景は、フランス系カナダ人である最大単独サブセット（４０９家族）を有する、ヨーロッパ人家系の混合であった。モントリオール小児病院及び他の参加センターの研究倫理委員によって研究が認可されており、文書によるインフォームドコンセントは全患者から得られていた。

２．１型糖尿病遺伝子コンソーシアムコホート：
１型糖尿病遺伝子コンソーシアムコホートは、２００５年７月現在でデータが決定している、少なくとも２人の子供が糖尿病と診断され両親が応対できる５４９家族（２３５０個人）から構成されていた。判断基準は、診断時に３５歳未満で、診断の６ヶ月以内でインスリンによる治療が中断されていないこととした。３５歳以下で診断された発端者の同胞に対して、診断時の年齢制限は、彼らに傾向があり、抗体が陽性であった及び／若しくは診断時に低Ｃ−ペプチドレベルであった場合、４５歳まで延長した。年齢中央値は、４歳及び１３歳の四分位点を伴った、８歳であった。サンプルは、ヨーロッパ、北アメリカ及びオーストラリアで集め、ほとんどの対象は祖先がヨーロッパ人であった。自己抗体結果は利用可能ではあるが、上述したことを除いて診断を実証するためには使用しなかった。

３．フィラデルフィアからの１型糖尿病コホート：
Ｔ１Ｄコホートは、２００６年９月からフィラデルフィア小児病院（ＣＨＯＰ）で集められた１０３人の小児から構成されていた。全ての患者は１８歳以下で診断されていた。その内、４９人のＴ１Ｄ患者（３２人の女性、１７人の男性）は、自己報告（発症の平均年齢は７．０７歳；範囲は９ヶ月〜１４歳）によって白人であり、彼らは解析に含まれた。全員、診断からインスリンで治療されており、それ以降どんな理由でも治療をやめていなかった。ＣＨＯＰの研究倫理委員でその研究は認可されており、文書によるインフォームドコンセントが全患者から得られていた。

４．糖尿病コントロール及び合併症の大規模臨床研究／糖尿病の疫学
合併症及び介入（ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ）１型糖尿病コホート：
ＤＣＣＴは、１型糖尿病を患った患者における網膜症及び腎症合併症の発症及び進行を軽減することに関わる、集中インスリン治療の効果を決定するための多施設ランダム化臨床治験であった^{１９、２０}。１型糖尿病を患った総数１，４４１人の対象は、１９８３〜１９８９年の間に北アメリカ中の２９のセンターからＤＣＣＴへ集められた；彼らは１３〜３９歳の間であり、５３％が男性であった。彼らは２つのコホートへ分けられた：第一の予防コホートは、網膜症がなく、アルブミン排出速度が<２８μｇ／分であり、１〜５年間糖尿病を患っており、集中治療によって網膜症のない患者において糖尿病性網膜症の発症を予防したかどうか以前決定されていた、７２６人の対象から構成されていた；第二の介入コホートは、非増殖性網膜症を患っており、尿中アルブミン***速度が<１４０μｇ／分であり、１〜１５年間糖尿病を患っており、集中治療が初期網膜症の進行に影響を与えていたかどうか決定するためにテストされていた、７１５人の対象から構成されていた^１９。ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ遺伝子研究に対する認可は、トロントの小児病院（ｔｈｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｓｉｃｋ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）の研究倫理委員によって提供されていた。

Ｉｌｌｕｍｉｎａ １Ｍアッセイによって、全ての利用可能な発端者に対して遺伝子型を同定した。大多数が自己報告による白人発端者からの集団層別化であるので、異常値を検出し除去するために、Ｅｉｇｅｎｓｔｒａｔ^２１を使用し、系列分析によって発端者を選択した。異常値の排除後、Ｔ１Ｄの診断時の平均年齢が２１歳（ＳＤ＝８、範囲が０〜３８）である１３０３のＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ発端者（６９５人の男性、６０８人の女性）が存在した。

５．フィラデルフィアからのコントロール対象：
コントロール群には、自己報告で白人である１，１４６人の小児で、平均年齢が９．４２歳；５３．０５％が男性で４６．９５％が女性であり、糖尿病を患っていない或いはＴ１Ｄの第一度近親がいない小児が含まれた。１，１００のＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ Ｔ１Ｄ発端者と以前マッチしていたコントロール群には、自己報告で白人である２，０２４人の小児で、平均年齢８．８２歳；５０．８３％が男性で４９．１７％が女性であり、糖尿病を患っていない或いはＴ１Ｄの第一度近親がいない小児が含まれた。これらの個人は、４つのプライマリケアクリニック、及び小児の来診がよくあるいくつかのグループ診察室及び外来診察室を含む、ＣＨＯＰヘルスケアネットワーク内のＣＨＯＰの臨床医及び看護スタッフによって集められた。これらの２０２４人の個人の内、１６７３人は、上述のＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ発端者（８６８人の男性、８０１人の女性、４人のあいまいな性別）と同様に、ｅｉｇｅｎｓｔｒａｔからの集団層別化解析を用いて選択された。ＣＨＯＰの研究倫理委員は本研究を認可しており、文書によるインフォームドコンセントは全患者から得られていた。

