JP6088584B2 - Nucleic acids for allergy treatment - Google Patents
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Description
（発明の分野）
本発明は、分子生物学及び医薬品の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡワクチンとして使用するための核酸、並びにこれを使用して、アレルギー応答に罹患している又はアレルギー応答の疑いのある患者を治療する方法に関する。
(Field of Invention)
The present invention relates to the fields of molecular biology and medicine. More particularly, the present invention relates to nucleic acids for use as DNA vaccines and methods of using them to treat patients suffering from or suspected of having an allergic response.
アレルギーは、アレルゲン又はアレルギーを惹起する分子に対するＩｇＥ抗体の産生により特徴づけられる、アレルギー疾患である。アレルギーは人口の２５％超が発症する。アレルゲンは、気道、皮膚接触、摂取、虫刺され、又は薬物の注入などの多くの経路を介して体内に侵入し得る。 Allergy is an allergic disease characterized by the production of IgE antibodies against allergens or molecules that cause allergies. Allergies occur in over 25% of the population. Allergens can enter the body through many routes such as the respiratory tract, skin contact, ingestion, insect bites, or drug infusions.
アレルギー疾患の管理には、診断及び治療が含まれる。アレルギー専門医は、皮膚プリックテスト、放射性アレルゲン吸着試験、ＥＬＩＳＡ、又は誘発試験などの様々な技術を使用してアレルギーを診断し、アレルゲン特異的なＩｇＥを実証し、アレルゲンの由来を特定する。アレルギー治療は、多くの場合２つのカテゴリ、すなわち回避及び抗ヒスタミン薬の投与に分類される。別の、第３のアレルギー免疫療法は、免疫系を補助してアレルゲンに対する応答を再誘導（reeducate）する目的で、原因となるアレルゲンを患者に毎週少量注射する必要がある。 Management of allergic diseases includes diagnosis and treatment. Allergists use various techniques such as skin prick test, radioallergen adsorption test, ELISA, or provocation test to diagnose allergies, demonstrate allergen-specific IgE, and identify the origin of allergens. Allergy treatment is often divided into two categories: avoidance and administration of antihistamines. Another, third allergy immunotherapy requires the patient to inject small amounts of causative allergens weekly for the purpose of assisting the immune system and reducing the response to the allergen.
アレルゲン融合タンパク質の使用及び生成は当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第７，５６６，４５６号は、ＩｇＥ及びＩｇＧ結合ドメインを有し、アレルゲンをコードする、融合タンパク質を教示する。更に、国際公開第９７／０７２１８号は、アレルギーの免疫療法に使用するための、アレルゲン抗ＣＤ３２融合タンパク質を教示する。しかしながら、これらの文書は、いずれも、どのようにして融合タンパク質が抗原提示によりＴ細胞と相互作用し、Ｔｈ１応答を誘導又は変更するのかを教示してはいない。更に、抗ＣＤ３２含有ワクチンを樹状細胞に対し作用させることと、Ｔｈ１細胞の正の誘導に影響を与えるよう作用させることとの間に理論的な関連付けはなされていない。これらの文書は、アレルゲン融合タンパク質としてアレルゲンを血清中に見ることができるよう、治療のためアレルゲンを導入する組成物を教示する。 The use and production of allergen fusion proteins is well known in the art. For example, US Pat. No. 7,566,456 teaches a fusion protein having IgE and IgG binding domains and encoding an allergen. In addition, WO 97/07218 teaches an allergen anti-CD32 fusion protein for use in allergy immunotherapy. However, none of these documents teach how a fusion protein interacts with T cells by antigen presentation and induces or alters a Th1 response. Furthermore, there is no theoretical link between acting an anti-CD32 containing vaccine on dendritic cells and affecting the positive induction of Th1 cells. These documents teach compositions that introduce allergens for therapy so that they can be found in serum as an allergen fusion protein.
Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ，２００２により、アレルゲンのＴ細胞エピトープ（この場合、アミノ酸第２４７〜２５８番に位置するＣｒｙ Ｊ２エピトープ）は、融合タンパク質に結合でき、これを使用してアレルギー特異的な免疫療法を実施できることが実証されている。Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ，２００２により記載される具体的な組成物は、アミノ酸第２４７〜２５８番に位置しクラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）に結合するＣｒｙ Ｊ２の主要なＣＤ４ Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡワクチンを使用する。ＣＬＩＰは、リソソーム／エンドソーム輸送配列を含有し、かつＭＨＣ ＩＩのペプチド結合溝に結合するドメインを含有する。Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ，２００２は、Ｃｒｙ Ｊ２ペプチド／ＣＬＩＰ ＤＮＡワクチンによる免疫化により、マウスでは、多量のＩＦＮ−γ及びＩｇＧ２ａ産生により特徴づけられるＴｈ１応答が主にプライミングされることになることを示している。しかしながら、Ｔｏｄａ ｅｔ ａｌ．は、アレルギー特異的な免疫療法を実施するのに有用なアレルゲンの完全なタンパク質コード配列に対する細胞内標的は教示していない。 Toda et al, 2002, the allergen T cell epitope (in this case, the Cry J2 epitope located at amino acids 247-258) can bind to the fusion protein and be used for allergy-specific immunotherapy. It has been proven that it can. The specific composition described by Toda et al, 2002 encodes a major CD4 T cell epitope of Cry J2 located at amino acids 247-258 and binding to a class II related invariant chain peptide (CLIP) Use a DNA vaccine. CLIP contains a lysosome / endosome transport sequence and contains a domain that binds to the peptide binding groove of MHC II. Toda et al, 2002 show that immunization with the Cry J2 peptide / CLIP DNA vaccine will result in predominantly primed Th1 responses characterized by high amounts of IFN-γ and IgG2a production in mice. . However, Toda et al. Does not teach an intracellular target for the complete protein coding sequence of an allergen useful for carrying out allergy specific immunotherapy.
米国特許第６，９８２，３２６号及び米国特許第６，０９０，３８６号は、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）の主要な花粉アレルゲンＣｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｊｕｎ ｓ Ｉ、及びＪｕｎ ｖ Ｉをコードする核酸配列、並びにそれらの断片又はペプチドについて記載している。本発明は、Ｃｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｊｕｎ ｓ Ｉ、及びＪｕｎ ｖ Ｉ、又はそれらの少なくとも１つの断片、並びにＣｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｊｕｎ ｓ Ｉ、若しくはＪｕｎ ｖ Ｉ断片、又はそれらの少なくとも１つの断片、並びに合成により作製されたＣｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｊｕｎ ｓ Ｉ、若しくはＪｕｎ ｖ Ｉ断片をコードする核酸配列により形質転換された宿主細胞において産生される、精製Ｃｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｊｕｎ ｓ Ｉ、及びＪｕｎ ｖ Ｉ、並びにそれらの少なくとも１つの断片も提供する。Ｃｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｊｕｎ ｓ Ｉ、及びＪｕｎ ｖ Ｉ、並びにそれらの断片は、スギ花粉症の診断、治療、及び予防に有用であるとして開示される。本発明は、Ｃｒｙ Ｊ１及びＣｒｙ Ｊ２の単離ペプチドも提供する。本発明の範囲内のペプチドは、Ｃｒｙ Ｊ１又はＣｒｙ Ｊ２のうちの少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、又は好ましくは少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。本発明は、天然に生じるアレルゲン又はそれらの部分に対応するものの低減された副作用を有するものとして、類似する又は増強された治療特性を有する改変ペプチドにも関する。患者におけるスギ花粉に対する敏感性の治療又は診断方法、並びに医薬組成物、並びに本発明の１種以上のペプチドを含むマルチペプチド（multipeptide）製剤も提供される。本発明は、免疫活性化特性を有するＤＮＡワクチンにエピトープ又はアレルゲンを組み合わせる方法については教示しない。 US Pat. No. 6,982,326 and US Pat. No. 6,090,386 code for Cryptomeria japonica major pollen allergens Cry J1, Cry J2, Jun s I, and Jun v I. Nucleic acid sequences, as well as fragments or peptides thereof. The present invention relates to Cry J1, Cry J2, Jun s I, and Jun v I, or at least one fragment thereof, and Cry J1, Cry J2, Jun s I, or Jun v I fragment, or at least one of them. And purified Cry J1, Cry J2, Jun s I produced in a host cell transformed with a nucleic acid sequence encoding the fragment and a synthetically produced Cry J1, Cry J2, Jun s I, or Jun v I fragment. And Jun v I, and at least one fragment thereof are also provided. Cry J1, Cry J2, Jun s I, and Jun v I, and fragments thereof, are disclosed as being useful for the diagnosis, treatment, and prevention of cedar pollinosis. The present invention also provides isolated peptides of Cry J1 and Cry J2. Peptides within the scope of the present invention comprise at least one T cell epitope of Cry J1 or Cry J2, or preferably at least two T cell epitopes. The present invention also relates to modified peptides having similar or enhanced therapeutic properties as having reduced side effects of naturally occurring allergens or their counterparts. Also provided are methods of treating or diagnosing susceptibility to cedar pollen in a patient, as well as pharmaceutical compositions and multipeptide formulations comprising one or more peptides of the present invention. The present invention does not teach how to combine epitopes or allergens with DNA vaccines with immunostimulatory properties.
米国特許第７，５４７，４４０号及び米国特許第７，１１２，３２９号は、ジャパニーズ・サイプレス（Japanese cypress）花粉アレルゲンの一次構造とオーバーラップするペプチドを用い、ジャパニーズ・サイプレス（Japanese cypress）（檜）花粉アレルギーに罹患している患者から樹立されたＴ細胞株を刺激することにより、ジャパニーズ・サイプレス（Japanese cypress）花粉アレルゲン分子に対するＴ細胞エピトープ部分を特定する。ペプチドは、ジャパニーズ・サイプレス（Japanese cypress）花粉と交差反応性を有する、ジャパニーズ・サイプレス（Japanese cypress）花粉症患者を含む、春季樹木花粉症患者のペプチド系免疫療法に有用である。ペプチドは、春季の樹木由来の花粉症の診断に有用である。本発明は、診断及びエピトープのポリペプチド送達に限定される。 US Pat. No. 7,547,440 and US Pat. No. 7,112,329 use a peptide that overlaps with the primary structure of Japanese cypress pollen allergen, and uses Japanese cypress (檜) ) Identify a T cell epitope portion for a Japanese cypress pollen allergen molecule by stimulating a T cell line established from a patient suffering from pollen allergy. Peptides are useful for peptide-based immunotherapy of spring tree hay fever patients, including Japanese cypress hay fever patients who have cross-reactivity with Japanese cypress pollen. Peptides are useful in the diagnosis of hay fever from trees in spring. The present invention is limited to diagnostic and epitope polypeptide delivery.
ＤＮＡワクチンは、従来の全細胞又は全ウイルスワクチンの代替法として開発されてきた。一般的に、ＤＮＡワクチンは、１つ以上のエピトープをコードする配列を含む、遺伝子操作された核酸である。核酸は、細胞、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達され、当該核酸が発現し、発現したタンパク質上に存在するエピトープはエンドソーム／リソソーム区画においてプロセシングを受け、最終的に表面上に提示される。米国特許第５，６３３，２３４号（Ａｕｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ．）は、リソソーム膜タンパク質の（ＬＡＭＰ）のエンドソーム／リソソーム標的配列を開示し、特徴付ける。当該特許は、エンドソーム／リソソーム区画に対しタンパク質を標的とするのに必要とされるタンパク質のＣ末端領域中の重要な残基を特定する。当該特許は、Ｃ末端ＬＡＭＰ標的配列に対する抗原性ペプチドの融合により、プロセシングの向上並びに免疫応答を惹起させるためのエピトープの提示がもたらされ得ることを開示する。 DNA vaccines have been developed as an alternative to conventional whole cell or whole virus vaccines. In general, a DNA vaccine is a genetically engineered nucleic acid that includes a sequence encoding one or more epitopes. The nucleic acid is delivered to a cell, typically an antigen presenting cell (APC), where the nucleic acid is expressed, and the epitope present on the expressed protein is processed in the endosomal / lysosomal compartment and finally presented on the surface Is done. US Pat. No. 5,633,234 (August et al.) Discloses and characterizes the endosomal / lysosomal targeting sequence of the lysosomal membrane protein (LAMP). The patent identifies key residues in the C-terminal region of the protein that are required to target the protein to the endosomal / lysosomal compartment. The patent discloses that fusion of an antigenic peptide to a C-terminal LAMP target sequence can result in improved processing as well as presentation of epitopes to elicit an immune response.
加えて、米国特許出願公開第２００４／０１５７３０７号（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．）は、ＤＮＡワクチンから発現されるキメラタンパク質に、リソソーム小胞経路を通過させるなどして、１つ以上の細胞内区画／細胞小器官を通過させる、「輸送ドメイン」としてのＬＡＭＰ筒状ドメインの使用を開示する。キメラタンパク質は、ＬＡＭＰポリペプチドの筒状ドメイン、予め特定されており、かつ抗原タンパク質から選択されているペプチドエピトープ配列を含む、抗原性ドメイン、膜貫通ドメイン、及びエンドソーム／リソソーム標的配列を含む。 In addition, US Patent Application Publication No. 2004/0157307 (Harris et al.) Describes one or more intracellular compartments / cells, such as passing a lysosomal vesicle pathway through a chimeric protein expressed from a DNA vaccine. Disclose the use of a LAMP tubular domain as a “transport domain” to pass organelles. The chimeric protein comprises a cylindrical domain of a LAMP polypeptide, an antigenic domain, a transmembrane domain, and an endosomal / lysosomal targeting sequence, including peptide epitope sequences that have been previously identified and selected from antigenic proteins.
ＤＮＡワクチンは、アレルギー性疾患の治療薬として提案されてきた（Ｒａｚ ｅｔ ａｈ，１９９６；Ｈａｒｔｌ ｅｔ ａｌ，２００４；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｃｒａｍｅｒｉ ２００７；Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ，２００６）。基本的な原理は、ＤＮＡワクチンによりコードされるアレルゲンタンパク質が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３の分泌、並びにＢリンパ細胞ＩｇＥの形成などの特有のＴｈ２型の応答よりも、ＡＰＣ、ナチュラルキラー（ＮＫ）、及びＴ細胞によるインターフェロンの産生により、アレルゲン特異的なＴｈ１細胞応答を優先的に活性化し、遅延型の応答において好酸球を補充するというものである。しかしながら、Ｔｈ１及びＴｈ２ Ｔ細胞表現形の差次的な導入に関係する機序が、ワクチン製剤の細菌ＤＮＡの独特の特性、例えば、非メチル化及びＣｐＧ ＤＮＡ残基、自然免疫によりもたらされるサイトカイン環境、並びにアレルゲンの細胞輸送特性（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２００１；Ｋａｅｃｈ ｅｔ ａｌ，２００２）などといった多くの因子に関与することは明白である。アレルゲンをコードする核酸を送達することにより実施されるアレルギー治療の不確実性に首尾よく対応している発明又は方法は存在しない。 DNA vaccines have been proposed as therapeutic agents for allergic diseases (Raz et ah, 1996; Hart et al, 2004; Hsu et al, 1996; Crameri 2007; Weiss et al, 2006). The basic principle is that the allergen protein encoded by the DNA vaccine is more prone to APC than the characteristic Th2 type response, such as the secretion of IL-4, IL-5, and IL-13, and the formation of B lymphocyte IgE. Natural killer (NK) and T cell production of interferon preferentially activates an allergen-specific Th1 cell response and recruits eosinophils in a delayed response. However, the mechanisms involved in the differential introduction of Th1 and Th2 T cell phenotypes are unique properties of bacterial DNA in vaccine formulations, such as unmethylated and CpG DNA residues, cytokine environment brought about by innate immunity As well as many other factors such as allergen cellular transport properties (Chen et al, 2001; Kaech et al, 2002). There is no invention or method that successfully addresses the uncertainty of allergy treatment performed by delivering nucleic acids encoding allergens.
したがって、現在では、このようなアレルギー治療は使用可能でない。加えて、アレルギー性疾患の治療のためのＤＮＡワクチンの投与は、結果として、細胞外環境へのアレルゲンペプチドの分泌をもたらし、ＩｇＥの活性化による偶発的なアレルギー応答を誘導し得る。 Therefore, currently no such allergy treatment is available. In addition, administration of DNA vaccines for the treatment of allergic diseases can result in the secretion of allergen peptides into the extracellular environment and induce an accidental allergic response due to the activation of IgE.
本発明は、アレルゲン性タンパク質、アレルゲン性ポリペプチド、及びアレルゲン性ペプチドをコードする核酸（本明細書においては「コンストラクト」とも呼ばれる）を提供する。核酸は、免疫細胞に送達され、これらの細胞内でアレルゲン性タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを産生するよう設計される。コードされるタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドは、１つ以上のエピトープをプロセシングしかつ提示するための、ＭＨＣ−ＩＩコンパートメントに対するタンパク質を標的とし、結果としてエピトープ（１つ又は複数）に対する免疫応答を生じる、標的配列を有する。一般に、核酸は、コードされるタンパク質の各ドメインに関連する、次のドメイン、シグナル配列ドメイン、細胞小器官内安定化ドメイン（intra-organelle stabilizing domain）、アレルゲンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質リソソーム／エンドソーム標的ドメインを含む。 The present invention provides allergenic proteins, allergenic polypeptides, and nucleic acids that encode allergenic peptides (also referred to herein as “constructs”). Nucleic acids are designed to be delivered to immune cells and produce allergenic proteins, polypeptides, and peptides within these cells. The encoded proteins, polypeptides, and peptides target proteins against the MHC-II compartment to process and present one or more epitopes, resulting in an immune response against the epitope (s) Have a target sequence. In general, a nucleic acid is associated with each domain of the encoded protein with the following domains, signal sequence domain, intra-organelle stabilizing domain, allergen domain, transmembrane domain, and cytoplasmic lysosome / Contains an endosomal targeting domain.
コードされるタンパク質との関連で、シグナル配列は、コードしているタンパク質を小胞体又はリソソームに輸送させるために提供される。細胞小器官内安定化ドメインは、タンパク質分解に耐性であり、タンパク質の残部及び特にアレルゲンドメインを、細胞によるエピトープ提示のためのプロセシング以前の分解から保護するよう設計された配列である。代表的な実施形態では、細胞小器官内安定化ドメインは、ＬＡＭＰ−１の筒状ドメインである。アレルゲンドメインは、エピトープが存在する動物において免疫応答の惹起をもたらし得る、１つ以上のアレルゲン性エピトープ配列を含む。典型的には、アレルゲンドメインは１つ以上のアレルゲンタンパク質を含むものの、実施形態においては、免疫原性ポリペプチド又はアレルゲン性タンパク質のペプチド断片を使用することができる。以降の実施形態では、エピトープは植物アレルゲンのエピトープである。本発明のコードされるタンパク質では、アレルゲンドメインは、アレルゲンタンパク質（１つ又は複数）の部分として天然に生じるシグナルペプチド（１つ又は複数）などのシグナルペプチドを含まない。アレルゲンドメインは、単一のアレルゲン性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含んでよく、あるいは２つ以上のアレルゲン性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含んでよい。２つ以上のアレルゲンが存在し、各アレルゲンは同一種／供給源由来であってよく、又は１つ以上が１つ以上の異なる供給源に由来してよい。２つ以上のアレルゲンが存在する場合、それらは協調的に発現させて、発現タンパク質において各コード領域のコピーを同数存在させる。膜貫通ドメインは、膜を通してのタンパク質の挿入及び移動を実施するのに好適な任意の配列であり得る。このような配列の多くは当該技術分野において既知であり、又は容易に設計することができる。リソソーム／エンドソーム標的ドメインは、リソソーム又はエンドソームにペプチドを輸送させることのできる任意の配列であり得る。このような配列は当該技術分野において既知であり、本明細書において、ＬＡＭＰ−１の細胞質側末端配列により例示される。 In the context of the encoded protein, a signal sequence is provided to transport the encoded protein to the endoplasmic reticulum or lysosome. An organelle stabilization domain is a sequence that is resistant to proteolysis and designed to protect the rest of the protein and especially the allergen domain from degradation prior to processing for epitope presentation by the cell. In an exemplary embodiment, the organelle stabilization domain is a cylindrical domain of LAMP-1. An allergen domain includes one or more allergenic epitope sequences that can result in the raising of an immune response in an animal in which the epitope is present. Typically, an allergen domain comprises one or more allergen proteins, but in embodiments, immunogenic polypeptides or peptide fragments of allergenic proteins can be used. In subsequent embodiments, the epitope is a plant allergen epitope. In the encoded protein of the invention, the allergen domain does not include a signal peptide, such as signal peptide (s) that occur naturally as part of the allergen protein (s). An allergen domain may comprise a single allergenic protein, polypeptide, or peptide, or may comprise two or more allergenic proteins, polypeptides, or peptides. There are two or more allergens, each allergen may be from the same species / source, or one or more may be from one or more different sources. If more than one allergen is present, they are expressed in concert, so that there are an equal number of copies of each coding region in the expressed protein. The transmembrane domain can be any sequence suitable for performing protein insertion and movement through the membrane. Many such sequences are known in the art or can be readily designed. The lysosome / endosome targeting domain can be any sequence capable of transporting a peptide to the lysosome or endosome. Such sequences are known in the art and are exemplified herein by the cytoplasmic terminal sequence of LAMP-1.
上記方法の通り、好ましい実施形態では、核酸は、アレルゲン性タンパク質のアレルゲン性コード配列全体を含むアレルゲンドメインを含むものの、アレルゲンのシグナル配列のコード配列は含まない。一部の実施態様では、本発明の核酸は、完全なアレルゲンコード配列は含まないものの、その代わりに、発現させたときに、ポリペプチド上に存在する少なくとも１つのエピトープの天然の立体構造が得られるよう、コードされているポリペプチドをフォールディングすることのできる、十分な量のコード配列のみを含む。コンストラクトが完全なアレルゲンコード配列を含む場合と同様、完全ではないコード配列が存在する場合、核酸コンストラクトは、アレルゲン性ポリペプチド又はペプチドに天然に生じるシグナルペプチドコード配列も含まない。 As described above, in a preferred embodiment, the nucleic acid comprises an allergen domain that includes the entire allergenic coding sequence of the allergenic protein, but does not include the coding sequence of the allergen signal sequence. In some embodiments, the nucleic acids of the invention do not contain the complete allergen coding sequence, but instead obtain the natural conformation of at least one epitope present on the polypeptide when expressed. As such, it includes only a sufficient amount of the coding sequence capable of folding the encoded polypeptide. A nucleic acid construct also does not include a signal peptide coding sequence that naturally occurs in an allergenic polypeptide or peptide, if there is a coding sequence that is not complete, as if the construct contained the complete allergen coding sequence.
