JP6093926B2 - パパイヤモザイクウイルス組成物および自然免疫応答刺激のためのその使用 - Google Patents
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Description
特に定義しない限り、本明細書中で使用するあらゆる技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明のPapMV部分は、PapMVまたはPapMV VLPのいずれであってもよい。本発明のある実施形態では、前記VLPを含む組成物は、ディスク形態の多量体化PapMV外被タンパク質を、少量含有してもよい。
(PayMV)
PapMVは、当該技術分野で公知であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)よりATCC No.PV−204(商標)として入手可能である。前記ウイルスは、標準プロトコールにしたがって(例えば、Erickson,J.W.&Bancroft,J.B.,1978,Virology 90:36−46参照)、パパイヤ(Carica papaya)およびキンギョソウ(Antirrhinum majus)のような宿主植物で維持し、前記宿主植物から精製することができる。
PapMV VLPは、当該技術分野で公知の標準的な技術(例えば、Tremblay et al.,2006、同上、および国際出願第PCT/CA2007/002069号明細書、国際出願第PCT/CA2008/000154号明細書、および国際出願第PCT/CA2009/00636号明細書参照)、ならびに、本明細書に記載のインビトロ集合技術により、調製可能である。
組換え外被タンパク質のVLPへの自己集合能は、標準的な技術、例えば、精製した前記タンパク質を電子顕微鏡によって視覚化することにより(例えば、Tremblay,et al,2006,FEBS J.,273:14−25参照)、分析が可能である。また、超遠心分離を用いてVLPをペレットとして単離し、より小さい凝集体(20mer以下)を上清に残しておき、円偏光二色性(CD)分光測光法により、前記組換えまたは改変タンパク質の二次構造を、野生型ウイルスと比較してもよい(例えば、Tremblay,et al.,同上参照)。
自然免疫応答刺激および防御または治療効果の生成におけるPapMV組成物の有効性は、当該技術分野で公知の標準的な技術によって評価することができる。例えば、防御効果に関しては、チャレンジ感染による検証を行うことができる。このような検証は、実験動物群(マウス等)への、標準的な技術によるPapMV組成物の接種を含む。非接種動物および/または公知の自然免疫応答刺激因子を接種した動物を含むコントロール群、あるいはその他のポジティブコントロールを、並行して設定する。ワクチン接種から適切な期間をおいた後、前記動物を、試験対象の病原体でチャレンジする。前記動物を、例えば体温、体重等を含む、感染に関連する他の状態の発生に関して観測する。例えば、抗原が、死亡リスクを伴うインフルエンザの特定の株または他の病原体から選択された抗原である場合のような特定の例では、生存率もまた、好適なマーカーである。感染の程度についても、所望される場合には、前記動物を屠殺した後、標準的な技術を使用してウイルス力価を測定することで評価できる。
本発明は、PapMV部分、ならびに1以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および/または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。所望される場合、例えば、追加の免疫刺激化合物、標準的な治療薬、ワクチン等の他の有効成分を、前記組成物に含有させてもよい。
本発明は、対象における自然免疫応答を刺激するためのPapMV組成物の使用を提供する。前記対象は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。前記組成物は、例えば、慢性感染を含む感染の治療または予防に有用である。
本発明は、PapMV組成物を含むキットをさらに提供する。ある実施形態では、前記キットは持ち運び可能であり、人が携帯することができる。前記キットはさらに、病原体検出器を任意に備えていてもよい。また、前記キットはさらに、PapMV組成物のガス噴霧剤または機械的な噴霧機構を任意に備えていてもよい。
配列番号4(図2B)に示す配列を有するPapMV外被タンパク質を使用し、これまでに記載の方法(Tremblay et al.、2006、FEBS J.、273:14−25)により、前記PapMV外被タンパク質を大腸菌の菌体内で発現させ自己集合させて、PapMV VLPを調製した。30または75μg(容積50μL)のPapMV VLPを7日間隔で鼻腔内投与することによりBalb/Cマウス(10匹/群)を2回処理し、2回目の処理の3日後に、100pfu(プラーク形成単位)のインフルエンザウイルス株WSN/33による鼻腔内チャレンジを行った。感染の発達を、14日間追跡調査した。これらの14日間、前記動物の体重を、1日1回測定した。20%超の体重低下を示した動物を屠殺した。コントロール群は、PBS(生理食塩緩衝液)で処理した。
