JP6073293B2 - 生体適合性部材 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、生体細胞または組織との接触用生体適合性部材、詳細には、生体組織への移植用インプラントの分野に関する。

発明の背景
歯科インプラントは、１本または数本の歯の喪失に伴って必要となる機能を回復するのに使用される医療用具である。長期にわたって順調な機能を得るために、歯科インプラントは、骨の中に十分に固定されて、たとえば咀嚼によって引き起こされる力に耐えなければならない。高い固定強度を得るための２つの重要な要素は、ｉ）材料の化学組成、およびｉｉ）すべての長さ尺度でのインプラントデザインである。様々な長さ尺度における幾何学的特徴によって、たとえば、骨吸収を防ぎ、最終的には骨を獲得するのに必要な、コラーゲンおよびミネラルの核生成部位、細胞接着、および生化学的刺激が誘導される。

現在一般的に使用される歯科インプラントは、チタンまたはチタン合金製であり、ねじの形をしたデザインで、表面が粗い。

これまで、インプラントのより適切な接着、ひいては骨結合の改善を実現するために、歯科用チタンインプラントなどの金属インプラントを処理する方法がいくつか存在する。それらの一部は、たとえば、表面粗さを未処理の表面と比べて増大させるために、インプラント表面上に不規則性を創出することにより、インプラントの形態を変更するものである。表面粗さが増すと、インプラントと骨組織との間により広い接触および接着面積が得られるため、インプラントと骨との間の機械的保定および強度がより良好になると考えられている。当業界内では、たとえば、プラズマ溶射（plasma spraying）、ブラスティング、または酸エッチングによって表面粗さを提供できることがよく知られている。

さらに、骨芽細胞、すなわち骨生成細胞が、下にある表面のいくつもの化学的および物理的特色を感知し、それに反応することも知られている。インプラント表面での骨の形成は、たとえば、Anselme K、Osteoblast adhesion on biomaterials, Biomaterials 21, 667-681 (2000)に記載されているように、前駆細胞が分泌性骨芽細胞へと分化して、ミネラル化していない細胞外基質（ＥＣＭ）を生成し、引き続いてこの基質が石灰化することが必要である。

インプラント表面の化学的特性の変更が、インプラントの骨組織へのより良好な接着を達成するために頻繁に使用されている。いくつかの方法は、ヒドロキシアパタイトが骨に化学的に関連することから、インプラントの骨への結合を改善するために、インプラント表面上に、ヒドロキシアパタイトなどのセラミック材料の層を適用することを含む。

しかしながら、ヒドロキシアパタイトを含む被覆剤を用いる共通の不都合は、骨と被覆剤との間に被覆剤とインプラントの間より強い結合が形成されるために、こうした被覆剤は脆弱になることがあり、インプラント表面からはがれ、または分かれる場合があり、これによりインプラントの最終的な破損につながりかねないことである。同様に提案されているタンパク質被覆剤に関しては、考慮すべき追加の側面がある。タンパク質の化学的性質のために、タンパク質被覆剤を有する表面には、その生物学的活性を維持するために、特定の滅菌および貯蔵条件が必要となる場合がある。加えて、タンパク質などの生体分子に対する宿主組織反応（たとえば、免疫応答）が予測できないこともある。

インプラント表面の種々の物理的および化学的特性は、一般に、材料の生体適合性にとって決定的な要素であるとみなされるが、新しい骨が生成する機序は、分子レベルでは依然として不明である。

簡潔に述べると、インプラントの骨結合を改善するための現存する技術は多いものの、骨結合および強力な骨−インプラント接着の形成に関してさらに改善された特徴を示すインプラントが求められている。

発明の概要
本発明の目的は、新しい組織、特に骨の形成、および／または骨結合と関連する、既知のインプラントの問題を少なくとも部分的に克服すること、ならびに生体適合性部材、たとえば、組織−インプラント接着の改善を示す歯科インプラントの部分を提供することである。

本発明の第１の側面によれば、この目的および他の目的は、生体組織との接触用表面を有する生体適合性部材であって、表面が金属酸化物の粒子を含み、前記粒子は平均粒径が１００ｎｍ未満である生体適合性部材によって実現される。本発明の好ましい態様では、粒子は、平均粒径が２５ｎｍ未満である。

本発明者らは、生体適合性部材の表面上にナノメートルサイズの金属酸化物粒子を設けることにより、対照と比べて、より早期のアパタイト核生成がｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発されたという点で、生体適合性部材の生物活性が増大したことを見出した。

インプラントが患者の身体に移植されると、インプラント表面は、たとえば血液と接触する。血液中に存在するイオンがインプラント表面に誘引され、小さいヒドロキシアパタイト結晶を形成し始める（核生成と呼ばれる過程）。ヒドロキシアパタイト結晶は、引き続いて、タンパク質および細胞、たとえば骨芽細胞のインプラント表面への誘因、ならびに組織−インプラント結合の樹立に寄与する。本生体適合性部材は、ｉｎ ｖｉｖｏで早期のヒドロキシアパタイト核生成を誘発し、したがって、組織再生の速度を上げることにより、骨結合過程を促進すると考えられる。本発明の態様による生体適合性部材は、疑似体液に浸漬したとき、１２時間以内で、骨中に存在する天然ヒドロキシアパタイトと同じである１．７のＣａ／Ｐ比を有するアパタイト結晶の生成が誘発されたことが認められた。

ナノ粒子の比較的均質な薄い層を生体適合性部材の表面に適用することにより、バルク材料特性がより優勢である、同じ化学組成および結晶化度の非粒子状の層または被覆剤を適用したときと比べて、異なる表面特性が得られる。たとえば、小さいナノ粒子は、より大きい類似物と比べて、より大きい表面電荷を有することが示されている（Zareen Abbas、Christophe Labbez、Sture Nordholm、およびElisabet Ahlberg.、J. Phys. Chem. C 2008, 112, 5715-5723）。このことは、アパタイト生成、ならびにそのような粒子で被覆された表面へのタンパク質および細胞の吸着に影響を及ぼし得ると考えられる。

金属酸化物のナノサイズ粒子により、生体適合性部材の表面上にナノ多孔質の層を設けることができる。粒子が表面上にびっしりと敷き詰められる結果、単層については０．２２５^*Ｒから、または多層については０．７３２^*Ｒからの範囲（それぞれ、Ｒは、ナノ粒子の半径である）の固有多孔度を有する層を得ることができる。多層、すなわち、粒子が存在する表面に対して垂直方向に１個を超える粒子を含む層は、実質的に球形であるナノ粒子の充填のミスマッチにより、より高い多孔度を有し得る。層が多孔質の性質であると、展開面積が、ナノ粒子のない表面と比べてより広くなる。電解質は、多孔質の構造に浸透することができるので、さらに、ナノ粒子によって、電気化学的活性表面積もより広くなる。したがって、部材の外部表面をなすナノ粒子構造は、粒子のない表面、または本発明で使用する粒子より大きさの大きい粒子の被覆剤を有する表面と比べて、より反応性が高くなり、異なる電子特性を有し得る。また、骨インプラント表面を覆う酸化物フィルムの電子特性が、細胞接着およびアパタイト核生成に対して、形態における小さな変化よりも大きな効果を与えること、ならびに絶縁性の低い酸化物フィルムの方がチタン歯科インプラントに好ましいといえることも見出した。さらに、本発明の態様において使用される粒子の層は、細菌の層への浸透および／または層内での蓄積を可能にしない程度に小さい多孔度を有することも可能である。

さらに、ナノ粒子を含む表面について見出されるバンドギャップにおけるエネルギー状態の数字が大きいことは、酸化還元活性のあるタンパク質、たとえばフィブリノーゲンの吸着にとって有益となり得ると考えられる。

本発明の態様では、粒子の、エレクトロスプレー走査移動粒径測定器（electrospray-scanning mobility particle sizer）（ＥＳ−ＳＭＰＳ）を使用して得られる、半値全幅（ＦＷＨＭ）を平均粒径で割った比であると解釈される粒径分布が、４５％まで、好ましくは４０％、より好ましくは３５％までである。したがって、一例として、平均径が１０ｎｍである粒子では、個々の粒径は、１０±４．５ｎｍ、好ましくは１０±４．０ｎｍ、より好ましくは１０＋３．５ｎｍとなる。狭い粒径分布の結果として、個々の粒子の大きさに従う波形を有する、滑らかな表面構造の粒子が得られる。

通常、粒子は、概ね球形の形状を有する。

本発明の態様では、金属酸化物は、少なくとも部分的に結晶質である。前記金属酸化物は通常、二酸化チタンを含む。好ましい態様では、前記二酸化チタンの主形態は、アナターゼである。たとえば、前記酸化チタンは、主としてアナターゼ（少なくとも５０％がアナターゼ）からなるものでよい。

しかしながら、通常は二酸化チタンと組み合わせて、他の金属酸化物も使用することができる。本発明の態様では、粒子は、ｉ）二酸化チタンから本質的になる粒子と、場合によりさらにｉｉ）ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、およびイリジウムのうちの１種以上の酸化物から本質的になり、ジルコニウムおよび／またはイリジウムの酸化物が特に有利である粒子とを含むものでよい。チタン粒子を上記酸化物のうちの１種以上の粒子と混合すると、たとえば、色、強度、および／または電子特性に関して、得られる層の特性を様々にすることができる。たとえば、二酸化チタンの粒子と組み合わせて、酸化イリジウムの粒子を使用すると、層の電子特性を強化することができる。

本発明の態様では、金属酸化物の粒子は、生体適合性部材の表面の少なくとも一部において層を形成する。したがって、生体適合性部材の表面が、生体組織との接触用ものであるため、粒子は、生体組織、特に骨と接触用である。

本発明の態様では、前記粒子によって形成される前記層は、厚さが、８ｎｍ〜約１μｍ、通常は５０ｎｍ〜５００ｎｍ、たとえば１００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内にあるものでよい。薄い層は、基材表面に対する密着がより良好であるために有利である。また、粒子の焼結層（以下を参照されたい）の場合では、そうした薄い層が、より厚い層より高い強度を備え得る。前記層は、前記粒子の単層でよい。すなわち、層厚さの下限は、粒子の大きさとほぼ同じである。ナノサイズ粒子の薄い層は、マイクロメートル未満のレベルでは表面粗さが低減されるが、より大きいスケール（ブラスティングレベル）では表面粗さが保たれる。これは、インプラントの長期の骨結合にとって重要である。

層は、前記粒子の連続層でよく、前記表面の少なくとも一部を覆うことができる。連続層とは、単一領域を形成する密着した層を意味する。連続層とは逆に、不連続層は、いくつもの離れた層領域からなるものとなる。本発明の態様では、粒子は、生体適合性部材の表面を完全に覆う層を形成していてもよい。

本発明の態様では、粒子は、前記層全体に均質に分布している。

本発明の態様では、粒子は、焼結していてもよい。ナノサイズ粒子の層を慎重に焼結させると、粒子の基材に対する接着を改善することができる。粒子を焼結させると、セラミックまたはセラミック様の層を得ることができる。しかしながら、粒子は、焼結していなくてもよい。

