JP6043997B2 - Inflammatory disease therapeutic agent that suppresses the function of inflammatory cytokines - Google Patents

Description

本発明は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース等のマンノース代謝に関与する化合物を有効成分として含む炎症性疾患の予防又は治療剤に関する。   The present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases comprising a compound involved in mannose metabolism such as 2-deoxy-D-glucose as an active ingredient.

炎症は、外因あるいは内因性の有害な刺激に応答してそれを除去する反応であるが、過度の反応は生体にとって害を及ぼし、様々な疾患の原因となっている。これらの病態は、炎症部位に集積するマクロファージなどの炎症細胞とこれらの細胞から産生される炎症性サイトカインやケミカルメディエーターによって引き起こされる。これまでに多くの炎症の治療法が開発されているが、その効果は限定的であり、副作用も多い。また、直接炎症性サイトカインの効果を抑制する治療法も開発されている。炎症の治療には免疫抑制作用をもつステロイド系抗炎症薬や主にシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２）の活性を抑制してケミカルメディエーターの産生を抑えることで働く非ステロイド系抗炎症薬があるが、副作用も多く効果も限定的である。直接炎症性サイトカインに働いてその効果を抑制する治療法としては、抗体を用いた抗ＩＬ−６、抗ＴＮＦ−α療法やＩＬ−１受容体アンタゴニストなどのタンパクを用いた治療があり、リウマチ性関節炎の治療などに用いられているが、高価であり単一のサイトカインを抑制するために、効果は限定的である。
これまで、アミノ糖の１種であるグルコサミンによる抗炎症効果について報告されている（特許文献１〜４等を参照）。グルコサミンの抗炎症作用についてプロスタグランジン合成経路の抑制等の現象が観察されているが、その分子機構は明らかではない（非特許文献１を参照）。また、グルコサミンの研究の過程で、構造的に類似している２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）と比較した報告もあるが（非特許文献２〜３を参照）、これらは２−デオキシ−Ｄ−グルコースの抗腫瘍効果について報告しており、また、抗腫瘍効果はグルコサミンよりも効果が劣っているとも報告されていた（非特許文献２を参照）。さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが肥満予防や肥満改善に効果があるという報告もあった（特許文献５を参照）。なお、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを抗炎症性物質としている報告もあるが（特許文献３）、実証データは示されておらず、単にグルコサミンとの構造的類似性から種々の化合物の１つと記載しているに過ぎない。実際、グルコースの誘導体は基本骨格は類似しているが、構造が類似していたとしても置換基が異なれば、その作用が異なることは周知の事実であり、単に構造が類似しているからといって、同様の作用効果を奏するとは言えない。
上記のように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの抗炎症効果については研究がされていなかった。
特表２０１０−５０６９０８号公報 特公平６−７８２３５号公報 特公平６−５１６２６号公報 特開２００７−２９１０１１号公報 特開２００９−２０９１４１号公報 Ｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０１０，１８；５−１１ Ｂｅｋｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９６９，２９；３５３−３５９ Ｌａｓｚｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｎｓｔ．，１９６０，２４；２６７−２８１ Ｂｅｋｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，１９６９，２１１；３７６６−３７７２ Inflammation is a reaction that removes an external or endogenous harmful stimulus in response to it, but an excessive reaction is harmful to the living body and causes various diseases. These pathologies are caused by inflammatory cells such as macrophages that accumulate at inflammatory sites, and inflammatory cytokines and chemical mediators produced from these cells. Many treatments for inflammation have been developed so far, but their effects are limited and have many side effects. In addition, therapies that directly suppress the effects of inflammatory cytokines have been developed. For the treatment of inflammation, there are steroidal anti-inflammatory drugs that have immunosuppressive action and non-steroidal anti-inflammatory drugs that work mainly by suppressing the production of chemical mediators by suppressing the activity of cyclooxygenases (COX-1, COX-2) There are many side effects but limited effects. Therapies that act directly on inflammatory cytokines to suppress their effects include anti-IL-6, anti-TNF-α therapy using antibodies, and treatments using proteins such as IL-1 receptor antagonists, and rheumatic properties. Although it is used for the treatment of arthritis, it is expensive and has a limited effect because it suppresses a single cytokine.
