JP6078875B2 - Water-soluble superparamagnetic nanoparticles - Google Patents
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Description
本発明は、水溶性超常磁性ナノ粒子、及びその製造方法に関する。 The present invention relates to water-soluble superparamagnetic nanoparticles and a method for producing the same.
近年、生体適合性を有する超常磁性ナノ粒子について、輸送剤、MRIの造影剤、生体分子の固定／分離、標識剤、及びセンサー等の医学的な応用を目指し、盛んに研究がなされている。これらの用途において、超常磁性ナノ粒子に求められる重要な特性は、水（蒸留水、生理食塩水又はリンゲル液等）に対して良好な溶解性、分散性又は懸濁性を示すこと、及び抗体等と結合可能な官能基を表面に有することである。 In recent years, superparamagnetic nanoparticles having biocompatibility have been actively studied for medical applications such as transport agents, MRI contrast agents, biomolecule immobilization / separation, labeling agents, and sensors. In these applications, the important characteristics required for superparamagnetic nanoparticles are that they exhibit good solubility, dispersibility or suspendability in water (distilled water, physiological saline, Ringer's solution, etc.), and antibodies. And having a functional group capable of binding to the surface.
上記特性を有する超常磁性ナノ粒子として、これまでに、コアに酸化鉄、シェルにポリマー等の有機物を結合したポリマー酸化鉄ナノコンポジットが開発されている（非特許文献１、２）。
As superparamagnetic nanoparticles having the above characteristics, polymer iron oxide nanocomposites in which an iron oxide is bonded to the core and an organic substance such as a polymer is bonded to the shell have been developed (Non-Patent
しかしながら、上記のこれまでに開発された酸化鉄ナノコンポジットは、水に対する分散性が不充分であるという問題があり、また、製造が複雑であることから、時間と経費の点においても課題を有していた。 However, the iron oxide nanocomposites developed so far have the problem of insufficient dispersibility in water, and the manufacturing is complicated, so there are also problems in terms of time and cost. Was.
本発明は、水溶性の新規ハイパーブランチポリマーで表面を修飾した水溶性超常磁性ナノ粒子、及びその簡便な製造方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide water-soluble superparamagnetic nanoparticles whose surface is modified with a novel water-soluble hyperbranched polymer, and a simple production method thereof.
本発明者らは、上記の課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、細胞毒性を示さず、かつタンパク質やペプチドと結合可能な官能基を表面に有する水溶性超常磁性ナノ粒子を合成することに成功し、本発明に至った。かかる知見に基づき、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have synthesized water-soluble superparamagnetic nanoparticles that do not show cytotoxicity and have functional groups that can bind to proteins and peptides on the surface. The present invention has been achieved successfully. As a result of further research based on this knowledge, the present invention has been completed.
即ち、本発明は、水溶性ハイパーブランチポリマーで表面修飾した水溶性超常磁性ナノ粒子、及びその簡便な製造方法を提供する。 That is, the present invention provides water-soluble superparamagnetic nanoparticles whose surface is modified with a water-soluble hyperbranched polymer, and a simple production method thereof.
項１．水溶性ハイパーブランチポリマーで表面修飾された水溶性超常磁性ナノ粒子。
項２．超常磁性ナノ粒子の表面に、反応性官能基を導入し、次いで水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーを反応させることにより得られる、項１に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子。
項３．反応性官能基を含有するシランカップリング剤で処理することにより、反応性官能基を導入する、項２に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子。
Item 3. Item 3. The water-soluble superparamagnetic nanoparticles according to
項４．反応性官能基を含有するシランカップリング剤が、アミノアルキルトリアルコキシシランである、項２又は３に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子。
Item 4. Item 4. The water-soluble superparamagnetic nanoparticles according to
項５．水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーが、アルキレンジグリコールジ（メタ）アクリレート及びトリス−２−アミノアルキルアミンである、項２〜４のいずれか１項に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子。
項６．さらに、下記一般式（２）で表される酸無水物で処理することにより得られる、項５に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子。
Item 6. Item 6. The water-soluble superparamagnetic nanoparticles according to
項７．超常磁性ナノ粒子が、四酸化三鉄（Fe3O4）である、項１〜６のいずれか１項に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子。
Item 7. Item 7. The water-soluble superparamagnetic nanoparticles according to any one of
項８．３−アミノプロピルトリメチルアミン鎖を表面に導入した超常磁性ナノ粒子の存在下に、エチレンジグリコールジ（メタ）アクリレート及びトリス−２−アミノアルキルアミンを反応させることにより、水溶性ハイパーブランチポリマーで表面修飾された水溶性超常磁性ナノ粒子を製造する方法。 Item 8. A water-soluble hyperbranched polymer by reacting ethylenediglycol di (meth) acrylate and tris-2-aminoalkylamine in the presence of superparamagnetic nanoparticles having 3-aminopropyltrimethylamine chain introduced on the surface. A method for producing water-soluble superparamagnetic nanoparticles surface-modified with
項９．項１〜７のいずれか１項に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子を含有する、タンパク質の標識材料。
Item 9. Item 8. A protein labeling material comprising the water-soluble superparamagnetic nanoparticles according to any one of
項１０．項１〜７のいずれか１項に記載の水溶性超常磁性ナノ粒子を含有する、機能性MRI造影剤。
本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、水への分散性が極めて良好で細胞毒性を示さず、かつタンパク質やペプチドと結合可能な官能基を表面に有している。 The water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention have a very good dispersibility in water, do not exhibit cytotoxicity, and have functional groups capable of binding to proteins and peptides on the surface.
本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、超常磁性を示す。 The water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention exhibit superparamagnetism.
本発明の製造方法は、簡便であり、また、安価で入手容易な原料を用いることから、経済的に有利である。 The production method of the present invention is convenient and economically advantageous because it uses inexpensive and readily available raw materials.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、新規の水溶性ハイパーブランチポリマーにより超常磁性ナノ粒子表面が修飾された、新規物質である。
１．水溶性超常磁性ナノ粒子
１−１．超常磁性ナノ粒子
本発明の超常磁性ナノ粒子としては、特に限定されないが、例えば、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏの単体及び合金の化合物からなる、強磁性体及びフェリ磁性体の微粒子を用いることができる。具体的には、ＦｅＯ、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４（四酸化三鉄）、ＭｎＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、ＮｉＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ等が挙げられる。中でも、生体適合性の観点から、四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）が好ましい。
The water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention are novel substances in which the surface of superparamagnetic nanoparticles is modified with a novel water-soluble hyperbranched polymer.