遺伝子型同定
本研究の遺伝子型は、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＩｎｆｉｎｉｕｍ及びＧｏｌｄｅｎＧａｔｅプラットフォームを用いて得た。本発明者らは、ＣＨＯＰの応用ゲノムセンターにある、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（商標）ＩＩ ＨｕｍａｎＨａｐ５５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ技術^１、２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ダンディエゴ）を用いて、高処理ゲノム−ワイドＳＮＰ遺伝子型同定を実行した。本発明者らは、製造者ガイドラインに従って、各サンプルの遺伝子型を同定するために７５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いた。ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣサンプルは、Ｉｍｍｕｍｉｎａ（サンディエゴ、カリフォルニア州）にてＩｌｌｕｍｉｎａ １Ｍチップ上で遺伝子型を同定した。

統計学
関連に対する全ての統計学的テストは、ソフトウェアパッケージｐｌｉｎｋ^２２を用いて実行した。ゲノム−ワイドデータに対する単一マーカー解析は、５６３ケース群及び１，１４６コントロール群の間のアレル数差異に対するχ^２テストを用いて実行した。オッズ比及び一致する９５％信頼区間は、関連解析を計算した。連鎖不均衡存続検定は、Ｔ１Ｄトリオ及び核家族における連鎖及び非連鎖アレル数の間の差異に対するＰ−値を計算するために使用した。発症した子孫に対するヘテロ接合性両親からの非連鎖及び連鎖アレルの数は、Ｈａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェアパッケージ^４に組込まれている標準連鎖不均衡存続検定を用いて決定した。本発明者らの３つの発見コホートにおけるケース−コントロール及び家族−ベース解析からのＰ−値は、Ｆｉｓｈｅｒ法^５を用いて組み合わせ、関連に対する総合的なエビデンスを定量化した。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供されるものである。それらは、本発明を制限することを意図するものではない。

Ｔ１Ｄに関連した遺伝子座位
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、膵臓β−細胞の自己免疫破壊に由来する強力な遺伝要素を有する多因子疾患である。６ｐ２１^１上のＨＬＡクラスＩＩ遺伝子にマッピングされ高度多型抗原−提示タンパク質をコード化する、主要なＴ１Ｄ感受性座位は、Ｔ１Ｄに対する遺伝子リスクのほぼ５０％を占める。より中等度の影響があるいくつかの他の座位は、リスクの１０〜２０％を占める^２。これらには以下が含まれる：（１）インスリンの胸腺発現及び耐性を調節する、主要なＴ１Ｄ抗原である^４、５、インスリン（ＩＮＳ）ＶＮＴＲ^３；（２）ＴＣＲシグナリングのネガティブ制御因子の機能に影響を与える^６、ＰＴＰＮ２２でのＡｒｇ６２０Ｔｒｐ一塩基多型（ＳＮＰ）；（３）ＩＬ２受容体複合体（ＣＤ２５）のα鎖をコード化し、免疫の受容な修飾因子であるＩＬ２ＲＡでの非−コーディングＳＮＰｓ^７−９；（４）ＣＴＬＡ４座位^１０における変異体であり、そのタンパク質産物は、Ｔ細胞活性化を減弱化する阻害シグナルを伝達するものである。これらＴ１Ｄ関連遺伝子の全てが免疫機能を有して細胞中に発現し、ＩＮＳ以外の全てが他の自己免疫疾患に関連していたということは何の意味もない。

高処理一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子同定アレイ技術の最近の発展によって、本発明者ら^１１や他の研究者ら^{１２、１３}は、残存Ｔ１Ｄ座位の検索におけるゲノム−ワイド関連（ＧＷＡ）研究が可能になった。Ｔ１Ｄにおける最初の使用成功例は、１２，０００の非同義ＳＮＰｓのスクリーニングに関連しており、これは、ｒｓ１９９０７６０とのＴ１Ｄ関連で発見され、ＩＦＩＨ１遺伝子（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されたインターフェロン）^１４上のＡｌａ９４６Ｔｈｒ置換に関連しているものである。本発明者らは最近、Ｔ１Ｄに対する本発明者らのＧＷＡの結果を報告し、そこにおいて本発明者らは、独立コホートにおけるＴＤＴ複製試行の成功に続いて、ヨーロッパ人家系の大規模小児Ｔ１Ｄコホートを調べた。以前に同定された座位を確認することに加えて、本発明者らは、最近Ｃ−タイプレクチンドメインファミリー１６メンバーＡ（ＣＬＥＣ１６Ａ）と新たに命名された遺伝子産物である、ＫＩＡＡ０３５０との高度な有意関連を観察し；その後の本発明者らのフォローアップデータでも１２ｑ１３^１６上の座位が明らかになった。Ｔｈｅ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ^１７でも、１２ｑ２４及び１８ｐ１１上の他の座位に沿って、その後フォローアップされ複製された^１８、１６ｐ１３及び１２ｑ１３の同じ領域との関連が証明された。

