JP6083849B2 - Method and kit for detecting or quantifying a target substance in a sample - Google Patents
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Description
本発明は、試料中の標的物質を検出又は定量する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for detecting or quantifying a target substance in a sample.
従来、試料中の標的物質を検出又は定量する方法として、抗原と抗体の反応を利用した酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が知られている。 Conventionally, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a reaction between an antigen and an antibody is known as a method for detecting or quantifying a target substance in a sample.
一方、例えば非特許文献１には、金ナノ粒子により、量子ドットのフォトルミネッセンスの強度が増強することが記載されている。
On the other hand, for example, Non-Patent
より多様な方法で試料中の標的分子を検出又は定量できれば、検出感度の向上、検出精度の向上、従来不可能であった測定が可能となる等の利点が得られる可能性がある。そこで、本発明は、試料中の標的物質を検出又は定量する新たな方法及びキットを提供することを目的とする。 If target molecules in a sample can be detected or quantified by a variety of methods, there are possibilities that advantages such as improved detection sensitivity, improved detection accuracy, and measurement that has been impossible in the past can be obtained. Accordingly, an object of the present invention is to provide a new method and kit for detecting or quantifying a target substance in a sample.
本発明は、試料中の標的物質を検出する方法であって、試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加してインキュベーションするインキュベーション工程と、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する判定工程と、を含み、第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する方法を提供する。 The present invention is a method for detecting a target substance in a sample, wherein the metal nanoparticle and the second probe on which the first probe is immobilized are immobilized on each of the sample and the negative control not containing the target substance. An incubation step in which quantum dots are added and incubated, a fluorescence measurement step in which the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample and the negative control after the incubation step is measured, and the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample are Determining that the target substance is present in the sample when it is stronger than the fluorescence intensity of the dots, and the first probe and the second probe bind to the target substance but do not bind to each other The first probe and the second probe bind to the target substance, so that the metal nanoparticles and the quantum dots are brought into close proximity, and thereby the fluorescence of the quantum dots To provide a method of degree is enhanced.
本発明により、試料中の標的物質を検出する新たな方法を提供することができる。この方法は、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接すると、量子ドットの蛍光強度が増強するという現象を利用するものである。試料中の標的物質と、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットが結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、量子ドットの蛍光強度が増強する。この蛍光強度の増強に基づいて試料中の標的物質を検出することができる。また、本発明の方法によれば、従来のＥＬＩＳＡ法では必要な工程である洗浄工程を行うことなく、試料中の標的物質を検出することができる。このため、簡便に標的物質を検出することができる。また、洗浄工程による標的物質の検出感度の低下を防止することができる。 The present invention can provide a new method for detecting a target substance in a sample. This method utilizes the phenomenon that the fluorescence intensity of the quantum dot increases when the metal nanoparticles and the quantum dot come close to each other. By combining the target substance in the sample with the metal nanoparticle to which the first probe is immobilized and the quantum dot to which the second probe is immobilized, the metal nanoparticle and the quantum dot come close to each other, and the fluorescence intensity of the quantum dot Will strengthen. Based on this increase in fluorescence intensity, the target substance in the sample can be detected. In addition, according to the method of the present invention, a target substance in a sample can be detected without performing a washing step, which is a necessary step in the conventional ELISA method. For this reason, a target substance can be detected simply. In addition, it is possible to prevent a decrease in detection sensitivity of the target substance due to the washing process.
本発明はまた、試料中の標的物質を定量する方法であって、試料及び既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料のそれぞれに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加してインキュベーションするインキュベーション工程と、インキュベーション工程後の試料及び複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、試料中の量子ドットの蛍光強度を、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度と比較して、試料中の標的物質を定量する定量工程と、を含み、第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する方法を提供する。 The present invention is also a method for quantifying a target substance in a sample, comprising a metal nanoparticle having a first probe immobilized on each of a sample and a plurality of standard samples containing a target substance at a known concentration, and a second Incubation step of adding and incubating probe-fixed quantum dots, fluorescence measurement step of measuring the fluorescence intensity of quantum dots in the sample and multiple standard samples after the incubation step, and fluorescence intensity of quantum dots in the sample Comparing the fluorescence intensity of the quantum dots in a plurality of standard samples to quantify the target substance in the sample, wherein the first probe and the second probe bind to the target substance Since the first probe and the second probe do not bind to each other and bind to the target substance, the metal nanoparticles and the quantum dots come close to each other, and thereby the quantum docks. The fluorescence intensity is to provide a method for enhancement of.
本発明により、試料中の標的物質を定量する新たな方法を提供することができる。また、本発明の方法によれば、洗浄工程を必要とせずに、試料中の標的物質を定量することができるため、簡便に標的物質を定量することができる。 According to the present invention, a new method for quantifying a target substance in a sample can be provided. Further, according to the method of the present invention, the target substance in the sample can be quantified without requiring a washing step, and therefore the target substance can be quantified easily.
本発明はまた、試料中の標的物質の検出又は定量用キットであって、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを含み、第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する、キットを提供する。 The present invention also provides a kit for detection or quantification of a target substance in a sample, comprising metal nanoparticles having a first probe immobilized thereon and quantum dots having a second probe immobilized thereon, The second probe binds to the target substance but does not bind to each other, and the first probe and the second probe bind to the target substance, so that the metal nanoparticles and the quantum dots are brought into close proximity, thereby A kit is provided that enhances fluorescence intensity.
本発明のキットによれば、新たな原理に基づいて、標的物質を簡便に検出することができる。 According to the kit of the present invention, a target substance can be easily detected based on a new principle.
上記の金属ナノ粒子は、金平糖状金属ナノ粒子であることが好ましい。 It is preferable that said metal nanoparticle is a gold flat sugar-like metal nanoparticle.
金平糖状金属ナノ粒子を用いることにより、標的物質の検出感度を高めることができ、より正確に標的物質を定量することができる。 By using the confetti metal nanoparticles, the detection sensitivity of the target substance can be increased, and the target substance can be quantified more accurately.
上記の金属ナノ粒子は、金ナノ粒子であることが好ましい。金ナノ粒子は、量子ドットの蛍光強度を効率よく増強することができる。 The metal nanoparticles are preferably gold nanoparticles. Gold nanoparticles can efficiently enhance the fluorescence intensity of quantum dots.
上記の量子ドットは、可視光領域の蛍光を発するものであってもよい。これにより、量子ドットの蛍光強度の増強を、肉眼で確認することができ、標的物質を容易に検出又は定量することができる。 The quantum dots may emit fluorescence in the visible light region. Thereby, the enhancement of the fluorescence intensity of the quantum dots can be confirmed with the naked eye, and the target substance can be easily detected or quantified.