本発明の態様では、粒子がなく、また自然金属酸化物で覆われた表面を有する対応する生体適合性部材と比べた、前記表面の相対的活性表面積であるＡ_aa（電気化学的活性表面積）が、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも１．８である。活性表面積が増大する結果、表面は、より反応性が高くなり、したがって、イオンをより著しい程度に吸着する、および／またはアパタイト沈殿の速度を上げることができる。

本発明の態様では、前記粒子の層は、５ｎｍ〜７０ｎｍ、たとえば５〜１５ｎｍの範囲の平均表面高さ（Ｓ_a）を有するものでよい。

本発明の態様では、生体適合性部材は、前記表面を有する基材を含み、基材は、金属材料を含む。通常、基材は、前記金属材料からなる金属体を含む。金属材料は、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、イリジウム、およびこれらの合金から選択されるものでよい。前記粒子と接触している基材の表面は、特に、基材がチタンを含むまたはそれからなる態様では、酸化チタンを含んでもよい。このような態様において、酸化チタンは、たとえば空気中で酸素と接触してチタン表面に自然かつ瞬時に生成する、自然酸化チタンでよい。基材が、上で言及した別の金属材料を含むまたはそれからなる態様では、前記粒子と接触しているその表面は、通常、上で言及したそれぞれの金属の自然酸化物を含む。

本発明の他の態様では、基材は、非金属材料、たとえば、生体適合性セラミック材料、たとえばジルコニアや、生体適合性ポリマー材料を含むものでよい。適切な材料は、当業者に知られている。このような態様において、基材は、セラミック体またはポリマー材料体からなるものでよい。

本発明による生体適合性部材は通常、生体組織、特に骨組織への移植用である。あるいは、部材は、軟部組織への移植用でもよい。たとえば、生体適合性部材は、歯科インプラントまたはその一部、たとえばデンタルフィクスチャーでよい。あるいは、生体適合性部材は、整形外科用インプラントまたはその一部でもよい。

有利なことに、本発明の態様による生体適合性部材は、疑似体液に浸漬されたとき、１２時間以内にヒドロキシアパタイト結晶の核生成を誘発することができる。

別の側面では、本発明は、
ａ）表面を有する基材を準備することと、
ｂ）平均粒径が１００ｎｍ未満である粒子を溶媒に分散させた、金属酸化物の粒子の分散液を準備することと、
ｃ）前記粒子の分散液を前記基材の表面に適用することと
を含む、生体適合性部材の製造方法を提供する。

ステップｂ）の分散液において、粒子は、完全に分散していてよい。このような態様において、ステップｃ）では、分散液中に存在する各粒子が、表面上に個々に適用される。しかしながら、粒子は、基材表面に適用されたら、びっしりと敷き詰められて、密な充填構造を形成する。

通常、前記粒子は、平均粒径が２５ｎｍ未満である。

溶媒は、水性溶媒、通常は脱イオン水でよい。

本発明の態様では、金属酸化物の粒子の前記分散液は、
ｂ−ｉ）ＴｉＣｌ₄の制御加水分解を行って、コロイド分散液を得ること、および
ｂ−ｉｉ）前記コロイド分散液の透析を行うこと
により生成できる。

ステップｂ−ｉ）は通常、ＴｉＣｌ₄を脱イオン水に、ゆっくりと、好ましくは滴下により加えて実施する。ＴｉＣｌ₄の温度は、０℃未満、通常は−１０℃未満でよく、前記水の温度は、撹拌状態で０℃〜５℃の範囲、好ましくは０℃でよい。

分散液は、スピンコーティング、溶射被覆（spray coating）、ディッピング（dipping）、浸漬（immersion）、ゾルゲル被覆、電気泳動堆積（electrophoretic deposition）などを始めとする、適切な何れかの方法によって基材上に適用することができる。

本発明の態様では、方法は、前記分散液を適用した後に前記溶媒を蒸発させることをさらに含む。

場合により、方法は、前記粒子を焼結させるステップをさらに含んでもよい。本発明の態様では、前記粒子の第１の層を適用し、焼結させた後、本明細書に記載のとおりの金属酸化物のさらなる粒子を適用し、この粒子は焼結させない、２ステップ手順を使用してもよい。すなわち、焼結した粒子と焼結していない粒子両方の利益を得ることができる。

基材は通常、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、およびイリジウム、ならびにこれらの合金から選択される金属を含むものでよく、好ましくは、チタンまたはその合金を含む。基材の表面は、自然金属酸化物、たとえば、チタン基材の場合では自然酸化チタンを含んでもよい。

本発明の態様では、基材の表面は、ステップｃ）の前に、表面粗化処理にかけてもよい。粗化処理の例としては、アブレッシブブラストおよび化学エッチングが挙げられる。あるいは、基材を旋削してもよいし、または研磨などの非粗化処理にかけてもよい。

本発明は、特許請求の範囲において列挙する特色のすべての可能な組合せに関するものであることを指摘する。

図１は、本発明の態様によるＴｉＯ₂ナノ粒子のＸ線回折のグラフを示している。 図２ａ〜ｃは、８ｎｍ（図２ａ）および２２ｎｍ（図２ｂ、ｃ）のＴｉＯ₂粒子、市販のＴｉＯ₂粒子（図２ｄ）を含む表面、ならびに粒子のない、ダブルエッチングした表面（図２ｅ）の高分解能ＳＥＭ画像を示している。 図３は、ナノサイズＴｉＯ₂粒子を含む表面および参照表面（ＴＳ）に対して行ったサイクリックボルタンメトリーから得たボルタモグラムを示している。 図４は、ここで調査した様々なチタン（Ｔｉ）表面についてのMott-Schottkyプロットを示すグラフを示している。 図５は、ナノサイズＴｉＯ₂粒子を含む金表面についてのMott-Schottkyプロットを示すグラフを示している。 図６は、ナノサイズＴｉＯ₂粒子を含む表面および参照表面の状態密度（ＤＯＳ）をフラットバンド電位を基準とした電位に対して示すグラフを示している。 図７は、疑似体液に浸漬してからそれぞれ１２時間、７２時間、および１週間後の、５種類の様々な表面へのアパタイト付着量を示すグラフである。 図８ａ−ｄは、疑似体液に浸漬してから１２時間後の、８ｎｍ（図８）、２２ｎｍ（図８ｂ）のＴｉＯ₂粒子、市販のＴｉＯ₂粒子（図２ｃ）を含むチタン表面、および粒子のない参照表面（図８ｄ）の高分解能ＳＥＭ画像を示している。 図８ａ−ｄは、疑似体液に浸漬してから１２時間後の、８ｎｍ（図８）、２２ｎｍ（図８ｂ）のＴｉＯ₂粒子、市販のＴｉＯ₂粒子（図２ｃ）を含むチタン表面、および粒子のない参照表面（図８ｄ）の高分解能ＳＥＭ画像を示している。 図８ｅ−ｈは、図８ａ−ｄの表面のＥＤＸスペクトルを示すグラフおよび選択された元素の原子濃度の記録を示している。 図８ｅ−ｈは、図８ａ−ｄの表面のＥＤＸスペクトルを示すグラフおよび選択された元素の原子濃度の記録を示している。 図９ａ−ｃは、疑似体液に浸漬してから１２時間後（図９ａ）、７２時間後（図９ｂ）、および１週間後（図９ｃ）の、２２ｎｍのＴｉＯ₂粒子を含むチタン表面を示すＳＥＭ画像である。 図１０ａ−ｂは、本発明の態様によるナノ粒子で覆われたチタン表面を示すＳＥＭ画像である。 図１１ａ−ｂは、本発明の態様によるナノ粒子で被覆した表面のＡＦＭ画像である。 図１２は、本発明の態様によるナノ粒子で被覆したチタンフィクスチャーの２５０，０００倍の倍率でのＦＥＧ−ＳＥＭ画像である。 図１３は、仔ウシの骨に取り付け、取り外した後の、本発明の態様によるナノ粒子で被覆したチタンフィクスチャーの１００，０００倍の倍率でのＦＥＧ−ＳＥＭ画像である。 図１４は、本発明の態様による表面上で成長した骨芽細胞において検出されたｃｂｆａの遺伝子発現レベルを示すグラフである。 図１５は、本発明の態様による表面の成長した骨芽細胞において検出されたＢＭＰ−２の遺伝子発現レベルを示すグラフである。 図１６は、本発明の態様による表面上で成長した骨芽細胞によって分泌されたＩＬ−６のレベルを示すグラフである。

発明の詳細な説明
例１：粒子を含んだ表面の調製および特徴付け
１．１ サンプル調製および特徴付け
１．１．１ サンプル調製
二酸化チタン（ＴｉＯ₂）ナノ粒子をＴｉＣｌ₄の制御加水分解によって合成して、清浄な表面の粒子を得た。０℃で合成するが、コロイド分散液の透析および貯蔵を８ｎｍサイズの粒子では０℃、２２ｎｍでは２０℃で行うことにより、様々な大きさのＴｉＯ₂粒子を得た。

典型的な合成では、ＴｉＣｌ₄（９９％）を−１６℃で冷却し、この溶液５．２±０．０５ｍｌを、２００ｍｌの脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）に、激しく撹拌しながら滴下した。合成は、大部分、１：４０のＴｉＣｌ₄：Ｈ₂Ｏ体積比を使用して行い、実現されるＴｉＯ₂濃度は１８ｇ／ｌであった。反応温度、透析時間／温度、および貯蔵時間／温度を調節することにより、様々な大きさのＴｉＯ₂粒子が得られる。透析ステップは、凝塊形成を回避するのに重要であり、得られる懸濁液は、主として単一のナノ粒子からなる。合成の詳細は、Z. Abbas、J. Perez Holmberg、A.-K. Hellstrom、M. Hagstrom、J. Bergenholtz、M. Hassellov、およびE. Ahlberg、Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects, 2011, doi:10.1016/j.colsurfa.2011.03.064で見ることができる。合成によって、粒子が実質的に単分散である分散液が得られる（Perez Holmberg、Z. Abbas、E. Ahlberg、M. Hassellov、およびJ. Bergenholtz、J. Phys. Chem. C, 2011出版是認）。

個々の粒径が３０〜８０ｎｍの範囲であり、アナターゼ対ルチルの比が４：１である市販のＴｉＯ₂粒子（Ｄｅｇｕｓｓａ Ｐ２５）を慎重に洗浄して、有機表面種を除去し、超音波浴で処理して、分散した溶液を得た。しかしながら、動的光散乱によって、より大きい凝集物の存在が示され、系を完全に分散させるのは不可能であった。粒子を、Ｔｉ（旋削表面を有するグレード４ディスク、直径１．１ｃｍ）またはＡｕディスク（ＳｉＣペーパー（４０００）で研磨したもの、直径０．６ｃｍ）上に、数ステップでスピンコーティングした。スピンコーティングした後、サンプルを脱イオン水ですすぎ、使用前に乾燥させておいた。ナノ粒子を含んだ表面の補完物として、ナノ構造のＴＳ＋ＡＴ１（シュウ酸およびフッ化水素酸で順次処理した旋削表面）表面をこの調査に含めた。