本発明者らは、付加的な新規Ｔ１Ｄリスク座位を明らかにするためのフォローアップ戦略を実行した。本明細書では、本発明者らは、この過程の間でＴ１Ｄに有意に関連した２つの座位を記載するものであり、その両者は、自己免疫と生物学的に関連のある遺伝子に属するものである。これらの遺伝子は、それぞれ、ユビキチン−関連及びＳＨＩＩＩドメイン−含有タンパク質Ａ（ＵＢＡＳＨ３Ａ）、及びＢＴＢ及びＣＮＣホモロジー２（ＢＡＣＨ２）をコード化しており、その両者はＴ細胞シグナリングに関連すると知られている。

Ｔ１Ｄ発端者及びコントロール＋同じ祖先のＴ１Ｄ家族トリオで作成された本発明者らの遺伝子同定データの組み合わせから、本発明者らは、主要組織適合複合体に属さず、Ｔ１Ｄに少なくとも名目上有意に関連しているという２つの判断基準を満たす、９８２のＳＮＰｓを選択した。次に本発明者らは、モントリオール及びＴ１ＤＧＣからの核Ｔ１Ｄ家族の独立したコホートにおける付加的遺伝子同定へとこれらのＳＮＰｓを進めた。表１に示されたように、３３の一点（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ）関連が、この過程の発見ステージで利用した４コホート全てで、少なくとも名目上有意に存在した。しかしながら、それらの大部分は、以前に報告されており、従って新規ではない、すなわちそれらは十分確立されたＰＴＰＮ２２^６、１２ｑ１３^{１６、１８}、ＫＩＡＡ０３５０^{１５、１８}、ＩＬ２ＲＡ^７−９、ＣＴＬＡ４^１０及びＩＦＩＨ１^１４座位に属しているものであった。しかしながら、５つの座位に属している６個のＳＮＰｓは、更なる複製試行に対する本発明者らの判断基準を満たしていた。

ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣコホートを参照すると、ユビキチン−関連及びＳＨ３ドメイン−含有タンパク質Ａ（ＵＢＡＳＨ３Ａ）、及びＢＴＢ及びＣＮＣホモロジー２（ＢＡＣＨ２）をコード化した遺伝子におけるシグナルは、この５つの独立したコホートにおいて複製されており（表２）、Ｐ−値は、実行された６つのテストで補正後、有意であった。以前記載された関連と比較して、明らかにリスクは相対的に中程度であり、本発明者らの処理能力でこのサンプルサイズで行った場合にのみ、本発明者らは独立した複製を介して真の陽性としてこれらのシグナルを検出し確立することができたが；表３では、利用した５つのコホート全部を組み合わせた場合、実はｒｓ９９７６７６７はゲノム−ワイドレベルで有意である、すなわちＰ＝２．３３ｘ１０^−８と示していた。

表２に提供された、シグナルを有する連鎖不均衡（ＬＤ）ブロックに対するコーディネート（ｔｈｅ ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｓ）は、以下に説明した。本発明は、Ｔ１Ｄのリスク増加に関連したこれらのブロックを有するあらゆるＳＮＰを含むものである。

２００６年３月に集められた３６のヒトゲノムの確立に関連する詳細は、ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙのワールドワイドウェブを参照のこと。

ＵＢＡＳＨ３Ａは、連鎖不均衡のこの領域における唯一の遺伝子であった。Ｓｔｓ２（ＵＢＡＳＨ３Ａに対するマウスホモログ）を欠如したマウスでは、Ｔ−細胞機能を含む全ての観点において正常であることが示されていた^２３。Ｓｔｓ１及びＳｔｓ２の両者を欠如したマウスは、脾細胞数が増加し、Ｔ−細胞受容体刺激に対して反応性亢進を示した。ＳＴＳ１及びＳＴＳ２はＴ−細胞活性化を調節するシグナリング経路の重要な調節因子であることが示唆された^２３。

ＢＡＣＨ２も、この座位の唯一の遺伝子であった。遺伝子産物は、ヘテロ二量体化することで転写活性化因子或いは抑制因子として機能する、基礎領域ロイシンジッパータンパク質であるスモールＭａｆファミリーのメンバーである。Ｍｕｔｏら^２４は、Ｂａｃｈ２−／−マウスは、血清ＩｇＭのレベルが相対的に高いが、ＩｇＡ及びＩｇＧサブクラスのレベルは低かったことを見出した。Ｂａｃｈ２−／−マウスはさらに、Ｔ細胞−非依存性及びＴ細胞−依存性ＩｇＧ反応の欠損も示したことが報告され、これによって著者らにＢＡＣＨ２が抗体反応の調節因子であったと結論付けていた^２４。

さらに、ｒｓ１９８３８５３は、全てのコホートにおいてＴ１Ｄと名目上有意に関連していたが、トロントデータセットでの最終複製試行における複数テストに対する補正では残存しなかったことにも注意すべきである。このＳＮＰは、胚移植のメカニズムに結びつけられていた、内皮分化遺伝子７（ＥＤＧ７；以前はＬＰＡ３）に属していた^２５。