1. Water-soluble superparamagnetic nanoparticles
1-1. Superparamagnetic nanoparticles The superparamagnetic nanoparticles of the present invention are not particularly limited. For example, it is possible to use ferromagnetic and ferrimagnetic fine particles composed of a simple substance of Fe, Mn, Ni, Co or an alloy compound. it can. Specifically, FeO, Fe 2 O 3, Fe 3 O 4 ( triiron tetroxide), MnFe 2 O 4, CoFe 2 O 4, NiFe 2 O 4, Fe, Co, Ni and the like. Among these, from the viewpoint of biocompatibility, triiron tetroxide (Fe 3 O 4 ) is preferable.
また、本発明の超常磁性ナノ粒子は、ナノオーダーの平均粒子径を有するものであれば特に限定されないが、通常、平均粒子径２〜４０ｎｍ程度のものが用いられる。好ましくは、平均粒子径５〜３０ｎｍである。ここで、平均粒子径とは、TEM（透過型電子顕微鏡）で測定した平均粒子径を指す。 The superparamagnetic nanoparticles of the present invention are not particularly limited as long as they have a nano-order average particle diameter, but those having an average particle diameter of about 2 to 40 nm are usually used. Preferably, the average particle size is 5 to 30 nm. Here, an average particle diameter refers to the average particle diameter measured with TEM (Transmission Electron Microscope).
１−２．水溶性ハイパーブランチポリマー
本発明の水溶性ハイパーブランチポリマーは、高度に分岐した樹状構造を有する高分子であって、水溶性のものである。
1-2. Water-soluble hyperbranched polymer The water-soluble hyperbranched polymer of the present invention is a polymer having a highly branched dendritic structure and water-soluble.
以下の製造方法に示すとおり、本発明のハイパーブランチポリマーは、Ａ２型モノマー＋Ｂ３型モノマーの重付加反応、又はＡ２＋Ａｘ型モノマーの重縮合反応等の反応により形成されるポリマーである。 As shown in the following production method, the hyperbranched polymer of the present invention is a polymer formed by a reaction such as a polyaddition reaction of A2 type monomer + B3 type monomer or a polycondensation reaction of A2 + Ax type monomer.
本発明の水溶性ハイパーブランチポリマーは、水溶性である限り、その数平均分子量は問わない。 As long as the water-soluble hyperbranched polymer of the present invention is water-soluble, the number average molecular weight is not limited.
２．製造方法
本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、下記（１）及び（２）の手順により製造される。（１）超常磁性ナノ粒子表面に、反応性官能基を導入する。
（２）超常磁性ナノ粒子表面の反応性官能基と、水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーを反応させる。
2. Production Method The water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention are produced by the following procedures (1) and (2). (1) A reactive functional group is introduced on the surface of superparamagnetic nanoparticles.
(2) The reactive functional group on the superparamagnetic nanoparticle surface is reacted with a water-soluble hyperbranched polymer-forming monomer.
以下、上記（１）及び（２）の手順について、説明する。 Hereinafter, the procedures (1) and (2) will be described.
２−１．超常磁性ナノ粒子表面への反応性官能基の導入
本発明において、超常磁性ナノ粒子は、水溶性ハイパーブランチポリマーにより表面を修飾するために、予め反応性官能基を超常磁性ナノ粒子表面に導入する。例えば、超常磁性ナノ粒子を、水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーと反応し得る官能基を有するシランカップリング剤で処理することにより、超常磁性ナノ粒子の表面に反応性官能基を導入することができる。
2-1. Introduction of Reactive Functional Group on Superparamagnetic Nanoparticle Surface In the present invention, superparamagnetic nanoparticles are preliminarily introduced with reactive functional groups on the surface of superparamagnetic nanoparticles in order to modify the surface with a water-soluble hyperbranched polymer. . For example, a reactive functional group can be introduced on the surface of the superparamagnetic nanoparticle by treating the superparamagnetic nanoparticle with a silane coupling agent having a functional group capable of reacting with a water-soluble hyperbranched polymer-forming monomer. .
上記シランカップリング剤としては、具体的には、下記一般式（１）で表される化合物が挙げられる。 Specific examples of the silane coupling agent include compounds represented by the following general formula (1).
（式中、Ｒ１はＣ１−４アルキル基を示し、Ｒ２はＣ１−５アルキレン基を示す。） (In the formula, R 1 represents a C 1-4 alkyl group, and R 2 represents a C 1-5 alkylene group.)
Ｃ１−４アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜４のアルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。 Examples of the C 1-4 alkyl group include linear or branched alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, and a t-butyl group.
Ｃ１−５アルキレン基としては、直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜５のアルキレン基が挙げられる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、２−メチルトリメチレン基、２，２−ジメチルトリメチレン基、１−メチルトリメチレン基、メチルメチレン基、エチルメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基等が挙げられる。 Examples of the C 1-5 alkylene group include linear or branched alkylene groups having 1 to 5 carbon atoms. Specifically, methylene group, ethylene group, trimethylene group, 2-methyltrimethylene group, 2,2-dimethyltrimethylene group, 1-methyltrimethylene group, methylmethylene group, ethylmethylene group, tetramethylene group, pentane A methylene group etc. are mentioned.
上記一般式（１）で表される化合物としては、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。 Examples of the compound represented by the general formula (1) include 3-aminopropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane, and the like.
一般式（１）で表されるシランカップリング剤において、アミノ基は末端にあることが好ましいが、末端になくてもよい。また、Ｒ２は、アルキレン基以外の基、例えば、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎ＝２〜１０）、−［Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｏ］ｎ−（ここで、ｎ＝１〜６）、−［Ｓｉ（Ｃ２Ｈ５）２Ｏ］ｎ−（ここで、ｎ＝１〜６）、−［Ｓｉ（ＯＣＨ３）２Ｏ］ｎ−（ここで、ｎ＝１〜６）、−［Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）２Ｏ］ｎ−（ここで、ｎ＝１〜６）等であってもよい。このようなシランカップリング剤としては、具体的には、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。 In the silane coupling agent represented by the general formula (1), the amino group is preferably at the terminal, but may not be at the terminal. R 2 is a group other than an alkylene group, for example, —O (CH 2 ) n— (where n = 2 to 10), — [Si (CH 3 ) 2 O] n— (where n = 1~6), - [Si ( C 2 H 5) 2 O] n- ( where, n = 1~6), - [ Si (OCH 3) 2 O] n- ( where, n = 1 ~6), - [Si (OC 2 H 5) 2 O] n- ( where it may be a n = 1 to 6) or the like. Specific examples of such silane coupling agents include 3- (2-aminoethylamino) propyltriethoxysilane and 3- (2-aminoethylamino) propyltrimethoxysilane.
さらに、一般式（１）で表されるシランカップリング剤において、水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーと反応し得る官能基としては、アミノ基以外にも、例えば、メルカプト基、グリシジル基、ウレイド基、ビニル基等の基であってもよい。 Furthermore, in the silane coupling agent represented by the general formula (1), as a functional group capable of reacting with the water-soluble hyperbranched polymer-forming monomer, in addition to an amino group, for example, a mercapto group, a glycidyl group, a ureido group, It may be a group such as a vinyl group.