実施例1に記載のものと同様の実験を行った。PapMV VLPを同じ方法で調製し、同じ処理スケジュールを採用したが、PapMV VLPの用量を変更した(60μg)。インフルエンザウイルス株WSN/33(200pfu)によるチャレンジを、10日目、12日目、14日目、および17日目(すなわち、PapMV処理の3日後、5日後、7日後、および10日後)に行い、チャレンジ後14日間、症状を観測した。
周知のトール様受容体3(TLR−3)リガンドであるポリイノシン・ポリシチジン酸(polyI:C;dsRNA)は、IL−6、CXCL10、JE、KC、mGCSF、CCL3、CCL5、およびTNF等の炎症性サイトカインの分泌を誘導することにより、肺における自然免疫応答を誘導する誘導因子であることがわかっている(Stowell et al.、2009、Respir.Res.、10:43)。また、TLR−7が、ssRNAおよびR837(グアノシン類似体)等のリガンドの結合により、自然免疫応答を活性化することも知られている。
PapMV VLPにより肺内で誘導されるメカニズムを解明するため、前述の実施例1〜3に記載のものと同じプロトコールにしたがい(すなわち、7日間隔で2回の鼻腔内投与)、60μgのssRNA含有PapMV VLP、15μgのPamCSK4(TLR−2リガンドであり、1型IFNの非誘導因子)(Cedarlane、Burlington、ON)またはコントロールである緩衝液(10mMトリスHC1、pH8)でマウス(5匹/群)を処理した。2回目の処理の24時間後に気管支肺胞洗浄(BAL)を行い、Luminex technology(Milliplex Mouse cytokine premixed 32−plex immunoassay kit;Millipore)を使用して、サイトカインの存在をスクリーニングした。
処理の6時間後にBALを行い、前述の処理を1回または7日の間隔をあけて2回とした以外は、実施例4と同様の方法で実験を行った。この実験においても、前述同様、60μgのssRNA含有PapMV VLPを使用した。Luminex(32サイトカイン検出キット)を使用し、処理後早期にサイトカイン産生をスクリーニングした。
C57BL/6マウス、TLR7ノックアウト(KO)マウス、MYD88 KOマウス、およびIRF5/7 KOマウス(3〜5匹/群)を、100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与により免疫した。免疫の24時間後に脾細胞を単離し、樹状細胞(DC)、CD8+T細胞、およびB細胞におけるCD86およびCD69の発現を分析した。FACSにより細胞をソーティングし、CD86およびCD69の発現量を、CD69またはCD86特異抗体の結合による蛍光強度により評価した。得られた結果を、PBSサンプルに対する分析対象サンプルの平均蛍光強度(MFI)の比率として、図8に示す。
C57BL/6マウス(5匹/群)を、BST2+細胞を除去する前処理あり、なしのいずれかの条件下、100μgのPapMV VLP ssRNAの静脈内投与により免疫した。除去のため、PapMV VLP ssRNAによる免疫の48時間前と24時間前に、C57BL/6マウスに抗BST2抗体(mAb 927)を500μg腹腔内注射した。PapMV VLP ssRNAによる免疫から24時間後に、単離した脾細胞におけるCD69、MHC−I、およびCD86の発現を、FACSによって分析した。
2群のC57BL/6マウスと、TLR−7KOマウスおよびMYD88KOマウス(4匹/群)とを、100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与により免疫した。C57BL/6マウス群の一方を、実施例7に記載の方法により、まず、抗BST2抗体によって処理した。血清および脾臓におけるIFN−α産生を、免疫の6時間後、12時間後、24時間後、および48時間後、(図10A)、または免疫の6時間後(図10B)に、ELISA(VeriKine(商標) Mouse Interferon Alpha ELISA Kit;PBL InterferonSource)によって観測した。
C57BL/6マウスおよびIFNAR KOマウス(3匹/群)を、100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与により免疫した。前記マウスの脾臓から単離したBリンパ球および樹状細胞におけるCD86、MHC−I、およびCD69の発現を、免疫の24時間後に、フローサイトメトリーにより評価した。
LCMVは、慢性感染(HCV感染等)の関連動物モデルである。LCMVのクローン13変異体により、マウスに持続感染が確立される。LCMV感染は、HCV感染同様、主としてCTLによって制御されており、CTL応答の疲弊は、PD−1の発現と関連付けられる。
ヒトPBMCを、フィコール勾配により単離し、100μg/mLのPapMV VLP ssRNAまたはPBSで処理した。処理の18時間後、CD14+CD11b+細胞集団(単球)について、フローサイトメトリーにより、CD86発現を分析した。
一群当たり10匹のマウスを、緩衝液のみ(10mMトリス、pH8)または60μgのPapMV VLP ssRNAを7日間隔で2回、鼻腔内経路を介して投与することにより処理した。処理後3日目に、前記マウスを肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の毒性株220CFU(コロニー形成単位)に感染させた。