参考文献
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１７．Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ １４，０００ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｃｏｍｍｏｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ３，０００ ｓｈａｒｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４４７， ６６１−７８ （２００７）．
１８．Ｔｏｄｄ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｒｏｂｕｓｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｎｅｗ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３９， ８５７−６４ （２００７）．
１９．Ｔｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｔｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２９， ９７７−８６ （１９９３）．
２０．Ｔｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ （ＤＣＣＴ）． Ｔｈｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ （ＤＣＣＴ）． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｐｈａｓｅ． Ｔｈｅ ＤＣＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３５， ５３０−４５ （１９８６）．
２１．Ｐｒｉｃｅ， Ａ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｆｏｒ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３８， ９０４−９ （２００６）．
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ＲＡＳＧＲＰ１座位及びＴ１Ｄ
上述したように、本発明者らは、Ｔ１Ｄに関連したＲＡＳＧＲＰ１座位において、ｒｓ８０３５９５７というＳＮＰを以前同定した。本発明者ら及びｔｈｅ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＷＴＣＣＣ）によって発表された２つのゲノム−ワイド関連研究は、多数の新規座位を明らかにした。

付加的な研究において、本発明者らは、２つの供給源：１）１，０４６カナダ人ケース−親トリオ、及び１型糖尿病遺伝子コンソーシアム（Ｔ１ＤＧＣ）からの９２９人の患者子孫を有する５３８の多重家族から成る２つのステージの総サンプルサイズを有する、以前刊行された本発明者らの第二ステージ研究；２）ＷＴＣＣＣ結果において１型糖尿病に対して最も高い統計学的有意差を有する１，５３６マーカーに関して、２，０５９人の患者個人（大部分は同胞ペア）を含む、１，０６２の非重複家族からの４，４１７人の個人の遺伝子型を同定した、Ｔ１ＤＧＣのＲＲ２プロジェクト、からのデータを解析した。

ｃｈｒ１５ｑ１４でＬＤブロックにマッピングしている１つの座位は、お互いに完全連鎖不均衡（ＬＤ）（ｒ^２＝１）における２つのマーカー（ｒｓ１７５７４５４６及びｒｓ７１７１１７１）からの結果を組み合わせることによって統計学的に有意であった。本発明者らは、１．３ｘ１０^−６の共同（ｊｏｉｎｔ）Ｐ値を得て、これは本発明者らの研究においてテストされた１，５３６のＳＮＰｓを補正することによって得られた３．２６ｘ１０^−５の保存的閾値を一桁超えるものである。オリジナルＷＴＣＣＣゲノム−ワイドデータでのメタ解析では、５．８３ｘ１０^−９のＰ値が算出された。

これらの研究は、ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子に関連した新規１型糖尿病座位を同定した実施例１に見られた結果を確認するものである。この遺伝子は、胸腺細胞分化、及びＲａｓシグナリング経路を活性化することによるＴＣＲシグナリングにおいて重要な役割を担っていると知られている。

以下の物質及び方法は、実施例１に記載されたものと類似しており、実施例２の実施を容易にするために提供されるものである。

１．Ｔ１ＤＧＣ ＲＲ２研究は、ＷＴＣＣＣ結果において１型糖尿病に対して最も高い統計学的有意差を有した１，５３６のマーカーに関して、２，０５９の患者同胞及び彼らの両親を含む、１，０６２の１型糖尿病家族から４，４１７人の個人を遺伝子型同定した。遺伝子型同定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅプラットフォームに対してＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで実行した。大部分の対象は、ヨーロッパ系祖先であり、発症時の年齢中央値は１０歳（６歳と１５．５歳の下位及び上位四分位点）であった。

２．本発明者らの研究において、本発明者らは、モントリオール、トロント、オタワ及びウィニペグにおける小児糖尿病クリニックで集めた、１，０４６の１型糖尿病ケース−親トリオを遺伝子型同定した。発症時の年齢中央値は８．４歳であり、５．０歳と１１．８歳の下位及び上位四分位点を有していた。民族バックグラウンドは、最大の単一サブセット（４０％）がフランス系カナダ人である、混合ヨーロッパ系家系であった。モントリオール小児病院及び他の参加センターの研究倫理委員によって、この研究は認可されており、文書によるインフォームドコンセントは全対象から得られていた。加えて、本発明者らは、１型糖尿病を患った少なくとも１人の子供及び両親（９４６人の総患者）を含む５４９の家族を遺伝子型同定した。発症時の年齢中央値は８歳であり、４歳と１３歳の四分位点を有していた。サンプルは、ヨーロッパ、北アメリカ及びオーストラリアで集め、大部分の対象はヨーロッパ系祖先であった。ＲＲ２研究にも含まれた１１の重複家族からの遺伝子型同定したデータは、解析から除去した。本発明者らが以前に記載したように、本発明者らは、ＴＤＴ及び本発明者らのオリジナルＧＷＡＳのケース−コントロール相の両者においてｐ<０．０５を有する、９８２のマーカーを遺伝子型同定するためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅアレイを使用した。加えて、本発明者らの２つのＧＷＡコホートの両者においてｐ<０．１及びＷＴＣＣＣにおいてｐ<０．０１を示した１５の一塩基多型（ＳＮＰ）は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ｉＰｌｅｘプラットフォームに対して質量分析を用いることで遺伝子型同定した。