上記の第１のプローブ及び第２のプローブは、抗原、抗体、レクチン、糖、レセプター、リガンド、アプタマー又は核酸であることが好ましい。 The first probe and the second probe are preferably antigens, antibodies, lectins, sugars, receptors, ligands, aptamers or nucleic acids.
第１のプローブ及び第２のプローブがこのようなものであれば、抗原、抗体、レクチン、糖、レセプター、リガンド、アプタマー又は核酸に結合可能な標的物質を検出又は定量することができる。 If the first probe and the second probe are such, a target substance that can bind to an antigen, antibody, lectin, sugar, receptor, ligand, aptamer or nucleic acid can be detected or quantified.
本発明により、洗浄工程を必要としない、試料中の標的物質を検出又は定量する新たな方法及びキットを提供することができる。 The present invention can provide a new method and kit for detecting or quantifying a target substance in a sample that does not require a washing step.
（原理）
量子ドットは数十ｎｍ以下の半導体結晶であり、励起光を照射すると蛍光を発する。本発明の検出方法及び定量方法は、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接すると、量子ドットの蛍光強度が増強するという現象を利用するものである。
(principle)
A quantum dot is a semiconductor crystal of several tens of nm or less, and emits fluorescence when irradiated with excitation light. The detection method and quantification method of the present invention utilize the phenomenon that the fluorescence intensity of a quantum dot increases when the metal nanoparticles and the quantum dot come close to each other.
図１は、この現象を説明する図である。図１は、量子ドット１０と金属ナノ粒子２０とが近接した状態を示している。この近接は、例えば、量子ドット１０及び金属ナノ粒子２０に固定された、第１のプローブ及び第２のプローブが、標的物質と互いに結合することにより達成される。ここで、量子ドットに励起光を照射すると、金属ナノ粒子２０の電荷が局在し、近接した量子ドット１０及び金属ナノ粒子２０の間で蛍光増強効果が生じ、量子ドット１０単体に励起光を照射した場合と比較して増強された蛍光が発生する。図では、励起光を点線の矢印で表し、蛍光を白矢印で表し、蛍光増強効果を直線の矢印で表す。また、金属ナノ粒子２０の電荷の局在を「＋」及び「−」の記号で表す。
FIG. 1 is a diagram for explaining this phenomenon. FIG. 1 shows a state in which the
図２は、試料中の標的物質を検出する方法の一実施形態を説明する図である。一例として、試料中の抗ネオスポラ抗体を検出する場合を説明する。牛ネオスポラ症とは、寄生虫であるネオスポラ・カニナムの寄生を原因とする寄生虫病である。牛ネオスポラ症に感染したウシの血清中には抗ネオスポラ抗体が含まれている。そこで、ウシ血清中の抗ネオスポラ抗体を検出することにより、牛ネオスポラ症の感染を検出することができる。 FIG. 2 is a diagram illustrating an embodiment of a method for detecting a target substance in a sample. As an example, a case where an anti-Neospora antibody in a sample is detected will be described. Bovine neosporosis is a parasitic disease caused by the parasitic parasite Neospora caninum. Antineospora antibodies are contained in the serum of cattle infected with bovine neosporosis. Therefore, by detecting an anti-Neospora antibody in bovine serum, infection with bovine neosporosis can be detected.
標的物質３０は、抗ネオスポラ抗体である。標的物質３０は、金属ナノ粒子２０に固定化された第１のプローブ２１に結合する。ここで、第１のプローブ２１は、抗ネオスポラ抗体の抗原であるＮｃＳＡＧ１タンパクである。また、標的物質３０は、量子ドット１０に固定化された第２のプローブ１１に結合する。ここで、第２のプローブ１１は、例えば、抗ウシＩｇＧ抗体である。これらの結合の結果、金属ナノ粒子２０及び量子ドット１０が近接し、量子ドット１０の蛍光強度が増強する。この蛍光強度の増強を測定することにより、試料中の標的物質３０を検出することができる。
The
（試料中の標的物質を検出する方法）
本実施形態に係る試料中の標的物質を検出する方法は、試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加してインキュベーションするインキュベーション工程と、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する判定工程とを含む。
(Method of detecting target substance in sample)
In the method for detecting a target substance in a sample according to this embodiment, a metal nanoparticle on which a first probe is immobilized and a quantum on which a second probe is immobilized on each of the sample and a negative control not containing the target substance. Incubation step in which dots are added, incubation step, fluorescence measurement step in which the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample and the negative control after the incubation step is measured, and the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample are the quantum dots in the negative control And a determination step of determining that the target substance is present in the sample when the intensity is higher than the fluorescence intensity of.
（標的物質及びプローブ）
本実施形態の方法では、標的物質として、抗原−抗体、レクチン−糖、レセプター−リガンド、アプタマー−アプタマーの標的物質、核酸−核酸等の、互いに特異的に結合する物質の組の一方を用い、他方をプローブとして用いることができる。より具体的には、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学物質、ホルモン、ウイルス、糖等を標的物質又はプローブに用いることができる。
(Target substances and probes)
In the method of this embodiment, as a target substance, one of a set of substances that specifically bind to each other, such as an antigen-antibody, a lectin-sugar, a receptor-ligand, an aptamer-aptamer target substance, and a nucleic acid-nucleic acid, is used. The other can be used as a probe. More specifically, proteins, peptides, DNA, RNA, chemical substances, hormones, viruses, sugars and the like can be used as target substances or probes.