C57BL/6マウス(3匹/群)を、0日目に2×106のPFULCMVクローン13に静脈内投与により感染させ、一日一回の100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与を、1日目、2日目、3日目、4日目、および5日目に行う(A群)か、または6日目および7日目のみに行う(B群)ことにより処理した。血液サンプルを5日目、10日目、および15日目に採取し、感染から15日目にマウスを屠殺し、血液、脾臓、腎臓、および脳におけるウイルス力価を、LCMVフォーカス形成アッセイにより分析した。
実施例2は、PapMV VLP処理により誘導される防御は、約5日間持続するものと思われることを示している。PapMV VLPの複数回投与による処理によれば、より長い防御期間を提供できるのかどうかを調べるため、実施例1に記載のレジメンの概略にしたがい、ssRNA含有PapMV VLPを1回(1×)、2回(2×)、5回(5×)、または10回(10×)1週間間隔で投与することにより、マウスを処理した。最後の処理の3日後に、実施例2に記載の方法で、マウスをインフルエンザWSN/33ウイルスでチャレンジした。
実施例1のプロトコールにしたがい、マウスに対してssRNA含有PapMV VLPの滴下投与(instillations)を2回行い、2回目の処理から6時間後に、気管支肺胞洗浄(BAL)を行った。結果を図21に示す。PapMV VLP処理マウスのBALで発見された好中球を、図21Bにおいて丸で囲んでいる。処理マウスにおいては、コントロール群と比べて、3倍の好中球が観察された。
2μgの3価不活性インフルエンザワクチン(TIV)と組み合わせた20μgのPapMV VLP ssRNAを、14日間隔で2回滴下投与することにより、Balb/Cマウス(10匹/群)を処理した。0日目、14日目、および28日目に出血を起こさせた。別の一群のマウスは、比較のため、同一のプロトコールにより、皮下経路で免疫した動物である。マウスを、15日目に、1LD50のインフルエンザWSN/33ウイルスでチャレンジし、体重低下を14日間追跡調査した。
先の実施例で実証したように、細菌宿主細胞内で調製したPapMV VLPおよびssRNAと共にインビトロで自己集合させて調製したPapMV VLPは、いずれも自然免疫応答を刺激することが可能である。しかしながら、前記2つの異なる方法で調製したVLPは、異なるTLRを活性化する。先に示したように、ssRNAと共にインビトロで自己集合させて調製したPapMV VLPは、TLR−7を活性化する。これに対し、これまでに記載の方法(Tremblay et al.、2006、同上)により、PapMV外被タンパク質を大腸菌の菌体内で発現させ自己集合させて調製したPapMV VLPは、TLR−2およびCD14を活性化する。
この実施例では、組換えPapMV外被タンパク質(rCP)を合成RNA鋳型(SRT)上に集合させて組換えVLP(rVLP)を製造することにより、PapMV VLPをインビトロで調製するプロセスについて述べる。rVLPは、幅15nm、長さ50〜数千nmの桿状のナノ粒子である。このプロセスを、図27に示すフローチャートに概略的に示している。
6×His標識を内部に有するrCPを、前記rCP遺伝子を含むプラスミドDNAで形質転換させた大腸菌内において、誘導性プロモーターの制御下で製造した。簡潔には、PapMV CPを、制限酵素NcolおよびBamHIに挟まれたpQE80ベクター(QIAGEN)にクローニングし、当該タンパク質をT5プロモーターの制御下で発現させた。発現には大腸菌BD−792を使用した。形質転換した細菌を、標準的な培地で培養した。前記培地(0.7〜1mM IPTGに22℃〜25℃で6〜9時間)に生化学的誘導因子を添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。誘導期間の終了時に、細胞を採取し、溶解用緩衝液(10mMトリス、pH8.0、500mM NaCl)に懸濁し、フレンチプレス、ホモジナイザー、またはソニケーターを使用して、機械的に破砕した。標準的なDNase処理によるゲノムDNAの除去、遠心分離またはタンジェント流ろ過(300kDa〜0.45μmのMWCO膜)による大型の細胞フラグメントおよび膜の除去により、細胞溶解物を清澄化した。rCPを、イオンマトリックス親和性樹脂上に捕捉し、標準的な手順を用いて、pH勾配またはイミダゾールにより溶出した。次いで、rCPを、陰イオン交換クロマトグラフィー/ろ過によりエンドトキシンから精製し、タンジェント流ろ過(0〜30kDaのMWCO膜)により小型低分子から精製した。rCP溶液中に存在する夾雑イミダゾールを、透析またはタンジェント流ろ過(5〜30kDaのMWCO膜)により除去した。最終的に得られたrCPタンパク質溶液を、ろ過により滅菌した。得られた滅菌製品は、2〜8℃で保存でき、しかも数年間安定である。
SRTの配列を、図28に示す[配列番号5]。SRTは、PapMVのゲノムに基づき、PapMV外被タンパク質核形成シグナルを5’末端に有している(図28において、四角で囲んでいる)。残りのヌクレオチド配列は、全ATGコドンをTAA終止コドンへと変異させるように、多重変異(poly−mutated)されている。前記配列の最初の16個のヌクレオチド(図28の下線部)は、pBluescript発現ベクター内に位置するT7転写開始部位を含み、RNA転写物内に存在している。五量体の繰り返し単位を、図28において下線部で示している。転写物全体としては、1522ヌクレオチドの長さである。