３．統計学
１型糖尿病関連は、ワールドワイドウェブのｂｉｏｓｔａｔ．ｈａｒｂａｒｄ．ｅｄｕ／〜ｆｂａｔ／ｆｂａｔ．ｈｔｍ^８で利用可能なＦａｍｉｌｙ Ｂａｓｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ＦＢＡＴ）ソフトウェアによってテストした。大部分のＴ１ＤＧＣ家族が複数の同胞を有していることを考慮すると、遺伝子関連の不偏テスト以外は左右されないことを可能にするために、実験分散の選択肢をＦＢＡＴ統計学で使用した。１，５３６のＳＮＰｓがＲＲ２研究においてテストされたように、本発明者らは、３．２６ｘ１０^−５の、多重比較で補正された保存された有意閾値を用いた。

結果
最近、２つの独立した研究で、ＵＢＡＳＨ３Ａ及びＢＡＣＨ２の１型糖尿病関連が確認された^２、３。更なる研究によって、ＲＡＳＧＲＰ１座位も重要な１型糖尿病座位であることが確認された。２つのプロジェクトで選択されたマーカーにおけるオーバーラップは、ＳＮＰｓの同一性によって、或いは物理的に近接している（<１Ｍｂ）場合、ＬＤ（ｒ^２値>０．８）によって決定された。既知１型糖尿病座位を排除した後、両プロジェクトにおいて１つの座位のみが名目上有意（Ｐ<０．０５）であった。これは、ＳＮＰのｒｓ１７５７４５４６（Ｐ＝３．４１ｘ１０^−３）としてＲＲ２コホートにおいて、及びｒｓ７１７１１７１（Ｐ＝８．４０ｘ１０^−５、表５）として本発明者らのセットにおいて評価された座位を含む。

ＲＲ２サンプルにおけるｒｓ１７５７４５４６の遺伝子型同定コールレート（ｃａｌｌｉｎｇ ｒａｔｅ）は９９．８％であり、本発明者ら自身のサンプルにおけるｒｓ７１７１１７１では９９．９％であった。メンデル遺伝エラーは両者で見出されなかった。これらＳＮＰｓは完全ＬＤ（ｒ２＝１）であるので、本発明者らは、Ｐ＝１．３０ｘ１０^−６を示した、直接組み合わせ解析を実行した。これは、補正有意差レベルの一桁以上を超えた。組み合わせ家族データセットで推定されたＯＲ（９５％ＣＩ）は、１．２２（１．１２、１．３３）であり、一方ＷＴＣＣＣケース−コントロールセットセットにおけるＯＲ（９５％ＣＩ）は、１．２１（１．０９、１．３３）（Ｐ＝２．６７ｘ１０^−４）であった。これら２つの結果のメタ解析は、ＯＲ（９５％ＣＩ）＝１．２１（１．１４、１．３０）及びＰ＝５．８３ｘ１０^−９であり、これはゲノム−ワイド研究では許容される有意差レベルであった。これらの結果に基づいて、本発明者らは、ＲＡＳＧＲＰ１座位は１型糖尿病と関連していると結論付けることができた。Ｒｓ１７５７４５４６及びｒｓ７１７１１７１の両者は、実施例１に記載したｒｓ８０３５９５７と共に、Ｄ’＝０．９０２及びｒ^２＝０．５５３を有していることに言及するのは興味深い。

この新規１型糖尿病関連シグナルは、ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の転写開始部位の１３ｋｂ上流である、Ｃｈｒ１５ｑ１４でのＬＤブロックへマッピングされており、あらゆる既知１型糖尿病座位とのＬＤを有していなかった。図１を参照のこと。１型糖尿病は膵臓β−細胞の自己免疫破壊によって引き起こされるので、ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子が重要な免疫機能を有しているのは興味深い。ＲＡＳＧＲＰ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０１２５）は、カルシウム及びＤＡＧ−調節性ＲＡＳグアニル放出タンパク質１（ＲａｓＧＲＰ１）をコード化している^９。ＲａｓＧＲＰ１は、胸腺細胞分化、及びＲａｓシグナリング経路を活性化することによるＴＣＲシグナリングにおいて重要な役割を担っている。ＲａｓＧＲｐ１−ヌル変異マウスは、成熟なシングルポジティブ（ＣＤ４^＋ＣＤ８⁻及びＣＤ４⁻ＣＤ８^＋）胸腺細胞の著明な欠損を除いて、ほぼ正常な数の未成熟胸腺細胞を有していた^１０。ＲａｓＧＲＰ１の遺伝子導入発現では、ダブルネガティブ胸腺細胞の成熟が誘導され、ＣＤ４⁻ＣＤ８^＋胸腺細胞の産生が増強された^１１。加えて、ＲａｓＧＲＰ１は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の発生及び機能に対して劇的な効果を有している。ＲａｓＧＲＰ１の欠如において、胸腺におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇの発生は著しく障害されており、一方ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇの末梢増殖及び機能は著しく増加した^１２。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇは、免疫ホメオスターシスを維持し、１型糖尿病及び他の自己免疫疾患の自己免疫反応を阻害するのに重要な役割を担っている^１３。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の移植は、レシピエントＮＯＤマウスにおける１型糖尿病を予防することができるので^１４、１型糖尿病におけるこのサブセットの産生に関連した遺伝子の役割を知ることは、予防介入の開発において重要な役割を担うであろう。