ここで、第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合しないものを選択する。第１のプローブと第２のプローブが直接結合してしまうと、標的物質の存在の有無に関係なく金属ナノ粒子と量子ドットが近接してしまい、誤検出や誤判定の原因となる。例えば、標的物質が抗原に特異的に結合する抗体である場合、第１のプローブ及び第２のプローブとしては、例えば、標的物質の抗体が結合する抗原及び標的物質の抗体に結合する２次抗体を使用することができる。これらは、いずれが第１のプローブであっても第２のプローブであってもよい。また、例えば、標的物質が抗原である場合、第１のプローブ及び第２のプローブとしては、標的物質上のそれぞれ異なるエピトープに結合する２種類の抗体を使用してもよい。また、例えば、標的物質が抗原であり、抗原が近接して複数存在する場合、第１のプローブ及び第２のプローブとしては、標的物質上の同一のエピトープに結合する抗体を使用してもよい。ここで、抗原が近接して複数存在する場合とは、例えば、抗原が多量体を形成している場合や、標的物質が、ウイルス、微生物、細胞等の表面に複数存在する抗原である場合が挙げられる。つまり、標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブが結合することにより、金属ナノ粒子と量子ドットが近接することができる限り、第１のプローブ及び第２のプローブの組み合わせに制限はない。 Here, the first probe and the second probe are selected to bind to the target substance but not to each other. When the first probe and the second probe are directly bonded, the metal nanoparticles and the quantum dots are brought close to each other regardless of the presence or absence of the target substance, which causes erroneous detection and determination. For example, when the target substance is an antibody that specifically binds to an antigen, the first probe and the second probe include, for example, an antigen to which the target substance antibody binds and a secondary antibody that binds to the target substance antibody. Can be used. Any of these may be the first probe or the second probe. For example, when the target substance is an antigen, two types of antibodies that bind to different epitopes on the target substance may be used as the first probe and the second probe. Further, for example, when the target substance is an antigen and a plurality of antigens are present close to each other, antibodies that bind to the same epitope on the target substance may be used as the first probe and the second probe. . Here, the case where a plurality of antigens are present in close proximity means, for example, the case where the antigen forms a multimer, or the case where the target substance is a plurality of antigens present on the surface of a virus, microorganism, cell or the like. Can be mentioned. That is, the combination of the first probe and the second probe is not limited as long as the target substance, the first probe, and the second probe can be combined to allow the metal nanoparticles and the quantum dots to approach each other.
検出対象となる標的物質は、液体中に存在していてもよく、固体、粉末、流動体、気体等の試料中に存在していてもよい。本実施形態に係る、試料中の標的物質を検出する方法は、液体中で実施することが好ましい。このため、試料が液体以外である場合には、適切なバッファー等に試料を溶解又は懸濁し、液体にすることが好ましい。 The target substance to be detected may be present in a liquid, or may be present in a sample such as a solid, powder, fluid or gas. The method for detecting a target substance in a sample according to this embodiment is preferably performed in a liquid. For this reason, when the sample is other than a liquid, it is preferable to dissolve or suspend the sample in an appropriate buffer or the like to obtain a liquid.
（金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子としては、ナノオーダーの粒径を有する金、銀等のプラズモン現象を有する金属の粒子が挙げられる。なかでも、量子ドットの蛍光を増強させる効果が大きいことから金であることが好ましい。プラズモン現象とは、金属中の自由電子が集団的に振動して擬似的な粒子として振る舞う現象を意味する。
(Metal nanoparticles)
Examples of the metal nanoparticles include metal particles having a plasmon phenomenon such as gold or silver having a nano-order particle size. Among these, gold is preferable because it has a great effect of enhancing the fluorescence of the quantum dots. The plasmon phenomenon means a phenomenon in which free electrons in a metal collectively vibrate and behave as pseudo particles.
金属ナノ粒子の調製方法は特に制限されない。例えば、金ナノ粒子は、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）をクエン酸とタンニン酸で還元することにより調製することができる。また、銀ナノ粒子は、硝酸銀水溶液をクエン酸等で還元することにより調製することができる。 The method for preparing the metal nanoparticles is not particularly limited. For example, gold nanoparticles can be prepared by reducing chloroauric acid (HAuCl 4 ) with citric acid and tannic acid. Silver nanoparticles can be prepared by reducing an aqueous silver nitrate solution with citric acid or the like.
（金平糖状金属ナノ粒子）
金平糖状金属ナノ粒子とは、表面に金平糖状の凹凸を有する金属ナノ粒子であり、ｕｒｃｈｉｎ−ｌｉｋｅ金属ナノ粒子ともいう。表面に凹凸を有するか否かは、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察することにより確認することができる。通常の金属ナノ粒子（表面が滑らかな金属ナノ粒子）がほぼ球状であるのに対し、金平糖状金属ナノ粒子は、金平糖のような形状である。金平糖状金属ナノ粒子は、例えば、１０ｍＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に２５０μｌの２０ｍＭ塩化金酸溶液を添加した後、溶液の色が黄色から濁った青に変わるまで室温で３０分間静置することにより調製することができる。
(Kinpira sugar-like metal nanoparticles)
The gold flat sugar-like metal nanoparticles are metal nanoparticles having a gold flat sugar-like unevenness on the surface, and are also referred to as urchin-like metal nanoparticles. Whether or not the surface has irregularities can be confirmed, for example, by observing with a transmission electron microscope (TEM). Ordinary metal nanoparticles (metal nanoparticles with a smooth surface) are almost spherical, whereas confetti metal nanoparticles are shaped like confetti. For example, after adding 250 μl of 20 mM chloroauric acid solution to 10 mL of 10 mM HEPES buffer (pH 7.4), the gold-peeled metal nanoparticles are allowed to stand still for 30 minutes at room temperature until the color of the solution changes from yellow to cloudy blue. Can be prepared.
（量子ドット）
量子ドットとは、直径が２〜１０ｎｍ程度の量子井戸構造を有するナノ結晶である。量子ドットには、コア構造のみのものと、コア／シェル構造のものが知られている。前者の例としては、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳｅＴｅ等のＣｄ系量子ドット；ＰｂＳ、ＰｂＳｅ等のＰｂ系量子ドット；ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ等のＺｎ系量子ドット等が知られている。後者の例としてはＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳｅ／ＺｎＳ、ＧａＡｓ／ＡｌＧａＡｓ等の量子ドットが知られている。本実施形態においては、これらのいずれの量子ドットも使用することができる。
(Quantum dot)
A quantum dot is a nanocrystal having a quantum well structure with a diameter of about 2 to 10 nm. Quantum dots are known to have only a core structure and a core / shell structure. Known examples of the former include Cd-based quantum dots such as CdS, CdSe, CdTe, and CdSeTe; Pb-based quantum dots such as PbS and PbSe; and Zn-based quantum dots such as ZnSe and ZnTe. As examples of the latter, quantum dots such as CdSe / ZnS, CdSe / CdS / ZnS, CdSe / ZnSe / ZnS, and GaAs / AlGaAs are known. In the present embodiment, any of these quantum dots can be used.
