JP6095578B2 - 全身における組織恒常性の撹乱をモニターする方法及び手段 - Google Patents
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Description
−アルコール中毒及び肝機能障害又はマラソン及びトライアスロン参加並びに筋肉疲労などの器官系の機能的ストレス、
−(早発性)加齢性退縮(老化)、
−例えばコルチコステロイドなどの薬物による、抑制及びそれに続く再生、
−例えば自己免疫疾患における、炎症並びにそれに続く再生及び/又は線維形成による修復、
−結核、ライム病、Q熱などの持続性くすぶり型及び潜行性の感染症、
−増殖の調節不全と、それに続く過形成、潜在的にやはりそれに続く異形成及び悪性転換。
b)異なるCTMサブセットの特定及び列挙のために、骨格マーカーCD14、CD16及びCD300e並びに好ましくは更にHLADRに対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記CTMを染色するステップ、
c)その起源組織における個々のCTMによる非CTMタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも1個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の1種類以上のエピトープに対する1種類以上の検出抗体を使用した前記CTMの固定、透過化及び染色、それによって循環組織特異的マクロファージ(CTSM)の少なくとも1つのサブセットを特定するステップ、
d)個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定するための骨格マーカーCD14、CD16及びCD300eのゲーティングによる前記染色CTM及びCTSMの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、
e)各CTMサブセット、及び測定された細胞内エピトープの各々を発現する各特定のCTSMサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
f)(i)評価された個々のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1セットによって規定された異なる正常及び変化組織から各々生ずる各CTMサブセット及び各特定のCTSMサブセット内の細胞の相対及び絶対数と、ii)評価された個々の細胞内ペプチドごとに関連付けられた抗体関連信号の量とを計算して、試験CTSM染色プロファイルを得るステップ、並びに
g)前記試験CTSM染色プロファイルを各評価組織の正常CTSM染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び/又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ。
(ii)同時にCD300eとHLADRを同時発現する低〜中間SSCの細胞を選択するための、少なくともCD14、CD16、CD300e及びHLADRによる染色、及び側方散乱(SSC)とCD300e及びHLADR+細胞の組合せに対するゲーティング、又は
(iii)少なくともCD14、CD16、CD45、CD300e及びHLADRによる染色、及びSSCとCD45、CD300e及びHLADR陽性細胞の組合せに対するゲーティング、好ましくは同時にCD300eとHLADRを同時発現するCD45を有する低〜中間SSCの細胞に対するゲーティング(図4A〜D)。
−他の初期CTM細胞すべて(対古典的単球)をCD16+/CD14+表現型を有する事象として選択することによって単球とCTMを識別すること、並びにCTMコンパートメント全体をCD64低として及びCD16+/CD64高として規定すること、続いて
−CD64、CD14及びCD16の発現レベルに基づいて選択されたCTMを異なる機能又は成熟関連コンパートメントに更に細分すること、好ましくは前記異なるコンパートメントはCD64高/CD14高/CD16低〜CD64高/CD14高/CD16高、CD64高/CD14低/CD16高、CD64低/CD14−/CD16高及びCD64低/CD14−/CD16低である。
−CTMサブセット:CD64高/CD36高/CD14高/CD16低〜CD64高CD36高/CD14高/CD16高、CD64高/CD36高CD14低/CD16高及びCD64低/CD36高/CD14−/CD16高〜CD64低/CD14−/CD16低/CD36−〜低細胞。
b)1種類の細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
c)単一器官又は組織の正常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
d)単一器官又は組織の異常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
e)正常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも1種類の抗体と異常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも1種類の抗体の組合せを含めて、単一器官又は組織の正常及び異常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、並びに