Until now, the anti-inflammatory effect by glucosamine which is 1 type of amino sugar has been reported (refer patent documents 1-4 etc.). Although phenomena such as suppression of the prostaglandin synthesis pathway have been observed for the anti-inflammatory action of glucosamine, the molecular mechanism is not clear (see Non-Patent Document 1). In addition, there is a report comparing with structurally similar 2-deoxy-D-glucose (2-deoxy-D-glucose) in the course of research on glucosamine (see Non-Patent Documents 2 to 3), These have reported the antitumor effect of 2-deoxy-D-glucose, and the antitumor effect has also been reported to be inferior to glucosamine (see Non-Patent Document 2). Furthermore, there was a report that 2-deoxy-D-glucose is effective for obesity prevention and obesity improvement (see Patent Document 5). In addition, although there is a report which uses 2-deoxy-D-glucose as an anti-inflammatory substance (Patent Document 3), no empirical data is shown, and one of various compounds is simply based on structural similarity with glucosamine. It is only described. In fact, the derivatives of glucose are similar in basic skeleton, but even if the structure is similar, it is a well-known fact that the action is different if the substituents are different, simply because the structure is similar That said, it cannot be said that there is a similar effect.
As described above, the anti-inflammatory effect of 2-deoxy-D-glucose has not been studied.
Special table 2010-506908 gazette Japanese Examined Patent Publication No. 6-78235 Japanese Examined Patent Publication No. 6-51626 JP 2007-291011 A JP 2009-209141 A Block et al. , Osteoarthritis Cartilage, 2010, 18; 5-11 Bekesi et al. , Cancer Res. , 1969, 29; 353-359. Laszlo et al. , J .; Natl. Cancer lnst. , 1960, 24; 267-281. Bekesi et al. , J .; Clinical Chem. , 1969, 211; 3766-3772.

本発明は、炎症性サイトカインの機能を抑制することにより抗炎症効果を示す炎症性疾患の予防又は治療剤の提供を目的とする。
上記のように、これまで２−デオキシ−Ｄ−グルコースと構造が類似しているグルコサミンによる抗炎症効果について報告されていた。しかしながら、構造が類似しているからといって、置換基の異なる２−デオキシ−Ｄ−グルコースがグルコサミンと同様の作用効果を奏するとは予測できなかった。本発明者らは、これまで研究されていなかった、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの抗炎症作用について検討を行った。その結果、２−デオキシ−Ｄ−グルコースがＩＬ−６やＩＦＮ−γ受容体分子の糖鎖修飾の抑制やそのシグナルの抑制効果を有することを見出し、さらにそれにより炎症性サイトカインの機能を抑制し、炎症反応を抑えることができることを見出した。すなわち、２−デオキシ−Ｄ−グルコースはＩＬ−６やＩＦＮ−γ等の種々の炎症性サイトカインの作用を抑制し、その作用は２−デオキシ−Ｄ−グルコースが糖代謝経路のうち、マンノース代謝からタンパクの糖鎖修飾（Ｎ−結合型糖鎖）を抑制することを介することにより発揮されていた。この作用により、特に受容体タンパク質の半減期の短いＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α受容体分子の糖鎖修飾が抑制された。本発明者等は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの作用を比較し、グルコサミンには２−デオキシ−Ｄ−グルコースで観察されたＩＬ−６受容体の糖鎖修飾の抑制やそのシグナルの抑制効果が認められないことを確認した。このことは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの作用効果が、従来から知られていたグルコサミンの抗炎症効果とは全く機序が異なることを示している。本発明者等はこの新たな知見を基に、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの種々の炎症性サイトカインに対する効果を調べ、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが多種類の炎症性サイトカインの効果を同時に抑制して炎症反応を抑える新しい予防又は治療法に用い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは、既に癌の治療やてんかんの治療を目的とした研究が行われており、それらの結果から副作用が非常に少ない安全な医薬として利用し得ることは知られていた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ ２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体を有効成分として含む、炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［２］ ２−デオキシ−Ｄ−グルコースの誘導体が、ＧＤＰ−２−デオキシマンノース、２−デオキシマンノース−１−リン酸及び２−デオキシマンノース−６−リン酸からなる群から選択される化合物である、［１］の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［３］ ２−デオキシ−Ｄ−グルコースの誘導体が、２−フルオロ−２−デオキシグルコース、２−フルオロデオキシグルコース、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸、２−フルオロ−デオキシマンノース、ＧＤＰ−２−フルオロデオキシマンノース、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸及び２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸からなる群から選択される化合物である、［１］の炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［４］ 炎症性疾患が炎症性サイトカインにより引き起こされるものである、［１］〜［３］のいずれかの炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［５］ 炎症性サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γからなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれかの炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
［６］ 炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、関節炎、敗血症及び炎症性腸疾患からなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれかの炎症性サイトカイン機能を抑制する炎症性疾患の予防又は治療剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−２７３７０４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。An object of this invention is to provide the preventive or therapeutic agent of the inflammatory disease which shows an anti-inflammatory effect by suppressing the function of inflammatory cytokine.