１．１．２ 粒径分布の測定
合成したＴｉＯ₂ナノ粒子の粒径分布は、Z. Abbas、J. Perez Holmberg、A.-K. Hellstrom、M. Hagstrom、J. Bergenholtz、M. Hassellov、およびE. Ahlberg、Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects, 2011, doi:10.1016/j.colsurfa.2011.03.064に記載されているように、エレクトロスプレー走査移動粒径測定器（ＥＳ−ＳＭＰＳ）法によって得ることができる。

１．１．３ 表面トポグラフィー
高分解能ＳＥＭ画像は、１ｋＶで作動させたＬｅｏ Ｕｌｔｒａ ５５ ＦＥＧ ＳＥＭを使用して記録した。表面粗さ分析は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ＩＩＩａ、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。タッピングモードＡＦＭ測定を、１サンプルあたり３点で、また１０×１０、５×５、および３×３μｍの３つの異なる走査サイズで実施した（走査振動数０．８Ｈｚ、５１２ライン）。ＡＦＭデータをＭｅＸ（登録商標）１９（Ａｌｉｃｏｎａ Ｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ）ソフトウェアにインポートし、そこで粗さ分析および３Ｄ−表面粗さパラメータの算出を行った。いくつもの走査サイズを使用し、ＭｅＸ（登録商標）ソフトウェアにおいて様々なサイズのガウスフィルタを適用することにより、１０μｍ〜１５０ｎｍの範囲のトポグラフィーのフィーチャについての情報が得られる。

１．１．４ 表面分析
ＣｕＫα照射（λ＝１．５４０５６Å）を利用するＳｉｅｍｅｎｓ Ｄ５０００粉末回折計を結晶相の特定に使用した。サンプルの異なる深さからの情報を得るために、Ｘ線回折を異なる入射角で測定した。ＸＰＳ分析については、単色ＡｌＫαをＸ線源とするＱｕａｎｔｕｍ ２０００ ＥＳＣＡ走査顕微鏡（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、米国）を使用した。

１．１．５ 電気化学測定
サイクリックボルタンメトリーおよびインピーダンス測定は、Ｇａｍｒｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ６００（商標）ポテンシオスタット／ガルバノスタット／ＺＲＡを使用して実施した。電気化学測定は、静止条件に使用される、特別に設計された三電極セルにおいて行った。サンプルを、旋削表面を電解質に向けてセルの底に置く。大きなＰｔカウンター電極をサンプルの周囲に同心円状に置いて、最適な電流分布を確保し、参照電極をセルの中央に配置する。このセル配置は、すべての種類の平面サンプルに有用であり、インピーダンス測定において良好な特徴を示す。すべての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（飽和ＫＣｌ、Ｅ＝０．１９７Ｖｖｓ．ｓｈｅ）参照電極を基準とする。電気化学インピーダンス（ＥＩＳ）測定は、脱気した０．５Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄中で実施し、インピーダンス測定中はＮ₂ガスによる継続的な弱いパージを続けた。インピーダンススペクトルは、１ｋＨｚ〜１０ｍＨｚの振動数範囲において、９ポイント／ディケードおよび振幅１０ｍＶｒｍｓとして、一定電位で記録した。電位は、＋１から−０．５Ｖまで５０ｍＶずつ上げ、次のスペクトルを記録する前の待ち時間を３００秒とした。サイクリックボルタンメトリーは、５０ｍＶｓ^-1の掃引速度を使用して、０．１Ｍ ＫＯＨ中で得た。

１．２．表面特徴付けの結果
１．２．１粒径分布
０℃および室温で貯蔵した分散液についての、貯蔵してから１週間および３週間後に得た粒径分布は、非常に似通っていた。以前の分析（Z. Abbasら、Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects, 2011, doi:10.1016/j.colsurfa.2011.03.064）において、サイズ分布の狭いＴｉＯ₂コロイド状ナノ粒子を得ることができることが示されている。分布は、半値全幅（ＦＷＨＭ）を平均径で割った比として測定され、３５〜４０％であることがわかった。

１．２．２ ＸＲＤおよびＸＰＳ
図１に、８または２２ｎｍの粒子を含んだ懸濁液から得た粉末形態のナノ粒子のＸ線回折を示す。粒子は、分析する前に１２０℃で１６時間乾燥させた。主相はアナターゼであるが、２θ＝３０．８°における反射によって示されるように、ブルッカイトの弱い寄与を伴う。広い回折ピークから、粒子は、より小さいクリスタライト（約４ｎｍ）からなることが示唆され、成長調査によって、粒子は、最初に生成したこの大きさの沈殿がゆっくりと凝集して生成することが示された。図１への挿入図において、チタンに接着させた粒子についての回折パターンを示す。ナノ粒子層は薄いので、シグナルは非常に弱いが、主アナターゼピークを認めることができる。これは、粒子の相が、堆積および乾燥後に残存することを示している。チタンに接着させたＰ２５粒子は、典型的な回折パターンを示し、アナターゼとルチルの比は約４／１である。ＴＳ＋ＡＴ１変更態様については、酸化物からの回折ピークを認めることができず、沈殿した層が非晶質であるか、または薄すぎて検出されないことが示唆される。

ナノ粒子層に対して行ったＸＰＳ分析では、微量の塩化物を伴って純粋なＴｉＯ₂が示される。Ｔｉ金属についてのシグナルは認められなかったため、皮膜が表面を完全に覆っていることが示唆される。より少ない価数のチタンイオンは認められなかった。炭素シグナルは、すべてのサンプルについて同様であり、表面の汚染と関連付けられる。

１．２．３ 表面トポグラフィーの結果
図２に、それぞれ８ｎｍ（ＴＳ＋８ｎｍ、図２ａ）または２２ｎｍ（ＴＳ＋２２ｎｍ、図２ｂ；Ａｕ＋２２ｎｍ、図２ｃ）のＴｉＯ₂粒子を含む表面の高分解能ＳＥＭ画像を示す。３種すべての表面がかなり滑らかに見える。これら表面のＳＥＭ画像から、下にある基材は、完全に覆われているように思われる。これは、本研究で使用した他の２種の変更態様については当てはまらない。Ｐ２５の懸濁液は、粒子の凝塊を含んでおり、こうした凝塊が、スピンコーティング手順の際にＴｉ表面へと移った。結果として、表面粗さは大きいが、間に旋削表面が見える（図２ｄ）。シュウ酸およびフッ化水素酸で順次エッチングしたＴＳ＋ＡＴ１表面については、むしろより大きい沈殿が生成し、間に非常に薄い酸化物層が存在する。球形のナノ粒子とは対照的に、ＴＳ＋ＡＴ１表面上の沈殿は、高さ０．４５μｍ（５つの山と谷の最大高さの平均から求めたもの、Ｓ_10z）の棒とみなすことができる（図２ｅを参照されたい）。

表面のトポグラフィー分析を、重複する走査サイズおよび様々なサイズのガウスフィルタを使用するＡＦＭ分析によって実施して、表面の特色についての情報を１０〜０．１５０μｍの範囲で得た。ＭｅＸ（登録商標）ソフトウェアを使用して３Ｄ−表面粗さパラメータを算出しており、異なる３パラメータについての値を表１に載せる。

Ｓ_a値（平均高さ）は、表面ＴＳ＋Ｐ２５およびＴＳ＋ＡＴ１で、ナノ粒子を含む表面および旋削表面より有意に大きい。これら表面処理はどちらも、旋削表面の上部において、それを完全に覆うことなく追加の表面構造を誘導した（図２ｄ〜ｅ）。８および２２ｎｍ粒子の層は、それぞれ、旋削表面を粒子で完全に覆い、旋削跡が覆われているので、今度は表面粗さの低下が引き起こされた（図２ａ〜ｂおよび表１を参照されたい）。２２ｎｍ粒子の層を適用した後にＳ_a値が低下する金基材（図２ｃ）でも、同じ傾向が認められる。ＴＳ＋８ｎｍとＴＳ＋２２ｎｍの表面についてのＳ_a値にはわずかな差しかないが、より小さい粒子でより低い値が得られたことは、粒子の曲率が表面粗さに反映されることを示唆している。傾きの二乗平均（Ｓ_dq）は、界面せん断強さと相関することが示されており、したがって、歯科インプラント用途について吟味するのに重要なパラメータである。生体力学的観点から、大きいＳ_dq値が望ましいことがある。Ｓ_dr（展開面積）値の傾向は、Ｓ_aおよびＳ_dq値と同じ傾向に従い、ナノ粒子を含む表面について最も小さい値が得られる。

１．３． 電気化学的特徴付け
１．３．１ サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）
図３では、ボルタモグラムの例を示して、走査範囲および走査回数の影響を、１種類の電極（図３ａ）、異なる粒径（図３ｂ）、部分的に被覆された電極（図３ｃ）、および異なる基材（図３ｄ）について例示する。基材としてのＴｉで得られるボルタモグラムの一般的特色は、最も負の電位における対称性の過程およびそれより負でない電位におけるピークを伴う、同じものである。最も負の電位で認められる過程は、伝導帯における電荷の蓄積、すなわち反応（１）、または伝導帯直下のトラップの充填、すなわち反応（２）のせいであるとされている。どちらの場合でも、プロトンの吸着が起こって、酸溶液中で電荷均衡が実現される。

