JP6048036B2 - Purification method of sugar chain - Google Patents
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Description
本発明は、糖タンパク質が有する糖鎖の精製方法に関する。 The present invention relates to a method for purifying a sugar chain possessed by a glycoprotein.
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸等の単糖およびこれらの
誘導体がグリコシド結合によって鎖状に複数結合した分子の総称である。
A sugar chain is a general term for molecules in which monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and derivatives thereof are linked in a chain form by glycosidic bonds. .
糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質等に結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整等に深く関わっていることが明らかになりつつある。 Sugar chains are very diverse and are substances that are involved in various functions of naturally occurring organisms. Sugar chains often exist as complex carbohydrates bound to proteins, lipids, and the like in vivo, and are one of the important components in vivo. It is becoming clear that sugar chains in living organisms are deeply involved in cell-to-cell information transmission, protein functions and interactions.
糖鎖を有する生体高分子としては、例えば、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる（非特許文献１）。 Examples of biopolymers having sugar chains include proteoglycans on the cell wall of plant cells that contribute to cell stabilization, glycolipids that affect cell differentiation, proliferation, adhesion, migration, etc., and cell-cell interactions and cells. Glycoproteins involved in recognition can be mentioned, but the mechanism by which these high-molecular sugar chains control advanced and precise biological reactions while acting, assisting, amplifying, regulating, or inhibiting each other's functions gradually. It is being revealed. Furthermore, if the relationship between such sugar chains and cell differentiation / proliferation, cell adhesion, immunity, and cell carcinogenesis is clarified, this sugar chain engineering and medicine, cell engineering, or organ engineering are closely related. It can be expected that a new development will be made in relation to (Non-patent Document 1).
特に細胞表面に存在する糖鎖は、様々な生体反応の足場として重要な役割をしている事が明らかとなってきた。例えば、レセプターとの相互作用異常による疾病の発生、あるいはエイズウイルスやインフルエンザウイルス等の感染、病原性大腸菌Ｏ１５７の毒素やコレラ毒素の細胞への侵入に関わるとされている。また、ある種の癌細胞では特異的な糖鎖が細胞表面に現れる等、細胞表面糖鎖は細胞に個性をあたえる重要な分子とされている。 In particular, it has been revealed that sugar chains present on the cell surface play an important role as scaffolds for various biological reactions. For example, it is said to be involved in the occurrence of diseases due to abnormal interaction with the receptor, infection with AIDS virus, influenza virus, etc., and invasion of pathogenic E. coli O157 toxin and cholera toxin into cells. In addition, specific sugar chains appear on the cell surface in certain types of cancer cells, and the cell surface sugar chains are considered to be important molecules that give the cells individuality.
これらの解析のため、糖鎖構造解析の技術が開発されており、これらの技術は、複合糖質からの糖鎖切り出し、糖鎖の分離精製、糖鎖の標識化等の工程を組み合わせたものであるが、これらの工程はきわめて煩雑である。 For these analyses, sugar chain structure analysis techniques have been developed, which combine processes such as sugar chain excision from glycoconjugates, separation and purification of sugar chains, and labeling of sugar chains. However, these steps are extremely complicated.
さらに、糖鎖の分離精製には、例えば、イオン交換樹脂、逆相クロマトグラフィ、活性炭、ゲル濾過クロマトグラフィ等の手法が用いられるが、これらの分離手段は糖を特異的に認識する方法ではないので、莢雑物（ペプチド、タンパク質等）の混入が避けられず、また糖鎖の構造によって回収率に差異が生じることが多い。 Furthermore, for separation and purification of sugar chains, for example, techniques such as ion exchange resin, reverse phase chromatography, activated carbon, gel filtration chromatography are used, but these separation means are not methods that specifically recognize sugars, Incorporation of impurities (peptides, proteins, etc.) is unavoidable, and the recovery rate often varies depending on the structure of the sugar chain.
また、クロマトグラフィで糖鎖を高精度に分離する場合には、糖鎖にピリジルアミノ化等の蛍光標識を施す必要があり、煩雑な操作が必要となる。そして、蛍光標識した糖鎖を分析するには、標識後の反応液中より未反応の２−アミノピリジン等の夾雑物を除き、この標識化糖鎖を精製することが必要である。 In addition, when a sugar chain is separated with high accuracy by chromatography, it is necessary to apply a fluorescent label such as pyridylamination to the sugar chain, which requires complicated operations. In order to analyze the fluorescently labeled sugar chain, it is necessary to remove unreacted impurities such as 2-aminopyridine from the labeled reaction solution and purify the labeled sugar chain.
一般には、標識化糖鎖と夾雑物の分子量の差を利用してゲルろ過を行い、夾雑物を除去する。しかしながら、この方法は器具を多く用いる点と、操作に多くの時間を要する点から、多数の試料を短時間に処理するのは困難である。 In general, gel filtration is performed using the difference in molecular weight between the labeled sugar chain and the contaminant to remove the contaminant. However, it is difficult to process a large number of samples in a short time because this method uses many instruments and requires a lot of time for operation.
また、簡易な方法として共沸により夾雑物を留去する方法も試みられているが、十分に夾雑物を除去するのは難しい。 Moreover, although a method of distilling off impurities by azeotropy has been tried as a simple method, it is difficult to sufficiently remove the impurities.
さらに、糖鎖構造と各種疾患の関係を調べるためには、統計的処理が可能な多数の検体の糖鎖構造を調べる必要がある。 Furthermore, in order to investigate the relationship between the sugar chain structure and various diseases, it is necessary to examine the sugar chain structures of a large number of specimens that can be statistically processed.
上述したような従来法では、糖鎖を分離するために、煩雑な工程を経る必要があり、膨大なコストと時間が必要となるため、簡単な作業でかつ多量に優れた精度で糖鎖を分離精製する手段が求められていた。 In the conventional method as described above, it is necessary to go through complicated steps to separate sugar chains, and enormous costs and time are required. A means for separation and purification has been demanded.
さらに、糖鎖に蛍光標識を施す方法は、種々開発されている（例えば、特許文献１、２、３）が、その標識化効率は１００％ではなく、１つのサンプルに標識された糖鎖とされていない糖鎖が混在していた。この状況は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）や、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）を用いて蛍光検出している際には大きな問題とならないが、質量分析法により糖鎖を分析する際にピークが複雑化するという問題点があった。また、標識化効率が悪い場合、ＨＰＬＣやＣＥによる分析においても、感度が低下するという問題が生じる可能性があった。 Furthermore, various methods for applying fluorescent labeling to sugar chains have been developed (for example, Patent Documents 1, 2, and 3). However, the labeling efficiency is not 100%. Unaccompanied sugar chains were mixed. This situation does not pose a major problem when fluorescence detection is performed using high performance liquid chromatography (HPLC) or capillary electrophoresis (CE method), but peaks are present when analyzing sugar chains by mass spectrometry. There was a problem of increasing complexity. In addition, when the labeling efficiency is poor, there is a possibility that the sensitivity is lowered in the analysis by HPLC or CE.
本発明の目的は、簡単な作業でかつ多量に優れた精度で糖鎖を多検体同時に分離精製することができる糖鎖の精製方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for purifying a sugar chain, which is capable of simultaneously separating and purifying a plurality of sugar chains with a large amount of accuracy with a simple operation.
このような目的は、下記（１）〜（１３）に記載の本発明により達成される。
（１） 糖鎖を含有する溶液を用意する第１の工程と、
フィルターを備えるウェルを複数有するマルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に前記糖鎖と特異的に結合する捕捉担体を収納した状態で、各前記ウェル内に前記糖鎖を含有する溶液を供給した後、乾燥させることにより、前記糖鎖と前記捕捉担体とを接触させて、この捕捉担体上に糖鎖を捕捉する第２の工程と、
前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体に結合した糖鎖以外の物質を除去する洗浄液を供給した後、前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、前記フィルターにより前記洗浄液と前記捕捉担体とを分離することにより、前記捕捉担体に結合した糖鎖以外の物質を除去する第３の工程と、
前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を再遊離させる遊離液を供給することで、前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を再遊離させる第４の工程と、
前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、再遊離した前記糖鎖を前記捕捉担体と分離して精製する第５の工程とを有することを特徴とする糖鎖の精製方法。
Such an object is achieved by the present invention described in the following (1) to ( 13 ).
(1) a first step of preparing a solution containing a sugar chain;
After supplying a solution containing the sugar chain in each well in a state where a capture carrier that specifically binds to the sugar chain is housed in each well of a multi-well filter plate having a plurality of wells with filters A second step of bringing the sugar chain into contact with the capture carrier by drying and capturing the sugar chain on the capture carrier;
A cleaning solution for removing substances other than sugar chains bound to the capture carrier is supplied into each well of the multi-well filter plate, and then a pressure difference is generated between the upper and lower portions of the well so that the cleaning solution is used by the filter. Separating the capture carrier and the capture carrier, thereby removing a substance other than the sugar chain bound to the capture carrier;
Said multiwell filter plate each said well of, by supplying the free liquid for re-release the sugar chain attached to the capture support, a fourth step of re-release the sugar chains bound to the capture support When,
The multi-well filter plate by creating a pressure differential above and below each of said wells, sugar chains and having a fifth step of purifying re liberated the sugar chains separately from the trapping carrier Purification method.
（２） 前記第３の工程において、前記フィルターの下側を負圧にすることで、前記フィルターの下側に、前記洗浄液を透過させる上記（１）に記載の糖鎖の精製方法。 (2) The method for purifying a sugar chain according to (1), wherein, in the third step, the lower side of the filter is set to a negative pressure so that the washing liquid is permeated to the lower side of the filter.
（３） 前記第５の工程において、前記フィルターの下側を負圧にすることで、前記フィルターの下側に、再遊離した前記糖鎖を含む前記溶液を透過させる上記（１）または（２）に記載の糖鎖の精製方法。 (3) In the fifth step, by the lower side of the filter to a negative pressure, the lower side of the filter, the which transmits the solution containing the re-liberated the sugar chain (1) or (2 The method for purifying sugar chains as described in 1 ) .