好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、アレルゲンドメイン中の複数のアレルゲン性タンパク質、ポリペプチド、及び／又はペプチドのコード配列を含む。各アレルゲンの提示は、同一供給源、各々異なる供給源、又はこれらの任意の組み合わせに由来し得る。 In a preferred embodiment, the nucleic acid construct comprises a plurality of allergenic proteins, polypeptides, and / or peptide coding sequences in the allergen domain. The presentation of each allergen can be from the same source, each different source, or any combination thereof.
核酸、ひいてはコードされる本発明のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドは、アレルギーに罹患している、又はアレルギーを発症する可能性のある患者、及び特に動物患者を治療する方法に使用できる。一般に、本発明に従う治療方法は、核酸を１つ以上の免疫細胞に、並びに好ましくは免疫系の１つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達するのに十分な量で、本発明の核酸を患者に投与することを含む。送達された時点で核酸は発現され、コードされているタンパク質は細胞内でプロセシングされ、エピトープ（１つ又は複数）は細胞表面に提示される。治療方法は、核酸及びタンパク質を使用して、治療的又は予防免疫応答をもたらす方法であると見なすことができる。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（１４）に関する。
（１） 単離又は精製核酸であって、順に、
シグナル配列をコードする配列、
細胞小器官内安定化ドメインをコードする配列、
アレルゲンドメインをコードする配列、
膜貫通ドメインをコードする配列、及び
エンドソーム／リソソーム標的ドメインをコードする配列、を含み、前記アレルゲンドメインは少なくとも１つのアレルゲンを含み、前記アレルゲンに関し天然に生じるシグナル配列を含まない、単離又は精製核酸。
（２） 前記細胞小器官内安定化ドメインが、リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ）をコードする配列を含む、前記（１）に記載の核酸。
（３） 前記細胞小器官内安定化ドメインが、ＬＡＭＰポリペプチド、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ−３、ＬＩＭＰ ＩＩ、又はＥＮＤＯＬＹＮをコードする配列を含む、前記（１）に記載の核酸。
（４） 前記アレルゲンドメインをコードする配列が、２つ以上のアレルゲンエピトープをコードする配列を含む、前記（１）に記載の核酸。
（５） 前記アレルゲンドメインをコードする配列が、２つ以上のアレルゲンをコードする配列を含む、前記（１）に記載の核酸。
（６） 前記アレルゲンが、２つ以上の異なる種に由来する、前記（５）に記載の核酸。
（７） 前記アレルゲンが、Ｃｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、Ｃｒｙ Ｊ３、ＣＪＰ−４、ＣＪＰ−６、ＣＪＰ−８、ＣＰＡ６３、Ｃｈａ ｏ １、Ｊｕｎ ａ １、Ｊｕｎ ｖ １、Ｃｕｐ ａ １、Ｊｕｎ ｏ １、Ｃｕｐ ｓ １、Ｃｈａ ｏ ２、Ｊｕｎ ａ ２、Ｃｕｐ ａ ２、Ｊｕｎ ａ ３、Ｊｕｎ ｒ ３、Ｃｕｐ ｓ ３、Ｃｕｐ ａ ３、Ｃｈ４Ａ、Ｃｈ４−１、ＰＴ−１、若しくはＬＴＰアレルゲン、又は少なくとも１つのアレルゲン性エピトープを有するこれらの部分である、前記（１）に記載の核酸。
（８） 宿主において免疫応答を誘導するＤＮＡワクチンである、前記（１）に記載の核酸。
（９） 前記アレルゲンドメインが、それぞれ同種に由来する２つ以上のアレルゲンをコードする配列を含む、前記（１）に記載の核酸。
（１０） 前記アレルゲンドメインが、それぞれ異種に由来する２つ以上のアレルゲンをコードする配列を含む、前記（１）に記載の核酸。
（１１） 対象においてアレルギー応答を低減、排除又は予防する方法であって、前記対象に、前記アレルゲン性エピトープに特異的なＩｇＥ応答の発生を低減又は排除するのに十分な量で、前記（１）に記載の前記ＤＮＡワクチンを投与することを含む、方法。
（１２） 前記方法が、アレルギー応答を予防する、前記（１１）に記載の方法。
（１３） 前記方法が、少なくとも１つの臨床的なアレルギー症状を低減、排除又は予防する、前記（１２）に記載の方法。
（１４） 前記方法が、少なくとも１つの臨床的なアレルギー症状を予防する、前記（１３）に記載の方法。
The nucleic acids and thus the encoded proteins, polypeptides and peptides of the present invention can be used in methods for treating patients suffering from or allergic to allergies, and in particular animal patients. In general, a therapeutic method according to the present invention comprises the nucleic acid of the invention in an amount sufficient to deliver the nucleic acid to one or more immune cells, and preferably to one or more antigen presenting cells (APCs) of the immune system. Including administering to a patient. Upon delivery, the nucleic acid is expressed, the encoded protein is processed intracellularly, and the epitope (s) are presented on the cell surface. A therapeutic method can be viewed as a method that uses nucleic acids and proteins to produce a therapeutic or prophylactic immune response.
That is, the present invention relates to the following (1) to (14).
(1) An isolated or purified nucleic acid, in order:
A sequence encoding a signal sequence,
A sequence encoding an organelle stabilizing domain,
A sequence encoding an allergen domain,
An isolated or purified nucleic acid comprising a sequence encoding a transmembrane domain, and a sequence encoding an endosomal / lysosomal targeting domain, wherein the allergen domain includes at least one allergen and does not include a naturally occurring signal sequence for the allergen .
(2) The nucleic acid according to (1), wherein the organelle stabilization domain includes a sequence encoding a lysosomal membrane protein (LAMP).
(3) The nucleic acid according to (1), wherein the organelle stabilization domain includes a sequence encoding LAMP polypeptide, DC-LAMP, LAMP2, LAMP-3, LIMP II, or ENDOLYN.
(4) The nucleic acid according to (1), wherein the sequence encoding the allergen domain includes a sequence encoding two or more allergen epitopes.
(5) The nucleic acid according to (1), wherein the sequence encoding the allergen domain includes a sequence encoding two or more allergens.
(6) The nucleic acid according to (5), wherein the allergen is derived from two or more different species.
(7) The allergen is Cry J1, Cry J2, Cry J3, CJP-4, CJP-6, CJP-8, CPA63,
(8) The nucleic acid according to (1) above, which is a DNA vaccine that induces an immune response in a host.
(9) The nucleic acid according to (1), wherein the allergen domain includes a sequence encoding two or more allergens derived from the same species.
(10) The nucleic acid according to (1), wherein the allergen domain includes a sequence encoding two or more allergens derived from different species.
(11) A method for reducing, eliminating or preventing an allergic response in a subject, wherein the subject is in an amount sufficient to reduce or eliminate the occurrence of an IgE response specific for the allergenic epitope. And administering the DNA vaccine according to
(12) The method according to (11), wherein the method prevents an allergic response.
(13) The method according to (12), wherein the method reduces, eliminates or prevents at least one clinical allergic symptom.
(14) The method according to (13), wherein the method prevents at least one clinical allergic symptom.
本発明の各種例示の実施形態を詳述するための参照を行う。以降の例示の実施形態の考察は、本願に広範に開示される本発明を制限することを意図するものではない。むしろ、以降の考察は、読者に、本発明の特定の態様及び特徴に関するより詳細な理解を与えるために提供されるものである。本発明の実施は、別途記載のない限り、当該技術分野における範囲内の一般的な分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ法を採用する。このような手法は、当業者に既知の文献中に十分に説明されており、そのため本明細書において詳述する必要はない。同様に、薬物療法のための本発明の実施は、当業者に一般的なプロトコルに従うものであり、これらのプロトコルは本明細書において詳述する必要はない。 Reference is made to detail various exemplary embodiments of the invention. The discussion of the exemplary embodiments that follow is not intended to limit the invention as broadly disclosed herein. Rather, the following discussion is provided to give the reader a more detailed understanding of certain aspects and features of the invention. The practice of the present invention employs general molecular biology, microbiology, and recombinant DNA methods within the scope of the art unless otherwise stated. Such techniques are explained fully in the literature known to the person skilled in the art and therefore do not need to be detailed here. Similarly, the practice of the present invention for drug therapy follows protocols that are common to those of ordinary skill in the art and these protocols need not be detailed herein.
本発明の実施形態を詳述する前に、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのものであり、制限を意図するものではないことは理解されるであろう。更に、値について範囲が提供される場合、文脈上明記されていない限り、下限とする単位の少数第一位までが開示されているものとし、それ以外には、範囲の上限値及び下限値の間の各数値も明確に開示されているものとする。任意の規定の値又は規定の範囲に含まれる値と、その他の任意の規定の値又は規定の範囲に含まれる値とに挟まれる、より小さな各々の範囲も本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して範囲に包含させることができ、あるいは除外させることができ、かつ各範囲が、記載の範囲内の任意の特定の制限を包含するよう、上限及び下限のいずれかを包含し、又はいずれも包含せず、又はいずれをも包含する、より小さな範囲も本発明に包含させる。規定の範囲が上限又は下限のいずれか又は両方を含有する場合、これらの含有される上限又は下限のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。したがって、値の範囲が表される場合、範囲内の各値、及び範囲内に当てはまる各範囲は同様に本質的に引用されるものであり、各及び全ての値、並びに全ての可能性のある値範囲の具体的な引用の回避は、これらの値及び範囲を除外するものではなく、むしろ本開示の読者、及び本開示の簡潔性のための便宜的なものであることは理解される。 Before detailed embodiments of the present invention, it is understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting. Let's go. In addition, when ranges are provided for values, up to the first decimal place of the lower unit shall be disclosed unless otherwise stated in the context, otherwise the upper and lower limits of the range shall be disclosed. Each numerical value in between is also clearly disclosed. Each smaller range sandwiched between any specified value or value included in a specified range and any other specified value or value included in the specified range is also encompassed by the invention. The upper and lower limits of these smaller ranges can be independently included or excluded in the range, and each range includes any specific limitation within the stated range. And the lower ranges are included in the present invention, including any or all of the lower limits, or none. When the specified range includes either or both of an upper limit and a lower limit, a range excluding either or both of the upper limit and the lower limit contained is also included in the present invention. Thus, when a range of values is expressed, each value in the range, and each range that falls within the range, is also inherently cited, each and every value, and all possible It is understood that the avoidance of specific citations for value ranges does not exclude these values and ranges, but rather is for the convenience of the reader of this disclosure and for the sake of brevity of this disclosure.
別途記載のない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書に記載のものと同様の、又は本明細書に記載のものに相当する任意の方法及び材料を、本開示を実施又は試験するために使用できるが、好ましい方法及び材料を以降に記載する。本明細書において言及される全ての出版物は、引用される出版物に関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本案件に援用される。本開示は、援用される任意の出版物と衝突する範囲を調節する。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present disclosure, the preferred methods and materials are described below. To do. All publications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to disclose and describe the methods and / or materials associated with the cited publication. This disclosure adjusts the extent to which it collides with any incorporated publication.
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。したがって、例えば、「アレルゲン」には、このようなアレルゲンが複数包含され、「サンプル」を参照する場合には、当業者に知られる１つ以上のサンプル及びその同等物等が包含される。更に、等価の用語を使用して記載することのできる用語の使用には、これらの等価の用語が含まれる。したがって、例えば、用語「対象（subject）」の使用は、用語「動物」、「ヒト」、並びに薬物療法を行われる対象を指すために当該技術分野で使用されるその他の用語を包含するものと理解される。 As used herein and in the appended claims, the singular articles “a”, “an”, and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, "allergen" includes a plurality of such allergens, and when referring to "sample", one or more samples known to those skilled in the art and equivalents thereof are included. Furthermore, the use of terms that can be described using equivalent terms includes these equivalent terms. Thus, for example, use of the term “subject” includes the terms “animal”, “human”, and other terms used in the art to refer to a subject undergoing drug therapy. Understood.
本明細書で使用するとき、用語「含む」は、コンストラクト、組成物、及び方法が、記載の要素及び／又は工程を含むものの、他の要素及び／又は工程を除外するものではないことを意味するものと意図する。コンストラクト、組成物、及び方法を定義するために使用するとき、「から本質的になる」は、記載のコンストラクト、組成物、及び方法に本質的に重要であるもの以外の要素及び工程を除外することを意味する。したがって、本明細書において定義される通りの要素から本質的になる組成物は、単離及び精製法並びに製薬上許容され得る担体（リン酸緩衝生理食塩水及び保存料など）から持ち込まれた微量の不純物を排除するものではない。「からなる」は、他の原材料の微量構成要素、及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法を除外することを意味する。これらの遷移する用語の各々により定義される実施形態は、本発明の範囲内である。 As used herein, the term “comprising” means that the constructs, compositions, and methods include the elements and / or steps described, but do not exclude other elements and / or steps. Intended to be. When used to define constructs, compositions, and methods, “consisting essentially of” excludes elements and steps other than those that are inherently important to the described constructs, compositions, and methods. Means that. Accordingly, a composition consisting essentially of the elements as defined herein is a trace amount brought in from isolation and purification methods and pharmaceutically acceptable carriers such as phosphate buffered saline and preservatives. This does not exclude impurities. “Consisting of” is meant to exclude minor ingredients of other raw materials and substantial methods for administering the compositions of the present invention. Embodiments defined by each of these transition terms are within the scope of this invention.
「キメラＤＮＡ」は、天然においてより大きな分子と関連することが見出されていない、より大きなＤＮＡ分子内の識別可能なＤＮＡ断片である。したがって、キメラＤＮＡがタンパク質断片をコードするとき、配列をコードする断片は、任意の天然型ゲノムにおいてはコード配列に隣接しないＤＮＡにより隣接される。隣接するＤＮＡがポリペプチド配列をコードする場合、コードされるタンパク質は、「キメラタンパク質」（すなわち、一緒に融合させた非天然型アミノ酸配列を有するタンパク質）と呼ばれる。対立遺伝子変異又は天然に生じる変異イベントは、本明細書において定義される通りのキメラＤＮＡ又はキメラタンパク質に対しては生じない。 “Chimeric DNA” is an identifiable DNA fragment within a larger DNA molecule that has not been found in nature to be associated with a larger molecule. Thus, when the chimeric DNA encodes a protein fragment, the fragment encoding the sequence is flanked by DNA that is not adjacent to the coding sequence in any native genome. If the adjacent DNA encodes a polypeptide sequence, the encoded protein is referred to as a “chimeric protein” (ie, a protein having non-natural amino acid sequences fused together). Allelic variation or naturally occurring mutational events do not occur for chimeric DNA or chimeric proteins as defined herein.
本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、任意の長さの重合形態のヌクレオチドを指すために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらの類似体を含有し得る。ヌクレオチドは、任意の立体構造を有してよく、既知の又は未知の任意の機能を発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、一重、二重、及び三重らせん分子、遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを包含する。核酸分子は、改変された核酸分子（例えば、改変された塩基、糖、及び／又はヌクレオチド間リンカーを含む）も包含し得る。 As used herein, the terms “polynucleotide” and “nucleic acid molecule” are used interchangeably to refer to a polymeric form of nucleotides of any length. A polynucleotide may contain deoxyribonucleotides, ribonucleotides, and / or analogs thereof. Nucleotides may have any conformation and may perform any known or unknown function. The term “polynucleotide” includes, for example, single, double, and triple helix molecules, genes or gene fragments, exons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozymes, antisense molecules, cDNA, recombinant polynucleotides, branched poly Includes nucleotides, aptamers, plasmids, vectors, isolated DNA of any sequence, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes, and primers. Nucleic acid molecules can also include modified nucleic acid molecules (eg, including modified bases, sugars, and / or internucleotide linkers).
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸サブユニット、アミノ酸類似体、又はペプチド模倣剤からなる化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合又はその他の結合（例えば、エステル、エーテル及び同様の結合など）により連結され得る。本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」は、一般的に、ペプチド（すなわち、２〜約２０残基のポリアミノ酸）、ポリペプチド（すなわち、約２０残基〜約１００残基のペプチド）、及びタンパク質（すなわち、約１００個又はそれ以上の残基を有するペプチド）を指す。 As used herein, the term “peptide” refers to a compound consisting of two or more amino acid subunits, amino acid analogs, or peptidomimetics. The subunits can be linked by peptide bonds or other bonds such as esters, ethers and similar bonds. As used herein, the term “peptide” generally refers to a peptide (ie, a polyamino acid of 2 to about 20 residues), a polypeptide (ie, a peptide of about 20 residues to about 100 residues). , And protein (ie, a peptide having about 100 or more residues).
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」は、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシン及びＤ又はＬ型光学異性体、及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣剤を包含する。３つ以上のアミノ酸からなるペプチドは、ペプチド鎖が短鎖である場合には、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。用語「タンパク質」は用語「ポリペプチド」を包含するのに対し、「ポリペプチド」は完全長に満たないタンパク質であり得る。 As used herein, the term “amino acid” refers to either natural and / or non-natural or synthetic amino acids and includes glycine and D or L optical isomers, and amino acid analogs and peptidomimetics. . A peptide composed of 3 or more amino acids is generally called an oligopeptide when the peptide chain is a short chain. The term “protein” encompasses the term “polypeptide”, whereas “polypeptide” may be less than full-length protein.
用語「アレルゲン」は、患者への反復暴露時に、アレルギー性の、すなわち、ＩｇＥ介在性応答を誘導することが報告されている、任意の天然型タンパク質又はタンパク質混合物を指す。アレルゲンは、アレルギー応答を誘起し得る任意の化合物、物質、又は材料である。アレルゲンは、通常、免疫応答を誘起し得る化合物、物質、又は材料である抗原のサブカテゴリーとして理解される。本発明を実施する差異、アレルゲンは、特に、天然又は未変性のアレルゲン、改変された天然のアレルゲン、合成アレルゲン、組み換えアレルゲン、アレルゴイド（allergoids）、及びこれらの混合物又は組み合わせから選択される。特に対象となるのは、ＩｇＥ介在性の即時型過敏症を引き起こし得るアレルゲンである。 The term “allergen” refers to any naturally occurring protein or protein mixture that has been reported to induce an allergic, ie, IgE-mediated response, upon repeated exposure to a patient. An allergen is any compound, substance, or material that can induce an allergic response. Allergens are usually understood as a subcategory of antigens that are compounds, substances or materials that can elicit an immune response. The differences, allergens embodying the invention are in particular selected from natural or native allergens, modified natural allergens, synthetic allergens, recombinant allergens, allergoids, and mixtures or combinations thereof. Of particular interest are allergens that can cause IgE-mediated immediate hypersensitivity.
天然型アレルゲンの例としては、花粉アレルゲン（例えば、樹木、雑草、薬草、及び草類の花粉アレルゲン）、ダニ・アレルゲン（例えば、ハウスダストのダニ、貯蔵に関係するダニ）、昆虫アレルゲン（例えば、吸入抗原、唾液及び毒液由来のアレルゲン）、例えば、唾液、毛髪及び由来の動物アレルゲン、並びに動物由来のフケ（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなど）、菌類アレルゲン、及び食品アレルゲンが挙げられる。アレルゲンは、アレルゲン抽出物、精製アレルゲン、改変アレルゲン又は組み換えアレルゲン、又は組み換え変異アレルゲン、アミノ酸３０個以上からなるアレルゲン断片、又はこれらの任意の組み合わせの形態であってよい。 Examples of natural allergens include pollen allergens (eg, tree, weed, medicinal herb, and grass pollen allergens), mite allergens (eg, house dust mites, storage related mites), insect allergens (eg, Inhaled antigens, saliva and venom-derived allergens), such as saliva, hair and derived animal allergens, and animal-derived dandruff (eg, dogs, cats, horses, rats, mice, etc.), fungal allergens, and food allergens It is done. The allergen may be in the form of an allergen extract, a purified allergen, a modified or recombinant allergen, or a recombinant mutant allergen, an allergen fragment consisting of 30 or more amino acids, or any combination thereof.
それらの化学的又は生化学的性質に関して、アレルゲンは、天然又は組み換えタンパク質又はペプチド、天然又は組み換えタンパク質又はペプチドの断片又はトランケート型、融合タンパク質、合成化合物（化学アレルゲン）、アレルゲンを模倣する合成化合物、あるいは化学的又は物理的に変更を加えたアレルゲン、例えば、熱変性により改変されたアレルゲンを表し得る。 In terms of their chemical or biochemical properties, allergens are natural or recombinant proteins or peptides, fragments or truncated forms of natural or recombinant proteins or peptides, fusion proteins, synthetic compounds (chemical allergens), synthetic compounds that mimic allergens, Alternatively, it may represent a chemically or physically altered allergen, for example, an allergen that has been modified by heat denaturation.
主要アレルゲンとしてのアレルゲンの分類には、数種類の試験を実施することができる。一般的に、少なくとも２５％の患者が強いＩｇＥ結合（スコア３）を示し、５０％の患者が少なくとも中等度の結合（スコア２）を示す場合に、アレルゲンは主要アレルゲンとして分類され、この結合はＣＲＩＥ（交差放射性免疫電気泳動法）により測定される（ＣＲＩＥの強力な結合（Ｌｅ．，）では１日後に、ＣＲＩＥの中等度の結合（Ｌｅ．，）では３日後に、ＣＲＩＥでの低強度（Ｌｅ．，）の結合では１０日後に、Ｘ線フィルム上でＩｇＥ結合が視認される）。患者の少なくとも１０％で強力なＩｇＥ結合が生じると、そのアレルゲンは中強度のアレルゲンとして分類され、明らかな特異的結合が患者の１０％未満である場合には、そのアレルゲンは弱強度アレルゲンとして分類される。ＩｇＥの結合を決定するにあたり、例えば、ＩｇＥブロットなどのその他の手法を使用することもできる。 Several types of tests can be performed to classify allergens as major allergens. In general, an allergen is classified as a major allergen when at least 25% of patients show strong IgE binding (score 3) and 50% of patients show at least moderate binding (score 2). Low intensity in CRIE as measured by CRIE (cross-radioimmunoelectrophoresis) (after 1 day for strong binding of CRIE (Le.,), After 3 days for moderate binding of CRIE (Le.,)) (Le.,) Binding shows IgE binding on X-ray film after 10 days). If strong IgE binding occurs in at least 10% of patients, the allergen is classified as a medium strength allergen, and if the apparent specific binding is less than 10% of the patient, the allergen is classified as a low strength allergen. Is done. In determining IgE binding, other techniques, such as, for example, an IgE blot can also be used.