As described above, the anti-inflammatory effect of glucosamine having a structure similar to that of 2-deoxy-D-glucose has been reported so far. However, it was not possible to predict that 2-deoxy-D-glucose having different substituents would have the same effect as glucosamine just because the structures were similar. The present inventors examined the anti-inflammatory action of 2-deoxy-D-glucose, which has not been studied so far. As a result, it was found that 2-deoxy-D-glucose has the effect of suppressing the sugar chain modification of IL-6 and IFN-γ receptor molecules and the signal, and further suppresses the function of inflammatory cytokines. It was found that the inflammatory reaction can be suppressed. That is, 2-deoxy-D-glucose suppresses the action of various inflammatory cytokines such as IL-6 and IFN-γ, and the action of 2-deoxy-D-glucose is derived from mannose metabolism in the sugar metabolic pathway. It was exhibited by inhibiting the sugar chain modification (N-linked sugar chain) of proteins. By this action, the sugar chain modification of IL-6, IFN-γ and TNF-α receptor molecules having a short half-life of the receptor protein was suppressed. The present inventors compared the effects of 2-deoxy-D-glucose and glucosamine. In glucosamine, inhibition of the sugar chain modification of IL-6 receptor observed in 2-deoxy-D-glucose and the signal thereof were compared. It was confirmed that no inhibitory effect was observed. This indicates that the mechanism of action of 2-deoxy-D-glucose is completely different from the conventionally known anti-inflammatory effect of glucosamine. Based on this new knowledge, the present inventors investigated the effects of 2-deoxy-D-glucose on various inflammatory cytokines, and 2-deoxy-D-glucose simultaneously suppressed the effects of many types of inflammatory cytokines. As a result, the inventors have found that the present invention can be used for a new preventive or therapeutic method for suppressing an inflammatory reaction, and completed the present invention. Note that 2-deoxy-D-glucose has already been studied for the treatment of cancer and epilepsy, and it is known from these results that it can be used as a safe pharmaceutical with very few side effects. It was.
That is, the present invention is as follows.
[1] A prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases that suppresses inflammatory cytokine function, comprising 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof as an active ingredient.
[2] The derivative of 2-deoxy-D-glucose is a compound selected from the group consisting of GDP-2-deoxymannose, 2-deoxymannose-1-phosphate and 2-deoxymannose-6-phosphate [1] A prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases that suppresses inflammatory cytokine function.
[3] A derivative of 2-deoxy-D-glucose is 2-fluoro-2-deoxyglucose, 2-fluorodeoxyglucose, 2-fluoro-deoxyglucose-6-phosphate, 2-fluoro-deoxyglucose-1- A compound selected from the group consisting of phosphoric acid, 2-fluoro-deoxymannose, GDP-2-fluorodeoxymannose, 2-fluoro-deoxymannose-6-phosphate and 2-fluoro-deoxymannose-1-phosphate A prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases that suppresses the inflammatory cytokine function according to [1].
[4] A prophylactic or therapeutic agent for an inflammatory disease that suppresses the inflammatory cytokine function according to any one of [1] to [3], wherein the inflammatory disease is caused by an inflammatory cytokine.
[5] Inflammation that suppresses the inflammatory cytokine function of any one of [1] to [4], wherein the inflammatory cytokine is selected from the group consisting of IL-1, IL-6, TNF-α, and IFN-γ Preventive or therapeutic agent for sexually transmitted diseases.