f)2つ以上の器官又は組織の正常又は異常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ。
2.その起源組織において個々のCTMによって処理された1種類以上のタンパク質の分解に由来するタンパク質断片又はペプチドの1種類以上のエピトープの同時細胞内検出に向けた第2のグループのマーカー。
────────────────────────────────────────
手順A CTM及びCTSMの細胞表面マーカーの染色
1.各特異的CTM又はCTSM抗体パネルの推奨に従って細胞表面マーカーに対する適切な体積の抗体を添加する。
2.必要に応じて、PBS+0.5%BSAを使用して最終体積100μL/管にする。
3.十分混合する。
4.光から保護して室温(RT)で15分間インキュベートする。
5.1×FACS溶解液(蒸留水(dH2O)で1/10vol/vol希釈された10×FACS溶解液;Becton Dickinson、サンホゼ、CA)2mLを添加する。
6.十分混合する。
7.光から保護して室温で10分間インキュベートする。
8.540gで5分間遠心分離する。
9.パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約50μLを残す。
10.2mLのPBS+0.5%BSAを細胞ペレットに添加する。
11.十分混合する。
12.540gで5分間遠心分離する。
13.パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約50μLを残す。
14.細胞ペレットを200μLのPBS+0.5%BSAに再懸濁させる。
15.染色後の細胞を得る、又は(すぐに得られない場合)多色フローサイトメーターで測定するまで4℃で最大3時間貯蔵する。
手順B 細胞表面膜並びにCTM及びCTSMの細胞内マーカーの混合染色
16.手順Aステップ13から続く。
17.各特異的CTM又はCTSM抗体パネルの推奨に従って適切な体積の抗体を添加する。
18.必要に応じて、PBS+0.5%BSAを使用して体積100μL/管にする。
19.十分混合する。
20.光から保護して室温で15分間インキュベートする。
21.2mLのPBS+0.5%BSAを細胞ペレットに添加する。
22.十分混合する。
23.540gで5分間遠心分離する。
24.パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約50Lを残す。
25.細胞ペレットを軽く混合して再懸濁させる。
26.試薬A(固定液Fix&Perm(商標)、An der Grub、ウィーン、オーストリア)100μLを添加する。*
27.光から保護して室温で15分間インキュベートする。
28.2mLのPBS+0.5%BSAを細胞ペレットに添加する。
29.十分混合する。
30.540gで5分間遠心分離する。
31.パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約50μLを残す。
32.細胞ペレットを軽く混合して再懸濁させる。
33.試薬B(透過処理溶液Fix&Perm(商標))100μLを添加する。*
34.十分混合する。
35.細胞内ペプチド(タンパク質断片)に対する適切な体積の抗体を添加する。
36.十分混合する。
37.光から保護して室温で15分間インキュベートする。
38.2mLのPBS+0.5%BSAを細胞ペレットに添加する。
39.十分混合する。
40.540gで5分間遠心分離する。
41.パスツールピペット又は真空系を使用して細胞ペレットを乱さずに上清を廃棄して、各管に約50μLを残す。
42.細胞ペレットを200μLのPBS+0.5%BSAに再懸濁させる。
43.染色後の細胞を得る、又は(すぐに得られない場合)多色フローサイトメーターで測定するまで4℃で最大3時間貯蔵する。
────────────────────────────────────────
*別の固定及び透過処理方法、例えば、FACS溶解液を使用することもできる。
b)異なるCTMサブセットの特定及び列挙のために、骨格マーカーCD14、CD16、CD300e並びに好ましくは更にHLADR、CD64及びCD36に対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記CTMを染色するステップ(図4及び5)、
c)個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定する前記染色CTMの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、前記分析は、例えば、Infinicytソフトウェアの自動集団分別−APS view−、又は多次元尺度(MDS)分析を使用した、多変量解析、好ましくは主成分分析(PCA)を含む(図4及び5)、
d)各CTMサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
e)(i)各CTMサブセット内の細胞の相対及び絶対数を計算するステップ、並びに