（４） 前記マルチウェルフィルタープレートの下側に、複数のウェルを有するマイクロウェルプレートが配置され、前記マルチウェルフィルタープレートのウェルに対応する、前記マイクロウェルプレートのウェルに、再遊離した前記糖鎖を含む前記溶液が選択的に供給される上記（３）に記載の糖鎖の精製方法。 ( 4 ) A microwell plate having a plurality of wells is disposed below the multiwell filter plate, and the sugar chain re-released in the well of the microwell plate corresponding to the well of the multiwell filter plate The method for purifying a sugar chain according to ( 3 ), wherein the solution containing is selectively supplied.
（５） 前記マルチウェルフィルタープレートの底面と、前記マイクロウェルプレートの上面との離間距離は、１０ｍｍ以下である上記（４）に記載の糖鎖の精製方法。 ( 5 ) The method for purifying a sugar chain according to ( 4 ) above, wherein the separation distance between the bottom surface of the multiwell filter plate and the top surface of the microwell plate is 10 mm or less.
（６） 前記第４の工程において、前記捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離させるとともに、該糖鎖をラベル化試薬でラベル化する上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の糖鎖の精製方法。
（７） 前記第４の工程において、前記補足担体からの前記糖鎖の再遊離の後に、前記糖鎖をラベル化試薬でラベル化する上記（６）に記載の糖鎖の精製方法。
( 6 ) The sugar according to any one of (1) to ( 5 ), wherein in the fourth step, the sugar chain bound to the capture carrier is re-released and the sugar chain is labeled with a labeling reagent. Chain purification method.
( 7 ) The method for purifying a sugar chain according to the above ( 6 ), wherein in the fourth step, the sugar chain is labeled with a labeling reagent after the sugar chain is re-released from the supplement carrier.
（８） 前記ラベル化試薬は、芳香族アミンで構成される蛍光物質である上記（７）に記載の糖鎖の精製方法。 ( 8 ) The method for purifying a sugar chain according to ( 7 ), wherein the labeling reagent is a fluorescent substance composed of an aromatic amine.
（９） 前記蛍光物質は、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ、５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ、３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅから選ばれる少なくとも１種である上記（８）に記載の糖鎖の精製方法。 ( 9 ) The fluorescent substance includes 2-aminobenzomide, 2-aminobenzoic acid, 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate, 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate, 2-amino9 (10H) -acidone, 5-Aminofluorescein, Dansylethylenediamine, 7- Amino-4-methylcoumarine, 3-aminobenzoic acid, 7-Amino-1-naphthol, according to 3- (acetylamino) at least one a is the selected from -6-aminoacridine (8) Purification method for sugar chain.
（１０） 再遊離した前記糖鎖を含む前記溶液における前記蛍光物質の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である上記（８）または（９）に記載の糖鎖の精製方法。 ( 10 ) The method for purifying a sugar chain according to the above ( 8 ) or ( 9 ), wherein the concentration of the fluorescent substance in the solution containing the re-released sugar chain is 0.5 mol / L or more.
（１１） 前記第５の工程において、再遊離した前記糖鎖を前記捕捉担体と分離した後、さらに、前記糖鎖を、ラベル化に使用されなかったラベル化試薬と分離する上記（６）ないし（１０）のいずれかに記載の糖鎖の精製方法。 In (11) the fifth step, after the re-liberated the sugar chains were separated from the trapping carrier further the sugar chain, the above (6) to be separated from the labeled reagent which has not been used for labeling ( 10 ) The method for purifying a sugar chain according to any one of ( 10 ).
（１２） 前記第５の工程において、再遊離した前記糖鎖の精製の後に、前記マルチウェルフィルタープレートと、シリカゲルを備えるウェルを複数有するマルチウェルシリカゲルプレートとを交換し、その後、前記マルチウェルシリカゲルプレートを用いて、前記シリカゲルに対する前記糖鎖と前記ラベル化試薬との吸着力の差に基づいて、前記糖鎖を、ラベル化に使用されなかった前記ラベル化試薬から分離する上記（１１）に記載の糖鎖の精製方法。 ( 12 ) In the fifth step, after the re-released sugar chain is purified, the multiwell filter plate is replaced with a multiwell silica gel plate having a plurality of wells equipped with silica gel , and then the multiwell silica gel In the above ( 11 ), the plate is used to separate the sugar chain from the labeling reagent that was not used for labeling based on the difference in adsorption force between the sugar chain and the labeling reagent with respect to the silica gel. The method for purifying the sugar chain as described.
（１３） 前記捕捉担体は、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基を有するポリマー粒子である上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の糖鎖の精製方法。 ( 13 ) The sugar chain purification method according to any one of (1) to ( 12 ), wherein the capture carrier is polymer particles having a hydrazide group or an oxylamino group.
本発明によれば、簡単な作業で優れた精度で糖鎖を分離精製することができる。さらに、複数のウェルに供給された処理液を一括して処理することができるため、一度の精製処理で、多量（複数種）の糖鎖を精製することができるようになる。 According to the present invention, sugar chains can be separated and purified with excellent accuracy by a simple operation. Furthermore, since the processing solutions supplied to a plurality of wells can be processed in a lump, a large amount (plural types) of sugar chains can be purified by a single purification process.
以下、本発明の糖鎖の精製方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
なお、以下では、本発明の糖鎖の精製方法の説明を行うのに先立って、まず、糖タンパク質が有する糖鎖の精製方法（本発明の糖鎖の精製方法）に用いられる精製装置の一例について説明する。
Hereinafter, the method for purifying a sugar chain of the present invention will be described in detail based on preferred embodiments.
In the following, prior to explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention, first, an example of a purification apparatus used for the method for purifying a sugar chain possessed by a glycoprotein (the method for purifying a sugar chain of the present invention). Will be described.
＜精製装置＞
図１は、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の一例を示す分解斜視図、図２は、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の一例を示す斜視図、図３は、図２に示す精製装置のＡ−Ａ線断面図（なお、図３（ａ）は、精製装置にマイクロウェルプレートを装着した場合を表し、図３（ｂ）は、精製装置にトレイを装着した場合を表す。）である。なお、説明の都合上、以下の説明では、図１〜図５中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
<Purification equipment>
FIG. 1 is an exploded perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention. FIG. 2 is a perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention. 3 is a cross-sectional view taken along line AA of the purification apparatus shown in FIG. 2 (note that FIG. 3 (a) shows a case where a microwell plate is attached to the purification apparatus, and FIG. 3 (b) shows a tray in the purification apparatus. Represents the case of wearing.). For convenience of description, in the following description, the upper side in FIGS. 1 to 5 is referred to as “upper” and the lower side is referred to as “lower”.
図１〜図３に示す精製装置１は、マルチウェルフィルタープレート１００と、このマルチウェルフィルタープレート１００を支持する第１の支持台４００と、マイクロウェルプレート２００と、トレイ３００と、これらマイクロウェルプレート２００またはトレイ３００を支持する第２の支持台５００とを有している。
1 to 3 includes a
マルチウェルフィルタープレート１００は、その全体形状が平板状をなし、その厚さ方向（上下方向）に設けられた、複数（本実施形態では９６個）のウェル（穴部）１０１を備えている。
The
これらのウェル１０１は、それぞれ、図３に示すように、その下側に底面１０３を備える構成をなしており、さらに、この底面１０３のほぼ中心に対応して、貫通孔１０４が設けられている。これにより、この貫通孔１０４を介した、ウェル１０１に供給（収納）された液体の外部への流出が、底面１０３側から許容される。
As shown in FIG. 3, each of these
貫通孔１０４の孔径は、好ましくは０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度、より好ましくは０．２ｍｍ〜０．７ｍｍ程度に設定される。
The hole diameter of the through
さらに、ウェル１０１の下側（底面１０３側）には、貫通孔１０４を塞ぐようにフィルター１０５が配置されている。このフィルター１０５と貫通孔１０４の孔径との関係により、マルチウェルフィルタープレート１００の静置時には、ウェル１０１に供給された液体が貫通孔１０４を介して、その外部へ流出することが阻害される。
Furthermore, a
これに対して、後述するように、マルチウェルフィルタープレート１００を精製装置１に装着して、吸引ポンプを用いて、第２の支持台５００が有する凹部５０５内を吸引した際には、前記液体のフィルター１０５の透過が許容される。そのため、前記液体が貫通孔１０４を介して、その外部に、底面１０３側から流出される。
On the other hand, as will be described later, when the
フィルター１０５の素材としては、特に限定されないが、例えば、多孔性フィルムおよび不織布等が挙げられる。また、その構成材料としては、ポリテトラフルオロエチレン、セルロースエステル、フッ化ビニリデン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびナイロン等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
Although it does not specifically limit as a raw material of the
なお、このフィルター１０５には親水処理が施されているのが好ましい。これにより、前記液体の透過性の向上を図ることができる。
The
この親水処理は、例えば、界面活性剤、水溶性シリコン、ポリプロピレングリコール等を付与（塗布）等することにより行うことができる。 This hydrophilic treatment can be performed, for example, by applying (coating) a surfactant, water-soluble silicon, polypropylene glycol, or the like.
