JP6092376B2 - Ｊａｋ１およびｊａｋ２の阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２を阻害し、がんを治療するのに有用となり得るアミノピラゾール化合物、またはその薬学的に許容される塩に関する。

ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーは、チロシンキナーゼのグループであり、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２を含む。ＪＡＫファミリーは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写因子）経路によってサイトカイン媒介シグナルを細胞内に伝達する。１つのこのような経路であるＪＡＫ−ＳＴＡＴ３は、多くの型のヒトがんおよびがん細胞系で恒常的に活性である。恒常的に活性なＳＴＡＴ３は、増殖、生存および進行の増加に関して腫瘍細胞に関与している。

ＪＡＫ３は、リンパ球で優先的に発現しており、ＪＡＫ３阻害剤についての免疫抑制効果が報告されている。ＪＡＫ３阻害剤の免疫抑制効果を考慮に入れれば、がん治療に使用するためのＪＡＫ阻害剤にＪＡＫ１およびＪＡＫ２の阻害、ならびにＪＡＫ３に対する選択性が求められるだろう。

特許文献１は、チロシン受容体キナーゼの阻害剤として特定のピラゾール化合物を開示しており、さらにその化合物ががんの治療に有用であると開示している。

国際公開第２００６／０８７５３０号

固形腫瘍を治療するための強力な代替ＪＡＫ１／２阻害剤を提供する必要性が依然としてある。また、ＪＡＫ３に対して、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２に選択的である強力なＪＡＫ阻害剤を提供する必要性も依然としてある。したがって、本発明は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２の強力な阻害剤を提供する。また、本発明は、ＪＡＫ３に対して、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２に選択的である強力なＪＡＫ阻害剤を提供する。

本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンである化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。

特定の実施形態として、本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンである化合物を提供する。別の特定の実施形態として、本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリドである化合物を提供する。

本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンと、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリドと、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩を含み、１種または複数の治療剤をさらに含む医薬組成物を提供する。

本発明は、有効量の３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。本発明は、有効量の３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。本発明は、有効量の３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリドを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療する方法を提供する。

本発明は、治療に使用するための、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、がんの治療に使用するための、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩を含む、がんの治療に使用するための組成物を提供する。

本発明は、医薬の製造における、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明は、がんを治療するための医薬の製造における、３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンまたはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。

本発明は、結晶型の３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンを提供する。本発明はまた、１６．１１ならびに４．３２、８．７１、１３．１２、１５．１９および１８．８６の１つまたは複数で生じる、２θ±０．２の特徴的ピークを有するＸ線粉末回折パターンによって特徴づけられる結晶型の３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンを提供する。

さらに、本発明は、がんが乳がん、肺がん、膵癌、腎がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、肝細胞癌および結腸がんからなる群から選択される、本明細書に記載される方法および使用の好ましい実施形態を提供する。

特に指示しない限り、上および本発明の明細書の全体にわたって使用される場合、以下の用語は以下の意味を有すると理解されるものとする。

「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」は、生物学的活性剤を哺乳動物、例えば、ヒトに送達するための当技術分野で一般的に許容されている媒体である。

「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の比較的非毒性の、無機および有機塩を指す。

「治療上有効量」または「有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床家によって求められている組織、系、動物、哺乳動物もしくはヒトの生物学的または医学的応答、あるいはこれらに対する所望の治療効果を誘発する、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物の量を意味する。

「治療」、「治療する」、「治療すること」などの用語は、障害の進行を遅らせるまたは逆戻りさせることを含むことを意図されている。これらの用語はまた、障害または状態が実際には排除されなくても、また障害または状態の進行自体が遅らせられていないまたは逆戻りさせられていなくても、障害または状態の１つまたは複数の症状を緩和する、寛解させる、減弱する、排除するまたは低減することを含む。

本発明の化合物は、例えば、いくつかの無機および有機酸と反応して薬学的に許容される塩を形成することができる。このような薬学的に許容される塩およびこれらを調製するための一般的方法論は当技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６６巻、第１号、１９７７年１月を参照されたい。

本発明の化合物は、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を使用して医薬組成物として製剤化され、種々の経路によって投与される。好ましくは、このような組成物は、経口投与用のものである。このような医薬組成物およびこれらを調製する方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編、第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、２００５）を参照されたい。

実際に投与される本発明の化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される本発明の実際の化合物、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む関連する状況下で、医師によって決定される。１日当たりの投与量は、通常約０．１〜約３００ｍｇの範囲内に入る。いくつかの例では、上記範囲の下限より低い投与量レベルで十分以上となり得る一方で、その他の場合では、さらに多い用量が使用され得る。投与量レベルは当業者によって決定され得る。

本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、当技術分野で知られている種々の手順ならびに以下の実施例に記載されるものによって調製され得る。本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を調製するために、記載される経路の各々についての具体的な合成ステップが様々な方法で組み合わせられ得る。

試薬および出発材料は一般的に当業者に容易に入手可能である。他は、有機および複素環化学の標準的技術、既知の構造的に類似の活性化合物およびプロドラッグの合成に類似の技術、ならびに任意の新規な手順を含む以下の実施例に記載される手順によって製造され得る。本明細書で示される化合物は、ＡＣＤＬＡＢＳまたはＳｙｍｙｘ Ｄｒａｗ ３．２のいずれかを使用して命名および番号付けされる。

実施例１の化合物は３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリドと命名され、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン，３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−，ジヒドロクロリドとも命名され、実施例１の化合物を明白に同定するために他の名称も使用され得る。実施例２の化合物は３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンと命名され、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン，３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−とも命名され、実施例２の化合物を明白に同定するために他の名称も使用され得る。

本明細書で使用される場合、以下の用語は指示される意味を有する：「ＤＭＥＡ」はジメチルエタノールアミンを指し；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し；「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し；「ＥｔＯＨ」はエタノールを指し；「ｅｅ」はエナンチオマー過剰を指し；「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を指し；「ＧＣ／ＭＳ」はガスクロマトグラフィーに続く質量分析を指し；「ＬＣ」は液体クロマトグラフィーを指し；「ＬＣ／ＭＳ」は液体クロマトグラフィーに続く質量分析を指し；「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し；「ＭＳ」は質量分析を指し；「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝食塩水を指し；「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを指し；「ＵＶ」は紫外線を指し；そして「ＸＲＤ」はＸ線回折を指す。