量子ドットの蛍光波長は量子ドットの粒径に依存する。例えば、ＣｄＳｅ量子ドットでは、粒径を３〜５ｎｍに変化させることによって青緑から赤まで（５００〜６５０ｎｍ）の蛍光を発生させることができる。一般に、量子ドットの粒径は、合成反応の反応時間、合成に用いる有機金属化合物の熱分解反応の温度等により制御することができる。 The fluorescence wavelength of the quantum dot depends on the particle size of the quantum dot. For example, in CdSe quantum dots, fluorescence from blue-green to red (500 to 650 nm) can be generated by changing the particle size from 3 to 5 nm. In general, the particle size of the quantum dots can be controlled by the reaction time of the synthesis reaction, the temperature of the thermal decomposition reaction of the organometallic compound used for the synthesis, and the like.
また、量子ドットの蛍光波長は、量子ドットの材料の半導体の種類にも依存する。ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ等の半導体により、可視から近赤外（４００〜２０００ｎｍ）の蛍光を発する量子ドットを合成することができる。 The fluorescence wavelength of the quantum dot also depends on the type of semiconductor of the quantum dot material. Quantum dots that emit fluorescence from visible to near infrared (400 to 2000 nm) can be synthesized using a semiconductor such as ZnSe, CdS, CdSe, CdSeTe, PbS, and PbSe.
量子ドットの合成法には、主にトップダウン法とボトムアップ法の２種類存在する。トップダウン法においては、半導体基板に電子ビームリソグラフィーや分子線エピタキシー法等を用いて量子ドットを合成する。ボトムアップ法においては、液相で化学合成する。また、液相での化学合成には、主に水溶液中で合成するものと有機溶媒中で合成する方法の２種類存在する。 There are two main types of quantum dot synthesis methods, a top-down method and a bottom-up method. In the top-down method, quantum dots are synthesized on a semiconductor substrate using electron beam lithography, molecular beam epitaxy, or the like. In the bottom-up method, chemical synthesis is performed in the liquid phase. In addition, there are two types of chemical synthesis in the liquid phase, mainly synthesized in an aqueous solution and synthesized in an organic solvent.
水溶液中での合成では、例えば、チオール系化合物を保護剤として、カドミウム塩の水溶液にテルル化水素ナトリウム等を反応させることによってＣｄＴｅ量子ドットを合成することができる。 In synthesis in an aqueous solution, for example, CdTe quantum dots can be synthesized by reacting sodium hydride or the like with an aqueous solution of a cadmium salt using a thiol compound as a protective agent.
有機溶媒中での合成では、例えば、配位性有機化合物であるトリオクチルフォスフィン（ＴＯＰ）やトリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を溶媒として、ジメチルカドミウム及びＳ、Ｓｅ、ＴｅのＴＯＰ錯体あるいは有機金属化合物を約３００℃で熱分解し、量子ドットを合成することができる。 In the synthesis in an organic solvent, for example, trioctylphosphine (TOP) or trioctylphosphine oxide (TOPO), which is a coordinating organic compound, is used as a solvent, and TOP complexes or organic compounds of dimethylcadmium and S, Se, Te. A metal compound can be thermally decomposed at about 300 ° C. to synthesize quantum dots.
本実施形態においては、これらのいずれの方法で合成された量子ドットも使用することができる。 In the present embodiment, quantum dots synthesized by any of these methods can be used.
（金属ナノ粒子及び量子ドットへのプローブの固定方法）
金属ナノ粒子及び量子ドットへのプローブの固定方法は特に限定されないが、例えば、金属ナノ粒子又は量子ドットの表面にアミノ基、カルボキシル基、チオール基等の官能基を導入し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）等の化学架橋剤を用いてプローブを固定することができる。金属ナノ粒子又は量子ドットの表面に官能基を導入する方法としては、例えば、金属ナノ粒子又は量子ドットを、８−メルカプトオクタン酸等の両親媒性のチオール化合物と反応させる方法等が挙げられる。
(Method of fixing probes to metal nanoparticles and quantum dots)
The method for fixing the probe to the metal nanoparticles and quantum dots is not particularly limited. For example, a functional group such as an amino group, a carboxyl group, or a thiol group is introduced on the surface of the metal nanoparticles or quantum dots, and 1-ethyl-3 Using a chemical crosslinking agent such as-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) The probe can be fixed. Examples of the method for introducing a functional group on the surface of the metal nanoparticle or quantum dot include a method of reacting the metal nanoparticle or quantum dot with an amphiphilic thiol compound such as 8-mercaptooctanoic acid.
（インキュベーション工程）
インキュベーション工程では、試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加してインキュベーションする。この工程により、試料中に標的物質が存在する場合には、標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブが結合し、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接する。金属ナノ粒子及び量子ドットの量は適宜設定すればよい。インキュベーション温度は、標的物質やプローブに応じて適宜選択できる。インキュベーション時間は、標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブの結合が平衡に達するのに要する時間に設定すればよく、例えば１時間である。
(Incubation process)
In the incubation step, the metal nanoparticle to which the first probe is immobilized and the quantum dot to which the second probe is immobilized are added to each of the sample and the negative control not containing the target substance and incubated. By this step, when the target substance is present in the sample, the target substance, the first probe, and the second probe are bound to bring the metal nanoparticles and the quantum dots close to each other. What is necessary is just to set the quantity of a metal nanoparticle and a quantum dot suitably. The incubation temperature can be appropriately selected depending on the target substance and the probe. The incubation time may be set to a time required for the binding of the target substance, the first probe, and the second probe to reach equilibrium, for example, 1 hour.
（蛍光測定工程）
蛍光測定工程では、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する。測定には、分光蛍光光度計等の一般的な蛍光測定機器を用いることができる。より具体的には、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照に対して、量子ドットの励起光を照射し、発生する蛍光強度を測定すればよい。
(Fluorescence measurement process)
In the fluorescence measurement step, the fluorescence intensity of the quantum dot in the sample after the incubation step and the negative control is measured. For the measurement, a general fluorescence measuring instrument such as a spectrofluorometer can be used. More specifically, the sample after the incubation step and the negative control may be irradiated with excitation light of quantum dots and the generated fluorescence intensity may be measured.
例えば、量子ドットとして可視光領域の蛍光を発するものを使用した場合、励起光照射装置があれば、蛍光測定機器を使わなくても、肉眼で観察することにより、蛍光を検出することも可能である。これにより、標的物質の検出が必要な現場において、標的物質の存在をその場で検出することが容易になる。 For example, when a quantum dot that emits fluorescence in the visible light region is used, if there is an excitation light irradiation device, it is possible to detect fluorescence by observing with the naked eye without using a fluorescence measurement device. is there. As a result, it becomes easy to detect the presence of the target substance on the spot at a site where the target substance needs to be detected.