フィルター１０５が備える細孔の孔径は、好ましくは０．１〜５０μｍ程度、より好ましくは０．２〜２０μｍ程度、さらに好ましくは０．４〜１０μｍに設定される。これにより、前記液体に含まれる液状成分の透過は許容されるとともに、後述するようなポリマー粒子２０の透過は確実に許容されなくなる。
The pore diameter of the pores provided in the
なお、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができ、なかでも、ポリプロピレン、塩化ビニル、ＰＴＦＥ等であるのが好ましい。これにより、マルチウェルフィルタープレート１００の耐溶剤性や耐熱性を向上させることができる。
In addition, although it does not specifically limit as a constituent material of each part except the
第１の支持台４００は、マルチウェルフィルタープレート１００を支持するための部材であり、平板状をなし、その中央部で開口する開口部４０２を備える底部４０１と、底部４０１の外縁に沿って上方に突出するように設けられた上側外壁４０３と、底部４０１の外縁に沿って下方に突出するように設けられた下側外壁４０４とを有している。
The
このような上側外壁４０３で取り囲まれることにより凹部４０５が形成され、この凹部４０５内にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入することで、マルチウェルフィルタープレート１００が第１の支持台４００により支持される。
A
また、底部４０１の開口部４０２の縁部に沿って溝が設けられており、この溝に対応するようにパッキン（シール部材）４０７が配置されている。これにより、凹部４０５内にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入した際に、開口部４０２と精製装置１の外部との連通が許容されなくなる。
Further, a groove is provided along the edge of the
なお、上側外壁４０３は、対向する２つの長辺の中央部において、厚さ方向（上下方向）に直交する方向に開口部４０８を有する構成をなしており、これにより、凹部４０５内に挿入（載置）されたマルチウェルフィルタープレート１００の出し入れを容易に行うことができるようになる。また、この開口部４０８は、マルチウェルフィルタープレート１００の上端が、凹部４０５から突出する場合には、その形成を省略することができる。
The upper
さらに、下側外壁４０４で取り囲まれることにより凹部４０６が形成され、この凹部４０６の内周面に沿って、後述する第２の支持台５００が有する突出部５０２を挿入することで、第２の支持台５００上に第１の支持台４００が固定される。
Furthermore, a
なお、本実施形態では、上側外壁４０３の外周面と下側外壁４０４の外周面とが、一体的に形成されていることで、１つの平坦面により構成されている。
In the present embodiment, the outer peripheral surface of the upper
なお、第１の支持台４００の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、ポリカーボネート、アクリル系樹脂、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体（ＡＢＳ樹脂）のような樹脂材料、ステンレス鋼等のＦｅ系合金、ＣｕまたはＣｕ系合金、ＡｌまたはＡｌ系合金のような金属系材料、アルミナ、アパタイト、窒化アルミのようなセラミックス系材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
In addition, although it does not specifically limit as a constituent material of the
マイクロウェルプレート２００は、第２の支持台５００が備える凹部５０５内に挿入して用いられるものである。
The
このマイクロウェルプレート２００は、マルチウェルフィルタープレート１００と同様に、その全体形状が平板状をなし、その厚さ方向（上下方向）に設けられた、複数（本実施形態では９６個）のウェル（穴部）２０１を備えている。
Similar to the
これらのウェル２０１は、その下側に底面２０３を備え、この底面２０３側で貫通しない構成をなしており、これにより、ウェル２０１に供給（収納）された液体がその内部に貯留される。
These
なお、マルチウェルフィルタープレート１００が備える各ウェル１０１と、マイクロウェルプレート２００が備えるウェル２０１とは、各プレート１００、２００同士を上下方向に重ね合わせたとき、それぞれ、上下方向に対応して配置するように設定されている。そのため、後に詳述するように、各ウェル１０１が備える貫通孔１０４を通過して底面１０３側から外部へ流出された液体は、各ウェル１０１に対応するように配置された各ウェル２０１に対して、選択的に供給されることとなる。
In addition, each well 101 with which the
また、マイクロウェルプレート２００は、複数のウェル２０１が形成されたウェル形成部２０２と、このウェル形成部２０２の周囲を取り囲むように配置されたフレーム部２０４とを有する構成をなしており、ウェル形成部２０２の厚さは、フレーム部２０４の厚さより厚くなっている。これにより、ウェル形成部２０２の上面は、フレーム部２０４の上面から突出する。このウェル形成部２０２の平面視形状は、第１の支持台４００の開口部４０２に挿入可能な大きさに設定されている。したがって、第２の支持台５００の凹部５０５内にマイクロウェルプレート２００を配置した状態で、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置すると、図３（ａ）に示すように、ウェル形成部２０２を開口部４０２内に挿入させることができる。そのため、ウェル形成部２０２の上面と、マルチウェルフィルタープレート１００の底面１０３との離間距離を小さく設定することができることから、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１から貫通孔１０４を介して流出された液体を、このウェル１０１に対応する、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１内に高効率に供給することができる。
The
なお、マイクロウェルプレート２００の構成材料としては、例えば、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
In addition, as a constituent material of the
トレイ３００は、マイクロウェルプレート２００と同様に第２の支持台５００が備える凹部５０５内に挿入して用いられるものである。すなわち、精製装置１を用いた糖鎖の精製方法で施される処理の種類に応じて、トレイ３００またはマイクロウェルプレート２００が凹部５０５内に挿入される。
Similar to the
このトレイ３００は、上述したマイクロウェルプレート２００と、複数のウェル２０１が形成されたウェル形成部２０２に対応する位置に、１つの凹部３０１を備えていること以外は、同様の構成をなしている。
The
トレイ３００を、このような凹部３０１を備える構成とすることで、図３（ｂ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５内にトレイ３００を配置した状態で、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置した際に、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１から貫通孔１０４を介して流出された液体を、トレイ３００の凹部３０１内に一括して貯留することができるようになる。
By configuring the
なお、トレイ３００は、図１等に示すように、マイクロウェルプレート２００のフレーム部２０４に対応する位置で突出する凸部を有する構成に限らず、その中心部側に凹部３０１が形成されている限りにおいて、凸部の形成が省略されたものであってもよい。
As shown in FIG. 1 and the like, the
なお、トレイ３００の構成材料としては、例えば、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
In addition, as a constituent material of the
調整板６００は、トレイ３００またはマイクロウェルプレート２００に先立って、第２の支持台５００が備える凹部５０５内に挿入して用いられるものである。
Prior to the
この調整板６００は、平板状をなしており、その厚さの異なるものが複数枚用意されている。
The
そして、凹部５０５内に挿入するマイクロウェルプレート２００の種類に応じて、適切な厚さのものを選択することで、マイクロウェルプレート２００（ウェル形成部２０２）の上面と、マルチウェルフィルタープレート１００の底面１０３との離間距離を容易に小さく設定することができるようになる。
Then, by selecting an appropriate thickness according to the type of the
なお、調整板６００の構成材料としては、例えば、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
In addition, as a constituent material of the
第２の支持台５００は、マイクロウェルプレート２００またはトレイ３００を支持するための部材であり、平板状をなす底部５０１と、底部５０１の外縁に沿って上方に突出するように設けられた外壁５０３とを有している。
The
このような外壁５０３で取り囲まれることにより、その内側に凹部５０５が形成され、この凹部５０５内にマイクロウェルプレート２００またはトレイ３００を挿入することで、マイクロウェルプレート２００またはトレイ３００が第２の支持台５００により支持される。
By being surrounded by such an
また、外壁５０３は、外壁５０３の内縁に沿って上方に突出する突出部５０２を有している。この突出部５０２は、第１の支持台４００が備える凹部４０６の内周面に沿って、挿入し得るように設定されており、これにより、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置した際に、突出部５０２が第１の支持台４００の凹部４０６に挿入されることで、第２の支持台５００上に第１の支持台４００が固定される。
The
外壁５０３の上面には、突出部５０２を取り囲むように溝が設けられており、この溝に対応するようにパッキン（シール部材）５０７が配置されている。これにより、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置した際に、支持台４００、５００同士間での外部との連通が許容されなくなる。
A groove is provided on the upper surface of the
さらに、外壁５０３は、外壁５０３の側面に、凹部５０５に貫通する貫通孔５０６を有している。この貫通孔５０６には、吸引ポンプ（図示せず）を連結し得るように構成されており、かかる吸引ポンプを作動させることで、凹部５０５内を減圧することができる。
Furthermore, the
なお、第２の支持台５００の構成材料としては、例えば、第１の支持台４００の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
In addition, as a constituent material of the
以上のような各部材で構成される精製装置１は、図３（ａ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５にマイクロウェルプレート２００を挿入して用いる第１の使用方法と、図３（ｂ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５にトレイ３００を挿入して用いる第２の使用方法との２つの使用方法で用いられるが、以下、これらの使用方法について説明する。
As shown in FIG. 3A, the refining device 1 composed of each member as described above includes a first usage method in which the
まず、第１の使用方法では、第１の支持台４００の凹部４０５にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびマイクロウェルプレート２００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する（図２、図３（ａ）参照。）。
First, in the first usage method, the
これにより、マルチウェルフィルタープレート１００が凹部４０５内に挿入され、マイクロウェルプレート２００が凹部５０５内に挿入され、マイクロウェルプレート２００のウェル形成部２０２が第１の支持台４００の開口部４０２に挿入され、さらに、第２の支持台５００の突出部５０２が第１の支持台４００の凹部４０６に挿入される。その結果、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１に対応して、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１が配置された状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００が固定される。
As a result, the
また、かかる状態では、パッキン５０７により、支持台４００、５００同士間での外部との連通が許容されておらず、パッキン４０７により、第１の支持台４００とマルチウェルフィルタープレート１００との間での連通が許容されていないため、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を、外部に対して閉鎖された閉鎖空間とすることができる。
In such a state, the packing 507 does not allow communication between the support bases 400 and 500, and the packing 407 allows the
したがって、貫通孔５０６に連結された吸引ポンプを作動させて、凹部５０５を減圧することで、前記閉鎖空間をその外部に対して負圧とすることができる。そのため、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内ではフィルター１０５を介して、その上下で圧力差が生じることから、この圧力差に基づいて、ウェル１０１内の液体がフィルター１０５を透過する。したがって、各ウェル１０１から貫通孔１０４を介して液体を流出させることができ、その結果、これらのウェル１０１に対応する、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１内に選択的に液体が供給される。
Therefore, by operating the suction pump connected to the through
次に、第２の使用方法では、第１の支持台４００の凹部４０５にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する（図２、図３（ｂ）参照。）。
Next, in the second usage method, the
第２の使用方法では、第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入すること以外は、第１の使用方法と同様である。
The second usage method is the same as the first usage method except that the
このような第２の使用方法によっても、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を、外部に対して閉鎖された閉鎖空間とすることができる。
Also in such a second usage method, the internal space formed by the
したがって、第１の使用方法と同様に、貫通孔５０６に連結された吸引ポンプを作動させて、凹部５０５を減圧することで、各ウェル１０１から貫通孔１０４を介して液体を流出させることができる。その結果、各ウェル１０１から流出した液体を、マルチウェルフィルタープレート１００の下側に位置するトレイ３００が有する凹部３０１に一括して貯留することができる。
Therefore, as in the first method of use, the suction pump connected to the through
なお、この第２の使用方法では、各ウェル１０１から流出した液体を、一括して凹部３０１に貯留すれば良いことから、凹部３０１の開口部と、貫通孔１０４との離間距離を必要以上に小さくさせる必要がないため、第２の支持台５００の凹部５０５に対する調整板６００の挿入を省略するようにしてもよい。
In this second method of use, the liquid flowing out from each well 101 may be stored in the
また、本実施形態では、精製装置１において、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１が有するフィルター１０５の下側を、その上側より負圧とすることでフィルター１０５に液体を透過させる構成としたが、かかる構成に限らず、精製装置は、フィルター１０５の上側を、その下側より正圧とすることでフィルター１０５に液体を透過させる構成のものであってもよい。
In the present embodiment, the purification apparatus 1 is configured such that liquid is allowed to pass through the
以上のような精製装置（マニホールド）１を用いて、例えば、以下のようにして、糖鎖を備える糖タンパク質から糖鎖を精製することができる。 Using the purification apparatus (manifold) 1 as described above, for example, sugar chains can be purified from glycoproteins having sugar chains as follows.