実施例１
３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリド

ステップ１：ベンジル−（６−フルオロインダン−１−イリデン）−アミン

６−フルオロインダン−１−オン（１４．５７ｇ、９７．０４ｍｍｏｌ）およびベンジルアミン（１０．６０ｍＬ、９７．０４ｍｍｏｌ）をトルエン（７５ｍＬ）に混ぜ合わせる。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．９２３ｇ、４．８５ｍｍｏｌ）を添加する。還流冷却器を取り付け、混合物を窒素下で加熱して６時間にわたって還流し、次いで、室温で１４時間攪拌する。混合物を酢酸エチルおよび水で抽出する。得られた有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、標記化合物が赤色油（２３．２２ｇ、１００％）として得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝２４０［Ｍ＋１］。

ステップ２：ベンジル−（６−フルオロインダン−１−イル）−アミン

ベンジル−（６−フルオロインダン−１−イリデン）−アミン（２３．２２ｇ、９７．０３ｍｍｏｌ）をエタノール（１２００ｍＬ）に溶解させる。混合物を窒素下で０℃に冷却する。水素化ホウ素ナトリウム（１１．０１ｇ、２９１．１０ｍｍｏｌ）を混合物に添加する。１時間後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）および水（１５０ｍＬ）を添加する。窒素下で１４時間攪拌し、真空中で濃縮してエタノールを除去する。残渣をジクロロメタンおよび飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出する。得られた有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、標記化合物が赤色油（２２．１２ｇ、９４％）として得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝２４２［Ｍ＋１］。

ステップ３：６−フルオロインダン−１−イルアミン

高圧フラスコに、エタノール（１００ｍＬ）中１０％パラジウム炭素（１．４４ｇ）を添加する。ベンジル−（６−フルオロインダン−１−イル）−アミン（１４．４４ｇ、５９．８４ｍｍｏｌ）のエタノール（２００ｍＬ）中溶液を添加する。チャンバーを窒素で３回、次いで、水素で３回パージする。水素（６０ｐｓｉ）下、５０℃で２時間激しく攪拌する。混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５２１を通して濾過し、固体をメタノールで洗浄する。濾液を真空中で濃縮すると、標記化合物が薄茶色液体（９．１４ｇ、１００％）として得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝１５２［Ｍ＋１］。

ステップ４：６−クロロ−Ｎ−（６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン

６−フルオロインダン−１−イルアミン（８．５０ｇ、５６．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）およびトリエチルアミン（８．６２ｍＬ、６１．８４ｍｍｏｌ）に溶解させる。２，６−ジクロロ−３−ニトロピリジン（１０．８５ｇ、５６．２２ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で１４時間攪拌する。反応混合物を濾過し、固体をメタノールおよびヘキサンで洗浄すると、標記化合物が黄色固体（９．００ｇ、５２％）として得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３０８［Ｍ＋１］。

ステップ５：Ｎ２−（６−フルオロインダン−１−イル）−Ｎ６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−ニトロピリジン−２，６−ジアミン

６−クロロ−Ｎ−（６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）−３−ニトロピリジン−２−アミン（９．００ｇ、２９．３４ｍｍｏｌ）および３−アミノ−５−メチルピラゾール（４．５６ｇ、４６．９５ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（６０ｍＬ）に混ぜ合わせる。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．１８ｍＬ、４６．９５ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を窒素下、１２０℃で９０分間加熱する。反応物を氷水（２００ｍＬ）に注ぎ込み、２０分間攪拌し、次いで濾過する。得られた固体をジクロロメタンおよびメタノールの混合物に懸濁し、４０℃で２０分間攪拌する。混合物を濾過すると、標記化合物が黄色固体（６．０３ｇ、５６％）として得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３６９［Ｍ＋１］。

ステップ６：３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン

Ｎ２−（６−フルオロインダン−１−イル）−Ｎ６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−ニトロピリジン−２，６−ジアミン（０．５７１ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解させる。インジウム（０．８９０ｇ、７．７５ｍｍｏｌ）および塩酸（１２Ｎ、０．６５ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を窒素下で１時間攪拌する。反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５２１を通して濾過し、固体をメタノールで洗浄する。濾液を真空中で濃縮すると、粗製Ｎ２−（６−フルオロインダン−１−イル）−Ｎ６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−ピリジン−２，３，６−トリアミンジヒドロクロリドが得られる。

Ｎ２−（６−フルオロインダン−１−イル）−Ｎ６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−ピリジン−２，３，６−トリアミンジヒドロクロリドを酢酸（５ｍＬ）およびオルトギ酸トリメチル（０．６８ｍＬ、６．２０ｍｍｏｌ）に溶解させる。窒素下で３０分間攪拌する。真空中で濃縮し、アセトニトリル中０．０３％塩酸水溶液の勾配で溶出する逆相クロマトグラフィーによって精製すると、標記化合物のラセミ体（０．１２４ｇ、１９％、２ステップ）が得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３４９［Ｍ＋１］。ラセミ体をキラルクロマトグラフィー条件で分離すると標記化合物が得られる：（７０ｍｇ、１１％。エナンチオマー１（３．７分での第１の溶離液）＞９９％ｅｅ、１００％ＭｅＯＨ、０．２％ＤＭＥＡ、１．０ｍＬ／分、４．６×１５０ｍｍ、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ−Ｈ）。

ステップ７：３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリド

３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン（０．０７０ｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させる。１，４−ジオキサン（０．１００ｍＬ、０．４００ｍｍｏｌ）中塩酸、４Ｍを添加する。この溶液を１４時間攪拌し、次いで、真空中で濃縮乾固する。メタノールに溶解させ、真空中で３回濃縮乾固すると標記化合物（０．０６７ｇ、７９％）が得られる。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３４９［Ｍ＋１］。