（判定工程）
判定工程では、蛍光測定工程において測定された蛍光強度に基づいて、試料中に標的物質が存在したか否かを判定する。具体的には、試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する。また、上記したように、量子ドットとして可視光領域の蛍光を発するものを使用した場合には、蛍光測定機器を使わなくても肉眼で観察することにより、蛍光を検出することも可能である。そして、肉眼で蛍光強度の増強に基づいて、標的物質の存在又は不存在を判定することができる。
(Judgment process)
In the determination step, it is determined whether or not the target substance is present in the sample based on the fluorescence intensity measured in the fluorescence measurement step. Specifically, when the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample is stronger than the fluorescence intensity of the quantum dots in the negative control, it is determined that the target substance is present in the sample. As described above, when a quantum dot that emits fluorescence in the visible light region is used, it is possible to detect fluorescence by observing with the naked eye without using a fluorescence measuring device. The presence or absence of the target substance can be determined based on the enhancement of the fluorescence intensity with the naked eye.
（試料中の標的物質を定量する方法）
試料中の標的物質を定量する方法は、基本的には試料中の標的物質を検出する方法と同様であり、試料と共に既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料を用いる点が異なる。具体的には、試料及び既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料のそれぞれに第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加して、上記と同様のインキュベーション工程及び蛍光測定工程を行う。続いて、次に説明する定量工程を行う。
(Method of quantifying the target substance in the sample)
The method for quantifying the target substance in the sample is basically the same as the method for detecting the target substance in the sample, except that a plurality of standard samples containing a known concentration of the target substance are used together with the sample. Specifically, a metal nanoparticle having a first probe immobilized thereon and a quantum dot having a second probe immobilized thereon are added to each of a sample and a plurality of standard samples containing a target substance having a known concentration, and The same incubation step and fluorescence measurement step are performed. Subsequently, the quantitative process described below is performed.
（定量工程）
定量工程では、試料中の量子ドットの蛍光強度を、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度と比較することにより、試料中の標的物質の存在量を求める。例えば、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度をもとに検量線を作成し、試料中の量子ドットの蛍光強度をこの検量線に当てはめることにより、試料中の標的物質の濃度を求めることができる。
(Quantitative process)
In the quantification step, the abundance of the target substance in the sample is determined by comparing the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample with the fluorescence intensity of the quantum dots in the plurality of standard samples. For example, by creating a calibration curve based on the fluorescence intensity of quantum dots in multiple standard samples, and applying the fluorescence intensity of quantum dots in the sample to this calibration curve, the concentration of the target substance in the sample is determined. Can do.
（キット）
一実施形態において、試料中の標的物質の検出又は定量用キットは、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを含む。これらの第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットは、溶液の状態で供給されてもよいし、乾燥状態で供給され、使用時にバッファーに溶解又は懸濁させるものであってもよい。これらの金属ナノ粒子及び量子ドットを用いて、上記のインキュベーション工程、蛍光検出工程、判定工程又は定量工程を実施することにより、試料中の標的物質を検出又は定量することができる。
(kit)
In one embodiment, a kit for detecting or quantifying a target substance in a sample includes metal nanoparticles having a first probe immobilized thereon and quantum dots having a second probe immobilized thereon. The metal nanoparticles having the first probe immobilized thereon and the quantum dots having the second probe immobilized thereon may be supplied in a solution state or supplied in a dry state and dissolved or suspended in a buffer at the time of use. It may be turbid. By using these metal nanoparticles and quantum dots, the target substance in the sample can be detected or quantified by performing the incubation step, the fluorescence detection step, the determination step, or the quantification step.
別の実施形態に係る、試料中の標的物質の検出又は定量用キットにおいて、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットは、例えば、ろ紙などの媒体中に染みこませた状態で供給されてもよい。媒体は、使用に適した形状及びサイズに適宜調整されてよく、例えば短冊状であってよい。キットの使用時には、試料及び標的物質を含まない陰性対照を、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットが存在する媒体に滴下する。これにより、試料中に標的物質が存在する場合には、媒体中で標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブが結合し、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接する。蛍光検出工程において、媒体に励起光を照射することにより、量子ドットから蛍光が発生する。本実施形態のキットは、特に、標的物質の迅速な検出が必要な、現場での簡易検出に適している。 In the kit for detecting or quantifying a target substance in a sample according to another embodiment, the metal nanoparticle to which the first probe is immobilized and the quantum dot to which the second probe is immobilized are, for example, a medium such as filter paper. You may supply in the state soaked in. The medium may be appropriately adjusted to a shape and size suitable for use, and may be, for example, a strip shape. When using the kit, a sample and a negative control containing no target substance are dropped onto a medium in which the metal nanoparticles having the first probe immobilized thereon and the quantum dots having the second probe immobilized thereon are present. Thereby, when the target substance is present in the sample, the target substance, the first probe, and the second probe are bonded in the medium, and the metal nanoparticles and the quantum dots are brought close to each other. In the fluorescence detection step, fluorescence is generated from the quantum dots by irradiating the medium with excitation light. The kit of this embodiment is particularly suitable for on-site simple detection that requires rapid detection of a target substance.
（表面が滑らかな金粒子の調製）
表面が滑らかな金粒子の溶液（金コロイド溶液）１００ｍＬを作製した。まず、使用する全ての器具を王水（塩酸と硝酸を容量比３：１で混合した液体）で洗浄し、エタノール及び超純水（比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ）ですすいだ。次に、次のＡ液及びＢ液の２種類の溶液を準備した。
Ａ液：１％塩化金酸１ｍＬと純水７９ｍＬの混合溶液
Ｂ液：１％クエン酸４ｍＬ、１％タンニン酸０．０２５ｍＬ及び純水の混合溶液（合計２０ｍＬ）
続いて、Ａ液及びＢ液をそれぞれ約６０℃に加熱し、Ａ液を攪拌しながら、Ａ液にＢ液を素早く加えた。混合した溶液の色が赤くなった後、約５〜１０分間沸騰させることにより、金コロイドを作製した。なお、上記の方法において、Ｂ液のタンニン酸の容量を変化させることにより、金粒子の粒径を調整することができる。例えば、３．５〜１４ｎｍの粒径の金粒子を調製することができる。
(Preparation of gold particles with a smooth surface)
100 mL of a solution of gold particles with a smooth surface (gold colloid solution) was prepared. First, all the instruments to be used were washed with aqua regia (liquid in which hydrochloric acid and nitric acid were mixed at a volume ratio of 3: 1) and rinsed with ethanol and ultrapure water (specific resistance value 18.2 MΩ · cm). Next, the following two types of solutions A and B were prepared.
