JP6071634B2 - Atpの定量方法及びそれに用いるキット - Google Patents
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Description
本発明は、検量線を使用することなく、ATP濃度を経時的に測定することが可能なATPの定量方法及びこの方法に用いるキットを提供することを目的とする。
S1:時点t1におけるATP濃度(M)
S2:時点t2におけるATP濃度(M)
Kma:第一のルシフェラーゼのATPに対するKm値
Kmb:第二のルシフェラーゼのATPに対するKm値
Xa:Va2/Va1
Xb:Vb2/Vb1
Va1:時点t1における第一のルシフェラーゼの発光強度
Va2:時点t2における第一のルシフェラーゼの発光強度
Vb1:時点t1における第二のルシフェラーゼの発光強度
Vb2:時点t2における第二のルシフェラーゼの発光強度
また、本発明の一形態において、時系列的に発光強度が測定される少なくとも2つの上記ルシフェラーゼ中、最も高いKm値を有するルシフェラーゼにおけるKm値が100μM以上であってよい。
また、本発明の一形態において、マレーシア産のLuciola属に属するホタルに由来する上記ルシフェラーゼは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むものであってよい。
また、本発明の一形態において、ATPを含む上記試料は生体由来であってよく、また、この生体は、例えば細胞であってよい。
また、本発明の一形態において、このキットに含まれる核酸の一つは、配列番号2に示される塩基配列を含むものであってよい。
ルシフェラーゼは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。ルシフェラーゼは、ATPに感受性があり、ATPの濃度変化に応じて発光強度が変化する。本発明に係るATPの定量方法は、このルシフェラーゼによる発光を利用したものであり、ATPをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることにより発生する発光強度を測定することにより試料中に含まれるATPを定量する。
S1:時点t1におけるATP濃度(M)
S2:時点t2におけるATP濃度(M)
Kma:第一のルシフェラーゼのATPに対するKm値
Kmb:第二のルシフェラーゼのATPに対するKm値
Xa:Va2/Va1
Xb:Vb2/Vb1
Va1:時点t1における第一のルシフェラーゼの発光強度
Va2:時点t2における第一のルシフェラーゼの発光強度
Vb1:時点t1における第二のルシフェラーゼの発光強度
Vb2:時点t2における第二のルシフェラーゼの発光強度
試料が細胞である場合、当該手法の1つは、細胞外で精製したルシフェラーゼを細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によってルシフェラーゼを細胞内に直接注入することができる。または、ルシフェラーゼを含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによってルシフェラーゼを細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まずルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内でルシフェラーゼを発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターからルシフェラーゼを発現させることができる。試料として細胞を使用する場合、細胞は生きた状態でも固定した状態でもよい。例えば、細胞の機能の一部または全部が維持された生きた状態の細胞を使用することで、同一細胞内のATP濃度の経時に伴う変化を測定したり、外部からの刺激に応じた同一細胞内のATP濃度の変化を経時的に測定したりすることができる。
本発明に係るATPの定量方法において必要なルシフェラーゼのATPに対するKm値の決定方法について、本発明において好適に使用し得る2つのルシフェラーゼの組み合わせ(SP2ルシフェラーゼ、P.pyralisルシフェラーゼ)を用いて説明する。
JM109(DE3)を含む大腸菌溶液50μlにP.pyralisルシフェラーゼおよびSP2ルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42℃で1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlのAmpicillinを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、0.1M Tris−HCl溶液(pH8.0)に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離(15000rpm、10分)し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi−Agar懸濁液500μlと0.1M Tris−HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4℃の条件で行った。25mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6(ザルトリウス)で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50%グリセリン溶液とした。保存は−20℃で行った。