「エピトープ」は構造であり、通常は、免疫系の構成因子により特異的に認識される又は特異的に結合される短鎖ペプチド配列又はオリゴ糖から構成される。Ｔ細胞エピトープは、一般的に線状オリゴペプチドであることが示されている。同一の抗体により特異的に結合され得る場合、２つのエピトープは互いに対応する。２つのエピトープは、いずれもが同一のＢ細胞受容体又は同一のＴ細胞受容体に結合することができ、ある抗体がそのエピトープに結合することにより他のエピトープによる結合が実質的（例えば、他のエピトープによる結合の約３０％未満、好ましくは約２０％未満、及びより好ましくは約１０％、５％、１％、又は約０．１％未満）に阻害され得る場合、互いに対応する。 An “epitope” is a structure, usually composed of short peptide sequences or oligosaccharides that are specifically recognized or specifically bound by components of the immune system. T cell epitopes have generally been shown to be linear oligopeptides. Two epitopes correspond to each other if they can be specifically bound by the same antibody. Both epitopes can bind to the same B-cell receptor or the same T-cell receptor, and binding of one antibody to that epitope results in substantial binding by another epitope (eg, other Of less than about 30%, preferably less than about 20%, and more preferably less than about 10%, 5%, 1%, or about 0.1% of binding by the epitopes.
本明細書で使用するとき、配列又はそれらの相補鎖が同一のアミノ酸配列をコードする場合、２つの核酸コード配列は互いに「対応」する。 As used herein, two nucleic acid coding sequences “correspond” to each other if the sequences or their complementary strands encode the same amino acid sequence.
本明細書で使用するとき、手作業により、あるいは当該技術分野で常規のソフトウェアプログラムを使用して最大限にアラインメントした場合に、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域）は、別の配列に対し特定の割合（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有し、これは２つの配列の比較において同一である塩基（又はアミノ酸）の割合を意味する。 As used herein, a polynucleotide or polynucleotide region (or polypeptide or polypeptide region) when maximally aligned, either manually or using routine software programs in the art, A specific percentage relative to another sequence (eg, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 99% ), Which means the percentage of bases (or amino acids) that are identical in a comparison of two sequences.
既定の長さのＤＮＡ配列にわたって、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、及び好ましくは少なくとも約８０％、及び最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％のヌクレオチドが一致するとき、２つのヌクレオチド配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。同様にして、既定の長さのポリペプチド配列にわたって、ポリペプチドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、及び好ましくは少なくとも約８０％、及び最も好ましくは少なくとも約９０又は９５％又は９８％のアミノ酸残基が一致するとき、２つのポリペプチド配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用し、配列を比較することにより特定できる。同様に、実質的に相同な核酸配列は、例えば、特定の系に関し定義される通りの、厳密な条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において特定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の決定は、当該技術の範囲内である。例えば、厳密な条件は、「４２℃、５ｘＳＳＣ及び５０％ホルムアミド下でハイブリッド形成、並びに６０℃、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム下で洗浄」であり得る。 Over a given length of DNA sequence, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 75%, and preferably at least about 80%, and most preferably at least about 90 or 95% nucleotides When matched, the two nucleotide sequences are “substantially homologous” or “substantially similar”. Similarly, over a given length of polypeptide sequence, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 66%, at least about 70%, at least about 75% of the polypeptide, and preferably Two polypeptide sequences are “substantially homologous” or “substantially similar” when at least about 80% and most preferably at least about 90 or 95% or 98% of the amino acid residues match. Substantially homologous sequences can be identified by comparing the sequences using standard software available in the sequence databank. Similarly, substantially homologous nucleic acid sequences can be identified in Southern hybridization experiments under stringent conditions, eg, as defined for a particular system. Determination of appropriate hybridization conditions is within the skill of the art. For example, the exact conditions can be “hybridization at 42 ° C., 5 × SSC and 50% formamide, and wash under 60 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% sodium dodecyl sulfate”.
同様に、ドメイン配列の「保存的に改変された変異体」も提供され得る。特定の核酸配列に対して、用語「保存的に改変された変異体」は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、又は核酸は、本質的に同一である配列に対するアミノ酸配列はコードしない。具体的には、選択された１つ以上（又は全て）のコドンの第３番めの位置を、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換し、配列を作製することにより、縮重しているコドンを置換できる（Ｂａｔｚｅｒ，ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１〜９８）。 Similarly, “conservatively modified variants” of a domain sequence can also be provided. For a particular nucleic acid sequence, the term “conservatively modified variant” refers to a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, or the nucleic acids are amino acids relative to a sequence that is essentially identical. Does not code an array. Specifically, degenerate by replacing the third position of one or more (or all) selected codons with a mixed base and / or deoxyinosine residue and creating a sequence. (Batzer, et al, 1991, Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka, et al, 1985, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608; Rossolini et al, 1994, Mol. Cell. Probes 8: 91-98).
用語、野生型タンパク質の「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な等価物」、及び「機能性誘導体」は、活性の検出に好適なアッセイを使用して測定したときに野生型タンパク質の生物活性と少なくとも実質的に等価である（例えば、大幅に異ならない）生物活性を保有する剤を意味する。例えば、輸送ドメインを含む生物学的に活性な断片は、輸送ドメインを含む完全長のポリペプチドと同一の区画に共局在し得るものである。 The terms “biologically active fragment”, “biologically active form”, “biologically active equivalent”, and “functional derivative” of a wild-type protein are suitable for detecting activity. Means an agent that possesses a biological activity that is at least substantially equivalent to (eg, not significantly different from) the biological activity of the wild-type protein as measured using a simple assay. For example, a biologically active fragment containing a transport domain is one that can co-localize in the same compartment as a full-length polypeptide containing a transport domain.
細胞は、外来又は異種核酸が細胞の内側に導入されている場合、このような核酸により「形質転換」、「形質導入」、又は「形質移入」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに（共有結合により）組み込まれていても又はいなくてもよい。例えば、原核生物、酵母、及び哺乳類細胞では、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム成分に維持され得る。真核細胞では、安定的に形質転換させた細胞は形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれており、染色体の複製を介し娘細胞に遺伝する。この安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞集団から構成される細胞株又はクローンを樹立する能力により実証される。「クローン」は、有糸***によって単一細胞又は共通の祖先から派生した細胞の個体群である。「細胞株」は多数（例えば、少なくとも約１０）の世代にわたり生体外で安定的に増殖し得る初代細胞クローンである。 A cell has been “transformed”, “transduced” or “transfected” with such nucleic acid when foreign or heterologous nucleic acid has been introduced inside the cell. The transforming DNA may or may not be integrated (covalently) into the chromosomal DNA making up the cell's genome. For example, in prokaryotes, yeast, and mammalian cells, the transforming DNA can be maintained on an episomal component such as a plasmid. In eukaryotic cells, stably transformed cells have the transforming DNA integrated into the chromosome and are inherited by daughter cells through chromosome replication. This stability is demonstrated by the ability of eukaryotic cells to establish cell lines or clones composed of daughter cell populations containing transforming DNA. A “clone” is a population of cells derived from a single cell or common ancestor by mitosis. A “cell line” is a primary cell clone that can be stably propagated in vitro for many (eg, at least about 10) generations.
「レプリコン」は、生体内でのＤＮＡ複製に関係する自律性ユニットとして機能する、任意の遺伝子成分である（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）。 A “replicon” is any gene component that functions as an autonomous unit involved in DNA replication in vivo (eg, plasmid, chromosome, virus).
本明細書で使用するとき、「ウイルスベクター」は、生体内、生体外、又は試験管内のいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、ウイルス又はウイルス粒子を指す。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びこれに類するものなどが挙げられるがこれに限定されない。遺伝子の移動がアデノウイルスベクターにより介在される態様では、ベクターコンストラクトは、アデノウイルスゲノム又はそれらの部分と、アデノウイルスキャプシドタンパク質と関連させて選択された非アデノウイルス遺伝子と、を含む、ポリヌクレオチドを指す。 As used herein, a “viral vector” refers to a virus or viral particle that contains a polynucleotide that is delivered to a host cell either in vivo, in vitro, or in vitro. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, and the like. In embodiments where gene transfer is mediated by an adenoviral vector, the vector construct comprises a polynucleotide comprising an adenoviral genome or portion thereof and a non-adenoviral gene selected in association with an adenoviral capsid protein. Point to.
本明細書で使用するとき、「核酸送達ベクター」は、対象とするポリヌクレオチドを細胞に輸送し得る核酸分子である。好ましくは、このようなベクターは、調節可能なように発現調節配列に連結されたコード配列を含む。しかしながら、対象とするポリヌクレオチド配列は、必ずしもコード配列を含む必要はない。例えば、一態様では、対象とするポリヌクレオチド配列は、標的分子に結合するアプタマーである。他の態様では、対象とする配列は、制御配列の相補的配列であり、制御配列に結合して制御配列の制御を阻害する。更に別の態様では、対象とする配列は、制御配列そのものである（例えば、細胞において制御因子を捕捉し、阻害する）。 As used herein, a “nucleic acid delivery vector” is a nucleic acid molecule that can transport a polynucleotide of interest to a cell. Preferably, such vectors contain a coding sequence operably linked to expression control sequences. However, the polynucleotide sequence of interest need not necessarily include a coding sequence. For example, in one aspect, the polynucleotide sequence of interest is an aptamer that binds to a target molecule. In other embodiments, the sequence of interest is a complementary sequence of a control sequence and binds to the control sequence to inhibit control of the control sequence. In yet another aspect, the sequence of interest is the regulatory sequence itself (eg, captures and inhibits a regulatory factor in a cell).
本明細書で使用するとき、「核酸送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチド（例えば、遺伝子又は遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマー及び同様物など）を宿主細胞に運搬することができ、このような運搬が上記のような核酸送達ベクターと関連して生じる、任意の分子又は分子群又は巨大分子として定義される。 As used herein, a “nucleic acid delivery vehicle” can carry an inserted polynucleotide (eg, gene or gene fragment, antisense molecule, ribozyme, aptamer, and the like) to a host cell, Such transport is defined as any molecule or group of molecules or macromolecule that occurs in connection with a nucleic acid delivery vector as described above.
本明細書で使用するとき、「核酸送達」又は「核酸移動」は、導入に使用される方法は関係なく、外来性のポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子など）を宿主細胞に導入することを指す。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定的に又は一過性に維持され得る。安定的な維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞と適合性のある複製起点を含有するか、あるいは宿主細胞の染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）などのレプリコン又は核若しくはミトコンドリア染色体などに組み込まれるかのいずれかを必要とする。 As used herein, “nucleic acid delivery” or “nucleic acid transfer” refers to the introduction of an exogenous polynucleotide (eg, a transgene, etc.) into a host cell, regardless of the method used for the introduction. . The introduced polynucleotide can be stably or transiently maintained in the host cell. Stable maintenance typically involves the introduction of a polynucleotide in which the introduced polynucleotide is compatible with the host cell, or a replicon such as an extrachromosomal replicon (eg, a plasmid) of the host cell or nuclear or mitochondria. It needs to be integrated into a chromosome.
本明細書で使用するとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるか及び／又はペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのスプライシングを包含し得る。 As used herein, “expression” refers to the process by which a polynucleotide is transcribed into mRNA and / or translated into a peptide, polypeptide, or protein. If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression can include splicing of mRNA transcribed from genomic DNA.
本明細書で使用するとき、「転写調節下」又は「操作可能に連結される」は、ポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写又は翻訳）が、適切に近接する発現調節エレメント及びコード配列により調節されていることを指す。一態様では、ＤＮＡ配列は、発現制御配列がＤＮＡ配列の転写を調節及び制御するとき、発現制御配列に「操作可能に連結され」ている。 As used herein, “under transcriptional regulation” or “operably linked” is the expression of a polynucleotide sequence (eg, transcription or translation) regulated by appropriately adjacent expression control elements and coding sequences. It means being. In one aspect, a DNA sequence is “operably linked” to an expression control sequence when the expression control sequence regulates and controls transcription of the DNA sequence.
本明細書で使用するとき、「コード配列」は、適切な発現調節配列の調節下に配置されているときに、ポリペプチドに転写されかつ翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと、３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンとにより決定される。コード配列としては、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び更には合成ＤＮＡ配列を挙げることができるがこれらに限定されない。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列に対し３’に配置されることになる。 As used herein, a “coding sequence” is a sequence that is transcribed and translated into a polypeptide when placed under the control of appropriate expression control sequences. The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '(amino) terminus and a translation stop codon at the 3' (carboxyl) terminus. Coding sequences can include, but are not limited to, prokaryotic sequences, cDNA from eukaryotic mRNA, genomic DNA sequences from eukaryotic (eg, mammalian) DNA, and even synthetic DNA sequences. . A polyadenylation signal and transcription termination sequence will usually be located 3 'to the coding sequence.
本明細書で使用するとき、「遺伝子改変」は、細胞の通常のヌクレオチド配列の任意の付加又は欠失又は破壊を指す。ＡＰＣの遺伝子改変をなすことのできる方法であれば、本発明の趣旨及び範囲内のものである。当業者であれば認識される方法としては、ウイルスにより介在される遺伝子移動、リポソームにより介在される移動、形質転換、形質移入及び形質導入、例えば、ウイルスにより介在される遺伝子移動（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルス系ベクター、並びにレトロウイルス系ベクターの使用など）が挙げられる。 As used herein, “genetic modification” refers to any addition or deletion or destruction of the normal nucleotide sequence of a cell. Any method capable of genetic modification of APC is within the spirit and scope of the present invention. Methods recognized by those skilled in the art include virus-mediated gene transfer, liposome-mediated transfer, transformation, transfection and transduction, eg, virus-mediated gene transfer (adenovirus, adenovirus, DNA virus vectors such as associated viruses and herpes viruses, and the use of retrovirus vectors).
本明細書で使用するとき、「リソソーム／エンドソーム区画コンパートメント」は、膜内にＬＡＭＰ分子を含有する膜結合型酸性液胞、抗原プロセシングに機能する加水分解酵素、並びに抗原の認識及び提示のためのＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。 As used herein, a “lysosomal / endosomal compartment” is a membrane-bound acidic vacuole that contains LAMP molecules in the membrane, a hydrolase that functions for antigen processing, and for antigen recognition and presentation. Refers to MHC class II molecules.
このコンパートメントは、飲食作用、食作用、及び飲作用を含む任意の多様な機序により細胞表面から内部移行した外来物質、並びに特定の自己分解現象によりこの区画に送達された細胞内物質を分解するための部位として機能する（例えば、ｄｅ Ｄｕｖｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３９１，１９８３を参照されたい）。本明細書で使用するとき、用語「エンドソーム」は、リソソームを包含する。 This compartment breaks down foreign substances internalized from the cell surface by any of a variety of mechanisms, including food and drink, phagocytosis, and drinking, as well as intracellular substances delivered to this compartment by specific autolysis phenomena (See, for example, de Duve, Eur. J. Biochem. 137: 391, 1983). As used herein, the term “endosome” includes lysosomes.
本明細書で使用するとき、「リソソーム関連性細胞小器官」は、リゾチームを含む任意の細胞小器官を指し、このような細胞小器官としては、ＭＩＩＣ、ＣＵＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解性顆粒、血小板密顆粒、好塩基性顆粒、バーベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソーム、及びこれに類するものなどが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、このような細胞小器官は、マンノース６−リン酸受容体を含まず、ＬＡＭＰを含み、ただしＭＨＣクラスＩＩ分子は含む場合と含まない場合とがある。評価のために、例えば、Ｂｌｏｔｔ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２；Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ １４：１２６５〜１２７８，２０００を参照されたい。 As used herein, “lysosome-related organelle” refers to any organelle containing lysozyme, such as MIIC, CUV, melanosomes, secretory granules, lytic granules. , Platelet dense granules, basophilic granules, Verbeck granules, phagolysosomes, secretory lysosomes, and the like, but are not limited thereto. Preferably, such organelles do not contain a mannose 6-phosphate receptor, contain LAMP, but may or may not contain MHC class II molecules. For evaluation, see, for example, Blott and Griffiths, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, 2002; Dell'Angelica, et al, The FASEB Journal 14: 1265-1278,2000.
本明細書で使用するとき、「ＬＡＭＰポリペプチド」は、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ６３／ＬＡＭＰ−３、ＤＣ−ＬＡＭＰ、又は任意のリソソーム関連性膜タンパク質、又はホモログ、オルソログ、変異体（例えば、対立遺伝子変異体）及び改変形態（例えば、天然に生じる又は遺伝子操作による１つ以上の変異を含む）を指す。一態様では、ＬＡＭＰポリペプチドは、哺乳動物のリソソーム関連性膜タンパク質であり、例えば、ヒト又はマウスリソソーム関連性膜タンパク質である。更に一般的に、「リソソーム膜タンパク質」は、エンドソーム／リソソームコンパートメント又はリソソームに関連する細胞小器官の膜に見られるドメインを含み、更に筒状ドメインを含む、任意のタンパク質を指す。 As used herein, a “LAMP polypeptide” refers to LAMP-1, LAMP-2, CD63 / LAMP-3, DC-LAMP, or any lysosomal associated membrane protein, or homolog, ortholog, variant ( For example, allelic variants) and modified forms (eg, including one or more mutations that occur in nature or by genetic engineering). In one aspect, the LAMP polypeptide is a mammalian lysosome associated membrane protein, eg, a human or mouse lysosome associated membrane protein. More generally, a “lysosomal membrane protein” refers to any protein that contains a domain found in the membrane of an endosome / lysosome compartment or an organelle associated with a lysosome, and further contains a tubular domain.
本明細書で使用するとき、「標的とする」は、ポリペプチド配列が、本発明のキメラタンパク質を、抗原のプロセシング及びＭＨＣ ＩＩに対する結合が生じる好ましい部位（細胞小器官又はコンパートメントなど）に向かわせることを意味する。そのようなものとして、「標的ドメイン」は、細胞コンパートメント／細胞小器官の送達に必要とされる一連のアミノ酸を指す。好ましくは、標的ドメインは、アダプタ又はＡＰタンパク質（例えば、ＡＰ１、ＡＰ２、又はＡＰ３タンパク質など）に結合する配列である。標的ドメイン配列例は、例えば、Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，２０００に記載される。 As used herein, “targeting” causes a polypeptide sequence to direct the chimeric protein of the invention to a preferred site (such as an organelle or compartment) where antigen processing and binding to MHC II occurs. Means that. As such, “target domain” refers to a series of amino acids required for delivery of a cell compartment / organelle. Preferably, the target domain is a sequence that binds to an adapter or an AP protein (such as an AP1, AP2, or AP3 protein). Examples of target domain sequences are described, for example, in Dell'Angelica, 2000.
本明細書で使用するとき、生体内核酸送達、核酸移動、核酸療法、及びこれに類するものなどは、外来性ポリヌクレオチドを含むベクターを、ヒト又は非ヒト哺乳動物などの生物の体内に直接導入することにより、生体内で、外来性ポリヌクレオチドをこのような生物の細胞に導入することを指す。 As used herein, in vivo nucleic acid delivery, nucleic acid transfer, nucleic acid therapy, and the like, introduces a vector containing an exogenous polynucleotide directly into the body of an organism such as a human or non-human mammal. By doing so, it refers to introducing an exogenous polynucleotide into the cells of such an organism in vivo.
本明細書で使用するとき、用語「その場で（in situ）」は、ある種の生体内核酸送達を指し、この送達では、核酸は標的細胞に近接させて持ち込まれる（例えば、核酸は全身投与されない）。例えば、その場送達法としては、核酸を部位（例えば、腫瘍又は心筋などの組織）に直接的に注入すること、開腹部位を介し、核酸を細胞（１つ又は複数）又は組織と接触させること、あるいはカテーテルなどの医療用アクセス装置を使用して部位に核酸を送達すること、が挙げられるがこれに限定されない。 As used herein, the term “in situ” refers to a type of in vivo nucleic acid delivery in which the nucleic acid is brought in close proximity to the target cell (eg, the nucleic acid is systemically delivered). Not administered). For example, in situ delivery methods include injecting the nucleic acid directly into a site (eg, a tissue such as a tumor or myocardium), or contacting the nucleic acid with the cell (s) or tissue through the laparotomy site Or delivering the nucleic acid to the site using a medical access device such as a catheter, but is not limited thereto.
本明細書で使用するとき、用語「単離」及び「精製」は、折にふれて互換的に使用され、細胞構成要素、及びあるいは通常は天然において関連するポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそれらの断片中の構成要素からの分離を意味する。例えば、ポリヌクレオチドに対して、単離ポリヌクレオチドは、通常では染色体において関連付けられる５’及び３’配列から分離されている。当業者には明白であるとおり、天然に生じるものではないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はこれらの断片は、天然に生じるその他の分子から「単離」して識別する必要はない。更に、用語「単離」及び「精製」は、完全な単離及び完全な純度を意味しない。これらの用語は、ポリヌクレオチドなどに関連して天然において見いだされる、いくつかの又は全てのその他の物質からの部分的な及び完全な純度の両方を指すために使用される。したがって、これらの用語は、天然に関連する物質（例えば、ＲＮＡからのＤＮＡの単離又は精製）からの単離又は精製、一般的に同様に分類されるその他の分子のからの単離又は精製（例えば、特定のタンパク質は、サンプル中の全タンパク質と比較した場合に純度２０％を示す）、又は任意の組み合わせを意味し得る。単離及び精製は、１００％を包含する、約１％〜約１００％の任意の濃度を意味し得る。そのため、「単離」又は「精製」された細胞集団は、天然において関連する細胞及び物質を実質的に含まない。実質的に不含である、又は実質的に精製されたＡＰＣにより、細胞集団の少なくとも５０％がＡＰＣであることが意味され、天然において関連する非ＡＰＣ細胞のうち好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、及び更により好ましくは少なくとも９０％を不含有であることを意味する。言うまでもなく、当業者であれば、値の分数を含む全ての値は、本明細書において各々の具体的な値を記載せずともこれらの範囲内に包含されることを認識するであろう。簡潔さのため、各値は具体的には開示されないものの、各及び全ての具体的な値は本質的に開示されており、本明細書に包含されることは読者により理解されるであろう。 As used herein, the terms “isolation” and “purification” are sometimes used interchangeably and refer to cellular components, and / or polynucleotides, peptides, polypeptides, proteins that are normally associated in nature. Means separation from components in antibodies, or fragments thereof. For example, relative to a polynucleotide, an isolated polynucleotide is separated from 5 'and 3' sequences that are usually associated in the chromosome. As will be apparent to those skilled in the art, non-naturally occurring polynucleotides, peptides, polypeptides, proteins, antibodies, or fragments thereof need to be “isolated” and distinguished from other naturally occurring molecules. Absent. Furthermore, the terms “isolation” and “purification” do not imply complete isolation and complete purity. These terms are used to refer to both partial and complete purity from some or all other materials found in nature in relation to polynucleotides and the like. Thus, these terms refer to isolation or purification from naturally relevant materials (eg, isolation or purification of DNA from RNA), or from other molecules generally classified as well. (For example, a particular protein may indicate 20% purity when compared to the total protein in the sample), or any combination. Isolation and purification can mean any concentration from about 1% to about 100%, including 100%. As such, an “isolated” or “purified” cell population is substantially free of naturally associated cells and materials. By substantially free or substantially purified APC, it is meant that at least 50% of the cell population is APC, preferably at least 70% of the naturally associated non-APC cells, more preferably Means at least 80% free, and even more preferably at least 90% free. Of course, one of ordinary skill in the art will recognize that all values, including fractions of values, are included within these ranges without each specific value being recited herein. For brevity, each value is not specifically disclosed, but each and every specific value is essentially disclosed and will be understood by the reader to be included herein. .