参考文献
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４．Ｇｒａｎｔ ＳＦ， Ｑｕ ＨＱ， Ｂｒａｄｆｉｅｌｄ ＪＰ， Ｍａｒｃｈａｎｄ Ｌ， Ｋｉｍ ＣＥ， Ｇｌｅｓｓｎｅｒ ＪＴ， Ｇｒａｂｓ Ｒ， Ｔａｂａｃｋ ＳＰ， Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎ ＥＣ， Ｅｃｋｅｒｔ ＡＷ， Ａｎｎａｉａｈ Ｋ， Ｌａｗｓｏｎ ＭＬ， Ｏｔｉｅｎｏ ＦＧ， Ｓａｎｔａ Ｅ， Ｓｈａｎｅｒ ＪＬ， Ｓｍｉｔｈ ＲＭ， Ｓｋｒａｂａｎ Ｒ， Ｉｍｉｅｌｉｎｓｋｉ Ｍ， Ｃｈｉａｖａｃｃｉ ＲＭ， Ｇｒｕｎｄｍｅｉｅｒ ＲＷ， Ｓｔａｎｌｅｙ ＣＡ， Ｋｉｒｓｃｈ ＳＥ， Ｗａｇｇｏｔｔ Ｄ， Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＡＤ， Ｍｏｎｏｓ ＤＳ， Ｐｏｌｙｃｈｒｏｎａｋｏｓ Ｃ， Ｈａｋｏｎａｒｓｏｎ Ｈ． Ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｄａｔａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ｌｏｃｉ ｆｏｒ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００９；５８：２９０−５．
５．Ｃｏｏｐｅｒ ＪＤ， Ｓｍｙｔｈ ＤＪ， Ｓｍｉｌｅｓ ＡＭ， Ｐｌａｇｎｏｌ Ｖ， Ｗａｌｋｅｒ ＮＭ， Ａｌｌｅｎ ＪＥ， Ｄｏｗｎｅｓ Ｋ， Ｂａｒｒｅｔｔ ＪＣ， Ｈｅａｌｙ ＢＣ， Ｍｙｃｈａｌｅｃｋｙｊ ＪＣ， Ｗａｒｒａｍ ＪＨ， Ｔｏｄｄ ＪＡ． Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｄａｔａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｒｉｓｋ ｌｏｃｉ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００８；４０：１３９９−４０１．
６．Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｐ， Ｏｎｅｎｇｕｔ−Ｇｕｍｕｓｃｕ Ｓ， Ｔｏｄｄ ＪＡ， Ｓｍｙｔｈ ＤＪ， Ｐｏｃｉｏｔ Ｆ， Ｂｅｒｇｈｏｌｄｔ Ｒ， Ａｋｏｌｋａｒ Ｂ， Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ， Ｈｉｌｎｅｒ ＪＥ， Ｊｕｌｉｅｒ Ｃ， Ｍｏｒａｈａｎ Ｇ， Ｎｅｒｕｐ Ｊ， Ｎｉｅｒｒａｓ ＣＲ， Ｃｈｅｎ ＷＭ， Ｒｉｃｈ ＳＳ． Ａ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｌｏｃｕｓ ｍａｐｓ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２１ｑ２２．３． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００８；５７：２８５８−６１．
７．Ｒｉｃｈ ＳＳ， Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｐ， Ｅｒｌｉｃｈ Ｈ， Ｊｕｌｉｅｒ Ｃ， Ｍｏｒａｈａｎ Ｇ， Ｎｅｒｕｐ Ｊ， Ｐｏｃｉｏｔ Ｆ， Ｔｏｄｄ ＪＡ． Ｔｈｅ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２００６；１０７９：１−８．
８．Ｈｏｒｖａｔｈ Ｓ， Ｘｕ Ｘ， Ｌａｉｒｄ ＮＭ． Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｂａｓｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ： ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｇｅｎｏｔｙｐｅ−−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２００１；９：３０１−６．
９．Ｅｂｉｎｕ ＪＯ， Ｂｏｔｔｏｒｆｆ ＤＡ， Ｃｈａｎ ＥＹ， Ｓｔａｎｇ ＳＬ， Ｄｕｎｎ ＲＪ， Ｓｔｏｎｅ ＪＣ． ＲａｓＧＲＰ， ａ Ｒａｓ ｇｕａｎｙｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ− ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｉｕｍ− ａｎｄ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；２８０：１０８２−６．
１０．Ｄｏｗｅｒ ＮＡ， Ｓｔａｎｇ ＳＬ， Ｂｏｔｔｏｒｆｆ ＤＡ， Ｅｂｉｎｕ ＪＯ， Ｄｉｃｋｉｅ Ｐ， Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ＨＬ， Ｓｔｏｎｅ ＪＣ． ＲａｓＧＲＰ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００；１：３１７−３２１．
１１．Ｎｏｒｍｅｎｔ ＡＭ， Ｂｏｇａｔｚｋｉ ＬＹ， Ｋｌｉｎｇｅｒ Ｍ， Ｏｊａｌａ ＥＷ， Ｂｅｖａｎ ＭＪ， Ｋａｙ ＲＪ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲａｓＧＲＰ１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８ ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７０：１１４１−９．
１２．Ｃｈｅｎ Ｘ， Ｐｒｉａｔｅｌ ＪＪ， Ｃｈｏｗ ＭＴ， Ｔｅｈ Ｈ−Ｓ． Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＲａｓＧＲＰ１−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；１８０：５９７３−５９８２．
１３．Ｓｈｅｖａｃｈ ＥＭ． Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ： ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋） ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００１；１９３：Ｆ４１−６．
１４．Ｓａｌｏｍｏｎ Ｂ， Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ＤＪ， Ｒｈｅｅ Ｌ， Ａｓｈｏｕｒｉａｎ Ｎ， Ｓｉｎｇｈ Ｂ， Ｓｈａｒｐｅ Ａ， Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ＪＡ． Ｂ７／ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００；１２：４３１．