f)試験CTSM染色プロファイルを各評価組織の正常CTM染色プロファイルと比較し、異常な試験染色プロファイルが組織損傷、変化した組織恒常性、疾患の存在、及び/又は耐性に対する治療の有効性を示すステップ。
・生活習慣(喫煙、食事、飲酒など)、
・家族関連疾患(心血管、癌、アルツハイマーなど)
防止及び/又は早期診断を目的として、個体ごとに組織由来のペプチドの特定の個別化された組合せをモニターすることができる。
・小児の成長:乳児期、小児期、青年期における器官の発達、例えば、骨コンパートメントにおける高い活性(成長及び再形成)、及び結果として骨由来ペプチドを含むCTSMサブセットの増加、
・幼児における大きい胸腺に反映されている、幼児における多数のB及びTリンパ球の産生のための極めて活性なリンパ様前駆細胞コンパートメント、
・加齢:器官退縮及びCTSMサブセットの増加を伴う老化、
・妊娠:胎盤機能及び機能不全(胎盤中毒の早期検出及び分娩時間)、
・胸腺退縮及びT細胞産生の減少:多数のT細胞(約90%)が胸腺においてネガティブ選択される、
・卵巣機能:卵巣CTSMの減少による(早発)閉経の検出、
・骨形成及び骨密度:加齢中、例えば、思春期/青年期、加齢及び早期閉経における骨形成及び骨吸収の評価。
・喫煙:粘膜及び上皮細胞バランスの測定による肺損傷の評価、
・アルコール:アルコール摂取に関連した肝損傷の評価、
・スポーツ:回復能力の異なるトップスポーツマンに対して個別化された練習プログラムを設計するための耐久スポーツ(例えば、マラソン、トライアスロン)における筋肉由来CTSMの評価、
・皮膚の太陽/UV光暴露:UV暴露レベル及び関連した損傷を評価するための皮膚上皮ペプチド及びメラニンペプチドの測定(UV露光の表面範囲及び強度)。
組織マクロファージにおける毒性成分の直接評価、又は以下の場合などの関係組織における間接的毒性測定
・石綿、
・塗料中の神経毒性材料、
・核事故後の放射線被曝の結果。
・外傷:外傷の程度、及び回復の進行のモニタリング、
・外科的介入:例えば、手術における研修医の技能の評価のための、例えば、「手術の質」の尺度としての手術後組織損傷の評価、
・体全体にわたる複数の病変部を有する敗血症の影響、
・癌治療などの医療行為の器官損傷及び他の望ましくない毒性副作用、
・特定の組織、例えば、熱傷に対する温度の影響(サイズ、深さ及び体表)、
・骨折、並びに骨折の複雑さ及び広がり(例えば、オステオカルシンペプチド及び/又はオステオポンチンペプチド及び/又は骨アルカリホスファターゼペプチドの測定)。
・全身性硬化症などの自己免疫疾患の広がり、
・シェーグレン病:特定の上皮ペプチドの測定による涙腺及び唾液腺の関与についてのより早い診断及びより明確な定義、
・自己免疫性ぼうこう炎;ぼうこう上皮ペプチドを含むCTSMの測定、
・糸球体腎炎:自己免疫性腎炎における腎臓損傷の程度、又は全身性エリテマトーデス(SLE)患者における腎臓損傷の早期検出、又は腎移植後の患者における拒絶プロセスの早期検出、
・リウマチ様関節炎:CTSM中の関節成分(滑膜ペプチド)の検出、
・血管炎:例えば、内皮細胞ペプチドを含むCTSMを有する側頭動脈炎。
・アルツハイマー病:変異Apoε4、APPなどの疾患関連タンパク質由来のペプチドを含むCTSMを介した早期診断、
・多発性硬化症:例えば、CTSM中のミエリンペプチドの検出、
・パーキンソン病
・クロイツフェルト ヤコブ病などのプリオン病。
同じTSMサブセット中の組織特異的ペプチドと微生物特異的ペプチドの複合検出:
・マイコバクテリウム感染症:BCG陽性患者及び小児における難しい診断、
・Q熱:難しい診断及び難しい治療有効性評価、
・ライム病:疾患の診断が難題のままであるあいまいな愁訴を有する患者におけるボレリア由来ペプチドの検出、
・B型肝炎及びC型肝炎:肝損傷及び/又はウイルスタンパク質由来ペプチドのモニタリング、
・侵襲性真菌及び酵母感染症の診断:アスペルギルス感染症の難しい診断;循環組織マクロファージにおける真菌抗原の検出、及び関係するCTSMの特定による関係組織の特定。
・肥満:例えば、脂肪細胞由来のタンパク質断片の異なる疾患特異的プロファイル、
・1型糖尿病(若年性インスリン依存性糖尿病):すい臓中のインスリン産生細胞の主要な損傷が起こる前の初期段階における検出、
・2型糖尿病(遅発性):アテローム硬化型合併症が存在する場合、機能(サイトカイン産生)の低下したCD14dim/CD16++組織マクロファージが増加、
・性腺機能低下におけるテストステロン治療:組織マクロファージの増加、ただし機能は低下。
例えば、筋肉由来ペプチド及び他の疾患マーカー(例えば、ウイルス成分)の検出:
・線維筋痛、
・慢性疲労症候群:組織マクロファージ中のウイルス成分の検出、
・起源の不明な(特発性)発熱:組織関連損傷の直接の反映としてのCTSMのプロファイルの定義。
ほとんどの癌の場合、上皮膜抗原を1種類以上の組織特異的マーカーと組み合わせて一般的マーカーとして使用することができる。
・乳癌:例えば、CA15−3抗原由来のペプチド、
・甲状腺癌:例えば、腫ようマーカーとしてのRET由来のペプチド、
・食道癌、
・胃癌、
・結腸癌:例えば、癌胎児性抗原(CEA)由来のペプチド、
・直腸/S状結腸癌、
・肺癌、
・子宮頚癌又は子宮癌、
・前立腺癌:例えば、PSA及びERGペプチド、