本明細書で使用するとき、「標的細胞」又は「レシピエント細胞」は、各細胞、又は外来性核酸分子、ポリヌクレオチド、及び／若しくはタンパク質のレシピエントとして所望される又はレシピエントとされてきた細胞を指す。用語は、単一細胞の子孫を包含することも意図し、子孫は、天然、偶発的、又は計画的な変異に起因し、由来する親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的に、又は遺伝的に、又は全体的なＤＮＡ相補性において）ではなくてもよい。標的細胞は他の細胞と接触していてもよく（例えば、組織において見られるように）、又は生物の体内を循環していてもよい。 As used herein, a “target cell” or “recipient cell” has been desired or has been the recipient of each cell, or foreign nucleic acid molecule, polynucleotide, and / or protein. Refers to a cell. The term is also intended to encompass single cell progeny, which are due to natural, incidental or deliberate mutations and are not necessarily completely identical (morphologically or genetically) to the parent cell from which they are derived. Or in total DNA complementarity). Target cells may be in contact with other cells (eg, as found in tissue) or may circulate within the organism.
本明細書で使用するとき、用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、主要組織適合性複合体分子、又はその部分、あるいは１つ以上の非古典的ＭＨＣ分子、又はその部分と関連する抗原を表面上に提示する任意の細胞を意図する。好適なＡＰＣの例は以降に詳細に記載され、限定するものではないが、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、及びフォスター抗原提示細胞などのホールセルが挙げられる。 As used herein, the term “antigen-presenting cell” or “APC” refers to a major histocompatibility complex molecule, or portion thereof, or an antigen associated with one or more non-classical MHC molecules, or portion thereof. Intended for any cell that presents on the surface. Examples of suitable APCs are described in detail below and include, but are not limited to, whole cells such as macrophages, dendritic cells, B cells, hybrid APCs, and foster antigen presenting cells.
本明細書で使用するとき、「遺伝子操作された抗原提示細胞」は、表面上に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を指す。例えば、このような細胞は、天然には、表面上に共刺激分子を有していなくてもよく、あるいは、表面上に、天然の共刺激分子に加えて追加の人工共刺激分子を有してもよく、あるいは表面上に非天然のクラスＩＩ分子を発現してもよい。 As used herein, “genetically engineered antigen-presenting cell” refers to an antigen-presenting cell that has a non-natural molecular moiety on its surface. For example, such cells may naturally have no costimulatory molecules on the surface, or have additional artificial costimulatory molecules on the surface in addition to the natural costimulatory molecules. Or non-natural class II molecules may be expressed on the surface.
本明細書で使用するとき、用語「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合して免疫応答を介在することのできる細胞を指す。これらの細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、及び細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、例えば、腫瘍、炎症、又はその他の浸潤由来のＣＴＬ株、ＣＴＬクローン、及びＣＴＬが挙げられるがこれに限定されない。 As used herein, the term “immune effector cell” refers to a cell that can bind an antigen and mediate an immune response. These cells include T cells, B cells, monocytes, macrophages, NK cells, and cytotoxic T cells (CTL), such as CTL lines, CTL clones, and CTLs derived from tumors, inflammation, or other invasions. However, it is not limited to this.
本明細書で使用するとき、用語「対象」及び「患者」は、本発明の対象とされる動物を指すために互換的に使用される。用語「動物」は、ヒト及び非ヒト動物を包含するものと理解され、これらの２種は区別されることが望ましく、用語「ヒト」及び／又は「非ヒト動物」が使用される。実施形態では、対象又は患者は脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、マウス、サル、ヒト、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ）、競技動物（例えば、ウマ）、及び愛玩動物（例えば、イヌ及びネコ）が挙げられるがこれに限定されない。 As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably to refer to an animal that is the subject of the present invention. The term “animal” is understood to include human and non-human animals, and it is desirable to distinguish between these two species, and the terms “human” and / or “non-human animal” are used. In embodiments, the subject or patient is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human. Mammals include, but are not limited to, mice, monkeys, humans, farm animals (eg, cows, sheep, pigs), sport animals (eg, horses), and companion animals (eg, dogs and cats).
臨床的なアレルギー症状は当業者に既知のものであり、本願において網羅的に掲載する必要はない。非限定例としては、眼及び鼻の発赤及びかゆみ、鼻のかゆみ及び鼻汁、咳（coaching）、喘鳴、息切れ、掻痒、及び組織の膨張などの一般的な症状を示す皮膚、眼、鼻、上下気道における反応を含む、鼻炎、結膜炎、ぜんそく、じんま疹、湿疹が挙げられる。 Clinical allergic symptoms are known to those skilled in the art and need not be exhaustively listed in this application. Non-limiting examples include skin, eyes, nose, upper and lower showing general symptoms such as redness and itching of the eyes and nose, itching and nasal discharge of the nose, coughing, wheezing, shortness of breath, pruritus, and tissue swelling. Rhinitis, conjunctivitis, asthma, urticaria, eczema, including reactions in the respiratory tract.
「免疫学的生体内試験」の例は、皮膚パッチ試験（ＳＰＴ）、眼粘膜誘発試験（ＣＰＴ）、アレルゲンによる気管支誘発試験（ＢＣＡ）、並びに１つ以上のアレルギー症状が観察される各種臨床試験である。例えば、Ｈａｕｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．９１，Ｎｏ．３，ｐｐ ７０９〜７２２，Ｍａｒｃｈ １９９３を参照されたい。 Examples of “immunological in vivo tests” include skin patch test (SPT), ocular mucosal provocation test (CPT), bronchial provocation test with allergen (BCA), and various clinical tests in which one or more allergic symptoms are observed It is. See, for example, Haugaard et al, J Allergy Clin Immunol, Vol. 91, no. 3, pp 709-722, March 1993.
本明細書で使用するとき、用語「製薬学的に許容され得る担体」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、及びエマルジョン（水中油型又は油中水型エマルジョンなど）、及び各種湿潤剤などの当該技術分野において既知の任意の標準的な医薬担体を包含する。組成物には、安定剤及び保存料も含有させることができる。担体、安定剤、及び補助剤の例は、Ｍａｒｔｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｅｉ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ ＰｕｂＬ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照されたい。 As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier” includes phosphate buffered saline, water, and emulsions (such as oil-in-water or water-in-oil emulsions), and various wetting agents. Any standard pharmaceutical carrier known in the art. The composition may also contain stabilizers and preservatives. Examples of carriers, stabilizers, and adjuvants can be found in Martin Remington's Pharm. Sei. , 15th Ed. (Mack PubL Co., Easton (1975)).
本明細書で使用するとき、「治療に有効な量」は、本願において、異常な生理学的応答を予防、矯正及び／又は正常に戻すのに十分な量を意味するために使用される。一態様では、「治療に有効な量」は、臨床的に十分な病理的特徴、例えば、腫瘍体積の大きさ、抗体産生、サイトカイン産生、発熱又は白血球数、又はヒスタミン濃度などを少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減させるのに十分な量である。 As used herein, “therapeutically effective amount” is used herein to mean an amount sufficient to prevent, correct and / or restore an abnormal physiological response to normal. In one aspect, a “therapeutically effective amount” is at least about 30% of a clinically sufficient pathological characteristic such as tumor volume size, antibody production, cytokine production, fever or white blood cell count, or histamine concentration. More preferably an amount sufficient to reduce by at least 50%, most preferably by at least 90%.
「抗体」は、特異的なエピトープに結合する抗体及びそれらの断片を含む、任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、及びキメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖及び軽鎖可変及び超可変領域から構成される抗体分子の立体構造部分である。代表的な抗体分子は、未変化の免疫グロブリン分子、実質的に未変化の免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）部分などのパラトープを含有するこれらの免疫グロブリン分子の部分であり、部分は、本明細書に記載の治療方法に使用するのに好ましい。 An “antibody” is any immunoglobulin, including antibodies and fragments thereof that bind to a specific epitope. The term includes polyclonal, monoclonal, and chimeric antibodies (eg, bispecific antibodies). An “antibody binding site” is the conformational portion of an antibody molecule that is composed of heavy and light chain variable and hypervariable regions that specifically bind antigen. Exemplary antibody molecules are intact immunoglobulin molecules, substantially unchanged immunoglobulin molecules, and those containing paratopes such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 and F (v) moieties. A part of an immunoglobulin molecule, which part is preferred for use in the therapeutic methods described herein.
用語「口腔粘膜投与」は、活性成分の局所的又は全身的な作用を得る目的で、剤形を舌下又は口腔内のどこかしらに配置し、活性成分を患者の口腔又は咽頭粘膜に接触させる、投与経路を指す。口腔粘膜投与経路の例は舌下投与である。用語「舌下投与」は、活性成分の局所的又は全身的な作用を得る目的で、剤形を舌下に配置する、投与経路を指す。本明細書で使用するとき、用語「皮内送達」は、ワクチンを皮膚内の真皮に送達することを意味する。しかしながら、ワクチンをほとんど真皮のみに配置する必要はない。真皮は、ヒトの皮膚表面から約１．０〜約２．０ｍｍの場所に位置する層であるものの、個人間及び身体の異なる部位間においてその量は異なる。一般に、皮膚表面から１．５ｍｍ深部に進むことで真皮に到達することが見込まれ得る。真皮は、表面の角質層及び表皮と、皮下層との間に位置する。送達系式に応じ、ワクチンは、最終的に真皮内部のみに又は主に真皮内部に配置してよく、あるいは最終的に表皮及び真皮内部に分布させてもよい。 The term “oral mucosal administration” refers to placing the dosage form sublingually or elsewhere in the oral cavity and bringing the active ingredient into contact with the oral or pharyngeal mucosa of the patient for the purpose of obtaining a local or systemic effect of the active ingredient. Refers to the route of administration. An example of an oral mucosal route of administration is sublingual administration. The term “sublingual administration” refers to a route of administration in which the dosage form is placed under the tongue for the purpose of obtaining a local or systemic effect of the active ingredient. As used herein, the term “intradermal delivery” means delivering the vaccine to the dermis within the skin. However, it is not necessary to place the vaccine almost exclusively in the dermis. Although the dermis is a layer located about 1.0 to about 2.0 mm from the human skin surface, the amount varies between individuals and between different parts of the body. In general, it can be expected to reach the dermis by going 1.5 mm deep from the skin surface. The dermis is located between the stratum corneum and epidermis on the surface and the subcutaneous layer. Depending on the delivery system, the vaccine may eventually be placed only within or primarily within the dermis, or may ultimately be distributed within the epidermis and dermis.
本明細書で使用するとき、アレルギーの免疫療法の文脈において、用語「予防」、あるいはアレルギー患者に対し意図される治療介入を述べるその他の用語は、全患者の少なくとも２０％においてＩｇＥ応答を予防することを意味する。用語「予防」は、全患者においてＩｇＥ介在性疾患の発症を完全に予防することを意味するものではなく、このような定義は、アレルギー症状を低減させる機序を介してアレルギーを治療するための本発明の範囲外であり、当該技術分野における用語の用途に合致するものではない。アレルギー治療は、１００％の患者に１００％有効なものではないことは、アレルギーの免疫療法に関係する当業者に周知であり、そのため「予防」に関する絶対的な定義は、本発明の文脈において適用されない。当業者であれば、予防の概念は、本発明により想到される。 As used herein, in the context of allergy immunotherapy, the term “prevention” or other terms that describe a therapeutic intervention intended for allergic patients prevents an IgE response in at least 20% of all patients. Means that. The term “prevention” is not meant to completely prevent the development of IgE-mediated diseases in all patients, and such a definition is intended to treat allergies through a mechanism that reduces allergic symptoms. It is outside the scope of the present invention and does not conform to the use of terminology in the art. It is well known to those skilled in the art of allergy immunotherapy that allergy treatment is not 100% effective in 100% patients, so the absolute definition of “prevention” applies in the context of the present invention. Not. For those skilled in the art, the concept of prevention is conceived by the present invention.
本発明は、ポリ核酸、ポリアミノ酸、並びにポリ核酸及びポリアミノ酸を必要としている対象を治療する方法を提供する。概して、細胞内で産生され、ポリ核酸を投与された対象の体内で防御免疫応答を誘導するアレルゲン製配列（ポリアミノ酸）のための、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）ワクチンとして、ポリ核酸を見なすことができる。投与されたとき、ポリ核酸は、好ましくはＭＨＣ−ＩＩ経路により細胞性免疫反応を誘起し、ＩｇＥ抗体、顆粒球（例えば、好酸球）、及びその他の物質の産生に関与するＴｈ２型の応答よりも、ＡＰＣ、ＮＫ細胞、及びＴ細胞によるインターフェロンの産生を用いるアレルゲン特異的１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）の細胞応答を活性化することにより、ＩｇＧ抗体を産生する。ある程度、ＭＨＣ−ＩＩ及びＭＨＣ−Ｉ応答の両方を生成させ得るものの、本発明は、主に又は実質的にＭＨＣ−ＩＩの応答をもたらす。好ましくは、核酸は抗生物質耐性遺伝子をコードしない。
The present invention provides polynucleic acids, polyamino acids, and methods of treating a subject in need of polynucleic acids and polyamino acids. Generally, polynucleic acids are considered as nucleic acid (eg, DNA, RNA) vaccines for allergen sequences (polyamino acids) that are produced intracellularly and induce a protective immune response in the body of a subject administered the polynucleic acid. be able to. When administered, the polynucleic acid induces a cellular immune response, preferably via the MHC-II pathway, and a Th2-type response that is involved in the production of IgE antibodies, granulocytes (eg, eosinophils), and other substances. Rather, IgG antibodies are produced by activating the cellular response of allergen-
本発明は、少なくとも部分的に、特定の構造的な及びひいては機能的な組み合わせの認識に基づくものであり、構成要素は、核酸ワクチン及びコードされるアレルゲンに有利な特性を提供し、当業界で未だ実現されていない、安全なアレルギー治療を可能にする。独立実施形態として、並びに独立実施形態の２つ以上の特徴が組み合わせられた実施形態として、単剤投与型として理解されることことが意図される本発明の各種実施形態では、組み合わせには、ＭＨＣ ＩＩタンパク質を有するリソソームにアレルゲンアミノ酸配列を移動させるためのリソソーム輸送ドメインの使用が包含される。そうすることで、アレルゲン配列に対するＩｇＥ応答ではなく、主にＩｇＧ応答が行われるようになる。更には、独立実施形態、又は実施形態の組み合わせは、天然に生じるエピトープの三次元構造をもたらすアミノ酸配列をコードさせるのに十分な長さの核酸配列を含有するコンストラクトを提供する。好ましい実施形態では、核酸配列は、完全長のアレルゲンコード配列を提供／コードするものの、アレルゲン配列に関連して天然に生じる任意のシグナルペプチド配列は非存在である。他の実施形態では、核酸配列は少なくとも１つのアレルゲン性領域をコードするが、完全長のアレルゲンタンパク質はコードしない（同様に、天然にシグナル配列が存在する場合には、このシグナル配列も非存在である）。当該技術分野では、免疫応答はエピトープの一次配列に対し生じ得るものであると認識されるが、本発明は、好ましくは、コードされているエピトープに対しＭＨＣ−ＩＩ免疫応答を生じさせるための核酸ワクチンは、少なくともアレルゲン性配列がプロセシングのためリソソームに送達される際に、アレルゲン性エピトープを含む領域に適切な三次元ペプチド構造をもたらすのに十分な配列データをコードする核酸コンストラクトを使用するものであると認識する。任意の特定の分子理論に制限されるものではないが、適切な立体構造にフォールディングされたタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをエンドソームに送達することで、免疫応答のためのアレルゲン性エピトープのプロセシング及び提示が改良されると考えられる。 The present invention is based, at least in part, on the recognition of specific structural and thus functional combinations, and the components provide advantageous properties for nucleic acid vaccines and encoded allergens in the art. Enables safe allergy treatment that has not yet been realized. In various embodiments of the invention that are intended to be understood as a single agent dosage form, as an independent embodiment, and as an embodiment in which two or more features of the independent embodiment are combined, the combination includes MHC The use of a lysosomal transport domain to transfer an allergen amino acid sequence to a lysosome with a II protein is included. By doing so, an IgG response mainly occurs instead of an IgE response to the allergen sequence. Furthermore, independent embodiments, or combinations of embodiments, provide a construct containing a nucleic acid sequence of sufficient length to encode an amino acid sequence that results in the three-dimensional structure of a naturally occurring epitope. In a preferred embodiment, the nucleic acid sequence provides / encodes the full length allergen coding sequence, but any naturally occurring signal peptide sequence associated with the allergen sequence is absent. In other embodiments, the nucleic acid sequence encodes at least one allergenic region, but does not encode a full-length allergen protein (also, if a signal sequence is naturally present, this signal sequence is also absent). is there). Although it is recognized in the art that an immune response can be generated against the primary sequence of an epitope, the present invention preferably uses a nucleic acid to generate an MHC-II immune response against the encoded epitope. A vaccine uses a nucleic acid construct that encodes sufficient sequence data to provide an appropriate three-dimensional peptide structure in a region containing an allergenic epitope, at least when the allergenic sequence is delivered to the lysosome for processing. Recognize that there is. Without being limited to any particular molecular theory, processing and presentation of allergenic epitopes for immune responses by delivering proteins, polypeptides, or peptides folded into the appropriate conformation to endosomes Will be improved.
単独で、又は組み合わせられた実施形態の一部として実施することのできる更に別の実施形態例によると、単一のコンストラクトから複数のアレルゲンの発現がもたらされる。これまでに、アレルゲンに対して防御的な核酸ワクチンを効果的に産生及び使用できることが示されたことはない。本発明は、アレルゲンに対して有効な核酸ワクチンを提供するだけでなく、更に、同時に複数のアレルゲンに対して有効な核酸ワクチンを提供する。アレルゲンは、同一種（例えば、単一の植物）由来のアレルゲンであってよく、あるいは２つ以上の種（例えば、樹木、花、食品など）由来のアレルゲンであってよい。上記の通り、完全長のアレルゲン配列を使用でき（アレルゲンに天然に関連付けられる任意のシグナル配列が非存在）、あるいはアレルゲン性部分を使用できる。複数のアレルゲン配列を含むコンストラクトにおいて、完全長又はトランケート型のアレルゲン配列の任意の組み合わせを使用することができる。更に、他の実施形態と同様、各アレルゲン配列に関し天然に生じるシグナル配列を除去する（すなわち、各アレルゲン配列に関し天然に生じるシグナル配列がコンストラクトに存在しない）ことは好ましい。 Yet another example embodiment that can be implemented alone or as part of a combined embodiment results in the expression of multiple allergens from a single construct. To date, it has never been shown that nucleic acid vaccines that are protective against allergens can be produced and used effectively. The present invention not only provides a nucleic acid vaccine effective against allergens, but also provides a nucleic acid vaccine effective against multiple allergens simultaneously. Allergens may be allergens from the same species (eg, a single plant) or may be allergens from more than one species (eg, trees, flowers, food, etc.). As described above, full-length allergen sequences can be used (there is no signal sequence naturally associated with the allergen), or allergenic portions can be used. Any combination of full length or truncated allergen sequences can be used in a construct comprising multiple allergen sequences. Furthermore, as in other embodiments, it is preferred to remove the naturally occurring signal sequence for each allergen sequence (ie, the naturally occurring signal sequence for each allergen sequence is not present in the construct).
アレルゲンドメイン内で、別個のアレルゲン性配列のためにシグナル配列を使用すると、核酸コンストラクトの機能に悪影響が生じることが判明しているものの、核酸ワクチンコンストラクト内でシグナル配列領域又はドメインを使用することは重要な特徴であることが判明している。そのため、実施形態では、核酸ワクチンは、コードされているペプチドを膜に及び膜を通して配置するためにシグナル配列ドメイン内に少なくとも１つのシグナル配列を含有する。シグナル配列のアミノ酸配列はコンストラクト間で変化し得るものであり、任意の既知のシグナル配列が選択され得るものの、好ましい実施形態では、シグナル配列が存在し、かつアレルゲン配列（１つ又は複数）のコード配列とインフレームで提供されることが判明している。単一のシグナル配列の使用は、コードされている完全なキメラタンパク質を、膜に及び膜を通して配置するのに適切である。そのため、各アレルゲン配列のシグナル配列は必要ではなく、実際に、免疫細胞表面上のアレルゲンエピトープの適切な局在、プロセシング及び発現に悪影響を及ぼすことが判明している。 Although it has been found that the use of signal sequences for distinct allergenic sequences within an allergen domain adversely affects the function of the nucleic acid construct, the use of signal sequence regions or domains within a nucleic acid vaccine construct It turns out to be an important feature. Thus, in an embodiment, the nucleic acid vaccine contains at least one signal sequence within the signal sequence domain to place the encoded peptide into and through the membrane. Although the amino acid sequence of the signal sequence can vary from construct to construct and any known signal sequence can be selected, in a preferred embodiment the signal sequence is present and the code for the allergen sequence (s) It has been found to be provided in sequence and in frame. The use of a single signal sequence is appropriate for placing the entire encoded chimeric protein into and through the membrane. Thus, a signal sequence for each allergen sequence is not necessary and in fact has been shown to adversely affect the proper localization, processing and expression of allergen epitopes on the immune cell surface.