実施例２
３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン

ステップ１：（１Ｓ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オール

２２Ｌ四つ首丸底フラスコに、オーバーヘッド攪拌機（ｏｖｅｒｈｅａｄ ａｇｉｔａｔｉｏｎ）、熱電対、１Ｌおよび５Ｌの付加漏斗、冷却浴ならびに窒素入口を装備する。窒素パージ下、フラスコに６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（５００ｇ、３．３３ｍｏｌ）およびトルエン（５Ｌ）を装入する。得られた混合物を５分間攪拌して全ての固体を溶解させ、次いで、氷／アセトン浴を用いて−１０℃に冷却する。１Ｌ付加漏斗にＲ−（−）−２−メチル−ＣＢＳ−オキサザボロリジン（トルエン中１Ｍ、６６６ｍＬ、０．６６６ｍｏｌ）を装入する。この溶液を反応混合物に添加し、次いで、５分間攪拌する。５Ｌ付加漏斗にトルエン（５Ｌ）、引き続いてボラン−硫化メチル錯体（３１０．１ｍＬ、３．３３ｍｏｌ）を装入する。漏斗を旋回させて試薬を混合した後、ポット温度を−５℃未満に維持しながら、この溶液を３時間にわたって反応混合物に滴加する。１５分後、ＴＬＣによって反応物の試料を監視する（５０μＬ ＭｅＯＨで２５μＬ反応混合物をクエンチする；７５／２５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、ＵＶ）。この分析は、残っている出発物質がないことを示す。混合物を冷浴で一晩攪拌させる。

反応混合物を１０℃に冷却し、メタノール（０．５Ｌ）を付加漏斗に装入し、次いで、３０分間にわたって滴加する。ＭｅＯＨクエンチの開始時にはガス放出（ｏｆｆ−ｇａｓｓｉｎｇ）が明らかであるが、約１／３の添加後に静まる。得られた混合物を１５分間攪拌し、次いで、飽和ＮａＣｌ（２．５Ｌ）で希釈する。２０分間攪拌した後、混合物をＨｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｌ（登録商標）のパッドを通して濾過し、パッドをトルエン（２Ｌ）ですすぐ。

濾液を底に口のあるフラスコに移し、層を分離する。有機層を脱イオン水（２．５Ｌ）、１Ｎ ＨＣｌ（２．５Ｌ）、飽和ＮａＨＣＯ_３（２．５Ｌ）および飽和ＮａＣｌ（２．５Ｌ）で洗浄する。Ｄａｒｃｏ（０．５ｋｇ）の存在下、Ｎａ_２ＳＯ_４（１ｋｇ）上で０．５時間乾燥させた後、混合物をＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０シリカ（０．５ｋｇ）が載ったＨｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｌ（登録商標）を通して濾過する。パッドをトルエン（１Ｌ）ですすぎ、濾液を真空中で濃縮する。得られた油に前に製造した固体をまいて結晶化を誘導する。結晶化が標記化合物を淡黄色固体（５００ｇ、９８．７％、９８．１％ｅｅ）として提供する。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、５００．０ＭＨｚ）：δ１．７４（ｂｓ、１Ｈ）、１．９９（ｍ、１Ｈ）、２．５４（ｍ、１Ｈ）、２．７７（ｍ、１Ｈ）、３．００（ｍ、１Ｈ）、５．２２（ｍ、１Ｈ）、６．９５（ｔｄ、１Ｈ）、７．０９（ｄｄ、１Ｈ）、７．１７（ｔｄ、１Ｈ）ｐｐｍ。

ステップ２：（１Ｒ）−１−アジド−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン

２２Ｌ三つ首フラスコに、オーバーヘッド攪拌機、熱電対、窒素入口、１Ｌの付加漏斗および冷却浴を装備する。フラスコに（１Ｓ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オール（７００ｇ、４．６ｍｏｌ）およびトルエン（７Ｌ）を装入する。得られた溶液を０〜５℃に冷却し、ジフェニルホスホリルアジド（１４４４ｇ、５．１ｍｏｌ）を一度に添加する。１５分後、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデカ−７−エン（８４７ｍＬ、５．５ｍｏｌ）を付加漏斗に装入し、次いで、ポット温度を１０℃未満に維持しながら、２時間にわたって反応容器に滴加する。浴を除去し、反応混合物を周囲温度で一晩攪拌させる。

２２時間後、ＴＬＣ（８０／２０ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、ＵＶ）およびＧＣ／ＭＳは、反応が完了していることを示す。脱イオン水（３．５Ｌ）を１５分にわたって添加し、１５分間攪拌する。混合物を底に口のあるフラスコに移し、層を分離する。有機層を脱イオン水（３．５Ｌ）、次いで、０．５Ｍ ＨＣｌ（３．５Ｌ）そして最後に脱イオン水（３．５Ｌ）で洗浄する。３つの水性洗浄液を合わせて、トルエン（３．５Ｌ）で逆抽出する。有機層を合わせ、Ｄａｒｃｏ（０．５ｋｇ）の存在下、Ｎａ_２ＳＯ_４（１ｋｇ）上で乾燥させる。１５分間攪拌した後、混合物をＨｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｌ（登録商標）のパッドが載ったＧＦＦ紙を通して濾過する。パッドをトルエン（１Ｌ）ですすぎ、濾液を２２Ｌビュッヒフラスコに移し、真空中で約４容積（２．８Ｌ）に濃縮する。

シリカゲルプラグクロマトグラフィー用の大型漏斗を用意し、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０シリカ（６Ｋｇ）を装入する。シリカに砂（１Ｋｇ）を載せ、トルエンで湿らせる。粗製生成物を含有する反応溶液２．８Ｌをわずかな真空下で漏斗に注ぎ入れる。生成物をトルエン（４×４Ｌ）で溶出する。濾液を、風袋を計ったフラスコに移し、真空中で約３Ｌ（トルエン溶液２７８８ｇ）に濃縮（４０℃浴）する。少量試料重量分析（トルエン溶液０．４６７ｇ中標記化合物０．１２３ｇ）に基づくと、標記化合物７５３．５ｇが存在する（トルエン中溶液７７８２ｇ、９０．２％収率）。トルエン溶液をガロンジャグに移し、その後のステップに使用するために冷蔵庫に保管する。