アルカリ溶液中では、電解質カチオンはおそらく、電荷を釣り合わせる種（すなわち、この場合ではＫ＋の吸着）である。より負傾向でない電位におけるピークは、伝導帯より下の表面状態の充填、すなわち、（２）によるＴｉ（ＩＶ）のＴｉ（ＩＩＩ）への還元のせいであるとされている。反応（２）については、アルカリ溶液中でもＴｉＯ（ＯＨ）の生成が可能である。あるいは、より負傾向でない電位におけるピークは、皮膜中の粒界におけるトラップ状態のせいであるとすることもできる。通常、最も負の電位における電流は、指数関数的に増加し、最終的に、水の還元によって水素放出が起こる。ナノ粒子で覆われた電極であるＴＳ＋８ｎｍおよびＴＳ＋２２ｎｍについて、陰極電荷と陽極電荷に対称性が認められたことは、電位が−１．８Ｖに制限される場合、ファラデー過程が関与しないことを示唆している。より負傾向の電位に分極すると、水素放出により電流がさらに増加する（表示せず）。ナノ粒子で覆われた電極についての他の調査とは対照的に、負方向への走査において、電流は、水素放出が始まる前に、極大を経る。この理由はわかっていないが、伝導帯直下のエネルギーレベルの完全な充填と関連付けることができる。より負傾向でない電位におけるピークは、表面状態または上で言及したような皮膜中の粒界におけるトラップ状態の充填のせいであるとされている。この調査では、皮膜は焼結させておらず、粒界の量は少ないと予想され、したがって、ピークは、表面状態によるものである見込みが最も高い。正の電位限界は０Ｖであったが、これは、負方向への走査の際に充填された表面帯を完全に空にするのに十分でなかった。このことは、後続の掃引に対して認められるはるかに小さいピークから明らかである（図３ａ）。ピーク電位は、被覆に応じて変化し、ＴＳ＋８ｎｍ電極で最も負のピーク電位、続いてＴＳ＋２２ｎｍおよびＴＳ＋Ｐ２５表面となっている（図３ｂおよび表２）。より負傾向の電位における過程についての電流も、粒子の種類に左右され（図３ｂ）、粒径が小さくなるのに伴って活性表面積が増すことが示唆されて、ナノ粒子皮膜の活性表面積と関連付けられた。チタン金属上に常に存在する自然酸化物については、粒子で覆われた電極と比べてより負傾向でない電位（−０．８９Ｖ）において還元ピークが出現し、酸化還元過程は、−０．８１Ｖにおける酸化ピークを伴って、いくらかの可逆性を示す。こうした電位における酸化還元過程のいくらかの可逆性は、ＴＳ＋Ｐ２５電極でも認められる（図３ｃ）。自然に生成した酸化物についての合計電荷は、ＴＳ＋Ｐ２５より少ないが、これは、利用可能な表面積がＰ２５のナノ粒子皮膜より大きくなるので、予想されたことでる。ＴＳ＋Ｐ２５についてのボルタモグラムをよく見ると、自然に生成した酸化物を伴う、覆われていない表面の寄与があることが示唆される（ピークの肩として示される）。これは、多孔質構造において、覆われていない表面が目に見える、図２ｄのＳＥＭ画像と一致する。しかしながら、より負傾向の電位における過程は、同じであり、ＴＳ＋Ｐ２５電極について、より高い陽極電荷を伴う可逆性があることだけが異なる。この過程の可逆性は、ＴＳ＋８ｎｍおよびＴＳ＋２２ｎｍ電極では、ＴＳ＋Ｐ２５および旋削表面と比べて高く、おそらくはより小さい粒径およびくっきりとした表面と関連付けられる。可逆性の欠如は、ファラデー過程のためである場合もあり、それは、２２ｎｍのＴｉＯ₂粒子で覆われた金電極Ａｕ＋２２ｎｍの場合におそらく当てはまる。還元ピークは、伝導帯により近く、水素放出は、酸化ピークが認められないので、おそらくはより負傾向の電位において起こる（図３ｄ）。しかしながら、小さい酸化ピークが、Ｔｉ被覆電極について認められるピークとほぼ一致して、−０．８２Ｖにおいて認められる。このピークは、ＴｉＯ₂粒子の表面上のエネルギー状態が空になることに伴う。

ボルタンメトリー応答に基づき、またファラデー過程が起こらないことを仮定すると、バンドギャップ内状態密度（ＤＯＳ）および電子密度は、式３を使用して求めることができる。

ここで、ｇ₀（−ｅＥ）は、０ケルビンで有効なバンドギャップ内ＤＯＳの最初の推定値である。Ｅは電極電位であり、Ｌは層の厚さであり、ｅは元素の電荷であり、Ａは表面積であり、νは掃引速度である。実験データには、２種類の状態、すなわち、最も負の電位における伝導帯の指数関数的な裾ｇ_tail（−ｅＥ）に関連する状態、およびガウス様分布ｇ_gauss（−ｅＥ）を伴うバンドギャップの状態を示す（式４および５を参照されたい）。

ｇ_tail（−ｅＥ）＝ｇ_tail,BEｅｘｐ［−αＦＥ／ＲＴ］ （４）
ここで、ｇ_tail,BEは、伝導帯の端におけるＤＯＳであり、αは、裾のバンドギャップへの伸びと関連付けられる。ガウス分布は、式５で示される。

ここで、ｇ_tail,BEは、バンドギャップにおける状態の完全な充填に相当し、Ｅ_pはピーク電位であり、σは、ピーク電位に関する標準偏差である。実験データをこれらの式に適合させようとしたが、バンドギャップにおける状態がガウス分布から逸脱し、信頼できる値を得ることができなかった。多孔質のナノ構造皮膜では、指数関数的増加に伴う電荷は、界面面積に比例することが以前から示されている。粒子層の正確な厚さは不明であるので、指数関数的な項から抽出される値は、（粒子のない）参照表面の面積で正規化した界面面積の算出に限って使用することができる（表２）。これらの値を展開面積Ｓ_drと比較すると、Ｐ２５が最大のＳ_dr値を有してはいるが、活性面積については、旋削表面よりわずかに高いだけであることがわかる。対照的に、ＴＳ＋８ｎｍおよびＴＳ＋２２ｎｍ表面の滑らかな外観は、より大きい界面面積をもたらし、最小のナノ粒子で得られる活性面積は最大である。一致がないことは、Ｓ_drが物理（受動）面積を表すのに対し、界面（活性）面積は、電解質と接触して創出されるものであることに起因する。

１．３．２ 電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）
インピーダンスデータは、１００ｋＨｚ〜１０ｍＨｚの振動数範囲において、振幅１０ｍＶｒｍｓで、電位に対して測定した。液抵抗（Ｒ_sol）と直列の１つまたは２つの時定数からなる同等の回路を使用することにより、インピーダンスデータを適合させた。各時定数は、酸化物に関連した抵抗と並列の定相位要素（ＣＰＥ）からなる。時定数の横分布については、液抵抗を計算に含めるが、表面に対して垂直の時定数の分布については、これを省いてよいことが証明された。多孔質の酸化物が生成し、電解質が多孔質相の大部分に浸透し得る、ここで調査する系では、時定数の分布は、表面が多孔質であるために横方向に生じ、したがって、実効キャパシタンスは、式６を使用して算出した。

ここで、Ｒ_solは液抵抗、Ｒ_filmは、酸化物皮膜抵抗と関連付けられ、αは、ＣＰＥ要素についてのばらつき要因（dispersion factor）である。実効キャパシタンスを使用して、半導電性二酸化チタン層の電気的特性を、よく知られているMott-Schottkyの関係式、すなわち式７を用いて予測した。

ここで、Ｃ_scは、空間電荷キャパシタンスであり、ε_rは、ＴｉＯ₂の誘電率であり、ε₀は、真空の誘電率であり、Ｎ_dは、電荷担体の数であり、ｅは、電子の電荷であり、Ｅは、印加電位であり、Ｅ_fbは、フラットバンド電位である。ここでは、二重層キャパシタンスが、空間電荷キャパシタンスよりはるかに高いことが想定される。式７によれば、線形の依存性が予想され、その傾きから電荷担体の数を、またその切片からフラットバンド電位を求めることができる。

図４に、様々な表面についてのMott-Schottkyプロットを示す。８および２２ｎｍ粒子を含むＴｉ表面については、Mott-Schottky挙動は同じであり、１本の曲線だけをグラフに示す。これらの表面では、すべての表面について非線形の挙動が認められるフラットバンド電位に近いことを除き、線形Mott-Schottkyの関係が見出される。ＴＳ＋Ｐ２５およびＴＳ＋ＡＴ１表面については、最も正の電位において傾きの変化が認められる。電荷担体の数は、各電位において、Mott-Schottkyプロットの傾きから算出しており、図４への挿入図に示す。Mott-Schottky曲線の傾きの変化にもかかわらず、電荷担体の数は、みごとに一定であり、最も線形である領域についての値を、以下の表２に、フラットバンド電位と共に示す。フラットバンド電位は、異なる表面でも同様であった。

Ｐ２５で覆われた表面では、０．４Ｖより高い電位において傾きが大きく増し、１．６倍低いドナー密度が得られる。この線を外挿すると、０Ｖに近い見かけのフラットバンド電位を得ることができる。この値は、同じ基礎材料上の陽極酸化された層について見出されるものと同じである。フラットバンド電位は、この研究で使用するｐＨで−０．３５Ｖに近くなることが予想されるので、見かけのフラットバンド電位は、おそらくは表面状態による影響を受ける。陽極酸化された皮膜の場合でも、還元ピークが認められ、エネルギーバンドがバンドギャップにある表面状態を表している。

Ａｕ＋２２ｎｍ電極についてのMott-Schottkyプロットは、他の電極と比べて異なって見える（図５）。この場合では、キャパシタンスを、一定振動数１００Ｈｚで得られるインピーダンス値から算出した。比較のために、キャパシタンス値を同じようにして算出した、ＴＳ＋２２ｎｍ電極についてのMott-Schottky曲線も示す。Ａｕ＋２２ｎｍ表面では、キャパシタンスは、正電位から出発して一定であり、すなわち、電位と無関係である。したがって、このキャパシタンスは、絶縁酸化物皮膜のキャパシタンスと関連付けられる。フラットバンド電位に近づくと、曲線が急速に変化する。酸化物キャパシタンスについて補正することにより、ドナー密度およびフラットバンド電位を推定することができる（以下の表２を参照されたい）。酸化物キャパシタンス値から、式８を使用して、平均酸化物厚さを算出することができる。２８ｎｍの値が得られ、金の場合では、表面に粒子の単層しか接着していないことが示唆される。

ここで、ε₀は、真空の誘電体誘電率（dielectric permittivity）であり、ε_rは、ＴｉＯ₂の誘電率（６０）であり、Ａは電極面積であり、Ｃはキャパシタンスである。

電荷担体の数は、金に対するナノ粒子皮膜では、チタン上の同じ皮膜よりはるかに少ない。これは、ＴｉＯ₂ナノ粒子が、チタン上の薄い酸化物皮膜と、金金属より密接に相互作用していることを示唆している。結果として、サイクリックボルタンメトリーで観察された表面状態は、粒子だけでなく、粒子とＴｉ上の自然酸化物皮膜との界面に起因すると結論付けてよいことになる。ＴＳ＋ＡＴ１表面については、電荷担体の数がナノ粒子皮膜より多く、また自然酸化物（ＴＳ）よりも多い（表２）。伝導率がわずかに高い一つの理由は、金属相中の水素化チタンの存在である可能性がある。しかしながら、ブラスティングしたサンプルでは、ＡＴ１処理を施した表面の伝導率が、ブラスティングしたサンプルより低いことがわかっている（I. MattissonおよびE. Ahlberg、Appl. Surf. Sci., 2011出版是認）。

ボルタンメトリー測定をアルカリ溶液中で行い、酸溶液において得た、実験的に求めたフラットバンド電位を使用し、ネルンストのｐＨ変化を想定することにより、ｐＨ１３、Ｅｆｂ＝−１．１±０．１Ｖについてフラットバンド電位を算出した。図６では、状態密度（ＤＯＳ）を、フラットバンド電位を基準とした電位に対してプロットしている。

８ｎｍ粒子を有する表面については、フラットバンド電位より高いエネルギーにおいてＤＯＳの極大が起こるが、他の表面では、極大は、Ｅ_fbの近く（ＴＳ＋２２ｎｍ）、またＥ_fbに関して正電位（ＴＳ＋Ｐ２５およびＴＳ）にある。エネルギーバンドの位置は、生体活性化合物の吸着、ひいては表面がｉｎ−ｖｉｖｏで機能する能力にとって重要となり得る。これについては、疑似体液に浸漬した後に得られた結果に関して、以下でさらに論述する。