アミノ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤としては、具体的には、３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、３−ウレイドプロピルトリエトキシシラン、３−ビニルプロピルトリエトキシシラン、３−ビニツプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。 Specific examples of the silane coupling agent having a reactive functional group other than an amino group include 3-isocyanatopropyltriethoxysilane, 3-mercaptopropylmethyldimethoxysilane, 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, 2- (3 , 4-epoxycyclohexyl) ethyltrimethoxysilane, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, 3-glycidoxypropylmethyldiethoxysilane, 3-glycidoxypropyltriethoxysilane, 3-ureidopropyltriethoxysilane, Examples thereof include 3-vinylpropyltriethoxysilane and 3-vinylpropylpropyltrimethoxysilane.
また、シランカップリング剤は、前記一般式（１）のようなトリアルコキシシラン化合物でなくてもよく、例えば、ジアルコキシシラン化合物、モノジアルコキシシラン化合物であってもよいし、超常磁性ナノ粒子と反応する官能基が、アルコキシ基以外の基、例えば、イソシアネート基、メルカプト基、グリシジル基、ウレイド基、ビニル基等であってもよい。 Further, the silane coupling agent may not be a trialkoxysilane compound as represented by the general formula (1), for example, a dialkoxysilane compound or a monodialkoxysilane compound, or superparamagnetic nanoparticles. The functional group that reacts with may be a group other than an alkoxy group, such as an isocyanate group, a mercapto group, a glycidyl group, a ureido group, or a vinyl group.
上記式（１）で表される、末端にアミノ基を有する化合物を用いて超常磁性ナノ粒子表面をアミノ基で修飾する場合、その反応は、下記反応式−１で示されるとおりである。 When the surface of the superparamagnetic nanoparticle is modified with an amino group using a compound having an amino group at the terminal represented by the above formula (1), the reaction is as shown in the following reaction formula-1.
（式中、●は超常磁性ナノ粒子を示し、Ｒ１はＣ１−４アルキル基を示し、Ｒ２はＣ１−５アルキレン基を示す。） (In the formula, ● represents superparamagnetic nanoparticles, R 1 represents a C 1-4 alkyl group, and R 2 represents a C 1-5 alkylene group.)
すなわち、超常磁性ナノ粒子の表面のヒドロキシル基と、シランカップリング剤の反応により、アルコールが脱離し、超常磁性ナノ粒子の表面にアミノ基が結合される。 That is, the alcohol is eliminated by the reaction between the hydroxyl group on the surface of the superparamagnetic nanoparticle and the silane coupling agent, and the amino group is bonded to the surface of the superparamagnetic nanoparticle.
アルコキシシランカップリング剤を用いて超常磁性ナノ粒子を処理する場合、超常磁性ナノ粒子を、アルコール及び水からなる混合溶媒に懸濁させ、この懸濁液中にシランカップリング剤を投入攪拌することにより、シランカップリングと超常磁性ナノ粒子のヒドロキシル基との反応が行われる。 When superparamagnetic nanoparticles are treated using an alkoxysilane coupling agent, the superparamagnetic nanoparticles are suspended in a mixed solvent composed of alcohol and water, and the silane coupling agent is added to the suspension and stirred. The reaction between the silane coupling and the hydroxyl group of the superparamagnetic nanoparticle is performed.
超常磁性ナノ粒子表面への官能基の付加は、上記のように１段階反応によってもよいし、必要に応じ、２段階で行われてもよい。例えば、上記反応式−１に示されるように、まず超常磁性ナノ粒子をアミノアルキルトリアルコキシシランで処理することにより表面アミノ基修飾超常磁性ナノ粒子を調製した後、得られた表面アミノ基修飾超常磁性ナノ粒子を、下記一般式（２）で表される酸無水物などで処理することにより、下記反応式−２で示されるように、表面カルボキシル基修飾超常磁性ナノ粒子を調製することができる。 The addition of the functional group to the superparamagnetic nanoparticle surface may be performed by a one-step reaction as described above, or may be performed in two steps as necessary. For example, as shown in the above reaction formula-1, after preparing superaminoparamagnetic nanoparticles having surface amino groups by first treating superparamagnetic nanoparticles with aminoalkyltrialkoxysilane, the superficial amino group-modified superparaffin obtained is prepared. By treating the magnetic nanoparticles with an acid anhydride or the like represented by the following general formula (2), surface carboxyl group-modified superparamagnetic nanoparticles can be prepared as shown in the following reaction formula-2. .
（式中、ＡはＣ２−３のアルキレン基を示す。） (In the formula, A represents a C 2-3 alkylene group.)
（式中、●は超常磁性ナノ粒子を示し、Ｒ２はＣ１−５アルキレン基を示し、Ｒ３はＣ２−３のアルキレン基を示す。） (In the formula, ● represents superparamagnetic nanoparticles, R 2 represents a C 1-5 alkylene group, and R 3 represents a C 2-3 alkylene group.)
Ｃ２−３のアルキレン基としては、具体的には、エチレン基、トリメチレン基が挙げられる。 Specific examples of the C 2-3 alkylene group include an ethylene group and a trimethylene group.
２−２．水溶性ハイパーブランチポリマーによる超常磁性ナノ粒子の表面修飾
上記１−１．の方法により得られた、表面が反応性官能基で修飾された超常磁性ナノ粒子に、水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーを反応させることにより、水溶性ハイパーブランチポリマーで表面修飾された超常磁性ナノ粒子を製造する。
2-2. Surface modification of superparamagnetic nanoparticles with water-soluble hyperbranched polymer 1-1. Superparamagnetic nanoparticles whose surface is modified with a water-soluble hyperbranched polymer by reacting the water-soluble hyperbranched polymer-forming monomer with the superparamagnetic nanoparticles whose surface is modified with a reactive functional group. Manufacturing.
水溶性ハイパーブランチポリマーは、基本的に、Ａ２型モノマー＋Ｂ３型モノマーの重付加反応、又はＡ２＋Ａｘ型モノマーの重縮合反応等の反応により形成される。ここで、ＡとＢは異なる官能基を意味し、数字及びｘは、１分子内の官能基の数を表す。すなわち、表面が反応性官能基で修飾された超常磁性ナノ粒子に、Ａ２型モノマー＋Ｂ３型モノマーを重付加させる、又はＡ２＋Ａｘ型モノマーを重縮合させることにより、水溶性ハイパーブランチポリマーで表面修飾された超常磁性ナノ粒子を製造することができる。中でも、Ａ２型モノマー＋Ｂ３型モノマーの重付加反応が好ましい。 The water-soluble hyperbranched polymer is basically formed by a reaction such as a polyaddition reaction of A2 type monomer + B3 type monomer or a polycondensation reaction of A2 + Ax type monomer. Here, A and B mean different functional groups, and the number and x represent the number of functional groups in one molecule. That is, the surface was modified with a water-soluble hyperbranched polymer by polyaddition of A2 type monomer + B3 type monomer or polycondensation of A2 + Ax type monomer to superparamagnetic nanoparticles whose surfaces were modified with reactive functional groups. Superparamagnetic nanoparticles can be produced. Among them, the polyaddition reaction of A2 type monomer + B3 type monomer is preferable.