Ｔ１Ｄの診断方法及びＴ１Ｄの治療に対して有用な薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイ

本明細書の上記情報は、Ｔ１Ｄの発症に対する増加した感受性を診断するために、及び治療介入のために患者へ臨床的に適用可能である。本発明の好ましい実施形態は、患者への本明細書に記載した情報の臨床適用を有するものである。マイクロアレイを含む診断組成物及び方法は、Ｔ１Ｄ発症に対する感受性を評価するために、患者からの核酸における本明細書に記載された遺伝子変異を同定するために設計され得る。これは患者がクリニックに到着した後に起こることであり；患者が採血を受け、本明細書に記載された診断法を用いて、臨床医は本明細書に記載された２１、１５、６、９及び１番染色体の領域におけるＳＮＰを検出することができる。スクリーニングされる患者の典型的な年齢範囲は、９から１２歳の間である。評価する前に任意に増幅され得る、患者サンプルから得られる情報は、Ｔ１Ｄ発症の感受性が増加した或いは減少した患者を診断するために使用されるであろう。本発明の診断方法を実行するためのキットも、本明細書で提供される。そのようなキットは、本明細書で提供されたＳＮＰｓの少なくとも１つを有するマイクロアレイ、及び上述されたように患者サンプルを評価するための必要試薬を有しているものである。

Ｔ１Ｄ−関連遺伝子及び患者結果の同定は、どの変異が存在するかを示し、Ｔ１Ｄ発症の変化リスクを有している患者を同定するであろう。本明細書で提供された情報は、以前可能であった疾患進行における初期期間での治療介入を可能にする。本明細書でも上述したように、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２及びＥＤＧ７は、Ｔ１Ｄの治療に対して有効な新しい薬剤の開発のための新規標的を提供する。特に、疾患を発症する傾向をより有している患者においてこれらの遺伝子の発現を阻止することが望ましい。この点において、本明細書に記載された治療用ｓｉＲＮＡｓは、患者シグナルに基づいた遺伝子産物の発現を阻止し、それによりＴ１Ｄで起こる膵臓β−細胞破壊を阻害するために使用され得る。

本発明において使用される候補ｓｉＲＮＡ組成物は、表６〜１０に提供されている。表６〜１０における配列は、いくつかのｓｉＲＮＡｓ（すなわち、標的領域に対するセンス配列）を含む。本分野の当業者は、センス鎖の開示に基づいてアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖の配列を決定することができ、それぞれＲＮＡ及びＤＮＡ分子に一致する、配列におけるあらゆる「Ｕ」及び「Ｔ」記号の間の違いを理解するであろう。さらに、Ｔ１Ｄを治療するためにＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２及びＥＤＧ７の既知阻害剤を使用する方法も、提供される。加えて、ｓｈＲＮＡコンストラクトは、表４〜８に提供されたセンス鎖に基づいて設計され、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＢＡＣＨ２及びＥＤＧ７を阻害するのに有効である。それぞれの標的に対して表６〜１０のセンス鎖を利用したｓｈＲＮＡコンストラクトには、センス配列に対するヘアピンループ３’が含まれ（例えば、これに限定されるものではないが、適切なヘアピンには：ＴＣＡＡＧＡＧ、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ、ＧＡＡＧＣＴＴＧ及びＴＴＣＧが含まれる）、その後に表６〜１０に提供されたセンス鎖からの対応するアンチセンス配列が続く。

特定の本発明の好ましい実施形態が記載され、特に上に例示されたが、これは本発明をそのような実施形態に制限することを意図するものではない。本分野の当業者にとって、様々な変化及び修飾は、以下の請求項に説明されたように、本発明の観点から逸脱することなく、なされ得ることを理解するであろう。

Claims (7)