＜精製方法＞
図４〜７は、糖タンパク質から糖鎖を精製する本発明の糖鎖の精製方法を説明するための縦断面図である。また、以下の説明では、図４〜７中の上側を「上」、下側を「下」という。
<Purification method>
4 to 7 are longitudinal sectional views for explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention for purifying a sugar chain from a glycoprotein. In the following description, the upper side in FIGS. 4 to 7 is referred to as “upper” and the lower side is referred to as “lower”.
なお、以下に示す糖タンパク質の精製方法では、電気泳動により分離されたゲル中の糖タンパク質から糖鎖を精製する場合について説明する。 In the glycoprotein purification method described below, a case where a sugar chain is purified from a glycoprotein in a gel separated by electrophoresis will be described.
以下に示す糖鎖の精製方法では、［１］糖タンパク質が保持されたゲルを得る工程と、［２］ゲルを糖鎖遊離手段で処理することで糖鎖を遊離させる工程と、［３］遊離した糖鎖をゲルから溶出させて糖鎖を含有する溶液を得る工程と、［４］糖鎖を含有する溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、この捕捉担体上に糖鎖を捕捉する工程と、［５］上記捕捉担体に結合しなかった糖鎖以外の物質を除去する工程と、［６］捕捉担体が備える官能基を失活させる工程と、［７］捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離するとともに、この糖鎖を他の化合物でラベル化する工程と、［８］ラベル化された糖鎖を精製する工程とを有する。 In the sugar chain purification method shown below, [1] a step of obtaining a gel retaining glycoprotein, [2] a step of releasing the sugar chain by treating the gel with a sugar chain releasing means, [3] A step of eluting the released sugar chain from the gel to obtain a solution containing the sugar chain; and [4] contacting the solution containing the sugar chain with a capture carrier that specifically binds to the sugar chain, A step of capturing a sugar chain, [5] a step of removing substances other than the sugar chain that did not bind to the capture carrier, [6] a step of deactivating functional groups of the capture carrier, [7] The method includes the step of re-releasing the sugar chain bound to the capture carrier, labeling this sugar chain with another compound, and [8] purifying the labeled sugar chain.
以下、各工程について詳述する。
［１］まず、糖タンパク質を含有する試料を用意し、この試料に対して所定の処理を施すことにより、糖タンパク質が保持されたゲルを得る。
Hereinafter, each process is explained in full detail.
[1] First, a sample containing a glycoprotein is prepared, and a predetermined treatment is performed on the sample to obtain a gel in which the glycoprotein is retained.
用意する糖タンパク質を含む試料としては、特に限定されないが、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織等の生体試料が挙げられる。また、予め所定の方法を用いて精製された、または未精製の糖タンパク質をも用いることができる。 The sample containing the prepared glycoprotein is not particularly limited, and examples thereof include biological samples such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva, cells, and tissues. In addition, glycoproteins that have been purified in advance using a predetermined method or that have not been purified can also be used.
なお、この試料は脱脂、脱塩、タンパク質分画糖の方法により前処理されていてもよい。 This sample may be pretreated by a method of degreasing, desalting, or protein fractionation sugar.
次いで、試料を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）や、等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥを組み合わせた二次元電気泳動等の所定処理を施すことにより、ゲル中において試料に含まれる糖タンパク質を分離する。 Next, the sample is subjected to a predetermined treatment such as SDS-PAGE (SDS-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis) or two-dimensional electrophoresis in which isoelectric focusing and SDS-PAGE are combined, so that the sample in the gel Isolate glycoproteins contained in
次いで、泳動後のゲルを、例えば、クーマシーブリリアントブルー等の染色剤を用いて染色する。これにより、染色された糖タンパク質が保持されたゲルを得ることができる。 Next, the gel after electrophoresis is stained with a staining agent such as Coomassie Brilliant Blue, for example. Thereby, a gel in which the stained glycoprotein is retained can be obtained.
［２］次に、染色された糖タンパク質を備える電気泳動後のゲルにおいてバンドを確認し、このバンドを、刃物等を用いて切り出す。そして、これを刃物等で細片化し、染色剤を洗浄除去したのち、ゲル内に保持されている糖タンパク質から、糖鎖遊離手段を用いて糖鎖を遊離させる。 [2] Next, a band is confirmed in the gel after electrophoresis provided with the stained glycoprotein, and this band is cut out using a blade or the like. Then, this is cut into pieces with a blade or the like, and the stain is washed and removed, and then the sugar chain is released from the glycoprotein held in the gel using a sugar chain releasing means.
糖鎖を遊離させる手段としては、特に限定されないが、例えば、N−グリコシダーゼまたはO−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。 The means for releasing the sugar chain is not particularly limited, and for example, methods such as glycosidase treatment using N-glycosidase or O-glycosidase, hydrazine decomposition, and β elimination by alkali treatment can be used.
なお、Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。また、Ｎ−グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシン等を用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。 When N-type sugar chains are analyzed, a method using N-glycosidase is preferable. Prior to the N-glycosidase treatment, protease treatment may be performed using trypsin, chymotrypsin, or the like.
［３］次に、糖鎖遊離処理後のゲルを取り出し、このゲルを、洗浄液を用いてリンスすることで、遊離された糖鎖をゲルから洗浄液中に溶出させる。そして、洗浄液中においてゲルを沈殿させた後、この上清を回収することで、糖鎖を含有する溶液を得る（第１の工程）。 [3] Next, the gel after the sugar chain releasing treatment is taken out, and the gel is rinsed with a washing solution to elute the released sugar chain from the gel into the washing solution. And after precipitating a gel in a washing | cleaning liquid, the solution containing a sugar chain is obtained by collect | recovering this supernatant (1st process).
洗浄液としては、特に限定されないが、例えば、水、各種緩衝液、各種有機溶媒等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。 Although it does not specifically limit as a washing | cleaning liquid, For example, water, various buffer solutions, various organic solvents, etc. are mentioned, Among these, it can use 1 type or in combination of 2 or more types.
なお、この溶液は、必要に応じて濃縮することで、溶液中における糖鎖の含有率を増大させるようにしてもよい。 In addition, you may make it increase the content rate of the sugar chain in a solution by concentrating this solution as needed.
また、前記工程［１］〜［３］における、糖タンパク質を含有する試料からの糖タンパク質の分離および糖タンパク質からの糖鎖の遊離は、電気泳動処理を施すことにより得られたゲル中から糖鎖を遊離することにより行うこととしたが、この場合に限定されず、アフィニティークロマトグラフィー処理やイオン交換クロマトグラフィ処理を前記試料に施すことにより精製された糖タンパク質から糖鎖を遊離するようにしてもよい。さらに、前記試料からの糖タンパク質の精製を省略してもよい場合には、前記試料に含まれる糖タンパク質に対して直接糖鎖を遊離させる処理を施すようにしてもよい。 In the steps [1] to [3], the separation of the glycoprotein from the glycoprotein-containing sample and the release of the sugar chain from the glycoprotein can be carried out by subjecting the However, the present invention is not limited to this, and the sugar chain may be released from the purified glycoprotein by subjecting the sample to affinity chromatography or ion exchange chromatography. Good. Furthermore, when purification of the glycoprotein from the sample may be omitted, a treatment for releasing the sugar chain directly from the glycoprotein contained in the sample may be performed.
［４］次に、糖鎖を含有する溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、この捕捉担体上に糖鎖を捕捉する（第２の工程）。 [4] Next, a solution containing a sugar chain is brought into contact with a capture carrier that specifically binds to the sugar chain, and the sugar chain is captured on the capture carrier (second step).
ここで、糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は、水溶液等の状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する物質である。 Here, the sugar chain is the only substance having an aldehyde group among in-vivo substances. That is, a sugar chain is a substance in which a cyclic hemiacetal type and an acyclic aldehyde type exist in an equilibrium state in an aqueous solution or the like.
これに対して、タンパク質、核酸および脂質等の糖鎖以外の生体内物質には、通常、アルデヒド基が含まれていない。 In contrast, in vivo substances other than sugar chains such as proteins, nucleic acids and lipids usually do not contain aldehyde groups.
このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。 From this, it is possible to selectively capture only sugar chains by using a capture carrier having a functional group that reacts specifically with an aldehyde group to form a stable bond.
アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、例えば、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、アミノ基、セミチオカルバジド基およびそれらの誘導体が好ましく、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基がより好ましく用いられる。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合、およびヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理等によって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。 As the functional group that specifically reacts with the aldehyde group, for example, a hydrazide group, an oxylamino group, an amino group, a semithiocarbazide group, and derivatives thereof are preferable, and a hydrazide group or an oxylamino group is more preferably used. The oxime bond generated by the reaction between the oxylamino group and the aldehyde group, and the hydrazone bond generated by the reaction between the hydrazide group and the aldehyde group are easily cleaved by acid treatment, etc. It can be easily separated from the carrier.