Solution A: Mixed solution of 1 mL of 1% chloroauric acid and 79 mL of pure water Solution B: Mixed solution of 4 mL of 1% citric acid, 0.025 mL of 1% tannic acid and pure water (total 20 mL)
Then, A liquid and B liquid were each heated to about 60 degreeC, and B liquid was rapidly added to A liquid, stirring A liquid. After the mixed solution turned red, it was boiled for about 5 to 10 minutes to prepare a gold colloid. In the above method, the particle size of the gold particles can be adjusted by changing the volume of tannic acid in the B liquid. For example, gold particles having a particle size of 3.5 to 14 nm can be prepared.
（金平糖状金ナノ粒子の調製）
使用する全ての器具を王水（塩酸と硝酸を容量比３：１で混合した液体）で洗浄し、エタノール及び超純水（比抵抗値１８．２ＭΩ・ｃｍ）ですすいだ。１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液を超純水で調製し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．４（２５℃）に調整した。続いて、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液１ｍＬと超純水９ｍＬを混合し、これに２０ｍＭ ＨＡｕＣｌ４溶液２５０μＬを添加した。室温で３０分以内に溶液の色が淡黄色からピンク色に変化し、最終的には不透明な青色になり、金平糖状金ナノ粒子を得た。
(Preparation of gold flat sugar-like nanoparticles)
All instruments used were washed with aqua regia (liquid in which hydrochloric acid and nitric acid were mixed at a volume ratio of 3: 1) and rinsed with ethanol and ultrapure water (resistivity value 18.2 MΩ · cm). A 100 mM HEPES solution was prepared with ultrapure water, and the pH was adjusted to 7.4 (25 ° C.) with 1 M NaOH. Subsequently, 1 mL of 100 mM HEPES solution and 9 mL of ultrapure water were mixed, and 250 μL of 20 mM HAuCl 4 solution was added thereto. Within 30 minutes at room temperature, the color of the solution changed from pale yellow to pink, and finally it became an opaque blue color, and gold flat sugar-like gold nanoparticles were obtained.
（量子ドットの調製）
チオール系化合物を保護剤としてＣｄＴｅ量子ドットを調製した。具体的には、０．９８５ｇ（２．３５ｍｍｏｌ）のＣｄ（ＣｌＯ４）２・６Ｈ２Ｏを１２５ｍＬの水に溶解し、５．７ｍｍｏｌのチオグリコール酸を撹拌しながら添加した。続いて、１Ｍ ＮａＯＨを滴下することによりｐＨを１１．４〜１１．６に調整した。この溶液を三つ口フラスコに入れ、窒素バブリングを３０分間行うことにより脱気した。続いて、溶液を撹拌しながら、ゆっくりとした窒素ガスの流れと共に、Ｈ２Ｔｅガスを溶液中に２０分間通した。Ｈ２Ｔｅガスは、窒素雰囲気下で、０．２ｇ（０．４６ｍｍｏｌ）のＡｌ２Ｔｅ３の塊と、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４ １５〜２０ｍＬとを反応させることにより調製した。凝縮装置を連結し、反応混合物を１００℃、大気下（ｏｐｅｎ−ａｉｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で２０分間還流することにより、ＣｄＴｅ前駆体が生成し、ＣｄＴｅナノ結晶に変換された。
(Preparation of quantum dots)
CdTe quantum dots were prepared using a thiol compound as a protective agent. Specifically, 0.985 g (2.35 mmol) of Cd (ClO 4 ) 2 · 6H 2 O was dissolved in 125 mL of water, and 5.7 mmol of thioglycolic acid was added with stirring. Subsequently, the pH was adjusted to 11.4 to 11.6 by dropwise addition of 1M NaOH. This solution was put into a three-necked flask and deaerated by performing nitrogen bubbling for 30 minutes. Subsequently, H 2 Te gas was passed through the solution for 20 minutes with a slow flow of nitrogen gas while stirring the solution. H 2 Te gas was prepared by reacting a mass of 0.2 g (0.46 mmol) of Al 2 Te 3 with 15-20 mL of 0.5 MH 2 SO 4 under a nitrogen atmosphere. A condenser was connected and the reaction mixture was refluxed at 100 ° C. under open-air condition for 20 minutes to produce a CdTe precursor, which was converted to CdTe nanocrystals.
（金ナノ粒子へのプローブの固定）
金ナノ粒子を、まず、８−メルカプトオクタン酸で修飾した。１．０ｍＬの８−メルカプトオクタン酸を９．０ｍＬの金平糖状金ナノ粒子と混合し、終濃度０．５ｍＭに調整した。室温で一晩、穏やかに振とうしながらインキュベートすることにより、金ナノ粒子の表面に８−メルカプトオクタン酸の単膜層（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ、ＳＡＭ）を形成した。続いて、溶液を４０００ｒｐｍ、１５分、４℃遠心し、上清を捨て、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）でペレットをすすいだ。この洗浄操作を３回以上繰り返して結合しなかった８−メルカプトオクタン酸を除去し、８−メルカプトオクタン酸で修飾した金ナノ粒子を５ｍＬの水に懸濁した。続いて、４００μＬの０．１Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を添加し、１０分間インキュベートした後に、１００μＬの０．１Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を添加した。続いて、抗ウシＩｇＧヤギ抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。この混合溶液を、穏やかに振とうしながら室温で８時間インキュベートし、上記と同様の遠心／すすぎ工程を３回以上繰り返して、結合しなかった抗ウシＩｇＧヤギ抗体を除去した。最終的なペレットを５．０ｍＬのリン酸緩衝液に懸濁し、使用するまで４℃で保存した。この方法は、表面が滑らかな金ナノ粒子及び金平糖状金ナノ粒子のいずれにも使用できる。
(Immobilization of probes to gold nanoparticles)
Gold nanoparticles were first modified with 8-mercaptooctanoic acid. 1.0 mL of 8-mercaptooctanoic acid was mixed with 9.0 mL of confetti gold nanoparticles and adjusted to a final concentration of 0.5 mM. By incubating overnight at room temperature with gentle shaking, a monolayer of 8-mercaptooctanoic acid (Self-Assembled Monolayer, SAM) was formed on the surface of the gold nanoparticles. Subsequently, the solution was centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was discarded, and the pellet was rinsed with a phosphate buffer (PBS, 0.01 M, pH 7.4). This washing operation was repeated three times or more to remove unmerged 8-mercaptooctanoic acid, and gold nanoparticles modified with 8-mercaptooctanoic acid were suspended in 5 mL of water. Subsequently, 400 μL of 0.1 M 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) was added and incubated for 10 minutes before 100 μL of 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS) was added. Added. Subsequently, an anti-bovine IgG goat antibody was added to a final concentration of 10 μg / mL. This mixed solution was incubated at room temperature for 8 hours with gentle shaking, and the same centrifugation / rinsing step as described above was repeated three times or more to remove unbound anti-bovine IgG goat antibody. The final pellet was suspended in 5.0 mL phosphate buffer and stored at 4 ° C. until use. This method can be used for both gold nanoparticles having a smooth surface and gold flat sugar-like gold nanoparticles.