ステップ３：（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−アミン

３ガロンＨｙｄｒｏタンクＴ−８５に５％Ｐｄ／Ｃ（１６４ｍＬトルエン中８．２ｇ）およびステップ２で得られた（１Ｒ）−１−アジド−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデンの３分の１（エタノール溶液２５９４ｇ中アジド１６３．９ｇ）を装入する。タンクを窒素でパージし、次いで、水素（約５０ｐｓｉ）で加圧する。混合物を３０分間攪拌する。次いで、タンクを大気にし、水素（約５０ｐｓｉ）を再装入し、さらに３０分間攪拌する。ＴＬＣおよびＧＣ／ＭＳは、反応が完了していることを示す。反応混合物をカーボイに移し、タンクを３Ａ−ＥｔＯＨですすぐ。この反応を同じスケールで２回繰り返す。３つの反応の溶液を合わせる。減圧下で約８容積に濃縮する。混合物をＧＦＦ紙によって濾過して触媒を除去し、パッドを３Ａ−ＥｔＯＨ（約２００ｍＬ）ですすぐ。少量試料分析に基づくと、標記化合物は３Ａ−ＥｔＯＨ溶液中９２％収率（３８６ｇ）で得られる。

ステップ４：６−クロロ−Ｎ−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−３−ニトロピリジン−２−アミン

１２Ｌ三つ首フラスコを窒素でパージし、次いで、熱電対、加熱マントルおよび冷却器を組み立てる。（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−アミン（３８６ｇ、２．５５ｍｏｌ）をフラスコに装入し、３Ａ−ＥｔＯＨ（３．９Ｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．３４Ｌ、７．６８ｍｏｌ）および２，６−ジクロロ−３−ニトロピリジン（６４３ｇ、３．０７ｍｏｌ）を添加する。反応混合物を周囲温度で８時間攪拌し、引き続いて１２時間７０℃に加熱する。反応混合物を１．２５時間にわたって８℃に冷却し、次いで、ポリプロピレンパッド上に濾過する。固体を３Ａ−ＥｔＯＨ（７６０ｍＬ）で洗浄し、風袋を計った皿に移し、真空オーブン（４５℃）中でさらに乾燥させると標記化合物が橙色固体（７８６ｇ、７１％、９８．０％ｅｅ）として得られる。ＧＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０７（Ｍ＋）。

ステップ５：Ｎ２−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ６−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−ニトロピリジン−２，６−ジアミン

三つ首フラスコ（２２Ｌ）に熱電対、冷却器、オーバーヘッド攪拌機、Ｎ_２入口および加熱マントルを装備する。フラスコに、６−クロロ−Ｎ−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−３−ニトロピリジン−２−アミン（６００ｇ、１．９５ｍｏｌ）、５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（２０８．３１ｇ、２．１４ｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（６．０Ｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（６８０．１１ｍＬ、３．９０ｍｏｌ）を装入する。この溶液を７０℃で２０時間攪拌する。混合物を周囲温度に冷却し、これをＭｅＯＨ（６．０Ｌ）で希釈する。脱イオン水（２．１Ｌ）を１時間にわたってこの溶液に添加すると橙色懸濁液が得られる。この懸濁液を１時間攪拌し、次いで、ポリプロピレンを通して濾過する。濾過ケークを脱イオン水（１２Ｌ）で洗浄し、固体を、風袋を計った皿に移し、一定重量まで真空乾燥（５０℃）させると標記化合物（６４７ｇ、９０％）が得られる。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３６９（Ｍ＋１）。

ステップ６：３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミン

Ｎ２−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ６−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３−ニトロピリジン−２，６−ジアミン（６２２ｇ、１．６９ｍｏｌ）を１０Ｌ丸底フラスコに添加し、これをＤＭＦ（５Ｌ）で処理する。全ての固体が溶解するまでフラスコ内容物を旋回させる。オルトギ酸トリメチル（１．８５Ｌ、１６．９ｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（４２．４ｇ、０．１６９ｍｏｌ）を旋回させながらフラスコに装入する。３ガロンｈｙｄｒｏタンクＴ−８５に５％Ｐｄ／Ｃ（９３．３ｇ、１５重量％充填）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中濃厚スラリーとして窒素パージ下で装入する。上記混合物をｈｙｄｒｏタンクに添加し、窒素で数回パージし、次いで、水素（約５０ｐｓｉ）下でタンクに装入する。混合物を６０℃に加熱し、一晩攪拌させる。約２２時間で、反応器を大気にし、試料を採取し、ＴＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって確認すると、両方とも反応が完了していることを示す。混合物をＨｙｆｌｏ Ｓｕｐｅｒ Ｃｅｌ（登録商標）のパッドを通して濾過し、タンクおよびパッドをＥｔＯＡｃ（１Ｌ）ですすぐ。濾液をビュッヒフラスコに移し、脱イオン水（６２２ｍＬ）で希釈し、真空中（５０℃浴）で濃縮して過剰なオルトギ酸トリメチルを除去する。ＤＭＦ溶液を５０Ｌの底に口のあるフラスコに移し、ＥｔＯＡｃ（１２．４Ｌ）で希釈する。この溶液を飽和ＬｉＣｌ溶液（３×６．２２Ｌ）で洗浄する。水性洗浄液を合わせて、ＥｔＯＡｃ（４×３．１１Ｌ）で逆抽出する。有機層を合わせて、飽和ＬｉＣｌ（２×１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて、ＧＦＦ紙を通して濾過する。濾液を真空中（４５℃浴）で濃縮すると、粗製生成物が緑色固体（６０９ｇ、１０３．５％）として得られる。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００．０ＭＨｚ）：δ２．１５（ｓ、３Ｈ）、２．６７（ｑ、２Ｈ）、２．９９（ｍ、１Ｈ）、３．１７（ｍ、１Ｈ）、５．８９（ｓ、１Ｈ）、６．１１（ｔ、１Ｈ）、６．７６（ｄｄ、１Ｈ）、６．８７（ｄ、１Ｈ）、７．１０（ｔｄ、１Ｈ）、７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．７６（ｄ、１Ｈ）、７．９９（ｓ、１Ｈ）、９．２３（ｂｓ、１Ｈ）、１１．６５（ｂｓ、１Ｈ）ｐｐｍ。