なお、一般的に，生理活性物質の捕捉・担持にはアミノ基が多用されているが、アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じる結合（シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤等を用いた二次処理が必要であることから、アミノ基は糖鎖の捕捉には好ましくない。 In general, amino groups are often used to capture and support physiologically active substances, but bonds (Schiff bases) produced by the reaction of amino groups and aldehyde groups are weak in binding force, so reducing agents are used. Amino groups are not preferred for capturing sugar chains.
糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。さらに、このポリマー粒子は、少なくとも表面の一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有した固体またはゲル粒子であることが好ましい。 As a carrier for capturing sugar chains, it is preferable to use polymer particles. Further, the polymer particles are preferably solid or gel particles having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain on at least a part of the surface.
ポリマー粒子が固体粒子またはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させた後に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、かかる粒子を容易に回収することができる。
If the polymer particles are solid particles or gel particles, the particles can be easily recovered using the well 101 provided in the
このようなポリマー粒子としては、例えば、下記一般式（１）で表されるものが挙げられる。 Examples of such polymer particles include those represented by the following general formula (1).
以下、捕捉担体としてポリマー粒子２０を用い、ポリマー粒子２０上に糖鎖を捕捉する方法について説明する。
Hereinafter, a method of capturing sugar chains on the
［４−１］まず、ポリマー粒子２０を、純水２１中に分散させて、ポリマー粒子が分散された粒子分散液２２を得る。
[4-1] First, the
このポリマー粒子２０の形状は、特に限定されないが、例えば、球状またはそれに類する形状が好ましい。
The shape of the
ポリマー粒子２０が球状の場合、平均粒径は、好ましくは０．０５〜１０００μｍ程度、より好ましくは０．０５〜２００μｍ程度、さらに好ましくは０．１〜２００μｍ程度、最も好ましくは０．１〜１００μｍ程度に設定される。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子２０を遠心分離やろ過で回収することが困難となるおそれがある。また、平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子２０と、後述する試料溶液との接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下するおそれがある。
When the
［４−２］次に、図４（ａ）に示すように、第１の支持台４００の凹部４０５にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。すなわち、本工程では、精製装置１の第２の使用方法が適用される。
[4-2] Next, as shown in FIG. 4A, the
そして、この状態で、前記工程［４−１］で予め調製した粒子分散液２２をマルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１内に供給した後、精製装置１の吸引ポンプを作動させることで、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を負圧とし、これにより、ウェル１０１内の粒子分散液２２を吸引する（図４（ｂ）参照。）。
In this state, after supplying the
これにより、粒子分散液２２中の純水２１はフィルター１０５を透過する。これに対して、フィルター１０５の細孔径と、ポリマー粒子２０の粒径との関係により、ポリマー粒子２０はフィルター１０５を透過することができない。そのため、フィルター１０５を透過した純水２１が、貫通孔１０４を介して、マルチウェルフィルタープレート１００の下側に位置するトレイ３００内に選択的に供給される。
As a result, the
その結果、図４（ｃ）に示すように、ポリマー粒子２０がマルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内に単独で充填された状態となる。
As a result, as shown in FIG. 4C, the
［４−３］次に、図４（ｄ）に示すように、前記工程［３］で得られた糖鎖を含有する溶液（以下、「糖鎖含有液２３」という。）を、ポリマー粒子２０が充填されたマルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内に供給する。
[4-3] Next, as shown in FIG. 4D, the solution containing the sugar chain obtained in the step [3] (hereinafter referred to as “sugar chain-containing
［４−４］次に、糖鎖含有液２３を加熱することで、供給した糖鎖含有液２３が乾燥するまで、糖鎖含有液２３を一定の温度範囲に保つ（図４（ｅ）参照。）。
[4-4] Next, by heating the sugar chain-containing
これにより、ポリマー粒子２０と、糖鎖含有液２３中に含まれる糖鎖とが反応し、ポリマー粒子２０上に糖鎖が捕捉される。
As a result, the
この際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。なお、ｐＨ調整は、例えば、前記工程［４−３］の後に、各種緩衝液または有機溶媒を添加することにより行うことができる。 The pH of the reaction system at this time is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6. In addition, pH adjustment can be performed by adding various buffer solution or an organic solvent after the said process [4-3], for example.
糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜１００℃程度、より好ましくは２０〜９０℃程度、さらに好ましくは３０〜８０℃程度、最も好ましくは４０〜８０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。 The temperature at the time of sugar chain capture is preferably kept at a temperature range of about 4 to 100 ° C., more preferably about 20 to 90 ° C., further preferably about 30 to 80 ° C., and most preferably about 40 to 80 ° C. Set to.
また、反応時間、すなわち溶液が乾燥するまでの時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１〜３時間程度、好ましくは、０．６〜２時間程度に設定される。 In addition, the reaction time, that is, the time until the solution is dried, is usually set to about 0.1 to 3 hours, preferably about 0.6 to 2 hours, when set in such a temperature range.
かかる条件で、ポリマー粒子２０と糖鎖とを反応させることで、ポリマー粒子２０上に糖鎖が確実に捕捉されることとなる。
By reacting the
なお、本実施形態のように、糖鎖含有液２３が乾燥するまで加熱する構成とすることにより、ポリマー粒子２０と糖鎖との反応率の向上を確実に図ることができる。
In addition, by setting it as the structure heated until the sugar
なお、糖鎖含有液２３を加熱する方法としては、特に限定されず、例えば、精製装置１の全体を加熱するようにしてもよいし、マルチウェルフィルタープレート１００を選択的に加熱するようにしてもよい。
The method for heating the sugar chain-containing
以上のような工程［４−１］〜［４−４］を経ることで、ポリマー粒子２０上に糖鎖が捕捉される。
Through the steps [4-1] to [4-4] as described above, sugar chains are captured on the
なお、ポリマー粒子２０がヒドラジド基を有するものである場合、ヒドラジド基と、糖鎖が有する還元末端との間で、下記式（２）で表される反応が進行することで、ポリマー粒子２０上に糖鎖が捕捉される。
In addition, when the
以上のように、マルチウェルフィルタープレート１００を備える精製装置１を用いることで、マルチウェルフィルタープレート１００の静置時には、ウェル１０１において、供給された液体の反応を進行させることができる。さらに、精製装置１を用いたマルチウェルフィルタープレート１００の吸引により、ウェル１０１に供給した液体中に含まれる固定成分と、液状成分との分離を容易に行うことができる。
As described above, by using the purification apparatus 1 including the
［５］次に、捕捉担体に捕捉された糖鎖以外の物質を除去する（第３の工程）。
ここで、上記のように捕捉担体としてポリマー粒子２０を用いた場合、ポリマー粒子２０に捕捉された糖鎖以外の物質としては、例えば、ポリマー粒子２０に捕捉されなかった糖鎖の他、ポリマー粒子２０の表面に、非特異的に吸着している糖鎖以外の夾雑物（タンパク質、脂質等）が挙げられる。
そのため、本工程［５］では、これらの物質を洗浄することで除去する。
[5] Next, substances other than the sugar chain captured by the capture carrier are removed (third step).
Here, when the
Therefore, in this step [5], these substances are removed by washing.
以下、前記工程［４］と同様に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、ポリマー粒子２０に捕捉された糖鎖以外の物質（以下、この物質を「洗浄物質」ということもある。）を洗浄除去する場合について説明する。
Hereinafter, in the same manner as in the above step [4], a substance other than the sugar chain captured by the
［５−１］まず、図５（ａ）に示すように、前記工程［４−４］において得られた、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１中で乾燥したポリマー粒子２０に対して、洗浄液２４を添加する。
[5-1] First, as shown in FIG. 5A, the cleaning
洗浄液２４としては、特に限定されないが、水、各種緩衝液、各種有機溶媒等が挙げられ、これらを適宜組み合わせて用いることができる。
Although it does not specifically limit as the washing | cleaning
［５−２］次に、精製装置１を前記工程［４−２］で説明した状態を維持したまま、すなわち、精製装置１の第２の使用方法を適用して、精製装置１の吸引ポンプを作動させることで、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を負圧とし、これにより、ウェル１０１内の洗浄液２４を吸引する（図５（ｂ）参照。）。
[5-2] Next, the suction pump of the purification apparatus 1 is applied while the purification apparatus 1 is maintained in the state described in the step [4-2], that is, the second usage method of the purification apparatus 1 is applied. , The internal space formed by the
その結果、洗浄液２４を、フィルター１０５を透過させることで、図５（ｃ）に示すように、マルチウェルフィルタープレート１００にポリマー粒子２０を残存させた状態で、マルチウェルフィルタープレート１００から選択的に洗浄液２４を、トレイ３００に除去することができるとともに、洗浄液２４中に溶解した洗浄物質を除去することができる。
As a result, by passing the cleaning
これら工程［５−１］および工程［５−２］で構成される洗浄を、複数回（繰り返して）行うことで、洗浄物質を洗浄液２４中に溶解させた状態で、トレイ３００に分離することができるため、洗浄物質を糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０から確実に除去することができる。
The cleaning composed of these steps [5-1] and [5-2] is performed a plurality of times (repeatedly) so that the cleaning substance is dissolved in the cleaning
すなわち、工程［５−１］および工程［５−２］において、フィルター１０５を備えるウェル１０１を複数有するマルチウェルフィルタープレート１００を用いて、ポリマー粒子２０に結合した糖鎖以外の物質を除去する洗浄液２４を、ウェル１０１中のポリマー粒子２０に供給した後、フィルター１０５の下側を負圧にすることでウェル１０１の上下で圧力差が生じ、その結果、フィルター１０５により洗浄液２４とポリマー粒子２０とが分離されることとなる。
That is, in the step [5-1] and the step [5-2], a cleaning solution that removes substances other than sugar chains bound to the
なお、この場合、まず水または緩衝液を洗浄液２４として用いて十分にポリマー粒子２０を洗浄したのち、さらに有機溶媒の洗浄液２４で洗浄し、必要に応じてこれら洗浄液２４による洗浄を繰り返し行い、最後に有機溶媒の洗浄液２４で洗浄するのが好ましい。これにより、洗浄物質、特に、非特異的にポリマー粒子２０の表面に吸着する夾雑物をより確実に除去することができるようになる。
In this case, first, the
［６］次に、捕捉担体が備える官能基を失活させる。
本工程では、前記工程［４］において、糖鎖の捕捉に用いられなかった、捕捉担体が備える官能基（糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基）を失活させる。
[6] Next, the functional group included in the capture carrier is deactivated.