rCPおよびSRTを組み合わせることにより、rVTPへの集合をインビトロで行った。集合反応は、中性の緩衝液(10mMトリス−HCl、pH8)中で行った。集合反応は、1mgのRNAに対し、15〜30mgのタンパク質というタンパク質対RNA比率を用いて行った。集合により新たに生じたrVLPを、少量のRNase(RNA1μg当たりRNAse0.0001μg)でインキュベートし、rVLPから突出しているRNAを除去した。この工程により、rVLPの溶解性が向上する。次いで、10〜100kDaのMWCO膜を用いたダイアフィルトレーションにより、夾雑物および遊離rCP(集合しなかった単量体のrCP)から、平滑化した(blunted)VLPを精製した。最終的に得られたrVLP懸濁液を、ろ過により滅菌した。得られた滅菌生成物は、2〜8℃で保存でき、しかも数年間安定である。
Claims (20)
- パパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)を含み、且つ抗原を含まず、
前記PapMV VLPは、ssRNAを含む、対象における非特異的な自然免疫応答を刺激することによる前記対象における微生物感染の予防用、またはその重症度の軽減用医薬品。 - 前記微生物感染が、粘模を介して前記対象の身体に到達する微生物による感染である、請求項1記載の医薬品。
- 前記微生物感染が、ウイルス感染または細菌感染である、請求項1記載の医薬品。
- 前記免疫応答が、粘膜表面で刺激される、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬品。
- パパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)を含み、且つ抗原を含まず、
前記PapMV VLPは、ssRNAを含む、病原体による感染からの対象の防御用医薬品であり、前記医薬品が、前記対象における非特異的な自然免疫応答を刺激することを特徴とする、医薬品。 - 前記病原体が、粘模を介して前記対象の身体に到達する微生物である、請求項5記載の医薬品。
- 前記病原体が、ウイルスまたは細菌である、請求項5記載の医薬品。
- 前記病原体が、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、またはライノウイルスである、請求項5記載の医薬品。
- 前記病原体が、炭疽菌(Bacillus anthracis)、ペスト菌(Yersinia pestis)、野兎病菌(Francisella tularensis)、肺炎球菌(Streptococcus pnemoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、セパシア菌(Burkholderia cepacia)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、レジオネラ菌(Legionella pneumophila)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎クラミジア(Chlamydophila pneumoniae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、カタル球菌(Moraxella catarrhalis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸菌(Escherichia coli)、またはコクシエラ菌(Coxiella burnetii)である、請求項5記載の医薬品。
- 前記医薬品が、前記対象が前記病原体と接触すると予測される4時間前から6日前の間の投与用である、請求項5から9のいずれか一項に記載の医薬品。
- 前記医薬品が、複数回投与用の医薬品である、請求項5から9のいずれか一項に記載の医薬品。
- 前記対象が、免疫無防備状態、化学療法中、または免疫抑制剤使用中である、請求項5から9のいずれか一項に記載の医薬品。
- 前記医薬品が、前記対象における免疫疲弊を予防する、請求項5から9のいずれか一項に記載の医薬品。
- パパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)を含み、且つ抗原を含まず、
前記PapMV VLPは、ssRNAを含む、対象における慢性または反復性の微生物感染の治療用医薬品であり、
前記医薬品が、前記対象における非特異的な自然免疫応答を刺激することを特徴とする、医薬品。 - 前記医薬品の投与を、1以上の従来の療法と組み合わせて行う、請求項14記載の医薬品。
- 前記微生物感染が、ウイルス感染または細菌感染である、請求項14または15記載の医薬品。
- 前記微生物感染が、C型肝炎ウイルス感染またはヒト免疫不全ウイルス感染である、請求項14または15記載の医薬品。
- 前記医薬品が、前記対象におけるウイルス量を低減する、請求項16記載の医薬品。
- 前記医薬品が、鼻腔内投与用である、請求項14または15記載の医薬品。
- 前記医薬品が、1以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および/または賦形剤と組合せて投与される医薬品である、請求項1、5、および14のいずれか一項に記載の医薬品。
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