・ぼうこう癌、
・黒色腫:例えば、メラニンペプチド;MART−1/Melan−A
・すい臓癌、
・腎癌など、
・神経芽細胞腫:例えば、ジシアロガングリオシドGD2由来のペプチド、
・脳腫よう、例えばGFAP(図6)、
・中皮腫:石綿被爆労働者のスクリーニング、及び循環組織マクロファージ中の中皮由来ペプチドを介した早期診断、
・下垂体腫ようなどの診断が困難な希少癌。
同じCTSMサブセット中の腫よう由来のペプチドと浸潤組織由来のペプチドの複合検出、例えば、
・骨又は肝臓における乳癌転移:同じTSMサブセット中の***由来のペプチドと骨又は肝臓由来のペプチドの複合検出、
・肝臓における結腸癌転移:同じCTSMサブセット中の結腸由来のペプチドと肝臓由来のペプチドの複合検出、
・骨における前立腺癌転移:同じCTSMサブセット中の結腸由来のペプチドと骨由来のペプチドの複合検出、
・血管内B細胞リンパ腫:同じCTSMサブセット中の内皮由来ペプチドとB細胞由来ペプチドの複合検出(検出された高レベルの組織マクロファージ:血液白血球の>10%)
・脳内リンパ腫:同じCTSM中のCNSペプチドとB細胞ペプチドの複合検出。
・狭心症:心筋梗塞を伴う又は伴わないECG異常、
・血栓形成リスクのある患者における凝固障害
・II型糖尿病患者におけるアテローム硬化型病変部。
材料及び方法
まず、診断時の(外科的介入前の)神経こう腫患者(n=9)及び健常対照群(n=9)から新たに収集された血液試料を、表2(手順A、ステップ1から13)に記載の染色手順に従って、CD300e(UP−H2)−APC(Immunostep、サラマンカ、スペイン)、CD14(MO−P9)−APCH7(BD Biosciences San Jose、CA、USA)、CD16(3G8)−PECy7(BD Biosciences San Jose、CA、USA)、CD45(HI30)−PacO(InVitrogen、グランドアイランド、NY、USA)、及びHLADR(L243)−PacB(BioLegend、サンディエゴ、CA、USA)で表面膜染色した。表面膜染色後、表2(手順B、ステップ16から43)に記載の染色手順に従って、抗GFAP(N−18)−PE抗体で試料を細胞内染色した。抗GFAP抗体は、タンパク質のN末端エピトープに対するものであり、Santa Cruz Biotechnology(サンタクルーズ、CA、USA)から入手した。細胞固定及び透過化をFix&Perm(An der Grub、ウィーン、AT)を用いて実施した。染色細胞をFACSCantoII多色フローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて測定し、データをInfinicytソフトウェア(Cytognos、サラマンカ、スペイン)によって分析した。単球及びCTMのゲーティングは、中間SSC及びCD45発現に対するゲーティングとそれに続くCD300e及びHLADR陽性に対するゲーティングに基づいた(一般的染色パターンについては図4参照)。次いで、更にCD16及びCD14発現を分析し、続いて細胞内GFAP染色を評価した(図6A参照)。
初期CTMの割合は、全評価集団(古典的単球+CTMすべて)に対して表され、GFAP陽性は、初期CTM集団内の陽性細胞割合として表された。健常対照群はすべて初期CTMが10%未満であり、健常対照群の6/9は初期CTMが5%未満であった。9名の健常対照群におけるGFAP陽性初期CTMの割合は、1%未満(0.6%、0.7%及び7回の0%)であった(図6B参照)。神経こう腫患者は初期CTMが8/9例で5%を超え、4/9例で10%を超えた。GFAP陽性初期CTM割合は、約1%から約31%まで変動した(0.9%、1.0%、1.3%、1.4%、2.5%、4.5%、8.7%、29.9%、30.7%))。GFAP陽性CTM割合は、神経こう腫瘤のサイズと幾らかの相関を示した(図6B参照)。
Claims (19)
- 血液中の循環組織マクロファージ(CTM)及びそのサブセットを検出及び同定する方法であって、
a)循環組織マクロファージ(CTM)を含む対象由来の生物学的試験試料を用意するステップ、
b)異なるCTMサブセットの特定及び列挙のために、骨格マーカーCD14、CD16及びCD300eに対する異なって標識された異なる抗体のパネルで前記CTMを染色するステップ、
c)その起源組織における個々のCTMによる非CTMタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも1個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の1種類以上のエピトープに対する1種類以上の検出抗体を使用した前記CTMの固定、透過化及び染色、それによって循環組織特異的マクロファージ(CTSM)の少なくとも1つのサブセットを特定するステップ、
d)個々の細胞に関連した各々異なる標識抗体の信号量を測定するための骨格マーカーCD14、CD16及びCD300eのゲーティングによる前記染色CTM及びCTSMの多パラメータフローサイトメトリー分析のステップ、
e)各CTMサブセット、及び測定された細胞内エピトープの各々を発現する各特定のCTSMサブセット内の個々の細胞の相対及び絶対数を測定するステップ、