Ａ２型モノマー＋Ｂ３型モノマーの重付加反応は、例えば、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリアルキレングリコールジ（メタ）アクリレート等のＡ２型モノマー、及びトリス−２−アミノアルキルアミン等のＢ３型モノマーを、溶媒中或いは無溶媒下、塩基存在下で重付加させることにより行われる。 The polyaddition reaction of A2 type monomer + B3 type monomer can be performed by, for example, converting A2 type monomer such as alkylene glycol di (meth) acrylate and polyalkylene glycol di (meth) acrylate, and B3 type monomer such as tris-2-aminoalkylamine. The polyaddition is carried out in the presence of a base in the presence or absence of a solvent.
アルキレングリコールジ（メタ）アクリレートとしては、具体的には、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、プロピレングリコールジメタクリレート、プロピレングリコールジアクリレート、ヘキサメチレンジメタクリレート、オクタメチレンジメタクリレート、ヘキサメチレンジアクリレート、オクタメチレンジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート等を挙げることができる。 As alkylene glycol di (meth) acrylate, specifically, ethylene glycol dimethacrylate, ethylene glycol diacrylate, propylene glycol dimethacrylate, propylene glycol diacrylate, hexamethylene dimethacrylate, octamethylene dimethacrylate, hexamethylene diacrylate, Examples include octamethylene diacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, and polyethylene glycol diacrylate.
トリス−（２−アミノアルキル）アミンとしては、具体的には、トリス−（２−アミノエチル）アミン、トリス−（２−アミノメチル）アミン、トリス−（２−アミノプロピル）アミン等を挙げることができる。 Specific examples of tris- (2-aminoalkyl) amine include tris- (2-aminoethyl) amine, tris- (2-aminomethyl) amine, and tris- (2-aminopropyl) amine. Can do.
例えば、エチレングリコールジメタクリレート及びトリス−（２−アミノエチル）アミンを用いる場合、下記反応式−３で表される反応となる。 For example, when ethylene glycol dimethacrylate and tris- (2-aminoethyl) amine are used, the reaction is represented by the following reaction formula-3.
この反応に用いられる溶媒としては、該反応に対して不活性な溶媒である限り公知の溶媒を広く使用することができる。例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、石油エーテル等の脂肪族もしくは脂環式炭化水素系溶媒、ベンゼン、クロロベンゼン、ニトロベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル系溶媒、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルホルムアニリド、Ｎ，Ｎ'−ジメチルイミダゾリノン、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒、スルホラン等のスルホン系溶媒を挙げることができる。これらの溶媒は、１種を単独で又は２種以上混合して使用される。 As the solvent used in this reaction, known solvents can be widely used as long as they are inert to the reaction. For example, aliphatic or alicyclic hydrocarbon solvents such as hexane, cyclohexane, heptane, petroleum ether, aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, chlorobenzene, nitrobenzene, toluene, xylene, methylene chloride, 1,2-dichloroethane, Halogenated hydrocarbon solvents such as chloroform and carbon tetrachloride, ether solvents such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether, and methyl-tert-butyl ether, methyl acetate, ethyl acetate Amide solvents such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylformanilide, N, N′-dimethylimidazolinone, N-methylpyrrolidone, etc. Examples thereof include nitrile solvents such as tonitrile and propionitrile, sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide, and sulfone solvents such as sulfolane. These solvents are used alone or in combination of two or more.
これらの溶媒は、原料となるモノマーの総重量に対し、通常１〜２０倍重量程度、好ましくは２〜１０倍重量程度使用される。 These solvents are usually used in an amount of about 1 to 20 times by weight, preferably about 2 to 10 times by weight, based on the total weight of monomers as raw materials.
塩基としては、例えば、ピリジン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、モルフォリン、ピペラジン、２−ピコリン、３−ピコリン、4−ピコリン、ジアザビシクロウンデセン（DBU）、ジアザビシクロノネン（DBN）等が挙げられる。 Examples of the base include pyridine, diethylamine, dimethylamine, triethylamine, trimethylamine, morpholine, piperazine, 2-picoline, 3-picoline, 4-picoline, diazabicycloundecene (DBU), diazabicyclononene (DBN). Etc.
塩基は、原料となるモノマーの総重量に対し、通常、０．００５〜０．１倍重量程度、好ましくは、０．０１〜１／９０倍重量程度使用される。 The base is usually used in an amount of about 0.005 to 0.1 times the weight, preferably about 0.01 to 1/90 times the weight of the total weight of the starting monomers.
上記Ａ２型モノマーとＢ３型モノマーとの使用割合は、広い範囲内から適宜選択することができるが、後者１モルに対して、前者を１．５モルより過剰に使用するのが好ましく、１．５１〜１．８モル使用するのがより好ましい。 The use ratio of the A2 type monomer and the B3 type monomer can be appropriately selected from a wide range, but the former is preferably used in excess of 1.5 mol with respect to 1 mol of the latter. It is more preferable to use 51 to 1.8 mol.
該反応は、通常、０〜４０℃で行うことができる。１０〜２５℃で反応を行うのが好ましい。 This reaction can be normally performed at 0-40 degreeC. The reaction is preferably carried out at 10 to 25 ° C.
反応時間は、原料化合物の種類及び反応温度等により異なり、一概には言えないが、通常、３〜５時間程度である。 The reaction time varies depending on the type of raw material compound and the reaction temperature, and cannot be generally specified, but is usually about 3 to 5 hours.
Ａ２型モノマー＋Ａｘ型モノマーの重縮合反応は、例えば、１級水酸基を２個有するアルカンジオール等のＡ２型モノマー、及び１級水酸基を３〜４個有するアルキルポリオール等のＡｘ型モノマーを、酸触媒存在下に、脱水縮合させることにより行われる。 The polycondensation reaction of A2 type monomer + Ax type monomer can be performed by, for example, converting an A2 type monomer such as alkanediol having 2 primary hydroxyl groups and an Ax type monomer such as alkyl polyol having 3 to 4 primary hydroxyl groups into an acid catalyst. It is carried out by dehydration condensation in the presence.