In this step, the functional group (functional group that reacts specifically with the aldehyde group of the sugar chain) provided in the capture carrier, which was not used for capturing the sugar chain in the step [4], is deactivated.
これにより、次工程［７］において、捕捉担体（ポリマー粒子２０）に結合した糖鎖を再遊離させた際に、この糖鎖が再度捕捉担体に捕捉されてしまうのを、確実に防止することができる。 Thereby, in the next step [7], when the sugar chain bound to the capture carrier (polymer particle 20) is re-released, the sugar chain is reliably prevented from being captured again by the capture carrier. Can do.
捕捉担体が備える官能基の失活は、例えば、前記官能基を失活させる機能を有する失活液を、捕捉担体に接触させることにより行うことができる。 The deactivation of the functional group provided in the capture carrier can be performed, for example, by bringing a deactivation liquid having a function of deactivating the functional group into contact with the capture carrier.
また、このような失活液の捕捉担体への接触は、前記工程［５−１］および前記工程［５−２］で構成される洗浄における洗浄液２４に代えて失活液を用い、前記工程［５−１］および前記工程［５−２］を施すようにすればよい。
Further, the contact of the deactivation liquid with the capture carrier uses the deactivation liquid in place of the
さらに、失活液としては、特に限定されないが、官能基がヒドラジド基である場合、例えば、無水酢酸、無水コハク酸等の酸無水物が挙げられる。これにより、官能基を容易に失活させることができる。 Furthermore, the deactivation liquid is not particularly limited, but when the functional group is a hydrazide group, examples thereof include acid anhydrides such as acetic anhydride and succinic anhydride. Thereby, a functional group can be deactivated easily.
［７］次に、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離させるとともに、この糖鎖を他の化合物（以下、「化合物Ａ」と言うこともある。）で置換する（第４の工程）。 [7] Next, the sugar chain bound to the capture carrier is released again, and this sugar chain is replaced with another compound (hereinafter sometimes referred to as “compound A”) (fourth step).
なお、この化合物Ａとしては、蛍光物質、吸光物質および放射性物質等のラベル化物質を備えるラベル化試薬が好ましく用いられる。 As this compound A, a labeling reagent including a labeling substance such as a fluorescent substance, a light absorbing substance and a radioactive substance is preferably used.
以下、前記工程［４］、［５］と同様に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、化合物Ａで糖鎖をラベル化する場合について説明する。
Hereinafter, as in the steps [4] and [5], the case where the sugar chain is labeled with the compound A using the well 101 provided in the
［７−１］まず、図５（ｄ）に示すように、化合物Ａを含有する化合物含有液２５を、糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０が充填されたマルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内に添加する。
[7-1] First, as shown in FIG. 5 (d), the compound-containing
マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内に添加する化合物Ａの添加量は、糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０に対して、過剰量となっているのが好ましい。これにより、次工程［７−２］における糖鎖に対する化合物Ａの置換率の向上を図ることができる。
The amount of Compound A added to the well 101 of the
具体的には、化合物Ａの添加量は、ポリマー粒子２０が有する糖鎖と特異的に反応する官能基量に対して、好ましくは１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上に設定される。
Specifically, the amount of compound A added is preferably 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, more preferably 3 times or more the amount of the functional group specifically reacting with the sugar chain of the
［７−２］次に、化合物含有液２５を加熱することで、添加した化合物含有液２５が乾燥するまで、化合物含有液２５を一定の温度範囲に保つ（図５（ｅ）参照。）。
[7-2] Next, by heating the compound-containing
これにより、捕捉された糖鎖はポリマー粒子２０から切り離され、それとほぼ同時に糖鎖に化合物Ａが付加することとなるため、糖鎖は化合物Ａでラベル化されることとなる。
As a result, the captured sugar chain is separated from the
この際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。なお、ｐＨ調整は、例えば、前記工程［７−１］の後に、各種緩衝液を添加することにより行うことができる。 The pH of the reaction system at this time is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6. In addition, pH adjustment can be performed by adding various buffer solutions after the said process [7-1], for example.
ラベル化時の温度は、好ましくは４〜１００℃程度、より好ましくは２０〜９０℃程度、さらに好ましくは３０〜８０℃程度、最も好ましくは４０〜８０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。 The temperature at the time of labeling is preferably kept in a temperature range of about 4 to 100 ° C, more preferably about 20 to 90 ° C, more preferably about 30 to 80 ° C, and most preferably about 40 to 80 ° C. Set.
また、反応時間、すなわち溶液が乾燥するまでの時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１〜３時間程度、好ましくは、０．６〜２時間程度に設定される。 In addition, the reaction time, that is, the time until the solution is dried, is usually set to about 0.1 to 3 hours, preferably about 0.6 to 2 hours, when set in such a temperature range.
かかる条件で、ラベル化を行うことで、糖鎖が確実に化合物Ａによりラベル化される。
なお、本実施形態のように、化合物含有液２５が乾燥するまで加熱する構成とすることにより、糖鎖と化合物Ａとの反応率の向上を確実に図ることができる。
By performing labeling under such conditions, the sugar chain is surely labeled with Compound A.
In addition, by setting it as the structure heated until the
以上のような工程［７−１］、［７−２］を経ることで、糖鎖が化合物Ａでラベル化される。 The sugar chain is labeled with compound A through the steps [7-1] and [7-2] as described above.
なお、化合物Ａとしては、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する化合物が好ましく用いられ、ポリマー粒子２０がヒドラジド基を有するものである場合、特に、下記化学式（３）で表されるN−aminooxyacetyl−tryptophanyl（arginine methyl ester）が好ましく用いられる。
As the compound A, a compound having an aminooxy group or a hydrazide group is preferably used, and particularly when the
また、この化合物Ａとしては、前記化合物の他、芳香族アミンで構成される蛍光物質を用いることができる。 Moreover, as this compound A, the fluorescent substance comprised with an aromatic amine other than the said compound can be used.
化合物Ａとして、このような芳香族アミンを用いた場合、捕捉された糖鎖は、まずポリマー粒子２０から切り離されて再遊離した後に、化合物Ａによりラベル化されることとなる。
When such an aromatic amine is used as the compound A, the captured sugar chain is first separated from the
以下、化合物Ａとして芳香族アミンを用いて、糖鎖を化合物Ａでラベル化する場合について説明する。 Hereinafter, a case where an aromatic amine is used as compound A and a sugar chain is labeled with compound A will be described.
［７−１’］まず、糖鎖を再遊離させる糖鎖遊離液を、糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０が充填されたマルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内に添加する。
[7-1 '] First, a sugar chain releasing solution for re-releasing sugar chains is added into the well 101 of the
［７−２’］次に、糖鎖遊離液を加熱することで、添加した糖鎖遊離液が乾燥するまで、糖鎖遊離液を一定の温度範囲に保つ。 [7-2 '] Next, by heating the sugar chain free solution, the sugar chain free solution is kept in a certain temperature range until the added sugar chain free solution is dried.
これにより、捕捉された糖鎖がポリマー粒子２０から切り離されることで、糖鎖は再遊離する。
As a result, the captured sugar chain is separated from the
この際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。このｐＨ調整が、前記工程［７−１’］における糖鎖遊離液の添加により行われ、各種緩衝液が糖鎖遊離液として用いられる。 The pH of the reaction system at this time is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6. This pH adjustment is performed by adding the sugar chain free solution in the above step [7-1 '], and various buffer solutions are used as the sugar chain free solution.
糖鎖遊離時の温度は、好ましくは４〜１００℃程度、より好ましくは２５〜９０℃程度、さらに好ましくは３０〜８０℃程度、最も好ましくは６０〜８０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。 The temperature at the time of sugar chain release is preferably kept at a temperature range of about 4 to 100 ° C, more preferably about 25 to 90 ° C, more preferably about 30 to 80 ° C, and most preferably about 60 to 80 ° C. Set to.
また、反応時間、すなわち溶液（糖鎖遊離液）が乾燥するまでの時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１〜３時間程度、好ましくは、０．６〜２時間程度に設定される。 In addition, the reaction time, that is, the time until the solution (sugar chain free liquid) is dried is usually about 0.1 to 3 hours, preferably about 0.6 to 2 hours, when set in such a temperature range. Is set.
かかる条件で、糖鎖の再遊離を行うことで、糖鎖がポリマー粒子２０から確実に切り離される。
By re-releasing the sugar chain under such conditions, the sugar chain is surely separated from the
なお、本実施形態のように、糖鎖遊離液が乾燥するまで加熱する構成とすることにより、糖鎖の遊離率の向上を確実に図ることができる。 In addition, by setting it as the structure heated until a sugar chain free liquid dries like this embodiment, the improvement of the release rate of sugar chains can be aimed at reliably.
［７−３’］次に、化合物Ａとして芳香族アミンを含有する化合物含有液２５を、ポリマー粒子２０から糖鎖が遊離している、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内に添加する。
[7-3 '] Next, the compound-containing
芳香族アミン（化合物Ａ）としては、特に限定されないが、例えば、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ、５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ、７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌおよび３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ等が挙げられる。中でも２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄであるのが好ましい。これらの化合物は、試薬としての入手、反応の簡便性から好適に用いられる。 Although it does not specifically limit as an aromatic amine (compound A), For example, 2-Aminobenzoamide, 2-Aminobenzoic acid, 8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonate, 8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate, 2-Amino9 (10H) -acidone, 5-Aminofluorescein, Dansylethylenediamine, 7-Amino-4-methylcoumarin, 3-Aminobenzoic acid, 7-Amino-1-naphthol, 3- (Acetinominor) -6-aminominorido-aminoidoid Among these, 2-aminobenzoamide or 2-aminobenzoic acid is preferable. These compounds are preferably used because of their availability as reagents and the convenience of the reaction.