f)(i)評価された個々のプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1セットによって規定された異なる正常及び変化組織から各々生ずる各CTMサブセット及び各特定のCTSMサブセット内の細胞の相対及び絶対数と、ii)評価された個々の細胞内ペプチドごとに関連付けられた抗体関連信号の量とを計算して、試験CTSM染色プロファイルを得るステップ、並びに
g)前記試験CTSM染色プロファイルを各評価組織の正常CTSM染色プロファイルと比較するステップ
を含む、方法。 - ステップb)が、マーカーCD300e、CD14、CD16及びHLADRに対する抗体で染色することを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップb)が、さらに、マーカーCD45、CD64及びCD36の1種類以上に対する抗体で染色することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップd)が、側方散乱(SSC)分析と組み合わせてCD300e、CD14及びCD16の細胞表面発現に基づくゲーティング戦略を実施することを含む、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ゲーティング戦略が、(i)側方散乱(SSC)分析と組み合わせて、CD300e及びHLADRの発現に基づく古典的単球とCTMの両方を包含する包含ステップと、(ii)それに続いて、前記古典的CD14高/CD16−単球をCTMから識別し、前記CTM集団内のサブセットを特定するサブセット特定ステップとで構成される、請求項4に記載の方法。
- 以下のいずれか1つを含む、請求項5に記載の方法:
(i)CD300eを発現する低〜中間SSCの細胞を選択するための、少なくともCD300e、CD14及びCD16についての染色、並びにSSCとCD300e+細胞の組合せに対するゲーティング、
(ii)同時にCD300eとHLADRを同時発現する低〜中間SSCの細胞を選択するための、少なくともCD300e、CD14、CD16及びHLADRについての染色、並びに側方散乱(SSC)とCD300e+及びHLADR+細胞の組合せに対するゲーティング、又は
(iii)少なくともCD300e、CD14、CD16、CD45及びHLADRについての染色、並びにSSCとCD300e+、CD45+及びHLADR+細胞の組合せに対するゲーティングであって、同時にCD300eとHLADRを同時発現するCD45を有する低〜中間SSCの細胞を選択するためのゲーティング。 - 前記サブセット特定ステップが、古典的(CD14高/CD16−)単球並びにCD14高/CD16低〜CD14高/CD16高、CD14低/CD16高及びCD14−/CD16高〜CD14−/CD16低細胞として特定される2つの主要なCTMサブセットの特定を含む、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記CTMサブセット特定ステップが、
−後期CTMを表すCD64低対古典的単球プラス初期CTMを表すCD64高に対してゲーティングを行うこと、続いて
−他の初期CTM細胞すべて(対古典的単球)をCD16+/CD14+表現型を有する事象として選択することによって単球とCTMを識別すること、並びにCTMコンパートメント全体をCD64低として及びCD16+/CD14+/CD64高として規定すること、続いて
−CD64、CD14及びCD16の発現レベルに基づいて選択されたCTMを異なる機能又は成熟関連コンパートメントに更に細分すること、前記異なるコンパートメントはCD64高/CD14高/CD16低〜CD64高/CD14高/CD16高、CD64高/CD14低/CD16高、CD64低/CD14−/CD16高及びCD64低/CD14−/CD16低である
を含む、請求項5又は6に記載の方法。 - 前記選択されたCTMを更に細分するステップがCD64、CD14、CD16及びCD36に基づき、少なくとも1つの以下のCTMサブセット、すなわちCD64高/CD36高/CD14高/CD16低〜CD64高/CD36高/CD14高/CD16高、CD64高/CD36高/CD14低/CD16高、CD64低/CD36高/CD14−/CD16高及びCD64低/CD14−/CD16低/CD36−〜低細胞の特定を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記生物試料が、末梢血、腹水、胸水、脳脊髄液、骨髄、リンパ節、リンパ液、滑液、又は固体組織から調製される単一細胞懸濁液を含む、請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップc)が以下の細胞内染色を含む、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法:
a.細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する単一プロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
b.1種類の細胞内プロセシングされた組織関連タンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