１級水酸基を２個有するアルカンジオールとしては、炭素数２〜８のアルカンジオールが挙げられ、具体的には、１，２−エタンジオール（エチレングリコール）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール（トリメチレングリコール）、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等が挙げられる。 Examples of the alkanediol having two primary hydroxyl groups include alkanediols having 2 to 8 carbon atoms, such as 1,2-ethanediol (ethylene glycol) and 1,2-propanediol (propylene glycol). 1,3-propanediol (trimethylene glycol), 1,4-butanediol, 1,6-hexanediol and the like.
１級水酸基を３〜４個有するアルキルポリオールとしては、例えば、トリオール、テトラオールが挙げられる。トリオールとしては、具体的には、トリメチロールメタン、トリメチロールエタン等が挙げられ、テトラオールとしては、例えば、ペンタエリスリトールが挙げられる。 Examples of the alkyl polyol having 3 to 4 primary hydroxyl groups include triol and tetraol. Specific examples of the triol include trimethylolmethane and trimethylolethane, and examples of the tetraol include pentaerythritol.
酸触媒としては、例えば、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、固体酸触媒等が挙げられる。 Examples of the acid catalyst include sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, and a solid acid catalyst.
酸触媒は、原料となるモノマーの総重量に対し、通常、０．００１〜０．３倍重量程度、好ましくは、０．００２〜０．２倍重量程度使用される。 The acid catalyst is usually used in an amount of about 0.001 to 0.3 times, preferably about 0.002 to 0.2 times the weight of the total weight of monomers as raw materials.
上記Ａ２型モノマーとＡｘ型モノマーとの使用割合は、広い範囲内から適宜選択することができるが、前者１モルに対して、後者を１モル以上使用するのが好ましく、１〜１．５モル使用するのがより好ましい。 The use ratio of the A2 type monomer and the Ax type monomer can be appropriately selected from a wide range, but it is preferable to use 1 mol or more of the latter with respect to 1 mol of the former. More preferably it is used.
該反応は、通常、１２０〜２５０℃で行うことができる。１４０〜２２０℃で反応を行うのが好ましい。 This reaction can be normally performed at 120-250 degreeC. The reaction is preferably carried out at 140 to 220 ° C.
反応時間は、原料化合物の種類及び反応温度等により異なり、一概には言えないが、通常、１〜４０時間程度である。 The reaction time varies depending on the type of raw material compound and the reaction temperature, and cannot be generally specified, but is usually about 1 to 40 hours.
また、上記反応により得られたハイパーブランチポリマーの末端遊離基を、他の官能基に変換することもできる。例えば、末端遊離基がアミノ基の場合に、酸無水物を反応させることにより、その末端をカルボキシル基に変換したり、末端遊離基がカルボキシル基の場合に、アミノ基含有化合物を反応させることにより、その末端をアミノ基に変換したり、末端遊離基がビニル基の場合に原子移動ラジカル重合（ATRP）により、その末端に、ポリマー鎖をグラフトさせたりすることができる。 Moreover, the terminal free radical of the hyperbranched polymer obtained by the said reaction can also be converted into another functional group. For example, by reacting an acid anhydride when the terminal free radical is an amino group, the terminal is converted to a carboxyl group, or when the terminal free radical is a carboxyl group, reacting an amino group-containing compound The terminal can be converted to an amino group, or the polymer chain can be grafted to the terminal by atom transfer radical polymerization (ATRP) when the terminal free radical is a vinyl group.
具体的には、ハイパーブランチポリマーの末端遊離基がアミノ基の場合、カルボキシル基含有化合物として、前記一般式（２）で表される酸無水物で処理することにより、その末端をカルボキシル基に変換することができる。 Specifically, when the terminal free radical of the hyperbranched polymer is an amino group, the terminal is converted to a carboxyl group by treating with an acid anhydride represented by the general formula (2) as a carboxyl group-containing compound. can do.
例えば、前記反応式−３で得られた水溶性超常磁性ナノ粒子に、上記一般式（２）で表される酸無水物として、無水コハク酸を用いて処理する場合、下記反応式−４で表される反応となる。 For example, when the water-soluble superparamagnetic nanoparticles obtained by the reaction formula-3 are treated with succinic anhydride as the acid anhydride represented by the general formula (2), the following reaction formula-4 is satisfied. It becomes the reaction expressed.
この反応には、公知の環状酸無水物のアミド化の条件を広く適用できる。例えば、前記反応式−３で得られた水溶性超常磁性ナノ粒子に、前記一般式（２）で表される酸無水物を、溶媒中或いは無溶媒下、塩基存在下に反応させることにより行われる。 For this reaction, known conditions for amidation of cyclic acid anhydrides can be widely applied. For example, the reaction is performed by reacting the water-soluble superparamagnetic nanoparticles obtained by the reaction formula-3 with the acid anhydride represented by the general formula (2) in a solvent or in the absence of a solvent in the presence of a base. Is called.
この反応に用いられる溶媒としては、該反応に対して不活性な溶媒である限り公知の溶媒を広く使用することができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられる。 As the solvent used in this reaction, known solvents can be widely used as long as they are inert to the reaction. For example, N, N-dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, chloroform, dichloromethane and the like can be mentioned.
これらの溶媒は、原料となる酸無水物の総重量に対し、通常、１〜２０倍重量程度、好ましくは２〜１０倍重量程度使用される。 These solvents are usually used in an amount of about 1 to 20 times by weight, preferably about 2 to 10 times by weight, based on the total weight of the acid anhydride as a raw material.
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン等が挙げられる。 Examples of the base include pyridine and triethylamine.
塩基は、原料となる酸無水物の総重量に対し、通常、０．００５〜０．１倍重量程度、好ましくは、０．０１〜１／９０倍重量程度使用される。 The base is usually used in an amount of about 0.005 to 0.1 times, preferably about 0.01 to 1/90 times the weight of the total weight of the acid anhydride as a raw material.
該反応は、通常、１０〜４０℃で行うことができる。１０〜２５℃で反応を行うのが好ましい。 This reaction can be normally performed at 10-40 degreeC. The reaction is preferably carried out at 10 to 25 ° C.
反応時間は、原料化合物の種類及び反応温度等により異なり、一概には言えないが、通常、１〜４８時間程度である。 The reaction time varies depending on the type of raw material compound and the reaction temperature, and cannot be generally specified, but is usually about 1 to 48 hours.
このように、遊離のアミノ基をカルボキシル基に変えることにより、酸に対する安定性を付与することができる。 Thus, the stability with respect to an acid can be provided by changing a free amino group into a carboxyl group.
３．用途
本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、その表面にタンパク質やペプチドと結合可能な官能基を有することから、例えば、タンパク質の標識材料、機能性MRI造影剤等の用途に用いることができる。
3. Applications The water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention have functional groups capable of binding to proteins and peptides on their surfaces, and therefore can be used for applications such as protein labeling materials and functional MRI contrast agents.