更には、特定の実施形態及び実施形態の組み合わせにおいて、細胞表面で提示させるためにポリペプチドをユニットへと分解する前のエンドソームにおける時間も含め、ポリペプチドを細胞質からエンドソームに移動させる間にアレルゲン配列を隔離又は物理的に保護することは、本発明に従う有用な核酸ワクチンの提供において重要な要素となり得ることが判明している。そのため、一般に、本発明は、アレルゲン配列を保護するために細胞小器官内安定化ドメイン（ＩＯＳＤ）を含むコンストラクトを包含する。 Furthermore, in certain embodiments and combinations of embodiments, allergen sequences during transfer of a polypeptide from the cytoplasm to the endosome, including time in the endosome before degrading the polypeptide into units for presentation on the cell surface. It has been found that sequestering or physically protecting can be an important factor in providing useful nucleic acid vaccines according to the present invention. Thus, in general, the invention encompasses constructs that include an organelle stabilization domain (IOSD) to protect allergen sequences.
本発明の核酸は、少なくとも次のドメイン、シグナル配列ドメイン、細胞小器官内安定化ドメイン、アレルゲンドメイン（単一のアレルゲン又は２つ以上のアレルゲンを含んでよく、各々１つ以上のアレルゲン性エピトープを含む）、膜貫通ドメイン、及び細胞質リソソーム／エンドソーム標的ドメインを含む。各種ドメインは、単一のキメラ上に又は遺伝子操作された核酸上に存在する。各種ドメインは、当該技術分野で既知でありかつ広く実施されている任意の配置順で組み合わせることができる。好ましい実施形態では、ドメインは、キメラタンパク質をコードする単一の翻訳領域を含むよう組み合わせられかつ配置され、翻訳領域は、転写に関係する構成要素に操作可能に連結されており、キメラタンパク質を発現させるのに十分なものである。したがって、核酸は、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター、又は同様物などの発現ベクターであり得る。好ましくは、核酸は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞において発現させるのに好適な、転写に関係する構成要素を含む。このような発現ベクター構成要素及び発現ベクターは、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００４／０１５７３０７号により例示されるとおり、当該技術分野で既知であり、かつ広く使用されている。本発明に従う核酸コンストラクトの作製に使用するためのプラスミド骨格の非限定例は、本明細書において、折に触れて「ｐＩＴＩ」プラスミドとして参照され、この配列は配列番号１として提供される。 The nucleic acid of the present invention includes at least the following domain, signal sequence domain, organelle stabilization domain, allergen domain (a single allergen or two or more allergens, each containing one or more allergenic epitopes). ), A transmembrane domain, and a cytoplasmic lysosome / endosome targeting domain. The various domains are present on a single chimera or on a genetically engineered nucleic acid. The various domains can be combined in any order of arrangement known and widely practiced in the art. In a preferred embodiment, the domains are combined and arranged to contain a single translation region encoding a chimeric protein, the translation region being operably linked to a transcriptional component and expressing the chimeric protein. It is enough to make it. Thus, the nucleic acid can be an expression vector such as a plasmid, phagemid, viral vector, or the like. Preferably, the nucleic acid comprises a transcriptional component suitable for expression in a mammalian cell such as a human cell. Such expression vector components and expression vectors are known and widely used in the art, as exemplified by US Patent Application Publication No. 2004/0157307, which is incorporated herein by reference. . A non-limiting example of a plasmid backbone for use in making a nucleic acid construct according to the present invention is occasionally referred to herein as a “pITI” plasmid, the sequence of which is provided as SEQ ID NO: 1.
本発明の核酸の構成例３つを、図１、３及び４に概略する。図１は、コードされるキメラタンパク中に、単一のエピトープを含む単一のアレルゲンが包含されるドメインの、配列配置を示す。図３は、単一のアレルゲンの複数の異なるエピトープが、アレルゲンドメイン内にコードされるキメラタンパク質に含有されるドメインの、配列配置を示す。２つのエピトープは、同一の読み枠中にあり、かつひいてはいずれもがキメラタンパク質の一部として産生されるよう配置される。標準的な分子生物学的手法を使用して、エピトープドメイン内の同一の読み枠に、３つ以上のエピトープが提供され得ることは、当業者であれば直ちに認識されるであろう。図４は、２つの異なるアレルゲンがアレルゲンドメイン内に存在するドメインの、配列配置を示す。言うまでもなく、当業者であれば、各々のアレルゲン配列が１つ又は複数のアレルゲンエピトープを含有し得ることは認識するであろう。本発明の核酸の実施形態のこれらの３つの略図をもとに、読者は、任意の数の供給源由来の任意の数のアレルゲン、並びに含有する任意の数のエピトープを、アレルゲンドメイン内に含有させることができ、並びに標準的な分子生物学手法を使用し、インフレームで連結させることができることを直ちに認識されるであろう。 Three structural examples of the nucleic acid of the present invention are schematically shown in FIGS. FIG. 1 shows the sequence arrangement of a domain that includes a single allergen containing a single epitope in the encoded chimeric protein. FIG. 3 shows the sequence arrangement of domains contained in a chimeric protein in which multiple different epitopes of a single allergen are encoded within the allergen domain. The two epitopes are in the same reading frame and are thus arranged so that both are produced as part of the chimeric protein. Those skilled in the art will readily recognize that three or more epitopes can be provided in the same reading frame within an epitope domain using standard molecular biology techniques. FIG. 4 shows the sequence arrangement of domains in which two different allergens are present in the allergen domain. Of course, one skilled in the art will recognize that each allergen sequence may contain one or more allergen epitopes. Based on these three schematics of the nucleic acid embodiments of the invention, the reader contains any number of allergens from any number of sources, as well as any number of epitopes contained within the allergen domain. It will be readily appreciated that can be made as well as linked in-frame using standard molecular biology techniques.
図２は、一般的に、図１に概略される本発明の実施形態に関連する、本発明の一実施形態に従う核酸のベクターマップ（「ｐＩＴＩ−ＣＲＹ Ｊ２−ＬＡＭＰ」；場合により、本明細書において「ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰ」とも参照される）を示す。ベクター又は送達ビヒクルには、ｐＵＣ複製起点と、コードされるタンパク質を産生させるための各種翻訳及び発現構成要素とを有するプラスミド骨格が含まれる。より詳細には、ｐＩＴＩ骨格配列（配列番号１）を含有する。本発明の好ましい実施形態に従い、核酸コンストラクトは、抗生物質耐性遺伝子を含有しないことにも留意されたい。核酸は、シグナル配列及び細胞小器官内安定化ドメインを含有するヒトＬＡＭＰタンパク質のＮ末端領域を含む、コードされているタンパク質のための配列を更に含む。核酸は、ＬＡＭＰタンパク質のＮ末端領域にインフレームで融合させたＣｒｙＪ２アレルゲン配列（シグナル配列が非存在である）を含みコードされているタンパク質のための配列を、更に提供する。核酸は、膜貫通領域及び標的領域を含有するヒトＬＡＭＰタンパク質のＣ末端領域の部分をコードする配列を更に含む。ＣＲＹ Ｊ２−ＬＡＭＰキメラタンパク質配列のコード領域を配列番号２として提供する。ＣＲＹ Ｊ２−ＬＡＭＰキメラタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３として提供する。 FIG. 2 is a nucleic acid vector map (“pITI-CRY J2-LAMP”) according to one embodiment of the invention, generally related to the embodiment of the invention outlined in FIG. 1; Are also referred to as “CRYJ2-LAMP”). Vectors or delivery vehicles include a plasmid backbone having a pUC origin of replication and various translation and expression components to produce the encoded protein. More particularly, it contains the pITI backbone sequence (SEQ ID NO: 1). It should also be noted that according to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid construct does not contain an antibiotic resistance gene. The nucleic acid further comprises a sequence for the encoded protein, including the N-terminal region of the human LAMP protein containing a signal sequence and an organelle stabilization domain. The nucleic acid further provides a sequence for the encoded protein comprising a CryJ2 allergen sequence (in which the signal sequence is absent) fused in frame to the N-terminal region of the LAMP protein. The nucleic acid further includes a sequence that encodes a portion of the C-terminal region of the human LAMP protein that contains a transmembrane region and a target region. The coding region of the CRY J2-LAMP chimeric protein sequence is provided as SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence of the CRY J2-LAMP chimeric protein is provided as SEQ ID NO: 3.
例示的な実施形態では、本発明は、ＣｒｙＪ１アレルゲンを含む、その他のＣ．ジャポニカ（C. japonica）アレルゲンの送達及び発現のための核酸コンストラクトにも関する。同様のプラスミド骨格を使用して、ｐＩＴＩ−ＣＲＹＪ１−ＬＡＭＰコンストラクトが作成されている。キメラタンパク質は、ＭＨＣ ＩＩ型免疫応答を誘導し得る。ｐＩＴＩ−ＣＲＹＪ１−ＬＡＭＰコンストラクトのためのコード領域を配列番号４として示す。ＣＲＹ Ｊ１−ＬＡＭＰキメラタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５として示す。 In an exemplary embodiment, the invention relates to other C.I. containing CryJ1 allergens. It also relates to nucleic acid constructs for the delivery and expression of C. japonica allergens. A pITI-CRYJ1-LAMP construct has been created using a similar plasmid backbone. The chimeric protein can induce an MHC type II immune response. The coding region for the pITI-CRYJ1-LAMP construct is shown as SEQ ID NO: 4. The amino acid sequence of the CRY J1-LAMP chimeric protein is shown as SEQ ID NO: 5.
図３及び４に示すとおり、アレルゲンドメインには、複数のアレルゲン性エピトープを有するアレルゲンを１つ含有させることができ、あるいは複数のアレルゲン（各々が１つ以上のアレルゲン性エピトープを有する）を含有させることができる。図５は、アレルゲンドメインがアレルゲン性配列を２つ含有する核酸コンストラクトの特定の例示的な実施形態の、ベクターマップを示す。本例示的な実施形態では、アレルゲンドメインはインフレームで、かつＮ末端でＬＡＭＰシグナル配列ドメイン及び細胞小器官内安定化ドメインと融合させたＣ．ジャポニカ（C. japonica）のＣｒｙＪ１及びＣｒｙＪ２アレルゲン（各々天然のシグナル配列は非存在）を含有する。ＣｒｙＪ１−ＣｒｙＪ２配列も、Ｃ末端において、ＬＡＭＰ膜貫通ドメイン及び標的ドメインと融合される。キメラタンパク質のためのコード領域の完全なヌクレオチド配列は、配列番号６として表される。コードされるキメラタンパク質の完全なアミノ酸配列は配列番号７として示し、配列中、残基１〜２７はキメラタンパク質のシグナル配列を表し、残基２８〜３８０は細胞小器官内安定化ドメインを表し（ヒトＬＡＭＰから採用された配列）、残基３８１及び３８２はリンカーを表し、残基３８３〜７３５はＣｒｙＪ１のコード領域を表し（シグナル配列は除く）、残基７３６〜７４１はリンカー領域を表し、残基７４２〜１２３２はＣｒｙＪ２アレルゲンのコード領域を表し、残基１２３３〜１２３４はリンカー領域を表し、残基１２３５〜１２５８は膜貫通及び標的ドメインを表し、並びに残基１２５９〜１２７０は追加のＣ末端残基を表す。 As shown in FIGS. 3 and 4, the allergen domain can contain one allergen having a plurality of allergenic epitopes, or can contain a plurality of allergens (each having one or more allergenic epitopes). be able to. FIG. 5 shows a vector map of a specific exemplary embodiment of a nucleic acid construct in which the allergen domain contains two allergenic sequences. In this exemplary embodiment, the allergen domain is C. cerevisiae fused in-frame and N-terminally with the LAMP signal sequence domain and the organelle stabilization domain. It contains the C. japonica CryJ1 and CryJ2 allergens, each with no natural signal sequence. The CryJ1-CryJ2 sequence is also fused at the C-terminus with the LAMP transmembrane domain and the target domain. The complete nucleotide sequence of the coding region for the chimeric protein is represented as SEQ ID NO: 6. The complete amino acid sequence of the encoded chimeric protein is shown as SEQ ID NO: 7, in which residues 1-27 represent the signal sequence of the chimeric protein and residues 28-380 represent the organelle stabilization domain ( Sequences adopted from human LAMP), residues 381 and 382 represent linkers, residues 383-735 represent the coding region of CryJ1 (excluding the signal sequence), residues 736-741 represent the linker region, and the rest Groups 742-1232 represent the coding region of the CryJ2 allergen, residues 1231 to 1234 represent the linker region, residues 1235 to 1258 represent the transmembrane and target domains, and residues 1259 to 1270 represent additional C-terminal residues. Represents a group.
本発明の核酸コンストラクトでは、協調的に産生され得るアレルゲンの数は本質的に無限である。そのため、２、３、４、５、６、１０、２０、又はそれ以上の異なるアレルゲン（同一供給源又は異なる供給源の組み合わせに由来）を、本発明の核酸コンストラクトに含有させることができる。図６Ａは、本発明の実施形態に従う別の例示的な核酸のベクターマップを示す。ベクター又は送達ビヒクルには、ｐＵＣ複製起点と、コードされるタンパク質を産生させるための各種翻訳及び発現構成要素とを有するプラスミド骨格が含まれる。骨格は、必須ではないものの、配列番号１のｐＩＴＩ骨格とすることができる。核酸は、シグナル配列ドメイン及び細胞小器官内安定化ドメインを含有するヒトＬＡＭＰタンパク質のＮ末端領域を含む、コードされているタンパク質のための配列を更に含む。核酸は、落花生アレルゲンポリタンパク質ＡｒａＨ１／ＡｒａＨ２／ＡｒａｆＢを含む、コードされているキメラタンパク質の配列を更に提供する。核酸は、膜貫通領域及び標的領域を含有するヒトＬＡＭＰタンパク質のＣ末端領域の部分をコードする配列を更に含有する。キメラタンパク質のコード領域のヌクレオチド配列は、配列番号８として提供される。図６Ａのベクターによりコードされるキメラタンパク質を、図６Ｂに概略的に表す（配列番号９として）。 In the nucleic acid construct of the present invention, the number of allergens that can be produced cooperatively is essentially unlimited. Thus, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, or more different allergens (derived from the same source or a combination of different sources) can be included in the nucleic acid construct of the present invention. FIG. 6A shows another exemplary nucleic acid vector map according to an embodiment of the invention. Vectors or delivery vehicles include a plasmid backbone having a pUC origin of replication and various translation and expression components to produce the encoded protein. The skeleton is not essential, but can be the pITI skeleton of SEQ ID NO: 1. The nucleic acid further comprises a sequence for the encoded protein, including the N-terminal region of the human LAMP protein containing a signal sequence domain and an organelle stabilization domain. The nucleic acid further provides the sequence of the encoded chimeric protein comprising the peanut allergen polyprotein AraH1 / AraH2 / ArafB. The nucleic acid further contains a sequence that encodes a portion of the C-terminal region of the human LAMP protein that contains a transmembrane region and a target region. The nucleotide sequence of the coding region of the chimeric protein is provided as SEQ ID NO: 8. The chimeric protein encoded by the vector of FIG. 6A is schematically represented in FIG. 6B (as SEQ ID NO: 9).
本発明の核酸中に存在するドメインは、コードされているキメラタンパク質により提供される機能に関し以降に詳述される。本発明の実施は、任意の特定の核酸又はタンパク質配列に依存せず、あるいはこれにより制限されず、むしろ、コンストラクトに利点及び特性をもたらす構成要素及びドメインの組み合わせであることは理解されるであろう。同様に、コードされるタンパク質の物理的及び機能的特徴の文脈において議論されるとき、あるいはその逆について議論されるとき、各種核酸コンストラクトのドメインに関する記載であることも理解される。核酸又はタンパク質のいずれかの物理的及び機能的特徴については、当業者に十分に開示される。コンピューター及び遺伝子暗号の縮重を使用して、既知のタンパク質配列をコードする、可能性のある全ての核酸分子にたどり着くこと、並びに核酸によりコードされるタンパク質にたどり着くことは簡単である。したがって、特定のタンパク質配列の物理的又は機能的特徴の参照により、当業者には、物理的又は機能的特徴と関連付けられる、可能性のある全ての核酸配列が、並びにその逆も同様に、直ちに開示される。 The domains present in the nucleic acids of the invention are detailed below with respect to the function provided by the encoded chimeric protein. It will be understood that practice of the invention does not depend on or be limited by any particular nucleic acid or protein sequence, but rather is a combination of components and domains that provide advantages and properties to the construct. Let's go. Similarly, when discussed in the context of the physical and functional characteristics of the encoded protein, it is also understood that when describing the opposite, it is a description of the domains of the various nucleic acid constructs. The physical and functional characteristics of either nucleic acids or proteins are fully disclosed to those skilled in the art. Using the degeneracy of the computer and the genetic code, it is easy to arrive at all possible nucleic acid molecules that encode known protein sequences and to reach the protein encoded by the nucleic acid. Thus, by reference to the physical or functional characteristics of a particular protein sequence, one of ordinary skill in the art will immediately be aware of all possible nucleic acid sequences associated with physical or functional characteristics, and vice versa. Disclosed.
同様に、２つ以上の核酸分子又は配列を設計及び組み合わせて、本発明に従うキメラタンパク質をコードする配列にたどり着くことは十分当業者の範囲内である。同様に、転写及び翻訳制御配列を選択及び組み合わせて、所望されるとおりに生体内又は試験管内でコード配列及びキメラタンパク質を発現させる能力も、十分に当業者の範囲内である。したがって、これらの一般的に使用される手法は、本発明の実施を可能にするために本明細書において詳細に議論する必要はない。 Similarly, it is well within the skill of the art to design and combine two or more nucleic acid molecules or sequences to arrive at a sequence encoding a chimeric protein according to the present invention. Similarly, the ability to select and combine transcription and translation control sequences to express coding sequences and chimeric proteins in vivo or in vitro as desired is well within the skill of the art. Accordingly, these commonly used techniques need not be discussed in detail herein to enable the practice of the present invention.
本発明の核酸はシグナル配列ドメインを含む。シグナル配列ドメインは、コードされるキメラタンパク質を外部環境及び内部環境の境界を区別する生体膜に挿入するために提供される、シグナル配列を含有する。同様に、シグナル配列は、タンパク質を外部環境から内部環境に移動させる。シグナル配列の一般的な構造は当業者に周知であり、特定のシグナル配列の数多くの例の通りのものである。当業者は、本発明の範囲内の各実施形態の各種選択パラメータに従って、自由に任意の適切なシグナル配列を選択する。例示的な実施形態では、シグナル配列は、キメラタンパク質を小胞体に移動させる配列である。この接合点では、シグナル配列ドメインが、シグナル配列を含有するキメラタンパク質の唯一の部分であることには留意されたい。そのため、アレルゲンに関しアレルゲンドメイン内に属する天然に生じるシグナル配列は、アレルゲン配列をコンストラクトに包含させるより前に除去される。これらのそれぞれのシグナル配列を除去することで、生体内におけるコンストラクトの全体的な性能が向上することが判明している。 The nucleic acids of the present invention include a signal sequence domain. The signal sequence domain contains a signal sequence that is provided to insert the encoded chimeric protein into a biological membrane that distinguishes the boundary between the external environment and the internal environment. Similarly, the signal sequence moves the protein from the external environment to the internal environment. The general structure of a signal sequence is well known to those skilled in the art and is as many examples of specific signal sequences. Those skilled in the art are free to select any suitable signal sequence according to the various selection parameters of each embodiment within the scope of the present invention. In an exemplary embodiment, the signal sequence is a sequence that moves the chimeric protein to the endoplasmic reticulum. Note that at this junction, the signal sequence domain is the only part of the chimeric protein containing the signal sequence. Thus, the naturally occurring signal sequence that belongs to the allergen domain with respect to the allergen is removed before the allergen sequence is included in the construct. It has been found that removal of each of these signal sequences improves the overall performance of the construct in vivo.
本発明の核酸は、細胞小器官内安定化ドメイン（ＩＯＳＤ）を含有する。ＩＯＳＤは、キメラタンパク質がエンドソーム／リソソームコンパートメントにたどり着くより前に、化学結合によりアレルゲンドメイン中の１つ以上の配列に結合し、これらの配列を分解（例えば、タンパク質分解）から保護するアミノ酸配列をコードする配列を含む。本質的に、ＩＯＳＤは、これらの配列、詳細には、アレルゲン性エピトープ配列を、タンパク質分解酵素、低ｐＨ、及びその他のタンパク質不安定化させる物質及び条件から保護する、アレルゲンドメイン配列のための保護キャップとして想定され得る。ＩＯＳＤは、任意の数の既知の又は遺伝子操作された配列であってよく、ＬＡＭＰポリペプチド筒状ドメイン、並びに非常にグリコシル化された膜貫通型タンパク質であり、後期エンドソームタンパク質としてマクロファージ及びマクロファージ様細胞で発現されるマクロシアリン／ＣＤ６８タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＯＳＤの重要な特徴は、ＩＯＳＤは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が不変異体ペプチドから放出されるまでの間、アレルゲンドメインに結合し、かつタンパク質分解から保護し得るというものである。この方法では、アレルゲン性エピトープ（１つ又は複数）の立体構造は、相互作用に関し活性なＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子が利用可能となるまでの間保存される。好ましい実施形態では、ＩＯＳＤは、リソソームタンパク質の配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様では、ＩＯＳＤは、限定するものではないがマクロシアリン／ＣＤ６８などのＬＡＭＰポリペプチド筒状ドメイン以外のタンパク質又はポリペプチドである。 The nucleic acids of the present invention contain an organelle stabilizing domain (IOSD). IOSD encodes an amino acid sequence that binds to one or more sequences in the allergen domain by chemical bonds and protects these sequences from degradation (eg, proteolysis) before the chimeric protein reaches the endosomal / lysosomal compartment. Containing sequences to In essence, IOSD protects these sequences, in particular allergenic epitope sequences, from proteolytic enzymes, low pH, and other protein destabilizing substances and conditions, protection for allergen domain sequences. Can be envisioned as a cap. IOSDs can be any number of known or genetically engineered sequences, are LAMP polypeptide cylindrical domains, and highly glycosylated transmembrane proteins, macrophages and macrophage-like cells as late endosomal proteins Macrosialin / CD68 protein expressed in, but not limited to. An important feature of IOSD is that it can bind to the allergen domain and protect against proteolysis until the MHC class II molecule is released from the invariant peptide. In this method, the conformation of the allergenic epitope (s) is conserved until an active MHC class II molecule becomes available for interaction. In a preferred embodiment, the IOSD comprises all or part of the lysosomal protein sequence. In some embodiments, the IOSD is a protein or polypeptide other than a LAMP polypeptide cylindrical domain such as, but not limited to, macrosialin / CD68.