[6] An inflammatory disease that suppresses the inflammatory cytokine function according to any one of [1] to [5], wherein the inflammatory disease is selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, arthritis, sepsis, and inflammatory bowel disease Prophylactic or therapeutic agent.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2010-273704 which is the basis of the priority of the present application.

図１Ａは、培養細胞における２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるＩＬ−６受容体であるｇｐ１３０のＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を示す図である。
図１Ｂは、培養細胞における２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるＩＦＮ−γ受容体の発現への影響を示す図である。
図１Ｃは、培養細胞における２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるＴＮＦ−α受容体の発現への影響を示す図である。
図２は、サイトカイン刺激による転写活性化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図である。図２ＡはＩＬ−６刺激によるＳｔａｔ３の転写への効果を示し、図２ＢはＴＮＦ−α刺激によるＮＦ−κＢの転写への効果を示し、図２ＣはＩＬ−１刺激によるＮＦ−κＢの転写への効果を示し、図２ＤはＬＰＳ刺激によるＩＦＮ−βの転写への効果を示す。
図３Ａは、炎症性腸疾患モデルマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを摂取させた場合の効果を示す図である。
図３Ｂは、炎症性腸疾患モデルマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを摂取させた場合の大腸組織におけるＩＬ−６（図３Ｂ（ａ））、ＩＬ−１（図３Ｂ（ｂ））及びＨＰ（図３Ｂ（ｃ））の発現量を示す図である。
図４は、炎症性腸疾患モデルマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを摂取させた場合の組織病理学的解析の結果を示す写真である。図４Ａはコントロールマウス、図４Ｂはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）飲水マウス、図４ＣはＤＳＳ飲水マウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したマウスの結果を示す。
図５は、ＳＫＧマウスによる関節リウマチ発現に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す写真である。図５Ａは水を飲水したコントロールマウスの結果、図５Ｂは２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を飲水したマウスの結果を示す。
図６Ａは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における関節炎スコアに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図である。
図６Ｂは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における体重変化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図である。
図７は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース及びグルコサミンの構造を示す図である。
図８は、ＩＬ−６標的遺伝子群へのシグナル伝達経路を示す図である。
図９は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの糖鎖修飾及び炎症性シグナル伝達に対する効果の違いを示す図である。
図１０は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの腸炎に対する効果の違いを示す図である。
図１１は、ＳＫＧマウスによる関節リウマチ発現に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す写真である。図１１ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｃが無処置のＳＫＧマウスの肢の状態を示す。
図１２は、ＳＫＧマウスによる関節リウマチ発現に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示すＨｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色法で組織染色した結果を示す写真である。図１２ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの結果であり、図１２ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの結果である。
図１３Ａは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における関節炎スコアに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図であり、ラミナリン投与後の関節スコアを示す図である。
図１３Ｂは、ＳＫＧマウスの関節炎誘発実験における関節炎スコアに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を示す図であり、ラミナリン投与後の体重変化を示す図である。
図１４は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースをマウスに経口投与した場合の、マウス腹腔滲出マクロファージ（チオグリコレート誘導）のＩＬ−６受容体であるｇｐ１３０のＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を示す図である。
図１５は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの副作用低減効果を示す図である。図１５Ａは、マウス腹腔滲出マクロファージ（チオグリコレート誘導）を用いた結果を示し、図１５Ｂはマウス腹腔常在性マクロファージを用いた結果を示す。
図１６は、２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＦＤＧ）によるＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害の検討の結果を示す図である。FIG. 1A is a diagram showing inhibition of N-glycoside sugar chain modification of gp130, which is an IL-6 receptor, by 2-deoxy-D-glucose in cultured cells.
FIG. 1B is a diagram showing the influence of 2-deoxy-D-glucose on the expression of IFN-γ receptor in cultured cells.
FIG. 1C is a diagram showing the influence of 2-deoxy-D-glucose on the expression of TNF-α receptor in cultured cells.
FIG. 2 is a graph showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on transcriptional activation by cytokine stimulation. FIG. 2A shows the effect of IL-6 stimulation on Stat3 transcription, FIG. 2B shows the effect of TNF-α stimulation on NF-κB transcription, and FIG. 2C shows IL-1 stimulation of NF-κB transcription. FIG. 2D shows the effect on transcription of IFN-β by LPS stimulation.