例えば、本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子表面上の当該官能基に、がんを認識する抗体を結合して機能性MRI造影剤とすれば、がんを体外からモニターすることができる。あるいは、アルツハイマー病の原因物質であるアミロイドと結合性を示すペプチドと架橋させて機能性MRI造影剤とすれば、アルツハイマー病型認知症を検知することができる。 For example, cancer can be monitored from outside the body by binding an antibody that recognizes cancer to the functional group on the surface of the water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention to form a functional MRI contrast agent. Alternatively, Alzheimer's disease type dementia can be detected by cross-linking with a peptide showing binding properties to amyloid, which is a causative agent of Alzheimer's disease, to obtain a functional MRI contrast agent.
以下、本発明について、具体的な実施例に基づいて、さらに詳細を説明する。本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲において適宜変更して実施することが可能である。 Hereinafter, the present invention will be described in further detail based on specific examples. The present invention is not limited to the following examples, and can be implemented with appropriate modifications without departing from the scope of the invention.
また、各種測定方法は下記のとおりである。
＜粉末XRD測定＞
試料を乳鉢ですりつぶした後、粉末用セルに成形した。この粉末用セルについて、Rigaku X-ray Diffractometer X線発生装置を用いて測定した。
＜FT-IR（赤外吸収スペクトル）測定＞
試料及びKBrを乳鉢で粉末混合し、ミクロ錠剤成形器によって成形した。この成形された試料について、Jasco FT-IR 660 plus spectrometerを用いて測定した。
＜XPS測定＞
試料を、両面テープを用いて金属板に付着させ、クレイトス アナリティカル リミテッド AXIS-HSiを用いて測定を行った。
＜TEM画像（電子顕微鏡）測定＞
エタノールに分散させた試料を網目状のセルですくい、十分に乾燥させた後、Transmission Electron Microscopeを用いて測定を行った。
＜TG-DTA測定＞
試料を乳鉢ですりつぶした後、示差熱・熱重量分析を、昇温速度毎分10℃、空気中で、Rigaku TAS-100を用いて行った。
＜磁化率測定＞
試料を乳鉢ですりつぶした後、これをグリスと混合し、得られた混合物をカプセルに入れ、カンタム・デザイン 磁気特性測定装置 MPMSを用いて測定した。
＜元素分析＞
十分に乾燥させた試料を乳鉢ですりつぶした後、ヤナコ分析工業（株）のCHN コーダーを用いて測定した。
Various measurement methods are as follows.
<Powder XRD measurement>
The sample was ground in a mortar and then formed into a powder cell. The powder cell was measured using a Rigaku X-ray Diffractometer X-ray generator.
<FT-IR (infrared absorption spectrum) measurement>
The sample and KBr were mixed with powder in a mortar and molded with a microtablet molding machine. The molded sample was measured using a Jasco FT-IR 660 plus spectrometer.
<XPS measurement>
The sample was adhered to a metal plate using a double-sided tape, and the measurement was carried out using Kratos Analytical Limited AXIS-HSi.
<TEM image (electron microscope) measurement>
A sample dispersed in ethanol was scooped with a mesh-like cell and dried sufficiently, and then measured using a Transmission Electron Microscope.
<TG-DTA measurement>
After the sample was ground in a mortar, differential thermal / thermogravimetric analysis was performed using a Rigaku TAS-100 in air at a heating rate of 10 ° C. per minute.
<Magnetic susceptibility measurement>
The sample was ground in a mortar and then mixed with grease. The obtained mixture was put in a capsule and measured using a Quantum Design magnetic property measuring apparatus MPMS.
<Elemental analysis>
The sufficiently dried sample was ground in a mortar and then measured using a CHN coder of Yanaco Analytical Industries.
実施例１
（１）Fe 3 O 4 −APTMSの合成
Example 1
(1) Synthesis of Fe 3 O 4 -APTMS
50mLのナスフラスコに、エタノール：水＝95:5（容量比）の混合溶媒を10mL調製し、これにFe3O4ナノ粒子（アルドリッチジャパン（株））を0.5157g（0.002227mol）を量り入れた。超音波洗浄器を用いて懸濁液とし、さらに3−アミノプロピルトリメチルアミン（APTMS）（アルドリッチジャパン（株））を5mL加えた。この時のナノ粒子とAPTMSのモル比は、1:4.5であった。この溶液を室温で24時間撹拌し、得られた生成物を、メタノールを用いて4回撹拌洗浄し、遠心分離によって取り出した。これを24時間減圧乾燥することにより、Fe3O4−APTMSを0.4869g得た。 In a 50 mL eggplant flask, prepare 10 mL of a mixed solvent of ethanol: water = 95: 5 (volume ratio), and weigh 0.5157 g (0.002227 mol) of Fe 3 O 4 nanoparticles (Aldrich Japan) into this. It was. The suspension was made using an ultrasonic cleaner, and 5 mL of 3-aminopropyltrimethylamine (APTMS) (Aldrich Japan Co., Ltd.) was further added. At this time, the molar ratio of nanoparticles to APTMS was 1: 4.5. The solution was stirred at room temperature for 24 hours, and the resulting product was stirred and washed four times with methanol and removed by centrifugation. This was dried under reduced pressure for 24 hours to obtain 0.4869 g of Fe 3 O 4 -APTMS.
得られたFe3O4−APTMSについて、XRDパターン、FT-IRスペクトル、XPSスペクトル、TEM画像、TG-DTA及び磁化率を測定し、結果を図２〜６及び図１７に示した。また、元素分析の結果、C,7.43%, H,1.42%,N,1.56%であった。 The obtained Fe 3 O 4 -APTMS was measured for XRD pattern, FT-IR spectrum, XPS spectrum, TEM image, TG-DTA, and magnetic susceptibility, and the results are shown in FIGS. The results of elemental analysis were C, 7.43%, H, 1.42%, and N, 1.56%.