本発明の核酸コンストラクトはアレルゲンドメインを含む。アレルゲンドメインは、１つ以上のアレルゲン性エピトープを含むアレルゲンタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする１つ以上の配列を含む。アレルゲンドメインは、アレルゲンに存在するシグナル配列を含有しない。数多くのタンパク質性のアレルゲンが当該技術分野において既知であり、いずれか１つ、あるいはアレルゲン及び／又はアレルゲン性エピトープの組み合わせを、本発明に従って使用できる。完全長に満たないアレルゲン性配列が使用される場合、好ましくは、アレルゲン性タンパク質内のそれらの天然の位置との関連において、完全長アレルゲンタンパク質の１つ以上のエピトープが提供される。より詳細には、本発明は、改良された核酸ワクチンを提供し、ワクチンは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子がコンピテントとなってキメラタンパク質上のエピトープと結合するまでの間、３次元構造を保持又は実質的に保持するキメラタンパク質コードする。この方法では、一般的に適切な３次元構造を失っているＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子の短鎖ペプチドを送達させた場合と比較して、改良された免疫応答を誘導できる。したがって、元々アレルゲンタンパク質上に存在する場合、アレルゲンドメインが、１つ以上のエピトープを含有する比較的長鎖のアミノ酸配列をコードすることは好ましい。 The nucleic acid construct of the present invention contains an allergen domain. An allergen domain includes one or more sequences encoding an allergen protein, polypeptide, or peptide that includes one or more allergenic epitopes. Allergen domains do not contain signal sequences present in allergens. Numerous proteinaceous allergens are known in the art, and any one or a combination of allergens and / or allergenic epitopes can be used in accordance with the present invention. Where less than full length allergenic sequences are used, preferably one or more epitopes of the full length allergen protein are provided in the context of their natural location within the allergenic protein. More particularly, the present invention provides improved nucleic acid vaccines that retain or maintain a three-dimensional structure until the MHC class II molecule becomes competent and binds to an epitope on the chimeric protein. Encodes a chimeric protein that is retained This method can induce an improved immune response compared to the delivery of short peptides of MHC class II molecules that generally have lost the proper three-dimensional structure. Thus, when originally present on an allergen protein, it is preferred that the allergen domain encode a relatively long amino acid sequence containing one or more epitopes.
アレルゲンドメインには、２つ以上のアレルゲンを含有させることができ、各々は１つ以上のアレルゲン性エピトープを含有する。ある種のアレルゲン性タンパク質が２つ以上のエピトープを含有することは既知である。本発明の好ましい実施形態は、アレルゲン性タンパク質の、完全なアレルゲン性コード領域（すなわち、シグナル配列を含まないコード領域）、あるいはそれらの大部分を使用することから、特定のアレルゲンドメインは、天然に生じる関連性において２つ以上のエピトープを含有することになる。あるいは、２つ以上の既知のエピトープを１つのコード領域中に融合させることができる。更には、例示的な実施形態では、２つ以上のアレルゲン性タンパク質、又はそれらのアレルゲン性の領域は、アレルゲンドメイン中に存在する。２つ以上のエピトープが単一のエピトープドメイン中に存在するよう遺伝子操作されている場合、エピトープは同一の抗原性タンパク質に由来するものであり得る。あるいは、それらは同一種の２つの異なるタンパク質に由来するものであり得る。更には、それらは異なる２種の同一タンパク質に由来するものであり得る。更に、それらは２つ以上の異種由来の２つ以上の異なるタンパク質に由来するものであり得る。本質的に、同種又は異種由来の同一又は異なるタンパク質由来のエピトープの任意の組み合わせが本発明により想到される。同様に、各種アレルゲン及びエピトープの順番は、考えられる場合の数だけ変更することができる。複数種由来のアレルゲン性タンパク質及び／又はアレルゲン性ペプチドを組み合わせることで、複数のアレルゲンに基づく単一のアレルゲン性生物（例えば、特定の樹木種）のアレルギー用の治療、並びに複数のアレルゲンに基づく複数のアレルゲン性（例えば、１年の同じ季節の間に胞子を放出する複数の植物）のアレルギー用の治療を提供し得るロバストな核酸ワクチンを作製することができる。単一の核酸ワクチン由来の複数のアレルギーと対抗する能力については現在も証明されていない。 An allergen domain can contain more than one allergen, each containing one or more allergenic epitopes. It is known that certain allergenic proteins contain more than one epitope. Since preferred embodiments of the present invention use the entire allergenic coding region of the allergenic protein (ie, the coding region that does not include a signal sequence), or a majority of them, a particular allergen domain is naturally It will contain more than one epitope in the resulting association. Alternatively, two or more known epitopes can be fused into one coding region. Furthermore, in an exemplary embodiment, two or more allergenic proteins, or allergenic regions thereof, are present in the allergen domain. Where two or more epitopes are genetically engineered to exist in a single epitope domain, the epitopes can be from the same antigenic protein. Alternatively, they can be derived from two different proteins of the same species. Furthermore, they can be derived from two different identical proteins. Furthermore, they can be derived from two or more different proteins from two or more different species. In essence, any combination of epitopes from the same or different proteins of the same or different origin is contemplated by the present invention. Similarly, the order of the various allergens and epitopes can be changed as many as possible. By combining allergenic proteins and / or allergenic peptides derived from multiple species, treatment for allergies of a single allergenic organism (eg, a specific tree species) based on multiple allergens, and multiple based on multiple allergens Robust nucleic acid vaccines can be made that can provide treatment for allergies of allergenicity (eg, multiple plants that release spores during the same season of the year). The ability to combat multiple allergies from a single nucleic acid vaccine is not yet proven.
本発明の核酸コンストラクトは、膜貫通ドメインを更に含む。膜貫通ドメインは周知であり、生体膜の両面に部分的に存在するタンパク質の物理的及び機能的構成要素がよく特徴付けられている。本質的に、膜貫通ドメインは、アミノ酸の線状配列であり、天然の状態で一般的に疎水性又は親油性であり、タンパク質を生体膜に係留するよう機能する。一般的に、このような配列は長さにして２０〜２５残基である。当業者であれば、このような配列を良好に認識し、かつ本発明において使用するのに好適な膜貫通配列を容易に得ることができ、又は設計できる。 The nucleic acid construct of the present invention further comprises a transmembrane domain. Transmembrane domains are well known and the physical and functional components of proteins that are partially present on both sides of biological membranes are well characterized. In essence, a transmembrane domain is a linear sequence of amino acids that is generally hydrophobic or lipophilic in nature and functions to anchor proteins to biological membranes. Generally, such sequences are 20-25 residues in length. One skilled in the art can readily recognize or design such a transmembrane sequence that is well recognized for such sequences and suitable for use in the present invention.
上記の構成要素に加えて、本発明の核酸は標的ドメインを含む。標的ドメインは、エンドソーム／リソソームコンパートメントのため、コードされるキメラタンパク質を標的とするよう機能するアミノ酸配列をコードする配列である。同一性において限定されないものの、好ましい実施形態では、標的ドメインは、ＬＡＭＰポリペプチド、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ−３、ＬＩＭＰ ＩＩ、ＥＮＤＯＬＹＮ、又はマクロシアリン／ＣＤ６８のＣ末端細胞質標的配列を含む。 In addition to the above components, the nucleic acids of the invention include a target domain. A targeting domain is a sequence that encodes an amino acid sequence that functions to target the encoded chimeric protein for the endosomal / lysosomal compartment. Although not limited in identity, in preferred embodiments, the target domain comprises a C-terminal cytoplasmic target sequence of LAMP polypeptide, DC-LAMP, LAMP2, LAMP-3, LIMP II, ENDLYN, or macrosialin / CD68.
一実施形態では、本発明の核酸は、アレルゲンドメインの一部として配列番号２の配列（すなわち、シグナル配列を含まないＣｒｙ Ｊ２ヌクレオチド配列）、あるいは配列番号３をコードする別の配列（すなわち、シグナル配列を含まないＣｒｙ Ｊ２タンパク質配列）を、アレルゲンドメイン中に含む。配列番号２は、シグナル配列（すなわち、配列番号２）は除外してＣｒｙ Ｊ２（クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）の花粉に見られるペクチン酸リアーゼ）の完全長のタンパク質コード配列をコードするヌクレオチドから構成される。Ｃｒｙ Ｊ２が、ヒマラヤスギ花粉の存在する地域における季節性及び通年性アレルギーと関連することは当該技術分野において周知である。ヒマラヤスギ林付近の地域に住んでいるアレルギー患者においては、Ｃｒｙ Ｊ２に特異的なＩｇＥが一般に見られる。本開示の一部として提供される配列表において、存在する場合、各アレルゲンのシグナル配列が記載されていることには留意されたい。本発明のコンストラクトの文脈の範囲内で、これらのシグナル配列は存在しないことは理解されるであろう。 In one embodiment, the nucleic acid of the invention comprises a sequence of SEQ ID NO: 2 (ie, a Cry J2 nucleotide sequence that does not include a signal sequence) as part of an allergen domain, or another sequence that encodes SEQ ID NO: 3 (ie, a signal Cry J2 protein sequence without sequence) is included in the allergen domain. SEQ ID NO: 2 is from a nucleotide encoding the full-length protein coding sequence of Cry J2 (a pectate lyase found in Cryptomeria japonica pollen), excluding the signal sequence (ie, SEQ ID NO: 2). Composed. It is well known in the art that Cry J2 is associated with seasonal and perennial allergies in areas where cedar pollen is present. IgE specific to Cry J2 is commonly found in allergic patients living in the area near the cedar forest. It should be noted that in the sequence listing provided as part of this disclosure, the signal sequence for each allergen, if present, is listed. It will be understood that these signal sequences are not present within the context of the construct of the present invention.
他の実施形態では、核酸は配列番号４（すなわち、シグナル配列を含まないＣｒｙ Ｊ１ヌクレオチド配列）の配列、あるいは配列番号５（すなわち、シグナル配列を含まないＣｒｙ Ｊ２タンパク質配列）をコードする別の配列を含む。更なる他の実施形態では、核酸は、それぞれ、配列番号２及び配列番号４の両方の配列、又は配列番号３及び配列番号５をコードするその他の配列を含む。一実施形態では、核酸は本明細書で開示されるその他の配列を１つ以上含み、例えばそれらの配列は、次のアレルゲンのうちのいずれかをコードする：Ｃｒｙ Ｊ３（Ｃｒｙ Ｊ３．８；Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）；配列番号１０；シグナル配列は残基１〜２６）、ＣＪＰ−４（Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）：配列番号１１）、ＣＪＰ−６（Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）：配列番号１２）、ＣＪＰ−８（Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）：配列番号１３；シグナル配列は残基１〜３５）、ＣＰＡ６３（Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）；配列番号１４；シグナル配列は残基１〜２０）、ＣＪＰ３８（Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）：配列番号１５；シグナル配列は残基１〜２８）、Ｃｈａ ｏ １（Ｃ．オブツセ（C. obtuse）；配列番号１６；シグナル配列は残基１〜２１）、Ｊｕｎ ａ １（Ｊ．アセイ（J. ashei）；配列番号１７；シグナル配列は残基１〜２１）、Ｊｕｎ ｖ １（Ｊ．バージニアナ（J. virginiana）：配列番号１８；シグナル配列は残基１〜２１）、Ｃｕｐ ａ １（Ｈ．アリゾニカ（H. arizonica）；配列番号１９；シグナル配列は残基１〜２１）、Ｊｕｎ ｏ １（Ｊ．オキシセドラス（J. oxycedrus）；配列番号２０；シグナル配列は残基１〜２１）、Ｃｕｐ ｓ １（Ｃ．セムパービレンス（C. sempervirens）；配列番号２１；シグナル配列は残基１〜２１）Ｃｈａ ｏ ２（Ｃ．オブツセ（C. obtuse）；配列番号２２；シグナル配列は残基１〜２２）、Ｊｕｎ ａ ２（Ｊ．アセイ（J. ashei）；配列番号２３；シグナル配列は残基１〜２２）、Ｃｕｐ ａ ２（Ｈ．アリゾニカ（H. arizonica）；配列番号２４）、Ｊｕｎ ａ ３（Ｊ．アセイ（J. ashei）；配列番号２５；シグナル配列は残基１〜１６）、Ｊｕｎ ｒ ３（Ｊ．リジダ（J. rigida）；配列番号２６；シグナル配列は残基１〜２６）、Ｃｕｐ ｓ ３（Ｃ．セムパービレンス（C. sempervirens）；配列番号２７；シグナル配列は残基１〜２６）、Ｃｕｐ ａ ３（Ｈ．アリゾニカ（H. arizonica）；配列番号２８）、Ｃｈ４Ａ（Ｐ．モンチコラ（P. monticola）；配列番号２９；シグナル配列は残基１〜２５）、Ｃｈ４−１（Ｐ．メンジエシイ（P. menziesii）；配列番号３０；シグナル配列は残基１〜２６）、ＰＴ−１（Ｐ．タエダ（P. taeda）；配列番号３１）、及びＬＴＰ（Ｐ．アビエス（P. abies）；配列番号３２；シグナル配列は残基１〜２５）。配列番号を参照することにより掲載されていない核酸及びアミノ酸配列も公的に利用可能である。コンピュータープログラムを実装し核酸配列に基づき本発明に従うタンパク質配列にたどり着くことは大して難しいことではない。言うまでもなく、これらのタンパク質配列に対し生化学的に相同の配列は、これらの実施形態により包含される。例えば、開示される配列に対し、３０％以上、例えば、４０％以上、５０％以上、７５％以上、９０％又は９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を示す配列が、これらの実施形態により包含される。このコンセプトは、本明細書で開示されるアレルゲンの特定の配列だけでなく、本明細書で提供されるすべてのタンパク質及び核酸配列に適用されることは理解されるであろう。更に、上記のように、開示される範囲内の各値は、本開示により具体的に包含されることは理解される。 In other embodiments, the nucleic acid is a sequence of SEQ ID NO: 4 (ie, a Cry J1 nucleotide sequence that does not include a signal sequence), or another sequence that encodes SEQ ID NO: 5 (ie, a Cry J2 protein sequence that does not include a signal sequence). including. In still other embodiments, the nucleic acid comprises the sequences of both SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, or other sequences encoding SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, respectively. In one embodiment, the nucleic acid comprises one or more of the other sequences disclosed herein, eg, the sequences encode any of the following allergens: Cry J3 (Cry J3.8; C SEQ ID NO: 10; the signal sequence is residues 1-26), CJP-4 (C. japonica: SEQ ID NO: 11), CJP-6 (C. japonica (C. japonica)). japonica): SEQ ID NO: 12), CJP-8 (C. japonica): SEQ ID NO: 13; the signal sequence is residues 1-35), CPA63 (C. japonica); SEQ ID NO: 14; Signal sequence is residues 1-20), CJP38 (C. japonica: SEQ ID NO: 15; signal sequence is residues 1-28), Cha o 1 (C. obtuse); SEQ ID NO: 16; signal sequence is Groups 1-21), Jun a 1 (J. ashei; SEQ ID NO: 17; signal sequence is residues 1-21), Jun v 1 (J. virginiana): SEQ ID NO: 18 The signal sequence is residues 1 to 21), Cup a 1 (H. arizonica); SEQ ID NO: 19; the signal sequence is residues 1 to 21), Jun o 1 (J. oxycedrus) SEQ ID NO: 20; signal sequence is residues 1-21; Cups 1 (C. sempervirens); SEQ ID NO: 21; signal sequence is residues 1-21) Cha o 2 (C. obtuse (C obtuse); SEQ ID NO: 22; signal sequence is residues 1-22), Jun a 2 (J. ashei); SEQ ID NO: 23; signal sequence is residues 1-22), Cup a 2 (H ．Arizonica (SEQ ID NO :) 24), Jun a 3 (J. ashei; SEQ ID NO: 25; signal sequence is residues 1-16), Jun r 3 (J. rigida); SEQ ID NO: 26; signal sequence is Residues 1-26), Cups 3 (C. sempervirens; SEQ ID NO: 27; signal sequence is residues 1-26), Cupa 3 (H. arizonica); SEQ ID NO: 28 ), Ch4A (P. P. monticola; SEQ ID NO: 29; signal sequence is residues 1-25; Ch4-1 (P. menziesii; SEQ ID NO: 30; signal sequence is residues 1-26), PT- 1 (P. taeda; SEQ ID NO: 31), and LTP (P. abies; SEQ ID NO: 32; the signal sequence is residues 1-25). Nucleic acid and amino acid sequences not listed by reference to SEQ ID NOs are also publicly available. It is not very difficult to implement a computer program and arrive at the protein sequence according to the present invention based on the nucleic acid sequence. Of course, sequences that are biochemically homologous to these protein sequences are encompassed by these embodiments. For example, a sequence exhibiting 30% or more, eg, 40% or more, 50% or more, 75% or more, 90% or 95% or more, 98% or more, or 99% or more identity to the disclosed sequence, Included by these embodiments. It will be appreciated that this concept applies to all protein and nucleic acid sequences provided herein, not just the specific sequences of allergens disclosed herein. Further, as described above, it is understood that each value within the disclosed range is specifically encompassed by the present disclosure.
本発明の具体例において、アレルゲンドメイン内に配列番号２、又は配列番号３をコードする別の配列を含むＤＮＡワクチンが提供される。日本赤杉アレルギーに関係する重要な所見が見られる患者にこのようなワクチンが投与されるとき、ワクチンにより、アレルゲンＣｒｙ Ｊ２（配列番号３内に示される）を含む融合又はキメラ（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）タンパク質のデノボ合成が得られる。キメラタンパク質上に存在するドメインの組み合わせにより、タンパク質は小胞体からエンドリソソーム経路に誘導され、結果として、融合タンパク質のＭＨＣビヒクル中エピトープへのプロセシングが生じ、その内のいくつかはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、液性免疫応答の増強をもたらす。 In embodiments of the invention, a DNA vaccine is provided that comprises SEQ ID NO: 2 or another sequence encoding SEQ ID NO: 3 within the allergen domain. When such a vaccine is administered to a patient with significant findings related to Japanese red cedar allergy, the vaccine will cause a fusion or chimera containing the allergen Cry J2 (shown in SEQ ID NO: 3) (these terms are De novo synthesis of the protein (used interchangeably herein) is obtained. The combination of domains present on the chimeric protein directs the protein from the endoplasmic reticulum to the endolysosomal pathway, resulting in processing of the fusion protein to an epitope in the MHC vehicle, some of which are converted to MHC class II molecules. Combines, resulting in an enhanced humoral immune response.
本発明の別の例では、アレルゲンドメイン内に配列番号４の配列、又は配列番号５をコードする別の配列を含むＤＮＡワクチンが提供される。日本赤杉アレルギーに関係する重要な所見が見られる患者にこのようなワクチンが投与されるとき、ワクチンにより、アレルゲンＣｒｙ Ｊ１（配列番号４の配列内に見られる）を含む融合又はキメラ（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）タンパク質のデノボ合成が得られる。キメラタンパク質上に存在するドメインの組み合わせにより、タンパク質は小胞体からエンドリソソーム経路に誘導され、結果として、融合タンパク質のＭＨＣビヒクル中エピトープへのプロセシングが生じ、その内のいくつかはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、液性免疫応答の増強をもたらす。 In another example of the invention, a DNA vaccine is provided that comprises the sequence of SEQ ID NO: 4 or another sequence encoding SEQ ID NO: 5 within the allergen domain. When such a vaccine is administered to a patient with significant findings related to Japanese red cedar allergy, the vaccine will cause a fusion or chimera containing allergen Cry J1 (found within the sequence of SEQ ID NO: 4) De novo synthesis of the protein is obtained (the terms are used interchangeably herein). The combination of domains present on the chimeric protein directs the protein from the endoplasmic reticulum to the endolysosomal pathway, resulting in processing of the fusion protein to an epitope in the MHC vehicle, some of which are converted to MHC class II molecules. Combines, resulting in an enhanced humoral immune response.
本発明の別の例では、アレルゲンドメイン内に配列番号６を含むＤＮＡワクチンが提供される。日本赤杉アレルギーに関係する重要な所見が見られる患者にこのようなワクチンが投与されるとき、ワクチンにより、アレルゲンＣｒｙＪ１及びＣｒｙ Ｊ２（配列番号７）を含む融合又はキメラ（これらの用語は本明細書において互換的に使用される）タンパク質のデノボ合成が得られる。キメラタンパク質上に存在するドメインの組み合わせにより、タンパク質は小胞体からエンドリソソーム経路に誘導され、結果として、融合タンパク質のＭＨＣビヒクル中エピトープへのプロセシングが生じ、その内のいくつかはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、液性免疫応答の増強をもたらす。 In another example of the invention, a DNA vaccine comprising SEQ ID NO: 6 within the allergen domain is provided. When such a vaccine is administered to a patient with significant findings related to Japanese red cedar allergy, the vaccine will cause a fusion or chimera containing allergens CryJ1 and CryJ2 (SEQ ID NO: 7) A de novo synthesis of the protein (used interchangeably in the book). The combination of domains present on the chimeric protein directs the protein from the endoplasmic reticulum to the endolysosomal pathway, resulting in processing of the fusion protein to an epitope in the MHC vehicle, some of which are converted to MHC class II molecules. Combines, resulting in an enhanced humoral immune response.
本発明の別の例では、Ｊｕｎ ａ １（ジュニペラス・アセイ（Juniperus ashei）族に属するペクチン酸リアーゼ）の配列をコードする完全長のタンパク質をコードする核酸が、アレルゲンドメインに提供される。Ｊｕｎ ａ １はＣｒｙ Ｊ１と高度の配列同一性を示し、いずれもがＣｒｙ Ｊ１に対し類似する酵素活性を保持し、既知のエピトープにおいて高い類似性を保有する。 In another example of the present invention, a nucleic acid encoding a full-length protein encoding the sequence of Jun a 1 (a pectate lyase belonging to the Juniperus ashei family) is provided in the allergen domain. Jun a 1 shows a high degree of sequence identity with Cry J1, all possessing similar enzymatic activity to Cry J1, and possess high similarity in known epitopes.