また、芳香族アミンとして２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄを用いる場合、一般的な条件では０．３５ｍｏｌ／Ｌで使用されるが、本工程では、化合物含有液２５添加後のウェル１０１内の溶液、すなわち、再遊離した糖鎖を含む溶液における芳香族アミンの濃度は、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１．４ｍｏｌ／Ｌ以上に設定される。これにより、化合物Ａによる糖鎖の標識効率を向上させることが可能となる。ただし、濃度が３ｍｏｌ／Ｌ以上になると、後工程［８］において、反応に使用されなかった芳香族アミン（化合物Ａ）を除去するのが困難となるおそれがあるため、最も好ましい濃度は１．４ｍｏｌ／Ｌ以上３ｍｏｌ／Ｌ以下に設定される。
In addition, when 2-aminobenzamide or 2-aminobenzoic acid is used as the aromatic amine, it is used at 0.35 mol / L under general conditions, but in this step, the solution in the well 101 after addition of the compound-containing
また、液量に関して、ウェル１０１内に充填されたポリマー粒子２０で規定する場合、通常はポリマー粒子２０が浸る程度の液量、例えば、５ｍｇのポリマー粒子２０に対して５０μＬ程度に設定されるが、液量（容量）を倍量の１００μＬ程度に設定するのが好ましい。これにより、化合物Ａによる糖鎖の標識効率を向上させることが可能となる。ただし、液量は１００μＬを超えても良いが、一定量を超えると、後工程［８］において、反応に使用されなかった芳香族アミン（化合物Ａ）を除去するのが困難となるおそれがあるため、最も好まし液量は１００μＬ〜２００μＬの間に設定される。
Further, when the liquid volume is defined by the
より具体的には、芳香族アミンとして２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅを用いる場合、ウェル１０１内に、1.4 M 2−Aminobenzamid, 1 M sodium cyanoborohydrideの濃度になるように３０％酢酸／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた溶液１００μＬを化合物含有液２５として添加する。
More specifically, when 2-aminobenzamide is used as the aromatic amine, the well 101 is dissolved in 30% acetic acid / dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 1.4 M 2 -Aminobenzamid, 1 M sodium cyanoborohydride. 100 μL of the resulting solution is added as compound-containing
［７−４’］次に、化合物含有液２５を加熱することで、化合物含有液２５を一定の温度範囲に保つ。
[7-4 '] Next, the compound-containing
これにより、ポリマー粒子２０から再遊離している糖鎖は化合物Ａと反応し、その結果、糖鎖は化合物Ａでラベル化されることとなる。
Thereby, the sugar chain re-released from the
この際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。 The pH of the reaction system at this time is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6.
ラベル化時の温度は、好ましくは０〜１００℃程度、より好ましくは４〜９５℃程度、さらに好ましくは３０〜９０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。 The temperature at the time of labeling is preferably set to be kept in a temperature range of about 0 to 100 ° C, more preferably about 4 to 95 ° C, and still more preferably about 30 to 90 ° C.
また、反応時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１〜２０時間程度、好ましくは、０．６〜１２時間程度に設定される。 The reaction time is usually set to about 0.1 to 20 hours, preferably about 0.6 to 12 hours when set in such a temperature range.
より具体的には、芳香族アミンとして２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅを用いた場合、化合物含有液２５を３０〜７０℃の温度範囲で加熱して、１〜１０時間程度、反応する。
かかる条件で、ラベル化を行うことで、糖鎖が確実に化合物Ａによりラベル化される。
More specifically, when 2-aminobenzamide is used as the aromatic amine, the compound-containing
By performing labeling under such conditions, the sugar chain is surely labeled with Compound A.
なお、化合物Ａとして芳香族アミンを用いた場合、前記工程［７−２］で説明したような、化合物含有液２５の乾燥を省略することができる。
In addition, when an aromatic amine is used as the compound A, the drying of the compound-containing
以上のような工程［７−１’］〜［７−４’］によっても、糖鎖が化合物Ａでラベル化される。 The sugar chain is labeled with the compound A also by the steps [7-1 ′] to [7-4 ′] as described above.
さらに、本工程において、糖鎖のラベル化が必要ない場合には、糖鎖の化合物Ａによる置換を省略することができる。 Furthermore, in this step, when it is not necessary to label the sugar chain, substitution of the sugar chain with Compound A can be omitted.
［８］次に、化合物Ａでラベル化された糖鎖（以下、「ラベル化糖鎖」と言うこともある。）を精製する（第５の工程）。 [8] Next, the sugar chain labeled with Compound A (hereinafter sometimes referred to as “labeled sugar chain”) is purified (fifth step).
ここで、上記のようにポリマー粒子２０に捕捉された糖鎖を再遊離させることで、ラベル化糖鎖を得た場合、化合物Ａでラベル化された糖鎖以外に、マルチウェルフィルタープレート１００中に含まれる物質としては、糖鎖が遊離したポリマー粒子２０および糖鎖のラベル化に使用されなかった化合物Ａ（以下、「未使用化合物Ａ」と言うこともある。）が挙げられる。
Here, when the labeled sugar chain is obtained by re-releasing the sugar chain captured by the
そのため、本工程［８］では、これらポリマー粒子２０および未使用化合物Ａを除去することで、ラベル化糖鎖の精製を行う。
Therefore, in this step [8], the labeled sugar chain is purified by removing the
以下、前記工程［４］〜［７］と同様に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、ラベル化糖鎖を精製する場合について説明する。
Hereinafter, similarly to the steps [4] to [7], the case where the labeled sugar chain is purified using the well 101 provided in the
［８−１］まず、図６（ａ）に示すように、前記工程［７−２］において得られた、乾燥したラベル化糖鎖と、ポリマー粒子２０とがウェル１０１中に収納されたマルチウェルフィルタープレート１００を第１の支持台４００の凹部４０５に挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびマイクロウェルプレート２００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。すなわち、本工程では、精製装置１の第１の使用方法が適用される。
[8-1] First, as shown in FIG. 6 (a), a multi-layer in which the dried labeled sugar chains and
そして、この状態で、溶解液２６をマルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１内に添加する。
In this state, the
溶解液２６としては、ラベル化糖鎖を溶解し得る液剤であればよく、特に限定されるものではないが、水、各種緩衝液、各種有機溶媒等が挙げられる。
The
なお、前記工程［７−２］における化合物含有液２５の加熱によりポリマー粒子２０が乾燥していない場合には、本工程［８−１］におけるウェル１０１内への溶解液２６の添加を省略することができる。
If the
さらに、化合物Ａとして、芳香族アミンで構成される蛍光物質を用いた場合には、前記工程［７−１’］〜［７−４’］で得られる化合物Ａでラベル化された糖鎖が乾燥していないため、この場合についても、本工程［８−１］におけるウェル１０１内への溶解液２６の添加を省略することができる。
Furthermore, when a fluorescent substance composed of an aromatic amine is used as the compound A, the sugar chain labeled with the compound A obtained in the above steps [7-1 ′] to [7-4 ′] Since it is not dried, also in this case, the addition of the
［８−２］次に、精製装置１の吸引ポンプを作動させることで、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を負圧とし、これにより、ウェル１０１内の溶解液２６を吸引する（図６（ｂ）参照。）。
[8-2] Next, by operating the suction pump of the purification apparatus 1, the internal space formed by the
これにより、図６（ｃ）に示すように、溶解液２６を、フィルター１０５を透過させることで、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１にポリマー粒子２０を残存させた状態で、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１から選択的に溶解液２６を、このウェル１０１に対応する位置のマイクロウェルプレート２００が備えるウェル２０１内に貯留することができるとともに、この溶解液２６中に溶解したラベル化糖鎖をマイクロウェルプレート２００のウェル２０１に移動させることができる。その結果、ラベル化糖鎖とポリマー粒子２０とが分離される。
As a result, as shown in FIG. 6C, the
すなわち、工程［８−２］において、フィルター１０５を備えるウェル１０１を複数有するマルチウェルフィルタープレート１００を用いて、溶解液２６をウェル１０１中に供給した後、フィルター１０５の下側を負圧にすることでウェル１０１の上下で圧力差を生じさせ、その結果、ラベル化糖鎖とポリマー粒子２０とが分離される。
That is, in the step [8-2], the
なお、この際、未使用化合物Ａも、通常、溶解液２６に対して溶解性を示すため、溶解液２６に溶解した状態で、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１側に移動する。
At this time, since the unused compound A is usually soluble in the
なお、精製装置１の第１の使用方法では、前述したように、マイクロウェルプレート２００のウェル形成部２０２を、第１の支持台４００の開口部４０２内に挿入させることができるように設定されているため、ウェル形成部２０２の上面と、マルチウェルフィルタープレート１００の底面１０３との離間距離を小さく設定することができる。これにより、貫通孔１０４を通過した溶解液２６がたとえ飛散したとしても、このウェル１０１に対応する、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１内に溶解液２６を高効率に供給することができる。
Note that, in the first usage method of the purification apparatus 1, as described above, the well forming
このような離間距離は、具体的には、好ましくは１０ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、さらに好ましくは０．５ｍｍ以上、３ｍｍ以下に設定される。離間距離をかかる範囲内に設定することにより、前記効果をより顕著に発揮させることができる。 Specifically, such a separation distance is preferably set to 10 mm or less, more preferably 0.5 mm to 10 mm, and still more preferably 0.5 mm to 3 mm. By setting the separation distance within such a range, the effect can be exhibited more remarkably.