（２）Fe 3 O 4 −APTMS−hypの合成 (2) Synthesis of Fe 3 O 4 -APTMS-hyp
50mLのナスフラスコに、Fe3O4−APTMS、エチレングリコールジメタクリレート（EGD）（東京化成工業株式会社）：トリス（２−アミノエチル）アミン（TAEA）（東京化成株式会社）を、下記表１に示したとおり、EGD：TAEA＝１：１に対し、Fe3O4−APTMS 0.0195gのモノマー比で入れ、ピリジン（和光純薬工業株式会社）を１滴加えた。5時間撹拌後、粘性が出たため、クロロホルム（和光純薬工業株式会社）を2mL添加して生成物を溶解した。これを、石油エーテル（和光純薬工業株式会社）40mLに入れ、30分撹拌後、1時間放置した。その後、上澄みを捨て、再度石油エーテル40mLを加えた。さらに、30分撹拌から石油エーテル追加までの手順を3回繰り返した。これを洗浄後、蒸留アセトン（和光純薬工業株式会社）を20mL加え、生成物を溶解し、蒸留アセトンを用いて3日間透析した後、48時間減圧乾燥した。乾燥後は黒色フィルム状の物質と黄色フィルム状の物質とが生成したため、別々に取り出した。 In a 50 mL eggplant flask, Fe 3 O 4 -APTMS, ethylene glycol dimethacrylate (EGD) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.): Tris (2-aminoethyl) amine (TAEA) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) are shown in Table 1 below. As shown in Fig. 1, EGD: TAEA = 1: 1 was added at a monomer ratio of Fe 3 O 4 -APTMS 0.0195 g, and 1 drop of pyridine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. After stirring for 5 hours, viscosity appeared and 2 mL of chloroform (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to dissolve the product. This was put into 40 mL of petroleum ether (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), stirred for 30 minutes, and allowed to stand for 1 hour. Thereafter, the supernatant was discarded, and 40 mL of petroleum ether was added again. Furthermore, the procedure from stirring for 30 minutes to adding petroleum ether was repeated three times. After washing this, 20 mL of distilled acetone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to dissolve the product, dialyzed with distilled acetone for 3 days, and then dried under reduced pressure for 48 hours. Since a black film-like substance and a yellow film-like substance were formed after drying, they were taken out separately.
得られたFe3O4−APTMS−hypについて、XRDパターン、FT-IRスペクトル、TEM画像、TG-DTA及び磁化率を測定し、結果を図７、８、１０、１１及び図１７に示した。また、元素分析の結果、C,44.65%, H,8.27%,N,13.39%であった。 The obtained Fe 3 O 4 -APTMS-hyp was measured for XRD pattern, FT-IR spectrum, TEM image, TG-DTA, and magnetic susceptibility, and the results are shown in FIGS. 7, 8, 10, 11 and 17. . The results of elemental analysis were C, 44.65%, H, 8.27%, and N, 13.39%.
（３）Fe 3 O 4 −APTMS−hyp−sucの合成 (3) Synthesis of Fe 3 O 4 -APTMS-hyp-suc
200mLのナスフラスコに、Fe3O4−APTMS−hypを0.1488g入れ、無水N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）（和光純薬工業株式会社）を45mL添加した。この溶液を、超音波洗浄器を用いて懸濁液にした。次いで、無水DMF5mLに無水コハク酸（和光純薬工業株式会社）0.0258g（0.000258mol）を溶解した無水コハク酸溶液を、懸濁液に滴下し、窒素置換を行った後、室温にて24時間撹拌した。撹拌終了後、遠心分離器を用いて分離し、得られた生成物を、さらにヘキサン（和光純薬工業株式会社）を用いて5回洗浄した。その後、生成物を24時間減圧乾燥し、Fe3O4−APTMS−hyp−sucを0.1238g得た。
得られたFe3O4−APTMS−hyp−sucについて、XRDパターン、FT-IRスペクトル、TEM画像、TG-DTA及び磁化率を測定し、結果を図１２、１３、１５〜１７に示した。また、元素分析の結果、C,45.09%, H,7.93%,N,14.26%であった。 The obtained Fe 3 O 4 -APTMS-hyp-suc was measured for XRD pattern, FT-IR spectrum, TEM image, TG-DTA and magnetic susceptibility, and the results are shown in FIGS. The results of elemental analysis were C, 45.09%, H, 7.93%, and N, 14.26%.
実施例２〜５
EGD：TAEAの割合を、表１に示したとおりに変更する以外は、実施例１（２）と同様にして、Fe3O4−APTMS−hypを得た。
Examples 2-5
Fe 3 O 4 -APTMS-hyp was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that the ratio of EGD: TAEA was changed as shown in Table 1.
実施例６
EGD：TAEAの割合を、表１に示したとおりに変更する以外は、実施例１（２）と同様にして、Fe3O4−APTMS−hypを得た。得られたFe3O4−APTMS−hypについて、XRDパターン、FT-IRスペクトル及びXPSスペクトルを測定し、結果を図７〜９に示した。
Example 6
Fe 3 O 4 -APTMS-hyp was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that the ratio of EGD: TAEA was changed as shown in Table 1. The obtained Fe 3 O 4 -APTMS-hyp was measured for XRD pattern, FT-IR spectrum and XPS spectrum, and the results are shown in FIGS.
実施例７
EGD：TAEAの割合を、1 : 1.5に変更する以外は、実施例１（２）と同様にして、Fe3O4−APTMS−hypを得た。得られたFe3O4−APTMS−hypを用いて、実施例１（３）と同様にして、Fe3O4−APTMS−hyp−sucを得た。結果を表２に示した。得られたFe3O4−APTMS−hyp−sucについて、XRDパターン、FT-IRスペクトル及びXPSスペクトルを測定し、結果を図１２〜１４に示した。
Example 7
Fe 3 O 4 -APTMS-hyp was obtained in the same manner as in Example 1 (2) except that the ratio of EGD: TAEA was changed to 1: 1.5. Obtained using the Fe 3 O 4 -APTMS-hyp, in the same manner as in Example 1 (3), to obtain a Fe 3 O 4 -APTMS-hyp- suc. The results are shown in Table 2. The obtained Fe 3 O 4 -APTMS-hyp- suc, XRD patterns, the FT-IR spectra and XPS spectra were measured, and the results are shown in Figure 12-14.
試験例１（水に対する溶解性）
実施例１で得られたFe3O4−APTMS−hyp (EGD : TAEA＝1 : 1)及びFe3O4−APTMS−hyp−suc (EGD : TAEA＝1 : 1)を、乳鉢ですりつぶした後、pH4.0及びpH9.0の緩衝溶液並びに蒸留水に投入し、スターラーを用いて室温で10分間撹拌し、水に対する溶解性を測定した。水に完全に分散するか、あるいは殆ど均一な状態を可溶とした。結果を表３に示した。
Test Example 1 (Solubility in water)
Fe 3 O 4 -APTMS-hyp (EGD: TAEA = 1: 1) and Fe 3 O 4 -APTMS-hyp-suc (EGD: TAEA = 1: 1) obtained in Example 1 were ground in a mortar. Thereafter, the solution was poured into buffer solutions of pH 4.0 and pH 9.0 and distilled water, stirred for 10 minutes at room temperature using a stirrer, and the solubility in water was measured. It was completely dispersed in water, or an almost uniform state was made soluble. The results are shown in Table 3.
末端の遊離アミノ基をカルボキシル基に変換することにより、酸性水溶液に対する溶解性が向上することが確認できた。 It was confirmed that the solubility in acidic aqueous solution was improved by converting the terminal free amino group to a carboxyl group.