FIG. 3A is a diagram showing an effect when 2-deoxy-D-glucose is ingested in an inflammatory bowel disease model mouse.
FIG. 3B shows IL-6 (FIG. 3B (a)), IL-1 (FIG. 3B (b)) and HP in the large intestine tissue when 2-deoxy-D-glucose was ingested in an inflammatory bowel disease model mouse. It is a figure which shows the expression level of (FIG. 3B (c)).
FIG. 4 is a photograph showing the results of histopathological analysis when 2-deoxy-D-glucose was ingested in an inflammatory bowel disease model mouse. FIG. 4A shows the result of a control mouse, FIG. 4B shows the result of a dextran sulfate sodium (DSS) -drinking mouse, and FIG. 4C shows the result of administration of 2-deoxy-D-glucose to a DSS-drinking mouse.
FIG. 5 is a photograph showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on rheumatoid arthritis expression by SKG mice. FIG. 5A shows the results of a control mouse drinking water, and FIG. 5B shows the results of a mouse drinking 2-deoxy-D-glucose-containing water.
FIG. 6A is a graph showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on the arthritis score in the arthritis induction experiment of SKG mice.
FIG. 6B is a graph showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on body weight change in an arthritis induction experiment in SKG mice.
FIG. 7 is a diagram showing the structures of 2-deoxy-D-glucose and glucosamine.
FIG. 8 is a diagram showing a signal transduction pathway to the IL-6 target gene group.
FIG. 9 is a diagram showing the difference in the effects of 2-deoxy-D-glucose and glucosamine on sugar chain modification and inflammatory signaling.
FIG. 10 is a diagram showing the difference in the effects of 2-deoxy-D-glucose and glucosamine on enteritis.
FIG. 11 is a photograph showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on rheumatoid arthritis expression by SKG mice. FIG. 11a shows the state of the limb of a control SKG mouse fed with water, FIG. 11b shows the state of the limb of an SKG mouse fed with 0.5% 2-deoxy-D-glucose-containing water, and FIG. The limb status of treated SKG mice is shown.
FIG. 12 is a photograph showing the results of tissue staining by Hematoxylin-Eosin (HE) staining method showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on rheumatoid arthritis expression by SKG mice. FIG. 12a shows the results of control SKG mice fed with water, and FIG. 12b shows the results of SKG mice fed with 0.5% 2-deoxy-D-glucose-containing water.
FIG. 13A is a diagram showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on the arthritis score in the arthritis induction experiment of SKG mice, and is a diagram showing the joint score after administration of laminarin.
FIG. 13B is a diagram showing the effect of 2-deoxy-D-glucose on the arthritis score in the arthritis induction experiment of SKG mice, and shows the change in body weight after administration of laminarin.
FIG. 14 shows inhibition of N-glycoside sugar chain modification of gp130, an IL-6 receptor of mouse peritoneal exudate macrophages (thioglycolate induction) when 2-deoxy-D-glucose was orally administered to mice. FIG.
FIG. 15 is a diagram showing the side effect reducing effect of 2-deoxy-D-glucose. FIG. 15A shows the results using mouse peritoneal exudate macrophages (thioglycolate induction), and FIG. 15B shows the results using mouse peritoneal resident macrophages.
FIG. 16 is a diagram showing the results of examining the inhibition of N-glycoside-type sugar chain modification by 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (2-FDG).