三つ首フラスコ（２２Ｌ）に熱電対、冷却器、オーバーヘッド攪拌機、Ｎ_２入口および加熱マントルを装備する。フラスコに、すぐ上で製造した粗製物質（５９８．５ｇ、１．７ｍｏｌ）およびアセトニトリル（１２Ｌ）を装入し、得られた混合物を加熱還流する。完全な溶液に達したら、熱源を停止し、溶液を自己冷却させる。５６℃で溶液に上の緑色固体をまくと、結晶化が直ちに始まる。初期種材料は本質的に上のように得られる。この懸濁液を氷浴でさらに冷却し、一晩攪拌し、濾過する。生成物ケークをアセトニトリル（１．２Ｌ）で洗浄し、固体を、風袋を計った皿に移し、真空下（５０℃）で一定重量に乾燥させると標記化合物（３４９．５４ｇ、５８．４％）が得られる。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００．０ＭＨｚ）：δ２．１５（ｓ、３Ｈ）、２．６７（ｑ、２Ｈ）、２．９９（ｍ、１Ｈ）、３．１７（ｍ、１Ｈ）、５．８９（ｓ、１Ｈ）、６．１１（ｔ、１Ｈ）、６．７６（ｄｄ、１Ｈ）、６．８７（ｄ、１Ｈ）、７．１０（ｔｄ、１Ｈ）、７．４２（ｍ、１Ｈ）、７．７６（ｄ、１Ｈ）、７．９９（ｓ、１Ｈ）、９．２３（ｂｓ、１Ｈ）、１１．６５（ｂｓ、１Ｈ）ｐｐｍ。

Ｘ線粉末回折
結晶固体のＸＲＤパターンは、３５ｋＶおよび５０ｍＡで作動する、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えるＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ Ｘ線粉末回折計で得られる。試料は、ステップサイズ０．０８７°（２θ）およびスキャン速度０．５秒／ステップ、および０．６ｍｍ発散、５．２８ｍｍ固定抗散乱、および９．５ｍｍ検出器スリットで、４〜４０°（２θ）の間でスキャンされる。乾燥粉末が石英試料ホルダーに詰められ、ガラススライドを用いて滑らかな表面が得られる。任意の所与の結晶型について、回折ピークの相対強度は、結晶形態および晶癖などの因子から生じる好ましい配向により変化し得ることが結晶学分野で周知である。好ましい配向の影響が存在する場合、ピーク強度が変化するが、多形の特徴的ピーク位置は変化しない。さらに、任意の所与の結晶型について、角度方向ピーク位置はわずかに変化し得ることも結晶学分野で周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度の変動、試料変位、または内部標準の存在もしくは不在によってシフトし得る。この場合、±０．２（２θ）のピーク位置変動性は、示される結晶型の明白な識別を妨げることなく、これらの潜在的変動を考慮するだろう。結晶型の確認は、識別ピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの任意の独特な組み合わせに基づいてなされ得る。周囲温度および相対湿度で回収された結晶型回折パターンは、８．８５および２６．７７°２θのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整される。

したがって、実施例２の調製試料は、以下の表１に記載される回折ピーク（２θ値）を有するものとして、ＣｕＫａ放射線を用いたＸＲＤパターンによって特徴づけられる。具体的には、このパターンは、０．２°の回折角についての許容誤差で、４．３２、８．７１、１３．１２、１５．１９および１８．８６からなる群から選択されるピークの１つまたは複数と組み合わせて１６．１１のピークを含む。

ＪＡＫ１／２／３インビトロ酵素アッセイ
ＪＡＫ１、ＪＡＫ２およびＪＡＫ３キナーゼに対する化合物ＩＣ_５０値を測定するために、ＪＡＫ ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＰＶ４８４４）が使用される。このキナーゼアッセイは、長寿命テルビウム（Ｔｂ）標識抗体をドナー種としておよび緑色蛍光タンパク質シグナル伝達性転写因子（ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１）をアクセプター種として使用する時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイフォーマットである。

ＪＡＫ１、ＪＡＫ２またはＪＡＫ３活性を監視するためにＴＲ−ＦＲＥＴ比が使用され、ここではＧＦＰ−ＳＴＡＴ１のリン酸化の増加がＴＲ−ＦＲＥＴ比の増加をもたらす。浅い黒色３８４ウェルＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２６０）中で１２．５μＬ反応体積を用いてキナーゼ反応を行う。試薬を添加して、５０ミリモルＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．３、１．７６ミリモルＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ＪＡＫ１アッセイ用の２０．０マイクロモルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（ＪＡＫ２アッセイ用は５マイクロモルＡＴＰ、またはＪＡＫ３アッセイ用は２マイクロモルＡＴＰ）、１０．０ミリモル塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、１ミリモルエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５、０．０５マイクロモル緑色蛍光タンパク質シグナル伝達性転写因子（ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１）、１４ナノモルＪＡＫ１酵素（または、１．０ナノモルＪＡＫ２酵素、または２．５ナノモルＪＡＫ３酵素）、および４％ジメチルスルホキシド、および実施例１の化合物の連続希釈物（１：３希釈 ２００００から１ナノモル）の最終反応条件を得る。ＡＴＰ／ＧＦＰ−ＳＴＡＴ１添加後、アッセイプレートを１０００毎分回転数（ＲＰＭ）で１分間遠心分離する。プレートを室温で６０分間インキュベートさせ、次いで、２０ミリモルエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ナノモルＴｂ−抗−ｐＳＴＡＴ１［ｐＴｙｒ７０１］、０．６７ミリモルトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンヒドロクロリド（Ｔｒｉｚｍａ（登録商標））ｐＨ７．５、０．０２％アジ化ナトリウムおよび０．０１％ノニルフェニルポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０）を含有する停止緩衝液１２．５μＬを添加して停止する。室温で９０分間インキュベートし、３４０ｎｍ波長励起フィルターならびに５２０ｎｍおよび４９５ｎｍ波長の発光フィルターを用いてＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃２１０４−００１０）で読み取る。５２０ｎｍで測定されるＧＦＰ−ＳＴＡＴ１についての発光波長対Ｔｂ−抗−ｐＳＴＡＴ１［ｐＴｙｒ７０１］についての４９５ｎｍでの発光から比を得る。プレート上対照に対する反応物データ（活性酵素対２．０マイクロモル対照阻害酵素）から計算した阻害％データを用いて、化合物についてのＩＣ_５０を得る。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ４．０を使用して阻害％および１０点化合物濃度データを４パラメータロジスティック方程式に当てはめる。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上に記載されるこのアッセイで試験する。実施例１の化合物は、ＪＡＫ１に対して１．７ｎＭ＋／−０．８ｎＭのＩＣ_５０（ｎ＝３）、ＪＡＫ２に対して１．７ｎＭのＩＣ_５０（ｎ＝１）およびＪＡＫ３に対して８．０ｎＭ＋／−５．９ｎＭのＩＣ_５０（ｎ＝６）を有することが決定される。実施例１の化合物は、酵素アッセイで、ＪＡＫ３に対して４倍超のＪＡＫ１およびＪＡＫ２への選択性を示した。これらの結果は、実施例１の化合物がＪＡＫ１およびＪＡＫ２の強力なインビトロ阻害剤であり、ＪＡＫ３よりＪＡＫ１およびＪＡＫ２にインビトロで選択的であることを示している。

ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイ−Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標） ＨＣＳ
ＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイは、赤血球の過剰産生、真性多血症（ＰＶ）のマーカーを導く、赤血球前駆細胞におけるＪＡＫ２ ＳＴＡＴ５の恒常的活性化を模倣するものである。そのため、ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイは、インビトロでのＪＡＫ化合物のＪＡＫ２細胞活性の評価を可能にする。

ＴＦ−１（ヒト赤白血病）細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０７５％重炭酸ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバド、ＣＡ）および０．４５％グルコースを含むＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ−１６４０はＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでＭｏｏｒｅらによって開発された。その配合は、重炭酸塩緩衝系を利用し、アミノ酸およびビタミンの量を変更したＲＰＭＩ−１６３０シリーズの培地に基づく。）に維持する。この培地に、ＧＭ−ＣＦＳ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を２ｎｇ／ｍＬの最終濃度で補足する。細胞を５％ＣＯ_２、３７℃で維持する。細胞を無血清培地中で飢餓状態にして内因性成長因子を除去する。ＴＦ−１細胞をカウントし、細胞を回収して２×１０^５個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート当たり２×１０^７個の細胞を播種する。細胞を５×１０^５個細胞／ｍＬの最終濃度で０．６％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに懸濁する前に、細胞を未補足ＲＰＭＩ１６４０（０．０７５％重炭酸ナトリウム、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×抗生物質／抗真菌剤および０．４５％グルコースを含むＲＰＭＩ１６４０）で２回すすぐ。希釈細胞を組織培養フラスコに戻し、３７℃で一晩インキュベートする。試験化合物を１０ｍＭ濃度で１００％ＤＭＳＯ中に調製する。化合物を１０点−２００×濃度−応答範囲（４ｍＭ−２００ｎＭ）で、１００％ＤＭＳＯを用いて１：３連続希釈する。別の深い９６ウェルプレートで、４×濃度化合物プレートのために、２００×化合物溶液２．５μＬを、１０％ＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地１２５μＬに添加する。

アッセイを行うために、血清飢餓細胞を回収し、未補足ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄する。細胞を８×１０^５個細胞／ｍＬの最終濃度のために１０％ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地に懸濁する。４×濃度化合物プレートにおいて、２５０μＬの一定分量の希釈細胞（２×１０^５個細胞）を各ウェルに添加する。細胞をボルテックスすることによって混合し、プレートを３７℃水浴で１０分間インキュベートする。予備加温１０％ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ１６４０培地を使用することによって、６．４ユニット／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の新鮮な４×使用液を調製する。細胞を化合物で１０分間処理した後、ＥＰＯ培地１２５μＬを各ウェルに添加し、プレートをボルテックスする。細胞を３７℃水浴で２０分間インキュベートし、インキュベーション時間中、５分おきに混合する。最終的な１０点濃度−応答範囲は、ＤＭＳＯ０．５％およびＥＰＯ１．６Ｕ／ｍＬの最終濃度で２０μＭ−１ｎＭとなる。細胞処理後、１％ホルムアルデヒド溶液５００μＬ（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて新たに製造し、３７℃で加温維持した）を各ウェルに添加する。プレートを密閉し、８〜１０回逆さにして混合する。プレートを３７℃水浴に１０分間入れる。インキュベーション後、細胞プレートを室温（ＲＴ）において１２００ｒｐｍで５分間回転させる。上清を吸引すると、細胞１００μＬ（２×１０^５個細胞）が残る。この細胞をボルテックスし、回転ステップの繰り返しおよび最後の洗浄後に約２×１０^５個の細胞を含有する１００μＬを残すことによってＰＢＳ８００μＬで２回洗浄する。８００μＬの一定分量の冷９０％メタノールを細胞に添加し、−２０℃に一晩置く。プレートを回転させ、メタノールを除去する。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄する。２００μＬの一定分量のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）緩衝液中１〜１０希釈を細胞に添加する。細胞をよく混合し、暗所中室温で２時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞１００μＬを残す。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、モリスプレーンズ、ＮＪ）の使用液を、ＰＢＳを用いて調製する。２００μＬの一定分量を各ウェルに添加し、細胞を暗所中室温で１０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）５０μＬを細胞に添加する。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密閉する。プレートを遠心沈殿させる。平均蛍光強度データを回収し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを用いて分析する。化合物処理をビヒクルと比較して阻害％データを測定する。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ４．０による４パラメータロジスティック曲線当てはめ分析を用いて相対ＩＣ_５０を計算する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上に記載されるこのアッセイで試験する。実施例１の化合物は、０．０３５μＭ＋／−０．０１３μＭのＩＣ_５０（ｎ＝６５）でＪＡＫ２を阻害する。これらの結果は、実施例１の化合物がＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイでＪＡＫ２の強力な阻害剤であることを示している。