試験例２（ゼータ電位）
実施例１及び７で得られたFe3O4−APTMS−hyp (EGD : TAEA)及びFe3O4−APTMS−hyp−suc (EGD : TAEA)を、乳鉢ですりつぶした後、蒸留水に投入し、日本ルフトmodel 502で、ゼータ電位を測定した。結果を表４に示した。なお、比較のためにFe3O4−APTMSについても同様にゼータ電位を測定した。
Test Example 2 (Zeta potential)
Fe 3 O 4 -APTMS-hyp (EGD: TAEA) and Fe 3 O 4 -APTMS-hyp-suc (EGD: TAEA) obtained in Examples 1 and 7 were ground in a mortar and then poured into distilled water. The zeta potential was then measured with a Japan Luft model 502. The results are shown in Table 4. For comparison, the zeta potential was similarly measured for Fe 3 O 4 -APTMS.
Fe3O4-APTMSからFe3O4-APTMS-hypへ、さらにFe3O4-APTMS-hyp-sucへと合成が進むにつれ、平均ゼータ電位の絶対値が小さくなることが確認できた。 From Fe 3 O 4-APTMS to Fe 3 O 4- APTMS-hyp, further as the synthesis proceeds to Fe 3 O 4 -APTMS-hyp- suc, it was confirmed that the absolute value of the average zeta potential becomes smaller.
試験例３（造影剤の精製）
実施例１で得られたFe3O4−APTMS−hypを、抗体タンパク質（ウサギ由来）に、架橋剤EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)/sulfo-NHS(N-Hydroxysuccinimide)により結合させ、ネオジウム強力磁石によりFe3O4−APTMS−hypと抗体タンパク質との複合体を回収した。未反応の抗体タンパク質は、この操作を３回繰り返す洗浄操作により除去した。図１８に精製図を示した。
Test Example 3 (Purification of contrast medium)
The Fe 3 O 4 -APTMS-hyp obtained in Example 1 was applied to an antibody protein (rabbit derived) as a crosslinking agent EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) / sulfo-NHS (N- Hydroxysuccinimide), and a complex of Fe 3 O 4 -APTMS-hyp and antibody protein was recovered with a neodymium strong magnet. Unreacted antibody protein was removed by a washing operation in which this operation was repeated three times. FIG. 18 shows a purification diagram.
図１８に示したとおり、本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、マクロファージの細胞膜抗原を認識する抗体分子と結合していることが確認された。また、当該結合体は、ネオジウム磁石により簡便に分離することができた。 As shown in FIG. 18, it was confirmed that the water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention were bound to antibody molecules that recognize cell membrane antigens of macrophages. Further, the conjugate could be easily separated with a neodymium magnet.
試験例４（生体試験）
実施例１で得られたFe3O4−APTMS−hypを、ザイモサン（βグルカン）に、架橋剤EDC/sulfo-NHSにより結合させ、１２時間絶食させたマウスへ胃ゾンデにより強制投与して、動物用MRI装置でモニターした（T1画像）。結果を図１９に示した。
Test example 4 (biological test)
Fe 3 O 4 -APTMS-hyp obtained in Example 1 was bound to zymosan (β-glucan) with a crosslinking agent EDC / sulfo-NHS and forcedly administered to a mouse fasted for 12 hours with a stomach tube. Monitored with an animal MRI machine (T1 image). The results are shown in FIG.
上記結合体をＭＲＩでモニターした結果、図１９に示したとおり、上記結合体は生体内において安定であり、造影剤として活用できることが検証できた。 As a result of monitoring the conjugate by MRI, it was verified that the conjugate was stable in vivo and could be used as a contrast agent, as shown in FIG.
試験例５（細胞毒性試験）
実施例１で得られたFe3O4−APTMS−hypを、PBS(Phosphate buffered saline)に分散させ、濃度勾配希釈した各サンプルを、マウスマクロファージ系細胞株（Raw264.7）の培養液(10% FBS, Dulbecc’s MEM)に添加して、２４時間培養した。細胞障害性の有無をMTTアッセイ法により検証した。結果を図２０に示した。
Test Example 5 (Cytotoxicity test)
Each sample obtained by dispersing Fe 3 O 4 -APTMS-hyp obtained in Example 1 in PBS (Phosphate buffered saline) and diluting with a concentration gradient was added to a culture solution of mouse macrophage cell line (Raw264.7) (10 % FBS, Dulbecc's MEM) and cultured for 24 hours. The presence or absence of cytotoxicity was verified by MTT assay. The results are shown in FIG.
上記結合体は、１００ｎＭの高濃度においても、全く細胞毒性を示さないことが確認できた（図２０参照）。 It was confirmed that the conjugate did not show any cytotoxicity even at a high concentration of 100 nM (see FIG. 20).
本発明の水溶性超常磁性ナノ粒子は、超常磁性を示し、水への分散性が極めて良好であって細胞毒性を示さず、かつタンパク質やペプチドと結合可能な官能基を表面に有するという特性を生かし、例えば、タンパク質の標識材料、機能性MRI造影剤等の用途に用いることができる。 The water-soluble superparamagnetic nanoparticles of the present invention are superparamagnetic, have extremely good dispersibility in water, do not exhibit cytotoxicity, and have a functional group on the surface that can bind to proteins and peptides. It can be used for applications such as protein labeling materials and functional MRI contrast agents.
Claims (10)
超常磁性ナノ粒子と、反応性官能基を含有するシランカップリング剤と、水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーであるアルキレンジグリコールジ（メタ）アクリレート及びトリス−２−アミノアルキルアミンとの反応生成物である、水溶性超常磁性ナノ粒子。 Water-soluble superparamagnetic nanoparticles surface-modified with a water-soluble hyperbranched polymer ,
A reaction product of superparamagnetic nanoparticles, a silane coupling agent containing a reactive functional group, and alkylene diglycol di (meth) acrylate and tris-2-aminoalkylamine, which are water-soluble hyperbranched polymer-forming monomers. Some water-soluble superparamagnetic nanoparticles .
超常磁性ナノ粒子を、反応性官能基を含有するシランカップリング剤で処理することにより、超常磁性ナノ粒子の表面に反応性官能基を導入し、次いで水溶性ハイパーブランチポリマー形成モノマーであるアルキレンジグリコールジ（メタ）アクリレート及びトリス−２−アミノアルキルアミンを反応させる、製造方法。 A method for producing water-soluble superparamagnetic nanoparticles surface-modified with a water-soluble hyperbranched polymer,
By treatment with superparamagnetic magnetic nanoparticles contain reactive functional groups the silane coupling agent to introduce the reactivity functional groups on the surface of the superparamagnetic nanoparticles, then a water-soluble hyperbranched polymer forming monomers alkylene glycol di (meth) acrylate and tris-2-amino-alkylamines Ru reacted method.
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