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の有効成分は、マンノース代謝に関与し、マンノシルトランスフェラーゼによる、Ｎ結合型糖鎖合成前駆体であるドリコール脂質への糖鎖（マンノース）付加反応を抑制し得る化合物である。このマンノース付加は、マンノース代謝産物であるＧＤＰ−マンノースを基質としたマンノシルトランスフェラーゼによる反応である。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の有効成分は、上記反応を阻害し、代謝半減期の早いサイトカインレセプターの新規合成時の糖鎖修飾を阻害し、これにより炎症性サイトカインのシグナル伝達を阻害することにより抗炎症効果を発揮する。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の有効成分の存在下で、培養細胞を培養した場合、培養細胞中のＧＤＰ−マンノースが蓄積する。
上記の作用を奏する本発明の炎症性疾患の有効成分として用い得る化合物として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（２ＧＤ））、２−デオキシ−Ｄ−グルコースがマンノース代謝された際の生成物である２−デオキシマンノース−６−リン酸（２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（＝２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））、２−デオキシマンノース−１−リン酸（２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（＝２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ））及びＧＤＰ−２−デオキシマンノース（ＧＤＰ−２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ（＝ＧＤＰ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ））等が挙げられる。さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコースと同様の作用を持つことが知られている（Ｍｅｔｉｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００７；６（１１）：３０２９−５８）２−フルオロ−２−デオキシグルコース及び２−フルオロ−２−デオキシグルコースがマンノース代謝された際の生成物である２−フルオロデオキシグルコース（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、２−フルオロ−デオキシグルコース−６−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２−フルオロ−デオキシグルコース−１−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２−フルオロ−デオキシマンノース（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ）、２−フルオロ−デオキシマンノース−６−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２−フルオロ−デオキシマンノース−１−リン酸（２−ｆｌｕｏｒｏ−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等が挙げられる。上記化合物は、フリー体であってもよく、その生理学的に許容される塩又は溶媒和物であってもよい。さらに、水和物であっても非水和物であってもよい。塩は限定されないが、塩酸塩等の無機塩や酢酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩等の有機酸塩を含む。本発明においては、上記化合物を２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体という。
本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤の対象となる炎症性疾患は、炎症性サイトカインにより引き起こされる炎症性疾患である。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、炎症性サイトカインの産生を抑制し、あるいは炎症性サイトカインの機能を抑制し、炎症症状を抑えることができる。本発明において炎症性サイトカインの機能を抑制するとは、炎症性サイトカインの産生の抑制も炎症性サイトカインの作用の抑制も含む。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ（インターロイキン）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ（インターフェロン）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等が挙げられる。この中でも、本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤により、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γの機能を好適に抑えることができる。
炎症性サイトカインにより引き起こされる炎症性疾患は、炎症を伴う状態又は疾患をいい、上記のサイトカインの産生が亢進している状態又は疾患をいい、全身性の炎症性疾患も局所性の炎症性疾患も含まれる。このような炎症性疾患として、クローン病、潰瘍性腸疾患等の炎症性腸疾患；慢性関節リウマチ、骨関節炎、変形性関節炎、脊椎炎等の関節炎；慢性気管支炎；アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のアレルギー性の炎症性疾患；動脈硬化等のメタボリックシンドローム；自己免疫疾患；ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）；敗血症；皮膚炎；外傷、熱傷、術後等の全身性炎症；糸球体腎炎、腎炎等の腎臓の炎症性疾患等が含まれる。この中でも慢性関節リウマチ、関節炎、敗血症及び炎症性腸疾患の予防又は治療に好適に用いることができる。
ヒトの炎症性疾患だけでなく、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、フェレット、ニワトリ等の非ヒト脊椎動物の炎症性疾患も対象となる。
また、２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は正常細胞よりも炎症細胞で強く作用する。従って、２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体を有効成分として含む本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤を用いる場合には、正常細胞への作用が抑えられその結果、正常細胞が受ける小胞体ストレスに起因する副作用は軽減することができる。すなわち、本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、正常細胞に作用しにくい、副作用の少ない予防又は治療剤である。
本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、製薬上許容される担体や希釈剤等を含んでいてもよい。担体としては、限定されないが生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース液、緩衝生理食塩水等を挙げることができる。
投与経路は限定されないが、経口投与、あるいは皮下、筋肉内及び静脈内、直腸内等のなどの非経口投与により投与することができる。投与形態としては、種々の形態で投与することができ、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、噴霧剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤；デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを含んでいてもよい。また、乳剤、シロップ剤等の液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；オリーブ油、ごま油、大豆油等の油脂類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを含んでいてもよい。さらに、注射剤は、水；ショ糖、ソルビトール、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを含んでいてもよい。本発明の炎症性疾患の予防又は治療剤は、さらにｐＨ調整剤、抗酸化剤、安定化剤、保存剤、増粘剤、キレート化剤、保湿剤、着色剤、等張剤等を含んでいてもよい。
投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、１回投与当たり、フリー体換算で０．００５〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましく、２００〜３５０ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましく、２５０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。投与方法は限定されないが、静注する場合、１回投与当たり上記の量を生理食塩水等に溶解して投与することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The active ingredient of the prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention is involved in mannose metabolism, and suppresses the sugar chain (mannose) addition reaction to dolichol lipid, which is an N-linked sugar chain synthesis precursor, by mannosyltransferase. The resulting compound. This mannose addition is a reaction by mannosyltransferase using GDP-mannose which is a mannose metabolite as a substrate. The active ingredient of the prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention inhibits the above reaction and inhibits sugar chain modification during the novel synthesis of a cytokine receptor with a fast metabolic half-life, thereby causing signal transduction of inflammatory cytokines. It exerts an anti-inflammatory effect by inhibiting. When cultured cells are cultured in the presence of the active ingredient of the preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention, GDP-mannose in the cultured cells accumulates.