例２：表面生物活性の評価
２．１．サンプル調製
２．１．１ 疑似体液（ＳＢＦ）への浸漬
A. Oyane、H. M. Kim、T. Furuya、T. Kokubo、T. Miyazaki、およびT. Nakamura、J. Biomech. Mater. Res. A, 2003, 65, 188-195に記載の改定ＳＢＦ処方に従って、ＳＢＦ溶液を３７℃で調製した。１Ｍ ＮａＯＨを使用して溶液のｐＨを７．００±０．０５とし、調製したＳＢＦ溶液を新鮮なうちに使用した。

上記例１．１に従って調製したサンプルを、処理した表面を逆さまにして、４０ｍｌのＳＢＦ溶液に個々に浸漬し、固定した。１部門につき９つのサンプルを３７．０℃で浸漬し、１部門につき３つのサンプルを、それぞれ、浸漬してから１２時間、７２時間、および１週間後に評価した。１部門および浸漬時間につき１つのサンプルでＸ線回折（ＸＲＤ）分析を実施して、サンプルの化学組成を精査した。すべてのサンプルタイプについて、ＳＥＭ（ＥＳＥＭ ＸＬ３０、ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ）およびエネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）（Ａｐｏｌｌｏ １４、ＥＤＡＸ）分析を、１サンプルにつき３時点で実施して、生成したアパタイトの量および形態を評価した。使用したＳＥＭ設定は、１０ｋＶ、作動距離１０ｍｍ、および分析面積１２６×１０２μｍであった。

２．２ 結果
サンプルをＳＢＦ溶液に１２時間、７２時間、および１週間浸漬することにより、表面によるアパタイト核生成誘導能を評価した。ＳＢＦ溶液は、イオンをヒト血漿に類似した濃度で含有し、ＳＢＦ溶液の処方は様々でよい。本紙面では、Ｏｙａｎｏらが示した改定ＳＢＦ処方を使用した。サンプルは、処理した表面を逆さまにつるして固定して、重力による沈殿を防いだ。

生成したアパタイトの量は、ＥＤＸによって測定した。アパタイト付着量（Θ）は、式９を使用して、ＳＢＦ溶液への浸漬の後と前のチタンシグナルの比から算出した。アパタイトが浸漬の間に生成した唯一の沈殿であると想定されている。

結果は図７に示しており、興味深いことに、アパタイトの早期の核生成は、ＴｉＯ₂ナノ粒子を含む表面で、参照（ＴＳ）およびＴＳ＋ＡＴ１表面と比べて有意に多い。ＳＢＦに７２時間浸漬した後、粒子を含んだ表面と参照の差は少なくなり、それに代わってＴＳ＋ＡＴ１表面が最高のアパタイト付着量を示す。この傾向は、１週間後も続く（図７）。異なる表面の形態をＳＥＭによって精査し、明確な差が得られた。

図８ａ〜ｄに、チタン表面ＴＳ＋８ｎｍ（図８ａ）、ＴＳ＋２２ｎｍ（図８ｂ）、ＴＳ＋Ｐ２５（図８ｃ）、および参照表面ＴＳ（図８ｄ）の高分解能ＳＥＭ画像を示す。アパタイト結晶核生成部位が見られ、円で印をつけている。さらに、（電子殻Ｋに起因する電子から放出されたエネルギーを測定する）ＥＤＸ分析によって、試験表面（図８ｅ〜ｇ）上に、参照表面（ＴＳ、図８ｈ）と比べてより多い量のカルシウム（Ｃａ）およびリン（Ｐ）が存在することが確認される。ＥＤＸ分析は、各表面について一点だけで実施した。

表面粗さがアパタイト生成に及ぼす影響は、以前に精査されており、０．２〜０．６μｍのＲ_a値に相当する表面粗さで、連続的で密着性のあるアパタイト層が種々の材料上に生成することが示されている。測定技術および分析に違いがあるために、粗さパラメータの絶対値を比較することは難しい。しかしながら、相対値を使用することはでき、浸漬してから１週間後の結果は、粗い表面の方が、より滑らかな表面と比べて、厚く密着性のあるアパタイト層の形成に好都合であるという以前の発見を裏付けている（表２）。

ＴＳ＋Ｐ２５表面を除くすべての表面で、特徴の異なる割れたアパタイト層が観察された。

ＴＳ＋８ｎｍおよびＴＳ＋２２ｎｍ表面上に形成されたアパタイト層は、まずフィブロネクチン溶液中で、その後ハンクス緩衝食塩水（ＨＢＳＳ）中で１週間インキュベートした、チタン上に形成されたアパタイト層と似通った別のタイプの割れを示した（A. P. Do Serro、A. C. Fernandes、およびV. S. B. de Jesus、J. Biomed. Mater. Res., 2000, 49, 345-352）。亀裂または割れは、乾燥収縮によって引き起こされることが示唆されており、浸漬時間が増すにつれてより大きく深くなることが観察されている。別の説明は、表面上の核が成長し、最終的に完全に覆う皮膜を形成する、厚いアパタイト層の３Ｄ成長機序と関係している。異なる核が相互作用し始めたとき、応力がかかり、アパタイト層に亀裂が入る。この機序は、１２時間後には沈殿が存在しないが、７２時間後には完全に覆う皮膜を有するＴＳ＋ＡＴ１表面について当てはまると思われる。核生成の機序は、ナノ粒子を有する表面については異なると思われる。表面上の特定の部位において急速にヒドロキシアパタイトが沈殿した後、２Ｄ成長へと続くが、２Ｄ成長では、層は、下にある基材と弱い相互作用しか示さない。２Ｄ層の生成は、一般に観察されるより大きい凝塊の生成を防ぐと思われ、結果として、層は薄いままとなる。ナノ粒子で覆われた表面上に認められる早期の核生成を、図９でＴＳ＋２２ｎｍ表面について示す。１２時間後、はっきりした沈殿が認められるが（図９ａにおいて矢印をつけた）が、表面は、沈殿物で完全に覆われてはいない。この段階での沈殿物のＣａ／Ｐ比は、１．７（多くの試験点の平均）に近く、沈殿物の間ではＣａおよびＰシグナルが得られなかった。これは、熱力学的に最も安定した相であるヒドロキシアパタイト（Ｃａ₅（ＰＯ₄）₃（ＯＨ））の生成を示唆している。ヒドロキシアパタイトは、骨中の主なミネラルであり、高い機械的強度を得るのに非常に重要である。７２時間の浸漬後、表面は、薄いアパタイト層で覆われ、亀裂ができ始める（図９ｂ）。亀裂は、沈殿物と層の不適合によって引き起こされる応力により、最初の沈殿物から伝わるように思われる。１週間浸漬した後、アパタイト層は十分に展開するが依然として薄い（図９ｃ）。

この調査において、表面粗さに関係なく、すべての表面（ＴＳ＋Ｐ２５を除く）が割れを伴った（表２）。ＴＳ＋８ｎｍおよびＴＳ＋２２ｎｍ表面のアパタイト層は、下にある表面から分離していると思われる。しかしながら、これに関連して、ｉｎ ｖｉｖｏの状況では、本明細書に記載するような生体適合性部材が生体組織に移植された後、タンパク質やプロテオグリカンなどの巨大分子、および細胞が、移植後数時間以内に部材表面に誘因されることが観察されるはずであり、これらの存在および／または活性によって、アパタイトのいかなる２−Ｄまたは３−Ｄ層の生成も事実上妨げられることになると考えられる。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１週間後に生成したアパタイト層の特性は、ｉｎ ｖｉｖｏ移植結果とほとんど関連しないといえる。生成したアパタイト皮膜のＣａ／Ｐ比をＥＤＸ測定値から算出し、７２時間および１週間の浸漬後のすべての表面で、１．４２〜１．５６の範囲であることがわかった。これは、Ｃａ／Ｐ比＝１．５のリン酸三カルシウム（Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂）の生成を示唆するかもしれない。

生成したアパタイト層の化学組成を斜入射（gracing angle）Ｘ線回折（ＧＩ−ＸＲＤ）によって分析した。ＥＤＸ測定値は、１週間後のＴＳ、ＴＳ＋８ｎｍ、ＴＳ＋２２ｎｍ、およびＴＳ＋Ｐ２５表面についてむしろ高いアパタイト付着量を示すが、弱く広い回折シグナルしか得られなかった。このことは、生成した層が非晶質であることを示唆している。ＳＢＦ溶液からの均質な成長は、非晶質相の生成から始まり、引き続いて小さいアパタイト結晶が生成する（Z. Z. Zyman、D. V. Rokhmistrov、およびV. I. Glushko、J. Mater. Sci., Mater. Med., 2010, 21, 123-130）。

より厚いアパタイト層が得られたＴＳ＋ＡＴ１表面については、ＳＢＦに浸漬してから７２時間後および１週間後に、ヒドロキシアパタイトのはっきりした回折ピークが認められる。

長期の結果は、より粗い表面上では、厚いアパタイト層の展開が促進されることを示唆している。しかしながら、ナノ粒子を含んだより滑らかな表面は、より急速な核生成、および非晶質アパタイトの薄い２Ｄ層の生成を示す。表面によるヒドロキシアパタイト核生成誘導能とｉｎ−ｖｉｖｏ応答との相関については、T. KokuboおよびH. Takadama、Biomaterials, 2006, 27, 2907-2915で精査されている。

したがって、ＳＢＦ溶液への浸漬は、異なる表面の生物活性の尺度となり得る。この調査では、２タイプの核生成および成長挙動を観察した。より粗い表面では、核生成が最初は遅れるが、始まってしまえば、厚い層が形成される。これらの層は、皮膜における応力によって引き起こされた亀裂を有する。小さいアナターゼナノ粒子を有するより滑らかな表面では、最初の沈殿は急速であるが、ヒドロキシアパタイトの小さい核が少ししか形成されず、表面の残部が覆われないままである。

十分に分散した小さいナノ粒子からできた表面皮膜では、表面上に多孔質層が創出される。この結果、旋削表面、およびＰ２５の凝塊を含んだ表面と比べて、インピーダンス測定から求められるドナー密度もより大きくなり、活性面積もより大きくなる。その上、かなり高い伝導率を有する参照表面（ＴＳ）でアパタイト生成が制限されるので、物理的表面粗さは、アパタイト生成において重要な役割をもつと思われる。早期の核生成については、ナノ粒子で覆われた表面が好ましいと思われる。

例３：ナノ粒子で被覆された表面の調製および特徴付け
３．１ サンプル調製
ＴｉＯ₂ナノ粒子は、上述のとおりのＴｉＣｌ₄の制御加水分解によって合成した。反応温度、透析時間／温度、および貯蔵時間および／または温度を制御することにより、粒径が約２０ｎｍであるＴｉＯ₂ナノ粒子を得た。粒子は、主としてアナターゼからなり、ブルッカイトの痕跡は少なかった。以下のスキームに従って、旋削した脱脂チタンディスクに粒子をスピンコーティングした。サンプル群Ａ１については、１回だけスピンコーティングステップを実施し、サンプル群Ａ５は、５回スピンコーティングにかけた。スピンコーティング後、サンプルを水中ですすぎ、５０℃で５分間乾燥させておいてから、包装し、２１ｋＧｙでβ線滅菌した。