（量子ドットへのプローブの固定）
予め８−メルカプトオクタン酸で修飾した量子ドットを、エタノールで２回洗浄した。続いて、ネオスポラタンパク質である、ＮｃＳＡＧ１又はＮｃＳＲＳ２を、上記の金ナノ粒子へのプローブの結合と同様の方法によって、量子ドットに結合した。プローブを結合した量子ドットは、１．０ｍＬのリン酸緩衝液で懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
(Fixing the probe to the quantum dot)
The quantum dots previously modified with 8-mercaptooctanoic acid were washed twice with ethanol. Subsequently, NcSAG1 or NcSRS2, which is a neospora protein, was bound to the quantum dots by the same method as the binding of the probe to the gold nanoparticles. The quantum dots to which the probe was bound were suspended in 1.0 mL of phosphate buffer and stored at 4 ° C. until use.
（実験例１）
（プローブを固定した量子ドットにおける蛍光波長及び蛍光強度の変化の検討）
プローブを固定していない量子ドット、ネオスポラタンパク質であるＮｃＳＡＧ１を固定した量子ドット、及びネオスポラタンパク質であるＮｃＳＲＳ２を固定した量子ドットの蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトルの測定には、分光蛍光光度計（蛍光マイクロプレートリーダー）インフィニットＭ２００ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（商品名、ＴＥＣＡＮ社製）を用いた。
(Experimental example 1)
(Examination of changes in fluorescence wavelength and fluorescence intensity in quantum dots with fixed probes)
The fluorescence spectrum of the quantum dot which did not fix | immobilize the probe, the quantum dot which fixed NcSAG1 which is Neospora protein, and the quantum dot which fixed NcSRS2 which is Neospora protein was measured. A spectrofluorometer (fluorescence microplate reader) Infinite M200 NanoQuant (trade name, manufactured by TECAN) was used for the measurement of the fluorescence spectrum.
結果を図３に示す。量子ドットにプローブを固定しても蛍光波長には変化が認められなかった。 The results are shown in FIG. Even when the probe was fixed to the quantum dots, no change was observed in the fluorescence wavelength.
（実施例１）
（表面の滑らかな金ナノ粒子と量子ドットを用いた牛ネオスポラ症の感染の検出）
量子ドットに抗ウシＩｇＧヤギ抗体を固定した。また、表面の滑らかな金ナノ粒子に組換え体ネオスポラタンパク質ＮｃＳＡＧ１を固定した。これらの量子ドット及び金ナノ粒子の混合溶液に、牛ネオスポラ症に感染したウシの血清（陽性血清）と健常な牛の血清（陰性血清）をそれぞれ添加し、１時間インキュベートした後に蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。陽性血清を添加した場合の蛍光強度と陰性血清を添加した場合の蛍光強度との間に有意な差が認められ、この方法により牛ネオスポラ症の感染を検出できることが示された。陽性血清を添加した場合の蛍光強度は、陰性血清を添加した場合の蛍光強度と比較して９％増強した。
Example 1
(Detection of bovine neosporosis infection using smooth gold nanoparticles and quantum dots)
Anti-bovine IgG goat antibody was immobilized on the quantum dots. In addition, recombinant neospora protein NcSAG1 was immobilized on gold nanoparticles having a smooth surface. Serum of bovine neosporosis-infected bovine serum (positive serum) and healthy bovine serum (negative serum) are added to the mixed solution of these quantum dots and gold nanoparticles, and the fluorescence intensity is measured after incubation for 1 hour. did. The results are shown in FIG. A significant difference was observed between the fluorescence intensity when the positive serum was added and the fluorescence intensity when the negative serum was added, indicating that this method can detect bovine neosporosis infection. The fluorescence intensity when positive serum was added was increased by 9% compared to the fluorescence intensity when negative serum was added.
（実施例２）
（金平糖状金ナノ粒子と量子ドットを用いた牛ネオスポラ症の感染の検出）
量子ドットに組換え体ネオスポラタンパク質ＮｃＳＡＧ１を固定した。また、金平糖状金ナノ粒子に抗ウシＩｇＧヤギ抗体を固定した。これらの量子ドット及び金ナノ粒子の混合溶液に、リン酸緩衝液、牛ネオスポラ症に感染したウシの血清（陽性血清）と健常な牛の血清（陰性血清）をそれぞれ添加し、１時間インキュベートした後に蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。陽性血清を添加した場合の蛍光強度と陰性血清を添加した場合の蛍光強度との間に有意な差が認められ、この方法により牛ネオスポラ症の感染を検出できることが示された。陽性血清を添加した場合の蛍光強度は、陰性血清を添加した場合の蛍光強度と比較して１８％増加した。実施例１と実施例２では、量子ドット及び金ナノ粒子に固定したプローブがそれぞれ逆になっているが、いずれの場合においても牛ネオスポラ症の感染を検出できることが示された。また、金平糖状金ナノ粒子を用いることにより、表面の滑らかな金ナノ粒子を用いた場合よりも蛍光強度の増強が強いことが示された。
(Example 2)
(Detection of bovine neosporosis infection using gold-peeled gold nanoparticles and quantum dots)
Recombinant neospora protein NcSAG1 was immobilized on the quantum dots. In addition, an anti-bovine IgG goat antibody was immobilized on gold-plated sugar-like gold nanoparticles. A phosphate buffer, bovine serum infected with bovine neosporosis (positive serum), and healthy bovine serum (negative serum) were added to the mixed solution of these quantum dots and gold nanoparticles, respectively, and incubated for 1 hour. Later, the fluorescence intensity was measured. The results are shown in FIG. A significant difference was observed between the fluorescence intensity when the positive serum was added and the fluorescence intensity when the negative serum was added, indicating that this method can detect bovine neosporosis infection. The fluorescence intensity when positive serum was added increased by 18% compared to the fluorescence intensity when negative serum was added. In Example 1 and Example 2, the probes immobilized on the quantum dots and the gold nanoparticles were reversed, but it was shown that in any case, the infection of bovine neosporosis can be detected. In addition, it was shown that the fluorescence intensity was enhanced more strongly by using gold flat sugar-like gold nanoparticles than when gold nanoparticles having a smooth surface were used.