［８−３］次に、フィルター１０５に代えて、シリカゲル１０６がウェル１０１の下側に配置され、底面１０３の貫通孔１０４に対応する位置に突出部１０７が設けられたマルチウェルフィルタープレート（マルチウェルシリカゲルプレート）１００’を用意し、このマルチウェルフィルタープレート１００’を第１の支持台４００の凹部４０５に挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。
[8-3] Next, in place of the
そして、図７（ａ）に示すように、前記工程［８−２］において、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１に分離された、ラベル化糖鎖を含有する溶解液２６をアセトニトリル等の非水溶媒で希釈し、マルチウェルフィルタープレート１００’のシリカゲル１０６を備えるウェル１０１内に供給する。
Then, as shown in FIG. 7A, in the step [8-2], the
これにより、図７（ｂ）に示すように、ウェル１０１のシリカゲル１０６を透過した溶解液２６が貫通孔１０４を介して、各ウェル１０１に対応するトレイ３００の凹部３０１に液滴として流出することとなる。
As a result, as shown in FIG. 7B, the
この際、シリカゲル１０６をアセトニトリル等の非水溶媒で希釈した溶解液２６が透過するため、溶解液２６に含まれるラベル化糖鎖と未使用化合物Ａとは、シリカゲルに吸着する。
At this time, since the
［８−４］次に、図７（ｂ）の状態を維持したまま、さらに、マルチウェルフィルタープレート１００’のウェル１０１内にアセトニトリル等の非水溶媒を供給し、シリカゲル１０６を洗浄する。
[8-4] Next, while maintaining the state of FIG. 7B, a nonaqueous solvent such as acetonitrile is further supplied into the well 101 of the
ここで、シリカゲルへの吸着力は、未使用化合物Ａよりもラベル化糖鎖の方が高い。したがって、ウェル１０１内に非水溶媒を供給してシリカゲル１０６を洗浄することで、未使用化合物Ａの少なくとも一部をシリカゲルから除去することができる。
Here, the adsorptive power to silica gel is higher for labeled sugar chains than for unused compound A. Therefore, by supplying a non-aqueous solvent into the well 101 and washing the
［８−５］次に、図７（ｃ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５に、トレイ３００に代えてマイクロウェルプレート２００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。
[8-5] Next, as shown in FIG. 7C, the
その後、マルチウェルフィルタープレート１００’内に水２７を加え、シリカゲルを透過させることにより、未使用化合物Ａの混在が的確に防止または抑制された状態で、図７（ｄ）に示すように、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１に、水２７中に溶解した状態で、ラベル化糖鎖が精製（分離）されることとなる。
Thereafter, by adding
なお、本工程［８−３］〜［８−５］では、突出部１０７が形成されたマルチウェルフィルタープレート１００’を用いて、ラベル化糖鎖を精製することとしたが、この突出部１０７の形成が省略されたマルチウェルフィルタープレート１００’によっても、前記と同様にしてラベル化糖鎖を精製することができる。
In this step [8-3] to [8-5], the labeled sugar chain was purified using the
さらに、本工程［８−３］〜［８−５］では、ウェル形成部２０２の上面がフレーム部２０４の上面から突出するマイクロウェルプレート２００を用いて、ラベル化糖鎖を精製することとしたが、ウェル２０１の開口部に突出部１０７を挿入させることができる場合には、ウェル形成部２０２の上面がフレーム部２０４の上面から突出することなく、ウェル形成部２０２の上面とフレーム部２０４の上面とで連続する連続面（平坦面）を形成しているマイクロウェルプレートによっても、前記と同様にしてラベル化糖鎖を精製することができる。
Further, in the steps [8-3] to [8-5], the labeled sugar chain is purified using the
また、シリカゲルに代えて、このものに対する吸着力が未使用化合物Ａよりもラベル化糖鎖の方が高いものであれば、如何なる化合物も用いることができ、かかる化合物としては、例えば、グラファイトカーボン等が挙げられる。 Further, instead of silica gel, any compound can be used as long as the labeled sugar chain has higher adsorbing power than the unused compound A. Examples of such compounds include graphite carbon and the like. Is mentioned.
以上のように工程［８−３］〜［８−５］において、シリカゲル１０６を備えるウェル１０１を複数有するマルチウェルフィルタープレート（マルチウェルシリカゲルプレート）１００’を用いることで、シリカゲル１０６に対するラベル化糖鎖と未使用化合物Ａとの吸着力の差に基づいて、ラベル化糖鎖が未使用化合物Ａから分離される。
As described above, in steps [8-3] to [8-5], by using the multiwell filter plate (multiwell silica gel plate) 100 ′ having a plurality of
以上のような工程を経ることで、精製装置１を用いて、化合物Ａでラベル化された糖鎖が精製される。 Through the above steps, the sugar chain labeled with the compound A is purified using the purification apparatus 1.
なお、捕捉担体の官能基を失活する必要がない場合には、本工程［６］を省略するようにしてもよい。さらに、未使用化合物Ａを除去する必要がない場合には、本工程［８−３］を省略するようにしてもよい。 If there is no need to deactivate the functional group of the capture carrier, this step [6] may be omitted. Furthermore, when it is not necessary to remove the unused compound A, this step [8-3] may be omitted.
また、化合物Ａでラベル化された糖鎖は、MALDI−TOF MSに代表される質量分析、さらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の手法で分析することができる。 In addition, the sugar chain labeled with Compound A can be analyzed by a technique such as mass spectrometry represented by MALDI-TOF MS, and high performance liquid chromatography (HPLC).
特に、糖鎖が前述した化学式（３）で表されるN−aminooxyacetyl−tryptophanyl（arginine methyl ester）でラベル化されている場合、MALDI−TOF MSを用いて高感度分析を行うことができる。 In particular, when the sugar chain is labeled with N-aminooxyacetyl-tryptophanyl (arginine methyl ester) represented by the chemical formula (3), high-sensitivity analysis can be performed using MALDI-TOF MS.
このような糖鎖の精製方法によれば、簡単な作業で優れた精度で糖鎖を分離精製することができる。さらに、複数のウェルに供給された処理液を一括して処理することができるため、一度の精製処理で、多量の糖鎖を精製することができるようになる。 According to such a method for purifying sugar chains, sugar chains can be separated and purified with excellent accuracy by simple operations. Furthermore, since the processing solutions supplied to the plurality of wells can be processed at once, a large amount of sugar chains can be purified by a single purification process.
以上、本発明の糖鎖の精製方法を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。 As mentioned above, although the purification method of the sugar_chain | carbohydrate of this invention was demonstrated based on embodiment of illustration, this invention is not limited to these.
例えば、本発明の糖鎖の精製方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。 For example, in the method for purifying a sugar chain of the present invention, one or more optional steps may be added as necessary.
また、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の各部の構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、または、任意の構成のものを付加することもできる。 Moreover, the configuration of each part of the purification apparatus used in the method for purifying a sugar chain of the present invention can be replaced with an arbitrary one that can exhibit the same function, or an arbitrary configuration can be added. it can.
さらに、前記実施形態では、精製装置において、マルチウェルフィルタープレートの各ウェルが有するフィルターの下側を、その上側より負圧とすることでフィルターに液体を透過させる構成としたが、かかる場合に限らず、フィルターにおける液体の透過は、マルチウェルフィルタープレートに付与された遠心力によって行われるようにしてもよい。 Furthermore, in the above-described embodiment, in the purification apparatus, the lower side of the filter of each well of the multi-well filter plate is configured to allow the liquid to permeate the filter by making the lower pressure from the upper side. However, this is not the case. Instead, the permeation of the liquid through the filter may be performed by a centrifugal force applied to the multiwell filter plate.
１ 精製装置
２０ ポリマー粒子
２１ 純水
２２ 粒子分散液
２３ 糖鎖含有液
２４ 洗浄液
２５ 化合物含有液
２６ 溶解液
２７ 水
１００、１００’ マルチウェルフィルタープレート
１０１ ウェル
１０３ 底面
１０４ 貫通孔
１０５ フィルター
１０６ シリカゲル
１０７ 突出部
２００ マイクロウェルプレート
２０１ ウェル
２０２ ウェル形成部
２０３ 底面
２０４ フレーム部
３００ トレイ
３０１ 凹部
４００ 第１の支持台
４０１ 底部
４０２ 開口部
４０３ 上側外壁
４０４ 下側外壁
４０５ 凹部
４０６ 凹部
４０７ パッキン
４０８ 開口部
５００ 第２の支持台
５０１ 底部
５０２ 突出部
５０３ 外壁
５０５ 凹部
５０６ 貫通孔
５０７ パッキン
６００ 調整板
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1
Claims (13)
フィルターを備えるウェルを複数有するマルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に前記糖鎖と特異的に結合する捕捉担体を収納した状態で、各前記ウェル内に前記糖鎖を含有する溶液を供給した後、乾燥させることにより、前記糖鎖と前記捕捉担体とを接触させて、この捕捉担体上に糖鎖を捕捉する第２の工程と、
前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体に結合した糖鎖以外の物質を除去する洗浄液を供給した後、前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、前記フィルターにより前記洗浄液と前記捕捉担体とを分離することにより、前記捕捉担体に結合した糖鎖以外の物質を除去する第３の工程と、
前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を再遊離させる遊離液を供給することで、前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を再遊離させる第４の工程と、
前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、再遊離した前記糖鎖を前記捕捉担体と分離して精製する第５の工程とを有することを特徴とする糖鎖の精製方法。 A first step of preparing a solution containing a sugar chain;
After supplying a solution containing the sugar chain in each well in a state where a capture carrier that specifically binds to the sugar chain is housed in each well of a multi-well filter plate having a plurality of wells with filters A second step of bringing the sugar chain into contact with the capture carrier by drying and capturing the sugar chain on the capture carrier;
A cleaning solution for removing substances other than sugar chains bound to the capture carrier is supplied into each well of the multi-well filter plate, and then a pressure difference is generated between the upper and lower portions of the well so that the cleaning solution is used by the filter. Separating the capture carrier and the capture carrier, thereby removing a substance other than the sugar chain bound to the capture carrier;
Said multiwell filter plate each said well of, by supplying the free liquid for re-release the sugar chain attached to the capture support, a fourth step of re-release the sugar chains bound to the capture support When,
The multi-well filter plate by creating a pressure differential above and below each of said wells, sugar chains and having a fifth step of purifying re liberated the sugar chains separately from the trapping carrier Purification method.
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