３．２ サンプルの特徴付け
以下の技術を使用して、２種のサンプル表面Ａ１およびＡ５を特徴付けした。

−走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）（ＸＬ３０、ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ、５６５１ ＧＧ Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
−電界放出銃走査電子顕微鏡法（ＦＥＧ−ＳＥＭ）（Ｌｅｏ Ｕｌｔｒａ ５５ ＦＥＧ ＳＥＭ）
−エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸまたはＥＤＳ）（ＸＬ３０、ＦＥＩ Ｃｏｍｐａｎｙ、５６５１ ＧＧ Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）
−Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）（Ｑｕａｎｔｕｍ ２０００ ＥＳＣＡ走査顕微鏡、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、米国ミネソタ州Ｃｈａｎｈａｓｓｅｎ、およびＣａｓａＸＰＳソフトウェア）
−Ｘ線回折（ＸＲＤ）（ＣｕＫα照射、λ＝１．５４０５６Åを使用するＳｉｅｍｅｎｓ Ｄ５０００粉末回折計）
−原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ＩＩＩａ、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
−接触角測定法（ＥＱ−Ｑ−２８５７、ＳＹ−０３０２）
３．２．１ 走査電子顕微鏡法
ＳＥＭおよびＦＥＧ−ＳＥＭを使用して、３種の異なるサンプル表面の形態を精査した。普通の環境ＳＥＭを使用して個別のナノ粒子を検出するのは不可能であるので、ナノ構造表面Ａ１およびＡ５の確認には主としてＦＥＧ−ＳＥＭを使用した。より高い倍率で画像を得るために、ｉｎＬｅｎｓｅ検出器を、電位の低下、および結果としてのより短い作動距離と組み合わせて使用した。Ａ１サンプル表面の画像を図１０ａに、サンプル表面Ａ５の画像を図１０ｂに、どちらも倍率１００，０００倍で示す。ナノ粒子被覆層の厚さは、画像では見て取ることができないが、個別のナノ粒子が、表面上の小さい白色のドットとして目に見える。

図１０ａ〜ｂに示すＳＥＭ画像において、Ａ１およびＡ５表面は類似して見える。しかしながら、表面粗さが異なっている。表面粗についてはＡＦＭを使用して測定し、以下でさらに論述する。

３．２．２ エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）
２種のサンプルＡ１およびＡ５バルク材料の全体としての元素組成の定性的および定量的な元素分析値は、ＥＤＸを使用して求めた。ＥＤＸは、約１〜２μｍの深さからの情報を収集するが、このことは、この方法では、最も外側の層についての限られた情報しか検出できないことを意味する。分析は、化学組成が位置および／または侵入深さによって変化するか調査するために、各サンプルの異なる３箇所（サンプルの異なる縁における２箇所および中央の１箇所）において、３段階の異なる加速電圧（５、１５および３０ｋＶ）で実施した。

元素の定量化から、サンプルＡ１およびＡ５は、類似した組成を有することが観察された。ＥＤＸ分析からの値は相対的であるので、異なるサンプルおよび加速電位について、酸素／チタン、窒素／チタン、および炭素／チタンの比をそれぞれ算出した（表３を参照されたい）。サンプルＡ１およびＡ５は、類似した元素組成を有するとみなすことができる。さらに、両方のサンプル群で、チタンに対する酸素、窒素、または炭素それぞれの比は、加速電圧（すなわち、分析深さ）に応じて減少すると結論付けることもできる。

３．３．３ Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
ナノ粒子で覆われた表面の化学組成は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を使用して求めており、データを表４に示す。２種のサンプル表面Ａ１およびＡ５は、類似した化学組成を有し、主にチタン、酸素、および炭素の存在を示す。サンプル調製手順が手作業であるため、両方のサンプルで、多量の炭素が検出された。ナノ粒子合成からの塩素の痕跡は、どちらのサンプル表面についても確認されなかった。

Ｃａｓａ ＸＰＳソフトウェアを使用して、検出された元素のさらに詳しい分析も実施した。すべてのサンプルについて、４６５および４５９ｅＶにおけるＴｉ２ｐ１／２およびＴｉ２ｐ３／２の結合エネルギーが認められた。この二重項は、Ｔｉ（ＩＶ）によるものであり、ＴｉＯ₂がサンプル表面上の主な成分であることを示す。表面Ａ１およびＡ５両方について、それぞれ４５４．６ｅＶおよび４６１．４ｅＶにおけるＴｉ金属二重項も確認された。Ｔｉ金属ピークは、下にあるチタン基材に起因するものであり、表面Ａ１およびＡ５上においてＴｉＯ₂ナノ粒子被覆が薄いため確認することができる。

両方のサンプル表面が、Ｔｉ−Ｏ結合に起因する、５３１ｅＶにおけるはっきりとしたＯ１ｓピークを示した。加えて、より高い結合エネルギーにおける肩も観察された。Ｏ１ｓスペクトルのデコンボリューションによって、酸素の炭素への結合に起因する５３３ｅＶにおけるピークが得られた。Ｏ１ｓスペクトルについてのように、Ｃ１ｓスペクトルも、より高い結合エネルギーにおいて肩を有する主要な種を示した。２８５．５ｅＶにおける主ピークは、炭化水素（Ｃ−ＣおよびＣ−Ｈ）の存在によるものであるとされており、大気条件下の酸化物層上にしばしば見られる。より高い結合エネルギー（２８９ｅＶ）における肩は、それぞれＣ−ＯおよびＣ＝Ｏ種によるものであるとされている。

３．３．４ Ｘ線回折（ＸＲＤ）
表面Ａ１およびＡ５それぞれに対してＸ線回折測定を実施した。両方のサンプル表面で、７つすべてのチタン金属シグナルが示された。金属シグナルは、単結晶表面でのように不揃いに配向していなかったが、これはおそらく、バルク材料が冷間加工されているためである。二酸化チタン（ルチル）からのシグナルは表面上に存在しなかったが、これはおそらく、酸化物層が薄いためである。酸化物ピークの欠如は、酸化物がｘ線非晶質である、すなわち、粒径がブラッグの限界を超えているために、はっきりとした反射パターンを得ることができないことを示唆する場合もある。

３．３．５ 原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）
表面粗さをさらに精査するために、ＡＦＭ画像も記録した。図１１ａはＡ１表面を示し、図１１ｂはＡ５表面を示す。ＭｅＸ（登録商標）ソフトウェアを使用して３Ｄ表面粗さパラメータを算出し、異なる３つのパラメータについての値を表５に載せる。

ＡＦＭ画像から、表面Ａ１およびＡ５が、旋削表面の上部を覆う追加の表面構造を有するのを認めることができる。

サンプルＡ１（図１０ａ）およびＡ５（図１０ｂ）のＳＥＭ画像から、これら２つの表面は、下にある基材が同程度に覆われて、全く似通って見える。しかしながら、ＡＦＭ画像（図１２ａ〜ｂ）を注視すると、そうでないことが明白である。サンプルＡ５（図１１ｂ）では、下にある基材が、厚く滑らかな酸化物皮膜を生じさせる幾層かのナノ粒子の層で完全に覆われている。サンプルＡ１（図１１ａ）も、覆っているナノ粒子の被覆を有するが、構造がＡ５のものほど滑らかでない。これは、表５の表面粗さパラメータによっても裏付けられ、Ａ１のＳ_a値がＡ５と比べてやや高いことを見て取ることができる。傾きの二乗平均（Ｓ_dq）は、界面せん断強さと相関することが示されており、したがって、歯科インプラント用途について吟味するのに重要なパラメータである。生体力学的観点からは、大きいＳ_dq値が望ましく、表面Ａ１がＡ５に比べて若干有利となっている。Ｓ_dr（展開面積）値の傾向は、Ｓ_aおよびＳ_dq値と同じ傾向に従い、最も厚いナノ粒子層を有する表面、すなわちＡ５について得られた値が最も小さい。

３．３．６ 接触角
接触角測定を使用して、表面Ａ１およびＡ５の親水性を判定した。両方のサンプル表面が、通常の定義、すなわち接触角＜９０°に従って、親水性であった（表６を参照されたい）。

３．３ 考察
Ａ１およびＡ５サンプルは、同じタイプの基材、すなわち旋削チタン（グレード４）ディスクから調製したものである。どちらの場合でも、スピンコーティングされたナノ粒子の層が、下にある基材を覆っている。ナノ構造はあまりに小さいため、通常の環境ＳＥＭを使用して確認することができず、したがって、高分解能ＦＥＧ−ＳＥＭによってサンプルを分析した。これらの画像において、表面Ａ１およびＡ５は、個別のナノ粒子またはナノ粒子の集団が、下にある金属構造の上部に沈積しており、全く似通って見える。しかしながら、ＳＥＭ画像をＡＦＭ画像と比較すると、下にある表面構造がナノ粒子の皮膜で完全に覆われて、連続的な被覆が形成されていることが明らかである。サンプル群Ａ１は、１回しかスピンコーティングしていなかったが、サンプル群Ａ５については、スピンコーティング手順を５回繰り返した結果、はるかに厚い被覆が得られた。これは、表面Ａ５についてＡ１と比べて低いＳ_a値が示される表面粗さ測定によっても検証された。

接触角測定では、両方のサンプルが親水性であったことが示された。ＸＰＳ分析では、サンプルが清浄であり、表面が主に、チタン、酸素、および炭素で構成されていたことが示され、またＴｉＯ₂が、サンプル表面表に存在する主な成分であることも示された。加えて、サンプルＡ１およびＡ５の両方で、Ｔｉ金属シグナルを観察することができ、Ａ５被覆がＡ１被覆より厚いものの、ナノ粒子被覆が薄いことを示唆している。

ＸＰＳ分析では、両方のサンプル表面がＴｉＯ₂によって覆われていたことが示されたが、ＸＲＤ分析では、酸化物からの反射が少しも示されなかった。層が薄すぎるため、ＸＲＤによって酸化物を検証することはできない。

例４：ナノ粒子被覆の密着
４．１ サンプル調製
Abbasら、Nanoparticles Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 384 (2011) 254-261に従って、粒径が１９．５ｎｍであるＴｉＯ₂ナノ粒子の溶液を調製した。ナノ粒子溶液を、工業用として純粋で清掃したチタンフィクスチャー（旋削したもの、ブラスティングまたは酸エッチングなし）に、次のとおりにスピンコーティングした。フィクスチャーをサンプルホルダーに乗せ、１４００ｒｐｍで回転させる間、ナノ粒子溶液に浸した。ナノ粒子溶液に浸した後、フィクスチャーをすすぎ用の水に浸した。次いで、残留している水を除去するために、フィクスチャーを４５００ｒｐｍで約３０秒間回転させた。フィクスチャーをオーブンにおいて５０℃で数分間乾燥させた。