ＪＡＫ３ ＩＬ−２−ＮＫ−９２／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイ−Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標） ＨＣＳ
ＩＬ−２はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においてＪＡＫ３経路を活性化してＮＫおよびＣＤ８リンパ球増殖を駆動する。そのため、ＩＬ−２刺激ＮＫ９２／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイは、インビトロでのＪＡＫ化合物のＪＡＫ３細胞活性の評価を可能にする。

ＮＫ−９２（ナチュラルキラー）細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ）を、１５％ウシ胎児血清、１５％ウマ血清および１×抗生物質／抗真菌剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバド、ＣＡ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）αに維持する。この培地にＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を４ｎｇ／ｍＬの最終濃度で補足する。細胞を５％ＣＯ_２、３７℃で維持する。細胞を無血清培地中飢餓状態にして内因性成長因子を除去する。ＮＫ−９２細胞をカウントし、回収して２×１０^５個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート当たり２×１０^７個の細胞を播種する。細胞を８×１０^５個細胞／ｍＬの最終濃度で０．６％血清（０．３％ＦＢＳ、０．３％ウマ血清）を含むＭＥＭαに懸濁する前に、細胞を未補足ＭＥＭα（ＭＥＭα）で２回すすぐ。希釈細胞を組織培養フラスコに戻し、３７℃で一晩インキュベートする。試験化合物を１０ｍＭ濃度で１００％ＤＭＳＯ中に調製する。化合物を１０点−２００×濃度−応答範囲（４ｍＭ−２００ｎＭ）で、１００％ＤＭＳＯを用いて１：３連続希釈する。別の深い９６ウェルプレートで、４×濃度化合物プレートのために、２００×化合物溶液２．５μＬを、１０％ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ１６４０培地１２５μＬに添加する。アッセイを行うために、血清飢餓細胞を回収し、未補足ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄する。細胞を８×１０^５個細胞／ｍＬの最終濃度のために１０％ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地に懸濁する。４×濃度化合物プレートにおいて、２５０μＬの一定分量の希釈細胞（２×１０^５個細胞）を各ウェルに添加する。細胞をボルテックスすることによって混合し、プレートを３７℃水浴で１０分間インキュベートする。予備加温１０％ＦＢＳ完全ＲＰＭＩ培地を使用することによって、２ｎｇ／ｍＬの新鮮な４×使用液を調製する。細胞を化合物で１０分間処理した後、ＩＬ−２培地１２５μＬを各ウェルに添加する。細胞をボルテックスすることによって混合する。細胞を３７℃水浴で２０分間インキュベートし、インキュベーション時間中、５分おきに混合する。最終的な１０点濃度−応答範囲は、ＤＭＳＯ０．５％およびＩＬ−２ ０．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で２０μＭ−１ｎＭとなる。細胞処理後、１％ホルムアルデヒド溶液５００μＬ（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて新たに製造し、３７℃で加温維持した）を各ウェルに添加する。プレートを密閉し、８〜１０回逆さにして混合する。プレートを３７℃水浴に１０分間入れる。インキュベーション後、細胞プレートを室温において１２００ｒｐｍで５分間回転させる。上清を吸引すると、細胞１００μＬ（２×１０^５個細胞）が残る。この細胞をボルテックスし、回転ステップの繰り返しおよび最後の洗浄後に約２×１０^５個の細胞を含有する１００μＬを残すことによってＰＢＳ８００μＬで２回洗浄する。８００μＬの一定分量の冷９０％メタノールを細胞に添加し、−２０℃に一晩置く。プレートを回転させ、メタノールを除去する。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄する。２００μＬの一定分量のマウス抗ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）緩衝液中１〜１０希釈を細胞に添加する。細胞をよく混合し、暗所中室温で２時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞１００μＬを残す。２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、モリスプレーンズ、ＮＪ）の使用液を、ＰＢＳを用いて調製する。２００μＬの一定分量を各ウェルに添加し、細胞を暗所中室温で１０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）５０μＬを細胞に添加する。細胞を９６ウェル黒色組織培養プレートに移し、密閉する。プレートを遠心沈殿させる。平均蛍光強度データを回収し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎ（登録商標）ＶＴｉを用いて分析する。化合物処理をビヒクルと比較して阻害％データを測定する。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ４．０による４パラメータロジスティック曲線当てはめ分析を用いて相対ＩＣ_５０を計算する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上に記載されるこのアッセイで試験する。実施例１の化合物は、０．２２８μＭ＋／−０．０７６μＭのＩＣ_５０（ｎ＝６１）でＪＡＫ３を阻害する。上記２つの細胞ベースアッセイの結果から、ＪＡＫ３／ＪＡＫ２の比、ＩＣ_５０が６倍超であることが決定され、このことは実施例１の化合物がＪＡＫ２ ＥＰＯ−ＴＦ１／ｐＳＴＡＴ５およびＪＡＫ３ ＩＬ−２−ＮＫ−９２／ｐＳＴＡＴ５細胞ベースアッセイでＪＡＫ３よりＪＡＫ２に選択的であることを示している。