c.単一器官又は組織の正常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
d.単一器官又は組織の異常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、
e.正常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも1種類の抗体と異常タンパク質のペプチドエピトープに対する少なくとも1種類の抗体の組合せを含めて、単一器官又は組織の正常及び異常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ、並びに
f.2つ以上の器官又は組織の正常又は異常細胞に由来する2種類以上の細胞内プロセシングされたタンパク質に由来する2個以上の異なるプロテアーゼ誘導タンパク質断片の1種類以上のエピトープ。 - 前記少なくとも1種類の検出抗体によって異常タンパク質に由来する1種類以上のペプチドエピトープの検出が可能になり、前記異常タンパク質が、発癌タンパク質、変異タンパク質、融合タンパク質、アレルゲンに由来するタンパク質、及びウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のような病原体に由来するタンパク質からなる群から選択される、請求項1ないし11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異なって標識された抗体のパネルが、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、ペリジン葉緑素タンパク質(PerCP)、アロフィコシアニン(APC)、alexa fluor 488、alexa 647、alexa 710、alexa fluor 405、cyanin 5(Cy5)、Cyanin 5.5(Cy5.5)、pacific blue(PacB)、horizon violet 450(HV450)、pacific orange(PacO)、brilliant violet(BV)、HV500、OC515、Krome Orange、量子ドット、及びPE、APC又はPerCPと結合したその複合物(例えば、PE/Cy5、PE/Cy5.5、PE/Cy7、PerCP/Cy5.5、APC/Cy7、PE−Texas Red、APCCy750)から選択される適合蛍光色素の組合せ、又は任意の追加の適合蛍光色素若しくは蛍光色素タンデムを含む、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
- 1セットの骨格マーカーに対する異なって標識された抗体を第1の容器に含む診断キットであって、前記骨格マーカーがCD300e、CD14、CD16、HLADR、及びCD36であり、さらに、その起源組織における個々のCTMによる非CTMタンパク質の細胞内分解に由来する少なくとも1個のプロテアーゼ誘導タンパク質断片上の1種類以上のエピトープに対する少なくとも1種類の検出抗体を含む第2の容器を含む、診断キット。
- 前記第1の容器が、更にマーカーCD64又はCD45に対する抗体の群から選択される少なくとも1種類の抗体を含む、請求項14に記載の診断キット。
- 前記第1の容器がCD300e、CD14、CD16、HLADR、CD45、CD64及びCD36に対する抗体を含む、請求項15に記載の診断キット。
- 前記第2の容器が、悪性腫ようの早期診断及びモニタリングに使用される、***上皮タンパク質、食道上皮タンパク質、胃上皮タンパク質、すい臓上皮タンパク質、結腸上皮タンパク質、直腸−S状結腸上皮タンパク質、甲状腺上皮タンパク質、肺若しくは気管支上皮タンパク質、前立腺上皮タンパク質、ぼうこう上皮タンパク質、頚部上皮タンパク質、子宮上皮タンパク質、黒色腫タンパク質、腎糸球体タンパク質の細胞内分解に由来する1個以上のプロテアーゼ誘導タンパク質断片に対する、又は別の上皮細胞マーカーに対する、少なくとも1種類の検出抗体を含む、請求項14ないし16のいずれかに記載の診断キット。
- 前記第2の容器が、アルツハイマー病、神経こう腫又は多発性硬化症の早期診断及びモニタリングに使用される、Apoε4、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、GFAP及びミエリンからなる群から選択される、脳又は神経特異的タンパク質の細胞内分解に由来する1種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも1種類の検出抗体を含む、請求項14ないし17のいずれかに記載の診断キット。
- 前記第2の容器が、それぞれ心臓、腎臓、肝臓又は肺移植を受けた患者における移植後の器官生存及び移植拒絶プロセスの評価に使用される、心筋特異的タンパク質(例えば、トロポニン又はCK−MB)、腎臓/糸球体特異的タンパク質、肝臓特異的タンパク質又は肺特異的タンパク質の細胞内分解に由来する1種類以上のエピトープの検出を可能にする少なくとも1種類の検出抗体を含む、請求項14ないし18のいずれか1項に記載の診断キット。
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