フィクスチャーは、図１２に示す、倍率２５０，０００倍でのＦＥＧ−ＳＥＭによって評価した。分析から、表面がナノ粒子を示したことが明らかになった。

４．２ 骨に取り付けた後の評価
試験を実施して、ナノ粒子被覆が、死んだ仔ウシの骨にフィクスチャーを取り付けた後、骨から取り外した後、および続く洗浄手順後に表面上に残存するかどうか精査した。結果から、ナノ粒子被覆は、仔ウシの骨へのフィクスチャーの取り付けによる影響を受けないと思われ、また続く洗浄手順でも無傷の状態であることが示された。図１３は、仔ウシの骨から取り外し、清掃した後の、ナノ粒子被覆されたチタンフィクスチャーを示す、倍率１００，０００倍でのＦＥＧ−ＳＥＭ画像である。多少の骨残留物が表面上に残った。ナノ粒子は、それでもねじ山の頂部にも密着していた。

例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞応答の評価
ヒト由来間葉系幹細胞モデルを使用しての細胞増殖および骨形成分化マーカーについての実験室用アッセイを使用して、上記例３．１に従って調製したサンプル表面の効果を評価した。

５．１ サンプル
上述のサンプルＡ１およびＡ５に加えて、工業用として純粋な機械加工されたチタンディスク（「Ｔｉ」）を対照として使用した。

５．２ 細胞培養
ヒト口蓋間葉系細胞（ＨＥＰＭ１４８６、ＡＴＣＣ）を、アール塩、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質［２５ｍｇ／ｍｌ］、アスコルビン酸［５０ｍｇ／ｍＬ］、ピルビン酸Ｎａ［１ｍＭ］、非必須アミノ酸［０．１ｍＭ］、Ｌ−グルタミン［２ｍＭ］を含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）において、５％ＣＯ₂と共に培養した。細胞培養には、ＨＥＰＭ細胞のトリプシン（typsin）による単離、（血球計算器での）計数、ペレット化、および５０，０００細胞／１０μｌでの懸濁を伴った。１０μｌの細胞懸濁液（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ａｐｐｒｏａｃｈ）を、各試験および対照表面上に播き、培養物を１時間密着させた後、１ｍｌのＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを穏やかに灌流させた（Stanford、Jacobsonら、1995、Journal of Biological Chemistry 270(16):9420-9428）。

アッセイについては、３ディスク／群／時点を使用した。アッセイは、アッセイ終始点を０、１、４、８、および１４日目として、１４日目まで実施した。０時点は、播く前に作製した細胞懸濁液の一定分量とした。培地の交換は、４日毎に行った。ディスクをインキュベートする２４ウェルディッシュの各ウェルから１００μｌの培地を集めた。

集めた培地は、骨に関連したタンパク質発現についてのプロテオミクスアッセイに向けて貯蔵した。プロテオミクス測定のための、培地からの培地の収集は、０、１、２、４、６、８、１２日目に行った。

５．３ 細胞増殖および細胞活性
５．３．１ 細胞増殖アッセイ
細胞増殖は、標準的なＭＴＴアッセイを使用して、１４日間にわたって測定した。Ｖｙｂｒａｎｔ ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｋｉｔ Ｖ−１３１５４）は、水溶性ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の不溶性ホルマザンへの変換を利用するマイクロプレート吸光度アッセイである。次いでホルマザンは可溶化され、マイクロタイタープレートリーダーにおいて５７０ｎｍで読み出される。

ＨＥＰＭ細胞のマイクロドット（５０，０００細胞／１０μｌ培地）を、２４ウェルプレートの中のディスクに乗せた。（細胞接着を可能にするために）１時間経過後、ディスクに、アスコルビン酸［５０ｍｇ／ｍｌ］を補充したＥＭＥＭ １ｍｌを灌流させた。培地は、１０％ＦＢＳおよびＰｅｎ／ｓｔｒｅｐも含有していた。２４時間後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖｙｂｒａｎｔ ＭＴＴ細胞増殖アッセイに従って、１日目のサンプルを集めた。サンプルをＳＤＳ−ＨＣｌ溶液中にて３７℃で終夜インキュベートし、次いで混合し、５７０ｎｍの吸光度を読み取った。この手順を２日目、４日目、６日目、８日目、および１４日目のサンプルについて繰り返した。

細胞増殖を検量線と対照した。以下のことが観察された。

１日目：すべての表面において、Ａ１およびＡ５表面上で、１日目のＴｉと比べて細胞が接着し、生存可能であったことが示された。Ａ１表面上でＴｉと比べて細胞の数の増加が認められた。

４日目：Ａ１およびＡ５表面において、Ｔｉと比べて細胞の数の減少が示された。

８日目：８日後、Ａ１およびＡ５両方の表面で、Ｔｉ表面と比べて細胞の数の減少が示された。

１４日目：１４日後のＴｉと同等の数の細胞が示され、Ａ１およびＡ５表面上の細胞が回復した。

５．３．２ 骨関連遺伝子マーカーの遺伝子発現レベル
アルカリホスファターゼ、ｃｂｆａ１、オステオカルシン、およびＢＭＰ−２についての骨芽細胞遺伝子発現の変化を、多重および実時間ＰＣＲ戦略を使用して、０、１、４、８および１４日目に分析した。微量培養物（５０，０００細胞／１０μｌ培地）を、以前に記載されているとおりに、対照としてのプラスチック上に、３通りに播いた（Schneider、Zahariasら、2004. Journal of Biomedical Materials research. 69A 3:462-468）。接着させて１時間後、ウェルをＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳおよび５０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸で灌流させた。０、１、４、８および１４日目に、全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者の使用説明書に従って抽出した。次いで細胞をホモジナイズし（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ ｃｏｌｕｍｎ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮｅａｓｙカラムにかけ、すすぎ、溶離させた。２６０ｎｍでの吸光度からＲＮＡ濃度を算出し、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比からＲＮＡ純度を求めた。抽出されたＲＮＡを鋳型として使用して、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写反応を実施し、ＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）においてＲＴ反応を実施した。２５℃で最初の１０分が経過後、反応混合物を４８℃で３０分間インキュベートし、９５℃で５分間加熱し、引き続いて４℃に冷やした。ＴａｑＭａｎリボソームＲＮＡ対照試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、内因性対照としての１８ｓリボソームＲＮＡを検出した。

次いで、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間を４０サイクル、および６０℃で１分間の熱サイクルパラメータによる多重ＰＣＲによって、アルカリホスファターゼ、ｃｂｆａ１、オステオカルシン、およびＢＭＰ−２ターゲット、ならびに内因性ｒＲＮＡ対照を増幅した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７３００実時間ＰＣＲ検出系において、９６ウェル光学反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、実時間ＰＣＲ反応を実施した。骨形成性遺伝子（ここではＢＭＰ−２およびｃｂｆａ１だけを例示した）のためのＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲプロトコールは、Ｐｅｒｉｎｐａｎａｙａｇａｍ，Ｈ．（２００２）が記載している方法に従った。簡潔に述べると、培養物を収穫し、ＰＢＳ中ですすぎ、全細胞ＲＮＡを抽出した。実時間ＰＣＲプライマーおよびＲＵＮＸ−２／Ｃｂｆａ１用のプローブは、その遺伝子のエキソン１および２に対応する２９４ｂｐの既知のラット配列（Xiaoら(1998) Journal of Biological Chemistry, 273(49): 32988-32994）から、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって設計して、エキソン接合部に重なり合った８０ｂｐの産物を生成した。ＤＮＡプローブは、５’−レポーター色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）および３’−クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）で修飾した。各反応試験管において、ΔＣｔ（ここで、ΔＣｔ＝（ＦＡＭ）Ｃｔ−（ＶＩＣ）Ｃｔである）を算出することにより、Ｃｂｆａ１レベルを１８Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化した。定数を差し引いて、ΔΔＣｔ（ここで、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ−ｋであり、ｋは、概算の最小ΔＣｔ値に適合させた）を得た。ｃｂｆａ１の相対的レベルを２^(-ΔΔCt)として算出した。

異なる時点で次の結果が認められた。

１日目：試験表面上のＢＭＰ−２、ｃｂｆａ１、アルカリホスファターゼ、またはオステオカルシンの遺伝子発現には、Ｔｉと比べて差異がない。

４日目：表面Ａ１上でＢＭＰ−２およびｃｂｆａ１の発現が増加し、Ａ５上でアルカリホスファターゼの発現がわずかに増加したが、すべての試験表面上でオステオカルシンの発現が減少した。

８日目：すべての試験表面上でＢＭＰ−２応答が増加し、Ａ１表面上ではＴｉと比べて有意に高い値が示された。ｃｂｆａ１発現については、Ａ５表面上ではＴｉ対照表面に対してより高いレベルが、Ａ１上では同等のレベルが示された。全般に、すべての表面上で低いレベルのアルカリホスファターゼ発現が観察された。

１４日目：Ａ１表面上でＢＭＰ−２発現が有意に増加した。Ｔｉ対照とＡ１は、同等のレベルのｃｂｆａ１発現を示したが、Ａ５表面は、対照（Ｔｉ）と比べて増加したレベルを示した。対照と比べて、アルカリホスファターゼまたはオステオカルシン発現レベルは上昇しなかった。アルカリホスファターゼレベルは低い。

ｃｂｆａ発現を図１４に、ＢＭＰ−２発現を図１５に示す。

５．３．３ タンパク質レベル測定
ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現された骨形成性タンパク質マーカー（オステオカルシン、オステオポンチン、およびオステオプロテグリン（osteoprotegrin））の最も客観的な測定が実現される、多重キットを選択した。簡潔に述べると、５０μｌの細胞培養上清を、抗ヒト多重タンパク質マーカービーズと共に、４℃で１８時間インキュベートし、結合していない材料を濾過によって除去した（Ａｓｓａｙ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビルリカ）。２５μｌの抗ヒト多重ペプチドビオチンレポーターを加え、反応液を暗所にて室温で１．５時間インキュベートした。２５μｌのストレプトアビジン−フィコエリトリンを加え、プレートを室温でさらに３０分間インキュベートした。２５μｌの停止溶液を加え、プレートをプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ １００ ＩＳ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、米国テキサス州オースティン）で読み取った。各サンプル中のサイトカインＩＬ−６およびＴＮＦ−αの濃度を、Ｂｅａｄｖｉｅｗソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビルリカ）を使用して基準から外挿した（２．３から１０，０００ｐｇ／ｍｌ）。

すべての表面が通常の回復過程を辿り、いずれの表面上でも特別に高いタンパク質レベルは示されなかった。炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−ａおよびＩＬ−６については、８日後および１４日後にＩＬ−６のレベルの増大が示され、Ａ１表面上で最も高い値が認められた。ＩＬ−６応答を図１６に示す。

５．３．４ 要約および結論
試験表面では、全般に、Ｔｉ対照表面と同等の増殖が示された。一般に、増殖は分化より顕著であった。このことは、４日目に最高点に達したが後の時点で下降している、アルカリホスファターゼ発現の低い活性によって示された。骨誘発性ＢＭＰ−２は、４日目から１４日目までのＡ１表面についてだけ認められた。骨芽細胞分化マーカーｃｂｆａ１は、４日目から１４日目までのＡ５上で増加した。