1. １型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発症に対する感受性を評価するために患者から単離されたＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＲＡＳＧＲＰ１、ＥＤＧ７、またはＢＡＣＨ２をコードする核酸における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の有無を検出するための方法であって、前記方法は、
   ａ）患者サンプルからの標的核酸を提供する工程であって、前記標的核酸は正常集団における所定配列を有しているものである、前記提供する工程；及び、
   ｂ）Ｔ１Ｄ発症の感受性の増加或いは減少を示すＳＮＰの存在を前記標的核酸で評価する工程、
   を有し、前記ＳＮＰは、
   １．２５×１０^−６の有意に関連するＰ値を有するＢＡＣＨ２遺伝子内のｒｓ３７５７２４７、
   ２．３３×１０^−８の有意に関連するＰ値を有するＵＢＡＳＨ３Ａ遺伝子内のｒｓ９９７６７６７、
   ２．６４×１０^−６の有意に関連するＰ値を有するＧＬＩＳ３遺伝子内のｒｓ１０７５８５９３、
   ３．５１×１０^−５の有意に関連するＰ値を有するＧＬＩＳ３遺伝子内のｒｓ１０７５８５９４、
   １．８７×１０^−６の有意に関連するＰ値を有するＥＤＧ７遺伝子内のｒｓ１９８３８５３、及び
   ３．９２×１０^−６の有意に関連するＰ値を有するＲＡＳＧＲＰ１遺伝子内のｒｓ８０３５９５７
   の少なくとも１つを有するものである、方法。
2. 請求項１の方法において、前記標的核酸は、サイズ解析、アレル特異的プローブのハイブリダイゼーション、アレル−特異的プライマー伸展、オリゴマーライゲーション、ＤＮＡシークエンス、一本鎖高次構造多型分析、及び定量的ＰＣＲから成る群から選択された方法を介して遺伝子変異を評価されるものである、方法。
3. 請求項１の方法であって、さらに、表１、２、４及び５に記載された１若しくはそれ以上のＳＮＰを検出する、方法。
4. 請求項１の方法において、前記ＳＮＰは、表３に記載された連鎖不均衡ブロックに存在するものである、方法。
5. 請求項１の方法であって、さらに、１５番染色体上のＲＡＳＧＲＰ１遺伝子内の３６６９４３３３位に存在するｒｓ７１７１１７１を検出する、方法。
6. Ｔ１Ｄを診断するために、標的核酸における少なくとも１つの特異的ヌクレオチドの有無を決定するための方法であって、前記方法は、
   ａ）糖尿病と関連すると知られている染色体領域から単離された、検出可能な量の標的核酸ポリマーを提供する工程であって、前記領域は配列ＩＤ番号１のＵＢＡＳＨ３Ａ遺伝子、配列ＩＤ番号２のＧＬＩＳ３遺伝子、配列ＩＤ番号３のＲＡＳＧＲＰ１遺伝子、配列ＩＤ番号４のＢＡＣＨ２遺伝子、または配列ＩＤ番号５のＥＤＧ７遺伝子を有するものである、前記提供する工程；
   ｂ）前記検出可能な量の核酸ポリマーを、１若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイゼーションする工程であって、各プライマーは標的核酸ポリマーにおける配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有しているものである、前記ハイブリダイゼーションする工程；
   ｃ）少なくとも１つのデオキシヌクレオチドを含有する混合液において、前記ハイブリダイゼーションされた核酸ポリマーを重合剤へ曝露する工程であって、前記デオキシヌクレオチドは検出可能なレベルを有しているものである、前記曝露する工程；
   ｄ）標識化デオキシヌクレオチドを含有するプライマー伸展産物の有無を、工程（ｃ）の重合化混合物で解析する工程であって、これによって定義部位での特異的ヌクレオチドの同定が決定されるものである、前記解析する工程；及び、
   ｅ）前記少なくとも１つのシングルヌクレオチド座位での遺伝子変異の存在を前記標的核酸で評価する工程であって、多型の存在はＴ１Ｄ発症の変化リスクと関連しているものであり、前記多型は、ＢＡＣＨ２遺伝子内のｒｓ３７５７２４７、ＵＢＡＳＨ３Ａ遺伝子内のｒｓ９９７６７６７、ＧＬＩＳ３遺伝子内のｒｓ１０７５８５９３、ＧＬＩＳ３遺伝子内のｒｓ１０７５８５９４、ＥＤＧ７遺伝子内のｒｓ１９８３８５３、ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子内のｒｓ１７５７４５４６、ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子内のｒｓ７１７１１７１、及びＲＡＳＧＲＰ１遺伝子内のｒｓ８０３５９５７の少なくとも１つを有するものである、前記評価する工程、を有するものである、方法。
7. 請求項６の方法を実行するためのキットであって、コードされた核酸の単離に適したプライマーであって、前記コードされた核酸はＧｅｎｅＣｈｉｐに固定されたＴ１Ｄの改変リスクに関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を有する、前記プライマーと、容器および使用説明書とを有し、前記核酸はＢＡＣＨ２、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＧＬＩＳ３、ＥＤＧ７、およびＲＡＳＧＲＰ１から成る群から選択される遺伝子によってコードされるものであり、前記ＳＮＰはＢＡＣＨ２ ＳＮＰ、ＵＢＡＳＨ３Ａ ＳＮＰ、ＧＬＩＳ３ ＳＮＰ、ＥＤＧ７ ＳＮＰ、およびＲＡＳＧＲＰ１ ＳＮＰから成る群から選択されるものである、キット。

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