（実施例３）
（金平糖状金ナノ粒子と量子ドットを用いた牛ネオスポラ症の感染の検出）
実施例２と異なるプローブを用いた検討を行った。量子ドットに組換え体ネオスポラタンパク質ＮｃＳＲＳ２を固定した。また、金平糖状金ナノ粒子に抗ウシＩｇＧヤギ抗体を固定した。これらの量子ドット及び金ナノ粒子の混合溶液に、リン酸緩衝液、牛ネオスポラ症に感染したウシの血清（陽性血清）と健常な牛の血清（陰性血清）をそれぞれ添加し、１時間インキュベートした後に蛍光強度を測定した。結果を図６に示す。陽性血清を添加した場合の蛍光強度と陰性血清を添加した場合の蛍光強度との間に有意な差が認められ、この方法により牛ネオスポラ症の感染を検出できることが示された。陽性血清を添加した場合の蛍光強度は、陰性血清を添加した場合の蛍光強度と比較して４８％増加した。
(Example 3)
(Detection of bovine neosporosis infection using gold-peeled gold nanoparticles and quantum dots)
A study using a probe different from that in Example 2 was performed. Recombinant neospora protein NcSRS2 was immobilized on the quantum dots. In addition, an anti-bovine IgG goat antibody was immobilized on gold-plated sugar-like gold nanoparticles. A phosphate buffer, bovine serum infected with bovine neosporosis (positive serum), and healthy bovine serum (negative serum) were added to the mixed solution of these quantum dots and gold nanoparticles, respectively, and incubated for 1 hour. Later, the fluorescence intensity was measured. The results are shown in FIG. A significant difference was observed between the fluorescence intensity when the positive serum was added and the fluorescence intensity when the negative serum was added, indicating that this method can detect bovine neosporosis infection. The fluorescence intensity when positive serum was added increased by 48% compared to the fluorescence intensity when negative serum was added.
（実施例４）
（インフルエンザタンパクの検出）
量子ドットに抗インフルエンザＨ１Ｎ１ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体（ポリクローナル抗体）を固定した。また、金ナノ粒子に抗インフルエンザＨ１Ｎ１ ＨＡ抗体（ポリクローナル抗体）を固定した。９６ウェルプレートに、これらの量子ドット及び金ナノ粒子の混合溶液を分注し、組換え体インフルエンザＨ１Ｎ１ ＨＡタンパク質を、終濃度が１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ及び１ｐｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、３０分間インキュベートした後に蛍光強度を測定した。結果を図７に示す。組換え体インフルエンザＨ１Ｎ１ ＨＡタンパク質の濃度に応じた蛍光強度の増強（蛍光強度の増加）が得られた。この結果は、上記の方法により標的物質を定量できることを示す。
Example 4
(Influenza protein detection)
Anti-influenza H1N1 hemagglutinin (HA) antibody (polyclonal antibody) was immobilized on the quantum dots. Further, an anti-influenza H1N1 HA antibody (polyclonal antibody) was immobilized on the gold nanoparticles. In a 96-well plate, a mixed solution of these quantum dots and gold nanoparticles is dispensed, and the recombinant influenza H1N1 HA protein has a final concentration of 1000 ng / mL, 100 ng / mL, 10 ng / mL, 1 ng / mL, 100 pg. / ML, 10 pg / mL, and 1 pg / mL, respectively, and incubated for 30 minutes, and then the fluorescence intensity was measured. The results are shown in FIG. An increase in fluorescence intensity (increase in fluorescence intensity) according to the concentration of the recombinant influenza H1N1 HA protein was obtained. This result shows that the target substance can be quantified by the above method.
１０・・・量子ドット、１１・・・第２のプローブ、２０・・・金属ナノ粒子、２１・・・第１のプローブ、３０・・・標的物質。
DESCRIPTION OF
Claims (11)
試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加してインキュベーションするインキュベーション工程と、
インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する判定工程と、
を含み、
第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する、方法。 A method for detecting a target substance in a sample,
An incubation step of adding and incubating the metal nanoparticles having the first probe immobilized thereon and the quantum dots having the second probe immobilized thereto to each of the sample and the negative control not containing the target substance;
A fluorescence measurement step for measuring the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample and the negative control after the incubation step;
A determination step of determining that the target substance is present in the sample when the fluorescence intensity of the quantum dot in the sample is stronger than the fluorescence intensity of the quantum dot in the negative control;
Including
The first probe and the second probe bind to the target substance but do not bind to each other, and the first probe and the second probe bind to the target substance, thereby bringing the metal nanoparticles and the quantum dots close to each other, A method whereby the fluorescence intensity of the quantum dots is enhanced.
試料及び既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料のそれぞれに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを添加してインキュベーションするインキュベーション工程と、
インキュベーション工程後の試料及び複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
試料中の量子ドットの蛍光強度を、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度と比較して、試料中の標的物質を定量する定量工程と、
を含み、
第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する、方法。 A method for quantifying a target substance in a sample, comprising:
An incubation step of adding and incubating a metal nanoparticle to which the first probe is immobilized and a quantum dot to which the second probe is immobilized to each of the sample and a plurality of standard samples containing a target substance having a known concentration;
A fluorescence measurement step for measuring the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample after the incubation step and the plurality of standard samples;
A quantitative process for quantifying the target substance in the sample by comparing the fluorescence intensity of the quantum dots in the sample with the fluorescence intensity of the quantum dots in a plurality of standard samples;
Including
The first probe and the second probe bind to the target substance but do not bind to each other, and the first probe and the second probe bind to the target substance, thereby bringing the metal nanoparticles and the quantum dots close to each other, A method whereby the fluorescence intensity of the quantum dots is enhanced.
第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットを含み、
第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する、キット。 A kit for detecting or quantifying a target substance in a sample,
Comprising metal nanoparticles having a first probe immobilized thereon and quantum dots having a second probe immobilized thereon,
The first probe and the second probe bind to the target substance but do not bind to each other, and the first probe and the second probe bind to the target substance, thereby bringing the metal nanoparticles and the quantum dots close to each other, This increases the fluorescence intensity of the quantum dots.
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