試験表面上でのＩＬ−６レベルのわずかな増大は、ＢＭＰ−２の遅れとなって現れた可能性もある。

ナノ粒子で被覆された表面Ａ１およびＡ５は、分化にわずかな影響を及ぼすが、これら表面は、このｉｎ ｖｉｔｒｏ調査において骨芽細胞の増殖を促進するというのが一般的な傾向である。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
生体組織との接触用表面を有する生体適合性部材であって、前記表面は金属酸化物の粒子を含み、前記粒子は平均粒径が１００ｎｍ未満である生体適合性部材。
［２］
前記粒子は平均粒径が２５ｎｍ未満である［１］に記載の生体適合性部材。
［３］
前記粒子は、エレクトロスプレー走査移動粒径測定器（ＥＳ−ＳＭＰＳ）によって得られる粒径分布が４０％までである［１］又は［２］に記載の生体適合性部材。
［４］
前記粒子が概ね球形の形状を有する［１］〜［３］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［５］
前記金属酸化物が少なくとも部分的に結晶質である［１］〜［４］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［６］
前記金属酸化物が二酸化チタンを含む［１］〜［５］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［７］
前記二酸化チタンの主形態がアナターゼである［６］に記載の生体適合性物品。
［８］
前記金属酸化物の粒子が、二酸化チタンから本質的になる粒子を含み、場合により、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、またはイリジウムの酸化物のうちの１種以上から本質的になる粒子をさらに含む［６］または［７］に記載の生体適合性部材。
［９］
前記粒子が層を形成している［１］〜［８］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１０］
前記層は、厚さが、８ｎｍ〜約１μｍ、典型的には５０ｎｍ〜５００ｎｍ、たとえば１００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内にある［９］に記載の生体適合性部材。
［１１］
前記層が前記粒子の単層である［９］または［１０］に記載の生体適合性部材。
［１２］
前記層が前記粒子の連続層である［９］から［１１］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１３］
前記層が前記表面を完全に覆っている［９］から［１２］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１４］
前記粒子が前記層全体に均質に分布している［９］から［１３］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１５］
前記粒子が焼結していない［１］〜［１４］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１６］
前記粒子の少なくとも一部が焼結している［１］から［１４］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１７］
前記粒子がなく、自然金属酸化物で覆われた表面を有する対応する生体適合性部材に対する、前記表面の電気化学的相対活性表面積（Ａ _aa ）は、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも１．８である［１］〜［１６］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１８］
前記表面を有する基材を含み、この基材が金属材料を含む［１］〜［１７］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［１９］
前記金属材料が、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、およびイリジウム、ならびにこれらの合金から選択され、好ましくはチタンまたはチタン合金を含む［１８］に記載の生体適合性部材。
［２０］
前記粒子と接触している前記基材の一部が、酸化チタン、好ましくは自然酸化チタンを含む［１］〜［１９］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［２１］
生体組織への移植用である［１］〜［２０］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［２２］
歯科インプラント、好ましくはデンタルフィクスチャーである［２１］に記載の生体適合性部材。
［２３］
整形外科用インプラントである［２１］に記載の生体適合性部材。
［２４］
疑似体液に浸漬されたとき、１２時間以内にその表面上でヒドロキシアパタイト結晶の核生成を誘導する［１］〜［２３］の何れか一に記載の生体適合性部材。
［２５］
ａ）表面を有する基材を準備することと、
ｂ）平均粒径が１００ｎｍ未満である金属酸化物の粒子の、溶媒中の分散液を準備することと、
ｃ）前記粒子の分散液を前記基材の表面に適用することと
を含む、生体適合性部材の製造方法。
［２６］
前記粒子は平均粒径が２５ｎｍ未満である［２５］に記載の方法。
［２７］
前記粒子が前記溶媒中に完全に分散している［２５］または［２６］に記載の方法。
［２８］
前記分散液をスピンコーティングによって適用する［２５］〜［２７］の何れか一に記載の方法。
［２９］
ｄ）前記溶媒を蒸発させること
をさらに含む［２５］〜［２８］の何れか一に記載の方法。
［３０］
ｅ）前記粒子を焼結させること
をさらに含む［２５］〜［２９］の何れか一に記載の方法。
［３１］
金属酸化物の粒子の前記分散液を、
ｂ−ｉ）水中でＴｉＣｌ ₄ の制御加水分解を行って、コロイド分散液を得ること、および
ｂ−ｉｉ）前記コロイド分散液の透析を行うこと
によって準備する［２５］〜［３０］の何れか一に記載の方法。
［３２］
前記基材が、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、およびイリジウム、ならびにこれらの合金から選択される金属を含む［２５］〜［３１］の何れか一に記載の方法。
［３３］
前記基材の表面が自然酸化物を含む［２５］〜［３２］の何れか一に記載の方法。
［３４］
ステップｃ）の前の前記基材本体の表面が、表面粗化処理、たとえば、アブレッシブブラストおよび／または化学エッチングにかけられている［２５］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［３５］
前記基材本体が旋削される［２５］〜［３３］の何れか一に記載の方法。
［３６］
前記基材本体の表面が研磨される、［２５］から［３３］の何れか一に記載の方法。

Claims (38)

1. 生体組織との接触用表面を有する生体適合性部材であって、前記生体組織との接触用表面は金属酸化物の粒子を含み、前記粒子は平均粒径が２５ｎｍ未満であり、前記粒子は、エレクトロスプレー走査移動粒径測定器（ＥＳ−ＳＭＰＳ）によって得られる粒径分布が４０％までであり、前記粒子は前記生体組織との接触用表面の少なくとも一部を覆う層を形成する、上記生体適合性部材。
2. 前記粒子が概ね球形の形状を有する請求項１に記載の生体適合性部材。
3. 前記金属酸化物が少なくとも部分的に結晶質である請求項１又は２に記載の生体適合性部材。
4. 前記金属酸化物が二酸化チタンを含む請求項１〜３の何れか一項に記載の生体適合性部材。
5. 前記二酸化チタンの主形態がアナターゼである請求項４に記載の生体適合性物品。
6. 前記金属酸化物の粒子が、二酸化チタンから本質的になる粒子を含む、請求項４または５に記載の生体適合性部材。
7. 前記金属酸化物の粒子が、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、またはイリジウムの酸化物のうちの１種以上から本質的になる粒子をさらに含む請求項６に記載の生体適合性部材。
8. 前記層は、厚さが、８ｎｍ〜１μｍの範囲内にある請求項１に記載の生体適合性部材。
9. 前記層は、厚さが、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内にある請求項８に記載の生体適合性部材。
10. 前記層は、厚さが、１００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内にある請求項８に記載の生体適合性部材。
11. 前記層が前記粒子の単層である請求項１から１０の何れか一項に記載の生体適合性部材。
12. 前記層が前記粒子の連続層である請求項１から１１の何れか一項に記載の生体適合性部材。
13. 前記層が前記生体組織との接触用表面を完全に覆っている請求項１から１２の何れか一項に記載の生体適合性部材。
14. 前記粒子が前記層全体に均質に分布している請求項１から１３の何れか一項に記載の生体適合性部材。
15. 前記粒子が焼結していない請求項１〜１４の何れか一項に記載の生体適合性部材。
16. 前記粒子の少なくとも一部が焼結している請求項１から１４の何れか一項に記載の生体適合性部材。
17. 前記粒子がなく、自然金属酸化物で覆われた表面を有する対応する生体適合性部材に対する、前記生体組織との接触用表面の電気化学的相対活性表面積（Ａ_aa）は、少なくとも１．５である請求項１〜１６の何れか一項に記載の生体適合性部材。
18. 前記生体組織との接触用表面の前記電気化学的相対活性表面積（Ａ_aa）は、少なくとも１．８である請求項１７に記載の生体適合性部材。
19. 前記生体組織との接触用表面を有する基材を含み、この基材が金属材料を含む請求項１〜１８の何れか一項に記載の生体適合性部材。
20. 前記金属材料が、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、およびイリジウム、ならびにこれらの合金から選択される、請求項１９に記載の生体適合性部材。
21. 前記金属材料が、チタンまたはチタン合金を含む請求項２０に記載の生体適合性部材。
22. 前記粒子と接触している前記基材の一部が、酸化チタンを含む請求項１９〜２１の何れか一項に記載の生体適合性部材。
23. 前記粒子と接触している前記基材の一部が、自然酸化チタンを含む請求項２２に記載の生体適合性部材。
24. 生体組織への移植用である請求項１〜２３の何れか一項に記載の生体適合性部材。
25. 歯科インプラントである請求項２４に記載の生体適合性部材。
26. デンタルフィクスチャーである請求項２５に記載の生体適合性部材。
27. 整形外科用インプラントである請求項２４に記載の生体適合性部材。
28. 疑似体液に浸漬されたとき、１２時間以内にその生体組織との接触用表面上でヒドロキシアパタイト結晶の核生成を誘導する請求項１〜２７の何れか一項に記載の生体適合性部材。
29. ａ）生体組織との接触用表面を有する基材を準備することと、
    ｂ）平均粒径が２５ｎｍ未満であり、エレクトロスプレー走査移動粒径測定器（ＥＳ−ＳＭＰＳ）によって得られる粒径分布が４０％までである金属酸化物の粒子の、溶媒中の分散液を準備することであって、前記粒子の分散液を、
    ｂ−ｉ）水中でＴｉＣｌ₄の制御加水分解を行って、コロイド分散液を得ること、および
    ｂ−ｉｉ）前記コロイド分散液の透析を行うこと
    によって準備することと、
    ｃ）前記粒子の分散液を前記基材の前記生体組織との接触用表面に適用し、前記生体組織との接触用表面の少なくとも一部を覆う層を形成することと
    を含む、請求項１に記載の生体適合性部材の製造方法。
30. 前記粒子が前記溶媒中に完全に分散している請求項２９に記載の方法。
31. 前記分散液をスピンコーティングによって適用する請求項２９又は３０に記載の方法。
32. ｄ）前記溶媒を蒸発させること
    をさらに含む請求項２９〜３１の何れか一項に記載の方法。
33. ｅ）前記粒子を焼結させること
    をさらに含む請求項２９〜３２の何れか一項に記載の方法。
34. 前記基材が、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、コバルト、およびイリジウム、ならびにこれらの合金から選択される金属を含む請求項２９〜３３の何れか一項に記載の方法。
35. 前記基材の前記生体組織との接触用表面が自然酸化物を含む請求項２９〜３４の何れか一項に記載の方法。
36. ステップｃ）の前の前記基材の本体の前記生体組織との接触用表面が、表面粗化処理、たとえば、アブレッシブブラストおよび／または化学エッチングにかけられている請求項２９〜３５の何れか一項に記載の方法。
37. 前記基材の本体が旋削される請求項２９〜３５の何れか一項に記載の方法。
38. 前記基材の本体の前記生体組織との接触用表面が研磨される、請求項２９から３５の何れか一項に記載の方法。

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