その他のポリペプチドがＣｒｙ Ｊ１に対し交差反応性であることは既知であり、この交差反応性は、ペクチン酸リアーゼファミリーのポリペプチドの酵素活性に関連するエピトープが共通することに起因する。このファミリーはヒノキ（Japanese cypress）（カマエキパリス・オブツサ（Chamaecyparis obtusa）（Ｃｈ ｏ １））の主要なアレルゲンを含み、ジュニペラス・アセイ（Juniperus ashei）（Ｊｕｎ ａ １）、ジュニペラス・バージニアナ（Juniperus virginiana）（Ｊｕｎ Ｖ １）、キュプレッサス・アリゾニカ（Cuppressus arizonica）（Ｃｕｐ ａ １）、ジュニペラス・オキシセドラス（Juniperus oxycedrus）（Ｊｕｎ ｏ １）、及びキュプレッサス・セムパービレンス（Cupressus sempervirens）（Ｃｕｐ ｓ １）由来のアレルゲンを含む。文献中に、アレルギー患者間で、ヒマラヤスギ科（イトスギ属（Cupressus））由来の花粉に対する強い交差反応性が存在することが観察されている。以下の表Ｉには、関連するタンパク質間の交差反応性の強度を示す表を掲載する。本発明は、Ｃｒｙ Ｊ１及びＣｒｙ Ｊ２に関して詳述するものの、本明細書及び特に表Ｉにおいて開示されるアレルゲンのうちの１つ以上に加えて、あるいはその代替として、Ｃｒｙ Ｊ１及びＣｒｙ Ｊ２配列を使用できることは理解されるであろう。 It is known that other polypeptides are cross-reactive with Cry J1, and this cross-reactivity is attributed to the common epitope associated with the enzymatic activity of the pectate lyase family of polypeptides. This family contains the major allergens of Japanese cypress (Chamaecyparis obtusa (Ch o 1)), Juniperus ashei (Jun a 1), Juniperus virginiana (Jun V 1), Cuppressus arizonica (Cup a 1), Juniperus oxycedrus (Jun o 1), and Cupressus sempervirens (Cup s 1) . It has been observed in the literature that there is a strong cross-reactivity among allergic patients to pollen from the cedar family (Cupressus). Table I below lists a table showing the strength of cross-reactivity between related proteins. The present invention is described in detail with respect to Cry J1 and Cry J2, but uses Cry J1 and Cry J2 sequences in addition to or as an alternative to one or more of the allergens disclosed herein and particularly in Table I. It will be understood that it can be done.
コード領域のヌクレオチド配列を、異なるコード領域（すなわち、融合部位）のヌクレオチド配列に挿入するための特定部位は、その他のものと比較してより望ましいことは当業者には周知である。アレルゲン配列の位置は教示されており、例えば、図１〜５は、本発明において教示される組成物を使用するのに望ましい位置として教示される。アレルゲン配列の位置を、ＬＡＭＰポリペプチドの筒状ドメイン又はその他の細胞小器官内安定化ドメイン内などの他の位置に移動させることも本発明の範囲内である。しかしながら、アレルゲンは、膜貫通又は細胞質ドメインのいずれかのコード領域内に配置させないことが好ましい。本発明の好ましい例では、ＬＡＭＰポリペプチドの筒状ドメインの膜貫通ドメイン接合部からアミノ酸５残基内及びＬＡＭＰポリペプチド筒状ドメインの５’Ｎ末端の最大でアミノ酸２０残基内に、アレルゲン配列が挿入される。 It is well known to those skilled in the art that specific sites for inserting a nucleotide sequence of a coding region into a nucleotide sequence of a different coding region (ie, a fusion site) are more desirable than others. The location of allergen sequences is taught, for example, FIGS. 1-5 are taught as desirable locations for using the compositions taught in the present invention. It is within the scope of the present invention to move the position of the allergen sequence to other positions, such as in the cylindrical domain of the LAMP polypeptide or in other organelle stabilization domains. However, it is preferred not to place the allergen within the coding region of either the transmembrane or cytoplasmic domain. In a preferred example of the present invention, the allergen sequence is within 5 amino acid residues from the transmembrane domain junction of the cylindrical domain of the LAMP polypeptide and within a maximum of 20 amino acid residues at the 5 ′ N-terminus of the LAMP polypeptide cylindrical domain. Is inserted.
本発明の核酸は、精製又は単離分子として提供できる。核酸は、組成物の一部として提供することもできる。組成物は本質的に核酸から構成することができ、すなわち核酸は、コード配列を発現させるのに好適な組成物中の唯一の核酸である。あるいは、組成物は本発明の核酸を含み得る。例示的な実施形態では、組成物は、本発明の核酸と、１つ以上の製薬学的に許容され得る物質又は担体とを含む医薬組成物である。一部の実施態様では、組成物は、細胞による核酸の取り込みを促進する物質を含む。一部の実施態様では、組成物は、核酸の、免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）などの特定の細胞型への送達を補助する、標的分子を含む。一実施形態では、核酸は、核酸を細胞又は組織に送達するための送達ビヒクル又は送達ベクターの一部である。 The nucleic acids of the invention can be provided as purified or isolated molecules. The nucleic acid can also be provided as part of the composition. The composition can consist essentially of nucleic acid, ie the nucleic acid is the only nucleic acid in the composition that is suitable for expressing the coding sequence. Alternatively, the composition can comprise a nucleic acid of the invention. In an exemplary embodiment, the composition is a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid of the invention and one or more pharmaceutically acceptable substances or carriers. In some embodiments, the composition comprises a substance that facilitates uptake of nucleic acids by the cell. In some embodiments, the composition includes a target molecule that assists in the delivery of the nucleic acid to a particular cell type, such as an immune cell (eg, APC). In one embodiment, the nucleic acid is part of a delivery vehicle or delivery vector for delivering the nucleic acid to a cell or tissue.
本発明の特定例では、組成物は、２種のＤＮＡワクチンの混合物を含み、１種のワクチンは１種のアレルゲンに関係する配列を含み、かつ他方のワクチンは別のアレルゲンに関係する配列を含む。２種のワクチンコンストラクトは、１：１、１：２、１：３、１：４から、順次最大１：１０比で一緒に混合することができる。好ましい比は１：１である。 In a specific example of the invention, the composition comprises a mixture of two DNA vaccines, one vaccine contains a sequence related to one allergen and the other vaccine contains a sequence related to another allergen. Including. The two vaccine constructs can be mixed together in a sequential ratio of 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4 up to 1:10. A preferred ratio is 1: 1.
本発明の特定の例では、Ｃｒｙ Ｊ１、Ｃｒｙ Ｊ２、及び／又はＪｕｎ ａ２の核酸は、核酸送達ベクター内に存在する。本発明の好ましい実施形態では、核酸送達ベクターは、米国特許出願公開第２００８／００６５５４号により教示される核酸送達ベクター、あるいは米国特許出願公開第２００６／００３１４８号において開示される又はこれの結果として得られるベクターなどの抗生物質耐性遺伝子を含有しない。本発明の特定の例では、核酸はアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターである。 In particular examples of the invention, the Cry J1, Cry J2, and / or Jun a2 nucleic acids are present in a nucleic acid delivery vector. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid delivery vector is a nucleic acid delivery vector taught by US Patent Application Publication No. 2008/006554, or disclosed in or obtained as a result of US Patent Application Publication No. 2006/003148. Does not contain antibiotic resistance genes such as In particular examples of the invention, the nucleic acid is a viral vector such as an adenoviral vector.
核酸及び組成物は新規のものであり、患者におけるアレルギー応答を低減させるのに有用である。例えば、核酸及び組成物は、日本赤杉の花粉に関連する、あるいはホモログの花粉又はアレルゲンに由来する例示的なアレルギー応答を示す患者において、花粉症を低減させるのに有用である。別の非限定例としては、核酸は、落花生又はその他の殻果類に対するアレルギーなどの、食品アレルギーの低減に有効である。核酸及び組成物を抗原提示細胞に遺伝子導入する、日本赤杉の花粉由来の花粉症を治療するための核酸及び組成物の送達は、Ｃｒｙ Ｊ１及び／又はＣｒｙ Ｊ２内に含有されるエピトープに特異的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の血清濃度の増加をもたらす。この応答は、アレルギー症状の低減に有用である。同様に、ブタクサ、その他の樹木の花粉、及び食品を含むその他のアレルギーに関係するアレルゲンの送達も、結果としてＩｇＧの血清濃度の増加をもたらす。 The nucleic acids and compositions are novel and are useful for reducing allergic responses in patients. For example, the nucleic acids and compositions are useful for reducing hay fever in patients exhibiting exemplary allergic responses related to Japanese red cedar pollen or derived from homologous pollen or allergen. As another non-limiting example, nucleic acids are effective in reducing food allergies, such as allergies to peanuts or other berries. Delivery of nucleic acids and compositions for the treatment of hay fever from Japanese red cedar pollen, which introduces nucleic acids and compositions into antigen-presenting cells, is specific to epitopes contained within Cry J1 and / or Cry J2 Resulting in increased serum concentration of normal immunoglobulin G (IgG). This response is useful for reducing allergic symptoms. Similarly, delivery of ragweed, other tree pollen, and other allergy-related allergens, including food, also results in increased serum levels of IgG.
本発明により、必要のある対象を治療する方法も提供される。方法は、１つ以上のアレルゲンに対するアレルギー応答を発症する又は発症する危険性のある対象を予防的に処置又は治療的に処置する方法である。方法は、ＡＰＣによるＤＮＡワクチンの取り込み及び発現を生じるのに十分な量で、本発明に従うＤＮＡワクチンを対象に投与することを含む。ＤＮＡワクチンの発現により、結果として、コードされているアレルゲン性エピトープ（１つ又は複数）がＡＰＣ上に提示され、ＩｇＧ免疫応答が発症する。 The present invention also provides a method of treating a subject in need. The method is a method of prophylactically or therapeutically treating a subject that develops or is at risk of developing an allergic response to one or more allergens. The method comprises administering to a subject a DNA vaccine according to the present invention in an amount sufficient to cause uptake and expression of the DNA vaccine by APC. Expression of the DNA vaccine results in the encoded allergenic epitope (s) being presented on the APC and developing an IgG immune response.
本発明の特定の例では、配列番号２、配列番号４、及び／又は配列をコードする別のアレルゲンが細胞に投与される。好ましい実施形態では、細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞である。好ましくは、樹状細胞はヒト樹状細胞である。本発明は、筋肉注射、皮下注射、電気穿孔法、遺伝子銃予防接種、又はリポソーム介在性移動など、当該技術分野において核酸ワクチンに有効な送達方法であることが既知である方法により投与され得る。 In particular examples of the invention, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and / or another allergen encoding sequence is administered to the cells. In a preferred embodiment, the cell is an antigen presenting cell such as a dendritic cell. Preferably, the dendritic cell is a human dendritic cell. The present invention can be administered by methods known to be effective delivery methods for nucleic acid vaccines in the art, such as intramuscular injection, subcutaneous injection, electroporation, gene gun vaccination, or liposome-mediated transfer.
本発明は、日本赤杉の花粉に関連する花粉症の治療に有用な処方を提供する。動物に対するアレルゲンのタンパク質コード配列をコードするＤＮＡプラスミドを送達することで、ＩＦＮ−γ産生を増加させ、かつＩＬ−４産生を低下させ得ることがこれまでに判明しており、これは特定のアレルゲンに対してアレルギーを示す動物の治療に有用である。本発明は、日本赤杉の花粉に関連するアレルギー患者を治療するための、改良されたＤＮＡワクチン組成物を提供する。本発明の融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ小胞と交差し、結果として免疫系に対するアレルゲンエピトープの提示を増強させ、具体的には、抗体応答の増強をもたらす、特異的な細胞内輸送パターンを有する。本発明により提供される核酸及び組成物は、アレルギー免疫療法の実施に有用である。 The present invention provides a formulation useful for the treatment of hay fever associated with Japanese red cedar pollen. It has been previously shown that delivery of a DNA plasmid encoding an allergen protein coding sequence to an animal can increase IFN-γ production and decrease IL-4 production, which is a specific allergen. It is useful for the treatment of animals that are allergic to the animal. The present invention provides an improved DNA vaccine composition for treating allergic patients associated with Japanese red cedar pollen. The fusion protein of the present invention has a specific intracellular transport pattern that crosses MHC class II vesicles, resulting in enhanced presentation of allergen epitopes to the immune system, specifically resulting in enhanced antibody responses . The nucleic acids and compositions provided by the present invention are useful for practicing allergic immunotherapy.
本発明は、細胞に投与したときに特異的な抗体応答の増加をもたらす処方を提供する。アレルゲンに対する抗体応答の増加は、ＩｇＥ介在性のアレルギー性疾患の治療に有用である。ＩｇＥは、細胞の限定に関連する特定の特徴を有し、同族アレルゲンに結合し細胞内シグナル伝達をもたらす。ＩｇＥは、Ｔｈ２細胞により分泌されたＩＬ−４をＢ細胞が受容したときに、アレルゲンに対して作成される。Ｂ細胞にＩｇＥクラス抗体を産生するよう指示するのに役立つ。Ｂ細胞による分泌に応じ、ＩｇＥは、高親和性受容体が肥満細胞及び好酸球により発現されるＦｃ−ｅＲＩに結合し、結果として、これらの細胞及び動物は将来的なアレルゲン暴露に感作されることになる。結果として、アレルギー症状は、アレルゲンの摂取、吸入、又は粘膜への接触に応じ誘発され得る。抗体には結合特性があることに起因し、アレルギー症状を低減させる手法の１つとして、他の抗体クラスと競合させることによりＩｇＥによる結合に利用され得る遊離アレルゲンをキレートすることが提案される。特に、ＩｇＧを増加させるアレルギー製剤は、アレルギー性疾患を低減させる経路となり得ることが提案されている。本明細書に記載の本発明は、ＩｇＧ産生の増強を誘導し、ひいては臨床的に重要な手法により、ＩｇＧに対するＩｇＥの比を低減させる。実施した試験結果により、Ｃｒｙ Ｊ２−ＬＡＭＰコンストラクトにより誘導されるＩｇＧ濃度が、第９８日目に、改変されていないＣｒｙ Ｊ２をコードするヌクレオチドの送達により誘導されるものを上回ることが示される。
The present invention provides formulations that result in an increase in specific antibody responses when administered to cells. Increased antibody responses to allergens are useful for the treatment of IgE-mediated allergic diseases. IgE has certain characteristics related to cell limitation and binds to cognate allergens resulting in intracellular signaling. IgE is made against allergens when B cells receive IL-4 secreted by Th2 cells. Helps direct B cells to produce IgE class antibodies. In response to secretion by B cells, IgE binds to Fc-eRI, a high affinity receptor expressed by mast cells and eosinophils, resulting in sensitization of these cells and animals to future allergen exposure. Will be. As a result, allergic symptoms can be triggered in response to allergen ingestion, inhalation, or mucosal contact. Due to the binding properties of antibodies, one approach to reducing allergic symptoms is to chelate free allergens that can be utilized for binding by IgE by competing with other antibody classes. In particular, it has been proposed that allergic preparations that increase IgG can be a route to reduce allergic diseases. The invention described herein induces enhancement of IgG production and thus reduces the ratio of IgE to IgG by clinically important techniques. The results of the tests performed show that the IgG concentration induced by the Cry J2-LAMP construct exceeds that induced by the delivery of the unmodified Cry J2 encoding nucleotides on
本発明の別の例では、方法は、Ｃｒｙ Ｊ１（ペクチン酸リアーゼ）のアミノ酸又は核酸配列との配列の程度を決定するための、ヒマラヤスギの樹木の花粉に見られるペクチン酸リアーゼポリペプチドの選択を教示し、そのため、Ｃｒｙ Ｊ１に類似する物質の新規組成物が生成され、物質の相同組成物を患者に投与することで、ヒマラヤスギの花粉に関連するアレルギーの治療に有用な治療結果がもたらされる。 In another example of the invention, the method selects a pectate lyase polypeptide found in pollen of a cedar tree to determine the degree of sequence with the amino acid or nucleic acid sequence of Cry J1 (pectinate lyase). Thus, a new composition of a substance similar to Cry J1 has been generated, and administering a homologous composition of the substance to a patient has resulted in a therapeutic outcome useful for the treatment of allergies associated with cedar pollen It is.
本発明は、本発明の実施形態例に対する参照を記載する。以降の実施例は、本発明のコンストラクトの作成及び活性を読者に良好に理解させることを意図するものであり、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。 The present invention describes references to example embodiments of the present invention. The following examples are intended to give the reader a better understanding of the creation and activity of the constructs of the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention.
実施例１：遺伝子材料及び方法
免疫化及び血清採取
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスをＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から購入し、出願者らの動物施設（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で維持した。ＤＮＡ免疫は、５０μｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬの滅菌ＰＢＳに入れて、筋肉内又は皮内のいずれかに行った。血清は眼窩内出血により得て、以降に解析するために−２０℃で保存した。感作させる際、マウスには、５ｕｇ／ｍＬの組み換えＣＲＹＪ２（ｒＣＲＹＪ２）又は組み換えＣＲＹＪ１（ｒＣＹＲＪ１）のいずれかと、１００μＬのミョウバン（２ｍｇ／ｍＬ）とを合計２００μＬで注射した。毎週、マウスから採血し、血清は、ＣＲＹＪ特異的な抗体に関し、ＥＬＩＳＡにより解析した。
Example 1: Genetic Materials and Methods Immunization and Serum Collection 6-8 week old BALB / c female mice were purchased from Harlan Laboratories (Frederick, Maryland) and maintained at Applicants' animal facility (Rockville, Maryland). . DNA immunization was performed either intramuscularly or intradermally in 50 μg of plasmid DNA in 100 μL of sterile PBS. Serum was obtained by intraorbital hemorrhage and stored at −20 ° C. for further analysis. Upon sensitization, mice were injected with a total of 200 μL of either 5 ug / mL recombinant CRYJ2 (rCRYJ2) or recombinant CRYJ1 (rCYRJ1) and 100 μL alum (2 mg / mL). Blood was collected from mice every week and serum was analyzed by ELISA for CRYJ specific antibodies.
モルモット
雌性モルモットを購入し、Ｓｐｒｉｎｇ Ｖａｌｌｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｏｄｌｉｎｅ，ＭＤ）にて収容した。２００μＬの滅菌生理食塩水に入れた１００μｇのプラスミドＤＮＡを筋肉内に投与し、ＤＮＡ免疫化した。心臓出血から血清を得て、後の解析のため２０℃で保存した。
Guinea pigs Female guinea pigs were purchased and housed at Spring Valley Laboratories (Woodline, MD). 100 μg of plasmid DNA in 200 μL of sterile saline was administered intramuscularly for DNA immunization. Serum was obtained from cardiac bleeding and stored at 20 ° C. for later analysis.
ＣＹＲＪ２特異的免疫グロブリン応答の検出
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノアッセイプレートを、ｒＣＲＹＪ２の５ｕｇ／ｍＬ濃度ＰＢＳ溶液で、４℃で一晩コーティングした。１％ ＢＳＡ（ＰＢＳ）により一晩ブロッキングした後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有させたＰＢＳにより血清を希釈し、１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、ウェルに固定したＣＲＹＪ２に結合したＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２を検出した。ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を加え、酵素活性をＴＭＢ停止液により停止させた。このプレートを４５０ｎｍで読み取りした。場合によっては、Ｓｕｒｅ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ）を使用し、プレートを６５０ｎｍで読み取りした。
Detection of CYRJ2-specific immunoglobulin response Nunc Maxisorp immunoassay plates were coated with rCRYJ2 in 5 ug / mL PBS overnight at 4 ° C. After blocking overnight with 1% BSA (PBS), the serum was diluted with PBS containing 0.05% Tween-20 (PBS-T) and incubated for 1 hour. Peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG, IgG1 or IgG2a antibody (Jackson Laboratories) was used to detect IgG, IgG1, or IgG2 bound to CRYJ2 immobilized on the wells. TMB substrate (KPL) was added and enzyme activity was stopped with TMB stop solution. The plate was read at 450 nm. In some cases, Sure Stop Solution (KPL) was used and the plates were read at 650 nm.
サイトカイン測定用の脾細胞の調製
無菌下で脾臓を摘出し、引裂き、単個細胞懸濁液を調製した。一次応答を試験するため、脾細胞を２４ウェルプレート（４×１０５個／ウェル）で、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、又は２．５μｇ／ｍＬのｒＣＲＹＪ２存在下又は非存在下で７２時間培養した。
Preparation of Spleen Cells for Cytokine Measurement The spleen was removed under aseptic conditions and torn to prepare single cell suspensions. To test the primary response, splenocytes were cultured in 24-well plates (4 × 10 5 cells / well) for 72 hours in the presence or absence of 10 μg / mL, 5 μg / mL, or 2.5 μg / mL rCRYJ2. did.
サイトカインアッセイ
ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の存在に関し、ＥＬＩＳＡにより上清を解析した。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４に関しては、適した抗体対を使用し、製造元の指示に従って実施した。マウス組み換えＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を用い標準曲線を作成した。全ての抗体及びサイトカインはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４アッセイの検出限界はそれぞれ２０及び１０ｐｇ／ｍＬであった。
Cytokine assays Supernatants were analyzed by ELISA for the presence of IFN-γ and IL-4. For IFN-γ and IL-4, appropriate antibody pairs were used and performed according to the manufacturer's instructions. A standard curve was generated using mouse recombinant IFN-γ and IL-4. All antibodies and cytokines were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA). The detection limits of the IFN-γ and IL-4 assays were 20 and 10 pg / mL, respectively.
実施例２：コンストラクトからのアレルゲンの発現
本発明の核酸コンストラクトを使用して、形質転換細胞において１つ又は複数のアレルゲンを発現させることができることを示すため、ヒト２９３細胞をＣｒｙＪ２−ＬＡＭＰプラスミド、ＣｒｙＪ１＋Ｊ２−ＬＡＭＰプラスミド（図４）、ＣｒｙＪ１−ＬＡＭＰプラスミド、ＣｒｙＪ１プラスミド（ＣｒｙＪ１シグナル配列は非存在；図７）、及びベースとなるプラスミドベクターのみ（陰性対照；配列番号１）により形質移入した。実験結果を図９に示す。
Example 2: Expression of allergens from constructs To demonstrate that the nucleic acid constructs of the present invention can be used to express one or more allergens in transformed cells, human 293 cells are expressed in CryJ2-LAMP plasmid, CryJ1 + J2. -LAMP plasmid (FIG. 4), CryJ1-LAMP plasmid, CryJ1 plasmid (CryJ1 signal sequence absent; FIG. 7) and only the base plasmid vector (negative control; SEQ ID NO: 1). The experimental results are shown in FIG.