・D−ルシフェリンおよびATPの濃度の決定
D−ルシフェリン溶液中のD−ルシフェリン濃度およびATP溶液中のATP濃度を以下の通りに決定した。
UV−Visible Spectrometer(Hitachi)を用いて、D−ルシフェリン溶液およびATP溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。
D−ルシフェリン:λmax 328nm、ε18200、pH5.0
ATP:λmax 259nm、ε15400、pH7.0。
様々なATP濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ATPに対する各ルシフェラーゼのKm値を決定した。
上記のようにして測定したKm値を使用して、HeLa細胞のアポトーシスに伴うATP量変化を経時的に算出した。
コドンを哺乳細胞用に最適化したP.pyralisおよびSP2ルシフェラーゼ遺伝子をpcDNA3.1ベクター(Invitorogen)のマルチクローニングサイトにBamHI, EcoRIサイトで挿入したプラスミドを作成した。各プラスミドを35mmプラスチックディッシュに播種したHeLa細胞にリポフェクション法で遺伝子導入し、24時間後10%FBSを含むD−MEM培地から10%FBSを含むCO2 Independent Medium(Invitrogen)に交換した。測定直前にD-luciferinを最終濃度1mMで添加した。さらにHeLa細胞にアポトーシスを誘導することが知られている薬剤スタウロスポリンを最終濃度4μMで添加し、培養細胞用ルミノメーターKronos(ATTO)を用いて発光強度を経時的に測定した。アポトーシスが誘導されたHeLa細胞の発光量の経時変化を図3に示す。
Kmb:SP2ルシフェラーゼのATPに対するKm値 1260μM
Xa:Va2/Va1 22516996/18411538
Xb:Vb2/Vb1 3982267/2491629
Va1:時点t1におけるP. pyralisルシフェラーゼの発光強度 18411538
Va2:時点t2におけるP. pyralisルシフェラーゼの発光強度 22516996
Vb1:時点t1におけるSP2ルシフェラーゼの発光強度 2491629
Vb2:時点t2におけるSP2ルシフェラーゼの発光強度 3982267
Claims (7)
- ATPをルシフェラーゼの触媒活性の下でルシフェリンと反応させることにより発生する発光強度を測定することにより試料中に含まれるATPを定量する方法であって、
前記ルシフェラーゼとしてATPに対するKm値が互いに異なる第一のルシフェラーゼおよび第二のルシフェラーゼについて同じ時系列で少なくとも2つの同じ時点において発光強度を測定することと、
前記第一のルシフェラーゼにおける前記2つの時点で得られた発光強度の比と、前記第二のルシフェラーゼにおける前記2つの時点で得られた発光強度の比とを求めることを含み、
前記第一のルシフェラーゼのATPに対するKm値と、前記第二のルシフェラーゼのATPに対するKm値と、前記第一のルシフェラーゼにおける前記発光強度の比と、前記第二のルシフェラーゼにおける前記発光強度の比を、ミカエリス・メンテン式に代入することにより、前記2つの時点におけるATP濃度が算出される、ATPの定量方法。 - 前記第一のルシフェラーゼのATPに対するKm値、前記第二のルシフェラーゼのATPに対するKm値、前記第一のルシフェラーゼにおける前記発光強度の比、および、前記第二のルシフェラーゼにおける前記発光強度の比をミカエリス・メンテン式に代入することにより下式(I)及び(II)を導き、前記2つの時点におけるATP濃度が算出される、請求項1に記載のATPの定量方法。
S1:時点t1におけるATP濃度(M)
S2:時点t2におけるATP濃度(M)
Kma:第一のルシフェラーゼのATPに対するKm値
Kmb:第二のルシフェラーゼのATPに対するKm値
Xa:Va2/Va1
Xb:Vb2/Vb1
Va1:時点t1における第一のルシフェラーゼの発光強度
Va2:時点t2における第一のルシフェラーゼの発光強度
Vb1:時点t1における第二のルシフェラーゼの発光強度
Vb2:時点t2における第二のルシフェラーゼの発光強度 - 時系列的に発光強度が測定される少なくとも2つの前記ルシフェラーゼにおけるATPに対するKm値の差が10μM以上である、請求項1または請求項2に記載のATPの定量方法。
- 時系列的に発光強度が測定される少なくとも2つの前記ルシフェラーゼ中、最も高いKm値を有するルシフェラーゼにおけるKm値が100μM以上である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のATPの定量方法。
- 時系列的に発光強度が測定される少なくとも2つの前記ルシフェラーゼにおける最大発光波長が互いに異なり、これらルシフェラーゼがATPを含む同じ試料中に導入されたものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のATPの定量方法。
- ATPを含む前記試料が生体由来である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のATPの定量方法。
- 前記生体が細胞である、請求項6に記載のATPの定量方法。
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