ＤＳ１−ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ−ｐＳＴＡＴ３−細胞ベースアッセイ
ＩＬ−６刺激ＳＴＡＴ３経路の遮断における化合物の効力を試験するために、ＤＳ１−ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ−ｐＳＴＡＴ３−細胞ベースアッセイが使用される。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路は、多くの型のがんで恒常的に活性であり、増殖、生存および侵襲の増加に関して腫瘍細胞に関係している。ＤＳ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ完全培地で培養し、次いで、９５％湿度において３７℃および５％ＣＯ_２の雰囲気下で１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ／高改変培地中に採用および培養する。ＤＳ１細胞を９６ウェルプレートに４×１０^４個細胞／ウェルの密度で蒔き、無血清培地中３７℃で３時間培養し、引き続いてビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）または０〜２０μＭの最終濃度範囲にわたる試験化合物で１０分間前処理する。次いで、ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、２０６−ＩＬ）を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で細胞培養液に添加し、これを３７℃でさらに３０分間継続する。最後に、細胞を５Ｘα溶解緩衝液で溶解し、ｐＳＴＡＴ３検出（＃ＴＧＲＳ３ＳＨＶ１００）のために反応混合物（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、南オーストラリア州、オーストラリア、＃ＴＧＲＳ３Ｓ１０Ｋ）を充填した３８４ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６００８２８０）に移す。このプレートを密閉し、室温で２時間インキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ０６プレートリーダー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、南オーストラリア州、オーストラリア）を使用してｐＳＴＡＴ３を測定する。データをＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ４．０で分析する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上に記載されるこのアッセイで試験する。実施例１の化合物は、０．０６６＋／−０．０２３μＭのＩＣ５０でＩＬ−６−ＳＴＡＴ３シグナル伝達を阻害する。これらの結果は、実施例１の化合物がＤＳ１−ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ−ｐＳＴＡＴ３−細胞ベースアッセイでＩＬ−６刺激ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路を阻害することを示している。

Ｍｉａ−Ｐａｃａ２−ＭＳＤ−ｐＳＴＡＴ３−細胞ベースアッセイ
膵がん細胞のＳＴＡＴ３リン酸化の遮断における化合物の効力を試験するために、Ｍｉａ−Ｐａｃａ２−ＭＳＤ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）−ｐＳＴＡＴ３−細胞ベースアッセイが使用される。Ｍｉａ−ｐａｃａ２細胞（ＡＴＣＣ）を、５％ＣＯ_２を含むインキュベーター中、３７℃で１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ完全培地中で培養する。次いで、細胞を回収し、カウントし、９６ウェルプレートに４×１０^４個細胞／ウェルで蒔き、５％ＣＯ_２、３７℃で一晩培養する。培養培地を細胞から除去し、ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）または１：３希釈（１０回希釈）の０〜２０μＭの範囲にわたる２Ｘ最終濃度の化合物のいずれかを含有する無血清培地と交換する。さらに５時間のインキュベーション後、１０日ＭＩＡ ＰＡＣＡ２培養上清（ならし培地）１００μＬをプレートに添加してＳＴＡＴ３を活性化する。細胞を、５％ＣＯ_２を供給したインキュベーター中、３７℃でさらに２０分間処理する。刺激後、全培地を上記のように手動で除去し、細胞を、１Ｘ ＨＡＬＴプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７８４４１）を含有する氷冷１Ｘ ＭＳＤ溶解緩衝液（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋ１５０ＤＩＤ−２）５０μＬに溶解する。９６ウェルプレートを密閉し、次いで、オービタルシェーカー上室温で２分間混合し、次いで直ちに、−８０℃で一晩凍結させる。ｐＳＴＡＴ３を、以下の通りＭＡ６０００ ＭＳＤ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ−３（Ｔｙｒ７０５）（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、＃Ｋ１５０ＤＩＤ−２）を使用して検出し、プレートを振盪しながら室温で１〜２時間、ブロッキングバッファーによりブロッキングし、次いで、洗浄緩衝液で４回洗浄する。タンパク質溶解液２５μＬを各ウェルに添加し、プレートをさらに１〜２時間インキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した後、ＭＳＤプレートリーダー６０００でプレートを読み取る。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄプログラムを使用してデータを分析する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上に記載されるこのアッセイで試験する。実施例１の化合物は、１２ｎＭのＩＣ_５０でＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。これらの結果は、実施例１の化合物が膵がん細胞系でＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路を阻害することを示している。

ＳＵＭ−１５９−ＭＳＤ−ｐＳＴＡＴ３細胞ベースアッセイ
乳がん細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化の遮断における化合物の効力を試験するために、ＳＵＭ−１５９−ＭＳＤ−ｐＳＴＡＴ３細胞ベースアッセイが使用される。Ｓｕｍ−１５９細胞（Ａｓｔｅｒａｎｄ）を、５％ＦＢＳ、インスリン（５μｇ／ｍＬ）およびヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）を含むＨＡＭ’ｓ Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ １１７６５−０５４）で培養および維持する。細胞を回収し、カウントし、９６ウェルプレートに４×１０^４個細胞／ウェルで蒔き、５％ＣＯ_２、３７℃で一晩培養する。次いで、培養培地を除去し、ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）または１：３希釈（１０濃度点）の０〜２０μＭの範囲にわたる２Ｘ最終濃度の化合物のいずれかを含有するＦ−１２培地と交換する。さらに５時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を２ＸヒトＩＬ−６（Ｆ−１２完全培地に希釈した２０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬで処理し、５％ＣＯ_２中、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。刺激後、全培地を上記のように手動で除去し、細胞を、１Ｘ ＨＡＬＴプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含有する氷冷１Ｘ ＭＳＤ溶解緩衝液５０μＬに溶解する。９６ウェルプレートを密閉し、次いで、オービタルシェーカー上室温で２分間混合し、次いで直ちに、−８０℃で一晩凍結させる。ｐＳＴＡＴ３を、上記の通りＭＡ６０００ ＭＳＤ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓａｔｅ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ−３（Ｔｙｒ７０５）（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、＃Ｋ１５０ＤＩＤ−２）を使用して検出する。ＭＳＤプレートリーダーを使用して。プレートを読み取る。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄプログラムを使用してデータを分析する。

本発明の範囲内の化合物を実質的に上に記載されるこのアッセイで試験する。実施例１の化合物は、２１ｎＭのＩＣ_５０でＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する。これらの結果は、実施例１の化合物が乳がん細胞系でＪＡＫ−ＳＴＡＴ３経路を阻害することを示している。

Claims (7)

1. ３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンである化合物、またはその薬学的に許容される塩。
2. ３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンである、請求項１記載の化合物。
3. ３−［（１Ｒ）−６−フルオロ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］−Ｎ−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−５−アミンジヒドロクロリドである、請求項１記載の化合物。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
5. 治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。
6. がんの治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。
7. 前記がんが乳がん、肺がん、膵癌、腎がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、肝細胞癌および結腸がんからなる群から選択される、請求項６に記載の化合物または塩。