図９Ａはトランスフェクション反応の結果を示す。検出には抗ＣｒｙＪ２抗体を使用した。簡潔に述べると、３０μｇの細胞可溶化物を電気泳動させ、次に免疫ブロット法のためメンブレンに転写した。ＣｒｙＪ２モノクローナル抗体を用い免疫ブロットを行った後、化学発光によりタンパク質を検出した。図に見られるとおり、ＣｒｙＪ２アレルゲンのみ及びＣｒｙＪ１＋ＣｒｙＪ２アレルゲンを含むコンストラクトが検出されたのに対し（レーン２及び３）、その他のアレルゲンは検出されなかった。この実験では、レーン５のコンストラクトを除き、ＣｒｙＪ１及びＣｒｙＪ２アレルゲンに関し天然に生じるシグナル配列は実験より前に除去した。これらの結果は、発明のコンストラクトはアレルゲンの発現に好適なだけでなく、複数のアレルゲンを共発現させることもできることを示す。
FIG. 9A shows the results of the transfection reaction. Anti-CryJ2 antibody was used for detection. Briefly, 30 μg of cell lysate was electrophoresed and then transferred to a membrane for immunoblotting. Proteins were detected by chemiluminescence after immunoblotting using CryJ2 monoclonal antibody. As can be seen in the figure, CryJ2 allergen alone and a construct containing CryJ1 + CryJ2 allergen were detected (
図９Ｂはトランスフェクション反応の結果を示す。検出には抗ＣｒｙＪ１抗体を使用した。簡潔に述べると、３０μｇの細胞可溶化物を電気泳動させ、次に免疫ブロット法のためメンブレンに転写した。ＣｒｙＪ１モノクローナル抗体を用い免疫ブロットを行った後、化学発光によりタンパク質を検出した。図に見られるとおり、ＣｒｙＪ１＋ＣｒｙＪ２アレルゲン（天然のシグナル配列は非存在）を含むコンストラクト（レーン３）が検出され、同様に、天然に生じるシグナル配列が除去されていないＣｒｙＪ１アレルゲンを含むコンストラクト（レーン５）が検出された。しかしながら、Ｃｒｙ１アレルゲンが天然のシグナル配列を含有するコンストラクトは検出されなかった。これらの結果は、本発明のコンストラクトが複数のアレルゲンの発現及び検出に好適であり、天然に生じるシグナル配列を除去することが産物の発現及び検出に重要であることを示す。 FIG. 9B shows the results of the transfection reaction. Anti-CryJ1 antibody was used for detection. Briefly, 30 μg of cell lysate was electrophoresed and then transferred to a membrane for immunoblotting. After blotting with CryJ1 monoclonal antibody, the protein was detected by chemiluminescence. As seen in the figure, a construct (lane 3) containing CryJ1 + CryJ2 allergen (natural signal sequence absent) was detected, as well as a construct containing CryJ1 allergen from which the naturally occurring signal sequence was not removed (lane 5). Was detected. However, no construct was detected in which the Cry1 allergen contained the natural signal sequence. These results indicate that the constructs of the present invention are suitable for the expression and detection of multiple allergens, and that removal of naturally occurring signal sequences is important for product expression and detection.
実施例３：コンストラクトのＭＨＣ ＩＩプロセシング経路を支持するデータ
プラスミド上のコード領域として、あるいは本発明に従うコンストラクトに対するアレルゲンドメインとして投与したとき、本発明のコンストラクトから産生されたキメラタンパク質が、ＭＨＣ ＩＩ経路によりプロセシングを受けているか決定するために、一連の実験を実施して、ＣｒｙＪ２タンパク質に対する免疫応答を比較した。結果を、図１０のパネルＡ及びＢに示す。
Example 3: Data supporting the MHC II processing pathway of a construct When administered as a coding region on a plasmid or as an allergen domain for a construct according to the present invention, the chimeric protein produced from the construct of the present invention is expressed by the MHC II pathway. To determine if they were processed, a series of experiments were performed to compare immune responses against the CryJ2 protein. The results are shown in panels A and B of FIG.
より詳細には、図は、４種のＤＮＡ免疫及び粗花粉抽出物感作による、ＣｒｙＪ２特異的な応答を示す。第０、７、１４、及び２１日目に、マウス群（ｎ＝５）を、ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰプラスミドＤＮＡ又はＣＲＹＪ２プラスミド（図８を参照されたい）ＤＮＡのいずれかにより皮下感作した。最後のＤＮＡ感作から６週間（７７日間）後、マウスは粗花粉のミョウバン中抽出物により感作し、３週間（９１日間）後に追加免疫した。データは、各時点でプールした血清から生成された値を示す。ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡの免疫を受けたマウスにおけるＩｇＧ１（パネルＡ）及びＩｇＧ２ａ（パネルＢ）応答は、第１１２日まで高濃度で維持され、ＬＡＭＰを含まないＣＲＹＪ２プラスミドＤＮＡの免疫を受けたマウスを良好に上回った。したがって、本発明に従うコンストラクトの手法によるアレルゲン送達は、本発明のコンストラクトを含まないアレルゲン送達と比較して優れたＭＨＣ ＩＩ応答を提供する。
More specifically, the figure shows a CryJ2-specific response with four DNA immunizations and crude pollen extract sensitization. On
実施例４：投与量の論拠−投与濃度の異なるコンストラクト及びベクター単独に対する免疫応答の比較
図１１は、ＩｇＧ２ａ産物及びＩｇＧ１産物の両方を異なる濃度で投与した４種のＤＮＡ免疫後のＣｒｙＪ２特異的応答を示す。マウス群（ｎ＝５）には、第０、７、１４、及び２１日目に、１０μｇ、５０μｇ、又は１００μｇのＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰプラスミドＤＮＡ又はベクターＤＮＡのいずれかを筋肉内投与した。最後のＤＮＡ免疫から３週間後、マウスを屠殺し、サイトカイン誘導アッセイのため脾臓を摘出した。
Example 4: Dosage Rationale-Comparison of immune responses to constructs and vectors alone at different dose concentrations FIG. 11 shows CryJ2-specific responses after four DNA immunizations administered both IgG2a and IgG1 products at different concentrations Indicates. Groups of mice (n = 5) received either 10 μg, 50 μg, or 100 μg of CRYJ2-LAMP plasmid DNA or vector DNA intramuscularly on
データは、各ワクチン投与に関しプールした血清から生成された値を示す。全３種の濃度のＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰプラスミドＤＮＡによりＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ応答が得られた。５０μｇでの投与で最も強い抗体応答が得られることが判明した。いずれの濃度でも、ベクター単独では、何ら抗体応答は誘導されなかった。これらのデータは、免疫応答の惹起には用量依存性の応答が存在し、免疫応答の少なくとも一部はＭＨＣ ＩＩ型応答であることを示す。 Data represent values generated from pooled sera for each vaccine dose. IgG1 and IgG2a responses were obtained with all three concentrations of CRYJ2-LAMP plasmid DNA. It was found that administration at 50 μg gave the strongest antibody response. At any concentration, the vector alone did not induce any antibody response. These data indicate that there is a dose-dependent response in eliciting an immune response and that at least a portion of the immune response is a MHC type II response.
実施例５：ＭＨＣ ＩＩ経路を介する免疫応答を示す更なるデータ
この一連の実験では、刺激した脾臓細胞の上清中のサイトカイン分泌は、マーカーとしてＩＬ−４及びＩＦＮ−γを使用して求めた。具体的には、第４２日目にマウス（ｎ＝３）脾臓細胞を採取し、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬの存在下で、又はｒＣＲＹＪ２の比存在下で培養した。無感作のマウス由来の脾臓細胞を陰性対照として使用した。ｒＣＲＹＪ２刺激した脾細胞のＩＦ−４及びＩＦＮ−γ濃度は、ｐｇ／ｍＬでＥＦＩＳＡにより測定した。
Example 5: Further data showing immune response via the MHC II pathway In this series of experiments, cytokine secretion in the supernatant of stimulated spleen cells was determined using IL-4 and IFN-γ as markers. . Specifically, on
データを、図１２のパネルＡ及びＢに示す。データは、５０μｇのＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰプラスミドＤＮＡを免疫したマウスは、低投与量のプラスミドＤＮＡにより免疫されたものと比較して、ＩＦＮ−γ（ＭＨＣ ＩＩ免疫応答経路の活性化について確立されているバイオマーカー）の発現が著しく高かったことを示す。ＭＨＣ Ｉ経路について確立されているバイオマーカーであるＩＦ−４濃度に関しては、いずれの群においても観察された応答は非常にわずかであった。ＩＦ−５に関しても、観察された場合にも応答はごくわずかであった（データ不掲載）。組み換えＣｒｙ Ｊ２タンパク質による刺激後、ＩＦＮ−γが産生され及びＩＦ−４は産生されなかったことに示されるとおり、これらの結果は、Ｃｒｙ Ｊ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡ免疫がＴｈ１記憶細胞の補充を誘導し、Ｔｈ２細胞に関しては誘導しなかったことを意味する。 The data is shown in panels A and B of FIG. The data show that mice immunized with 50 μg of CRYJ2-LAMP plasmid DNA were compared to those immunized with low doses of plasmid DNA in the established biosynthesis of IFN-γ (MHC II immune response pathway). It shows that the expression of the marker) was remarkably high. For IF-4 concentration, an established biomarker for the MHC I pathway, very little response was observed in either group. Regarding IF-5, the response was negligible when observed (data not shown). These results indicate that Cry J2-LAMP DNA immunity induces recruitment of Th1 memory cells, as shown by IFN-γ being produced and IF-4 not being produced after stimulation with recombinant Cry J2 protein, This means that Th2 cells were not induced.
実施例６：予めＣｒｙＪ２により感作したマウスにおいてＣｒｙＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡワクチンを用いる免疫の治療効果の試験
ＤＮＡ−ＬＡＭＰ−ＣｒｙＪ２ワクチンの治療効果を試験するため、マウス群（ｎ＝５）に、５μｇのｒＣＲＹＪ２組み換えタンパク質を３回注射して感作し、４週間後から、ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰプラスミドＤＮＡを、間隔を一週間ずつ（７日間）開けて４回注射し処置した。ＤＮＡ免疫により、ＩｇＧ２ａの追加免疫効果が誘導され、ＩｇＧ１抗体が一過性に増加したことから、ＤＮＡワクチンのＴｈ１誘導性の調節効果が示される。追加して、第１６７日目及び第１７４日目の２回ＤＮＡを免疫することにより、ＣＲＹＪ２特異的なＩｇＧ２ａ応答が追加免疫され、かつＩｇＧ１応答においては、ほとんど変化はなかった。マウスの視認試験により、肉体的な困難性又は皮膚反応は存在しないことが明らかとなった。同様に、食欲において変化は見られず、あるいは明らかな嗜眠も見られなかった。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの力価に対する影響を、それぞれ図１３のパネルＡ及びＢに示す。
Example 6: Testing the therapeutic effect of immunization with CryJ2-LAMP DNA vaccine in mice previously sensitized with CryJ2 To test the therapeutic effect of DNA-LAMP-CryJ2 vaccine, a group of mice (n = 5) The rCRYJ2 recombinant protein was sensitized by three injections, and after 4 weeks, CRYJ2-LAMP plasmid DNA was injected 4 times at intervals of one week (7 days). The boosting effect of IgG2a was induced by DNA immunization, and the IgG1 antibody increased transiently, indicating the Th1-induced regulatory effect of the DNA vaccine. In addition, immunization with DNA twice on day 167 and day 174 boosted the CRYJ2-specific IgG2a response and there was little change in the IgG1 response. A visual test of the mouse revealed that there was no physical difficulty or skin reaction. Similarly, there was no change in appetite or apparent lethargy. The effects on IgG1 and IgG2a titers are shown in panels A and B of FIG. 13, respectively.
実施例７：マウス脾細胞培養におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の誘導
サイトカイン誘導に関しＣｒｙＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡワクチンの治療効果も試験した。第１８３日めにマウス（ｎ＝３）の脾細胞を採取し、濃度を変えてｒＣＲＹＪ２により刺激した。無感作のマウス由来の脾臓細胞を陰性対照として使用した。ｒＣＲＹＪ２刺激した脾細胞のＩＬ−４及びＩＦＮ−γ濃度は、ｐｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰワクチン投与群において、ベクター群と比較して、ＩＦＮ−γの著しい発現増加が検出された。しかしながら、ＩＬ−４発現はベクター群と差は見られなかった。Ｃｒｙ １２−ＬＡＭＰ ＤＮＡ免疫の結果、ＩＦＮ−γが増加することは、抗原特異的Ｔｈ１細胞の補充及びＴｈ１サイトカイン環境の生成に関与する可能性がある。この実験により得られたデータを、図１４、パネルＡ及びＢに示す。
Example 7: Induction of IFN-γ and IL-4 in mouse splenocyte cultures The therapeutic effect of CryJ2-LAMP DNA vaccine was also tested for cytokine induction. On day 183, spleen cells of mice (n = 3) were collected and stimulated with rCRYJ2 at different concentrations. Spleen cells from naive mice were used as negative controls. IL-4 and IFN-γ concentrations of rCRYJ2-stimulated splenocytes were measured by ELISA at pg / mL. In the CRYJ2-LAMP vaccine administration group, a significant increase in the expression of IFN-γ was detected compared to the vector group. However, IL-4 expression was not different from the vector group. Increased IFN-γ as a result of Cry 12-LAMP DNA immunization may be involved in the recruitment of antigen-specific Th1 cells and the generation of a Th1 cytokine environment. The data obtained from this experiment is shown in FIG. 14, panels A and B.
実施例８：血清中の循環Ｃｒｙ Ｊ２タンパク質の検出
Ｃｒｙ Ｊ２タンパク質、ｐＤＮＡ−Ｃｒｙ Ｊ２（ＬＡＭＰ不含有）及びＣｒｙ １２−ＬＡＭＰ−ｖａｘによりマウスを免疫した。第０、１、２、３、４、及び７日目に血清サンプルを採取し、感受性のサンドイッチイムノアッセイにおいて、遊離のＣｒｙ Ｊ２タンパク質の存在を評価した。タンパク質及びＬＡＭＰ不含有免疫において遊離のＣｒｙ Ｊ２が検出された。しかしながら、Ｃｒｙ Ｊ２−ＬＡＭＰ−ｖａｘ免疫マウスを用いる任意の実験におけるいずれの時点においても、遊離アレルゲンは検出されなかった（検出限界２ｎｇ／ｍＬ）。これらの上清が示すデータを図１２に提供する。
Example 8: Detection of circulating Cry J2 protein in serum Mice were immunized with Cry J2 protein, pDNA-Cry J2 (without LAMP) and Cry 12-LAMP-vax. Serum samples were taken on
本発明に従うＬＡＭＰワクチンは、アレルギーを治療するものの遊離のアレルゲンを患者の全身にもたらすことのない、唯一の製剤である。これは、アレルゲンが全身にもたらされることに起因してアナフィラキシー反応を時折生じさせる、従来の免疫療法剤とは異なる。本実験は、Ｃｒｙ Ｊ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡプラスミドを投与したマウスは、遊離のＣｒｙ Ｊ２タンパク質を有しておらず、したがってタンパク質単独又はＣｒｙ Ｊ２ ＤＮＡ（ＬＡＭＰ不含有）を投与したマウスに見られるような、体循環への放出がないことを示す。 The LAMP vaccine according to the present invention is the only formulation that treats allergies but does not bring free allergens to the patient's whole body. This is different from conventional immunotherapeutic agents that occasionally produce anaphylactic reactions due to allergens being brought to the whole body. This experiment shows that mice administered with Cry J2-LAMP DNA plasmid do not have free Cry J2 protein, and thus are found in mice administered protein alone or Cry J2 DNA (without LAMP), Indicates no release to the systemic circulation.
実施例９：ＤＮＡワクチンのモルモットにおける効果
その他の哺乳動物における、本発明の核酸コンストラクトの機能に関する化学的な理解を深めるために、ＣｒｙＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡワクチンを免疫した後、組み換えＣｒｙＪ２タンパク質に暴露した雌性モルモットで試験を実施した。試験結果を図１６、パネルＡ及びＢに示す。
Example 9: Effect of DNA vaccine in guinea pigs To better understand the function of the nucleic acid construct of the present invention in other mammals, females exposed to recombinant CryJ2 protein after immunization with CryJ2-LAMP DNA vaccine Tests were conducted in guinea pigs. The test results are shown in FIG.
具体的には、第０、７、及び１４日目に、１００μｇのＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡワクチン又はベクター単独を雌性モルモットに筋肉内注射した。第１４日目の最後のＤＮＡワクチン免疫から４週間後、モルモットに、１０μｇ／ｍＬのｒＣＲＹＪ２タンパク質／ミョウバンを第４２日目及び第４９日目に皮下注射した。第０、２１、３５、６３、及び７７日目にモルモットから血清サンプルを得た。データは、ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡを投与したモルモットの平均吸光度は、第３５日目までの間、ＩｇＧ２に関しわずかに増加し、あるいはＩｇＧ１に関しては変化がなかったことを示す。ＩｇＧ２ａの増加は、Ｔｈ１偏向性の応答で典型的に見られるものと一致する。
Specifically, on
実施例１０：その他の哺乳動物における更なる調査−毒性データにより安全性が示された
ニュージーランド白色種ウサギに、４．１２８ｍｇのＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡを筋肉内注射した。年齢及び性別を一致させた対照ウサギには生理食塩水のみを投与した。ウサギは第１、１４、２８、４２、及び５６日目に免疫した。第１、１４、２８、４２、５６、５８、及び８５日目にウサギから血清サンプルを得た。ＣｒｙＪ２−ＬＡＭＰプラスミド又は生理食塩水の複数回筋肉内注射後１：１００希釈したウサギ血清の平均吸光度を図１７に示す。図に見られるとおり、データは、生理食塩水を投与したウサギの平均吸光度は０．１００未満であることを示す。ＣＲＹＪ２−ＬＡＭＰ ＤＮＡによる処置群のウサギの吸光度は、一般的に、第４２日目まで増加し、一部の場合では、第８５日目まで増加した。
Example 10: Further Investigation in Other Mammals-Safety Shown by Toxicity Data New Zealand white rabbits were injected intramuscularly with 4.128 mg of CRYJ2-LAMP DNA. Control rabbits matched in age and sex received saline alone. Rabbits were immunized on
実施例１１：食品アレルギーに対する適用性
直近２５年をかけて、落花生アレルギー患者における感作をもとに、８種の重大な落花生アレルゲンを同定した。３種の主要な落花生アレルゲンは、ほとんど共通して落花生アレルギー患者のＩｇＥにより認識され、６５〜１００％はＡｒａ ｈ１（６３．５ｋＤａの種子貯蔵タンパク質ビシリンファミリータンパク質）を認識し、７１〜１００％はＡｒａ ｈ２（１７ｋＤａの種子貯蔵コングルチニンファミリータンパク質）を認識し、４５〜９５％はＡｒａ ｈ３（１４ｋＤａの種子貯蔵グリシニンファミリータンパク質）を認識する。これらの３種のタンパク質は、落花生依存性アレルギー応答及び即時型過敏反応を誘引する一般的な原因となるだけでなく、強力なアレルギー応答を促進することも明白である。落花生アレルギーの免疫療法のための基盤としてこれらのアレルゲンを標的とすることには、多様な落花生アレルギー集団の中でも強力なアレルギー応答からの広範な保護をもたらす可能性がある。現在、アレルギーの免疫療法剤として、低アレルギー性の形態の、３種の主要なアレルゲン及び加熱殺菌細菌アジュバントを使用する、第Ｉ相臨床試験が実施中である。この試験は進行中であるものの、製造プロセスが非常に複雑であることに起因して、このような治療法の最終的な商業化には課題がある。
Example 11: Applicability to food allergies Over the last 25 years, eight major peanut allergens were identified based on sensitization in peanut allergy patients. The three major peanut allergens are most commonly recognized by IgE of peanut allergy patients, 65-100% recognize Ara h1 (63.5 kDa seed storage protein vicilin family protein), 71-100% Recognizes Ara h2 (17 kDa seed storage conglutinin family protein) and 45-95% recognizes Ara h3 (14 kDa seed storage glycinin family protein). It is clear that these three proteins not only cause a common cause of peanut-dependent allergic and immediate hypersensitivity reactions, but also promote a strong allergic response. Targeting these allergens as a basis for immunotherapy of peanut allergies may provide broad protection from strong allergic responses among diverse peanut allergy populations. Currently, Phase I clinical trials are underway using three major allergens and heat-killed bacterial adjuvants in hypoallergenic form as allergy immunotherapy agents. Although this trial is ongoing, the final commercialization of such treatments is challenging due to the very complex manufacturing process.
食品アレルギー、及び特に落花生アレルギーの発症に対処するため、本発明に従う核酸コンストラクトを創出した。上記の通りのコンストラクトを図６Ａに示し、コードされるキメラタンパク質の概略を図６Ｂに示す。このコンストラクトは、投与された対象において主にＭＨＣ ＩＩ応答をもたらすために使用できる。単一のキメラタンパク質において最も一般的な３種の落花生アレルゲンを存在させることで、集団における落花生アレルギーのほとんど大部分を治療する広範な免疫が可能である。 In order to cope with the development of food allergies and in particular peanut allergies, a nucleic acid construct according to the present invention was created. The construct as described above is shown in FIG. 6A, and an outline of the encoded chimeric protein is shown in FIG. 6B. This construct can be used primarily to produce an MHC II response in an administered subject. The presence of the three most common peanut allergens in a single chimeric protein allows extensive immunity to treat almost the majority of peanut allergies in the population.
コンストラクトを発現させ、得られた結果を図１８に示す。図１９は、全３種のアレルゲンを発現させることができ、これらはウェスタンブロットにおいて単一のポリタンパク質として検出されたことをを示す。 The construct was expressed and the results obtained are shown in FIG. FIG. 19 shows that all three allergens can be expressed and these were detected as a single polyprotein in the Western blot.
本発明の実施において及び核酸コンストラクトの作成において、本発明の範囲又は趣旨から逸脱せずに、各種実施形態及びその変形をなすことができることは当業者には明白であろう。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書及び実施に照らして判断することで、当業者には明白となろう。明細書及び実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明の正確な範囲及び趣旨は以降の特許請求の範囲により示される。 It will be apparent to those skilled in the art that various embodiments and modifications can be made in the practice of the invention and in making nucleic acid constructs without departing from the scope or spirit of the invention. Other embodiments of the invention will be apparent to those skilled in the art upon judgment in light of the specification and practice of the invention. The specification and examples are for illustrative purposes only, and the precise scope and spirit of the invention is indicated by the following claims.
配列リスト用の更なる配列
本出願の一部として提供される公式の配列リストに提供される配列に加えて、以降の配列が本開示の一部を構成する：
１．Ｃｒｙ１−Ｃｒｙ２−ＬＡＭＰキメラコンストラクトのコード領域のヌクレオチド配列は次のとおりである。
1. The nucleotide sequence of the coding region of the Cry1-Cry2-LAMP chimeric construct is as follows:
２．ｈｅ Ａｒａ Ｈ１／Ｈ２／ｈ３ポリタンパク質のコード領域の核酸配列：
２．Ａｒａ Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ポリタンパク質キメラコンストラクトのコード領域のアミノ酸配列は次のとおりである：
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