As a compound that can be used as an active ingredient of the inflammatory disease of the present invention having the above-mentioned effects, 2-deoxy-D-glucose (2-deoxy-D-glucose (2GD)), 2-deoxy-D-glucose is mannose metabolism. Products of 2-deoxymannose-6-phosphate (2-deoxymannose-6-phosphate (= 2-deoxyglucose-6-phosphate)), 2-deoxymannose-1-phosphate (2-deoxymannose) -1-phosphate (= 2-deoxyglucose-1-phosphate)) and GDP-2-deoxymannose (= GDP-2-deoxyglucose). Furthermore, it is known to have the same action as 2-deoxy-D-glucose (Metin K. et al Mol Cancer Ther 2007; 6 (11): 3029-58) 2-fluoro-2-deoxyglucose and 2-Fluoro-deoxyglucose (2-fluoro-deoxyglucose) and 2-fluoro-deoxyglucose-6-phosphate (2-fluro-deoxyglucose-), which are products when 2-fluoro-2-deoxyglucose is metabolized by mannose 6-phosphate), 2-fluoro-deoxyglucose-1-phosphate (2-fluoro-deoxyglucose-1-phosphate), 2-fluoro-deoxymannose (2-fluoro-deoxymannose) 2-fluoro - deoxy mannose-6-phosphate (2-fluoro-deoxymannose-6-phosphate), 2- fluoro - deoxy mannose-1-phosphate (2-fluoro-deoxymannose-1-phosphate) and the like. The above compound may be a free form, or a physiologically acceptable salt or solvate thereof. Furthermore, it may be a hydrate or non-hydrate. The salt is not limited, but includes inorganic salts such as hydrochloride and organic acid salts such as acetate, citrate and formate. In the present invention, the above compound is referred to as 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof.
The inflammatory disease which is the target of the preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention is an inflammatory disease caused by inflammatory cytokines. The preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention can suppress the production of inflammatory cytokines, or suppress the function of inflammatory cytokines, thereby suppressing inflammatory symptoms. In the present invention, to suppress the function of inflammatory cytokine includes to suppress the production of inflammatory cytokine and to suppress the action of inflammatory cytokine. Inflammatory cytokines include IL (interleukin) -1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, TNF-α, TNF-β, Examples include IFN (interferon) -α, IFN-β, and IFN-γ. Among these, the functions of IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, and IFN-γ can be suitably suppressed by the preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention.
An inflammatory disease caused by an inflammatory cytokine refers to a state or disease accompanied by inflammation, a state or disease in which the production of the above cytokines is increased, and includes systemic inflammatory diseases and local inflammatory diseases. included. Examples of such inflammatory diseases include inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative bowel disease; arthritis such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoarthritis and spondylitis; chronic bronchitis; allergic rhinitis and allergic conjunctivitis Allergic inflammatory diseases such as: metabolic syndrome such as arteriosclerosis; autoimmune disease; SIRS (systemic inflammatory response syndrome); sepsis; dermatitis; systemic inflammation such as trauma, burns, postoperative; glomerulonephritis, Examples include inflammatory diseases of the kidney such as nephritis. Among these, it can be suitably used for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis, arthritis, sepsis and inflammatory bowel disease.
In addition to human inflammatory diseases, non-vertebrate inflammatory diseases such as monkeys, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, goats, mice, rats, ferrets, and chickens are also targeted.
In addition, 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof acts more strongly on inflammatory cells than on normal cells. Therefore, when the prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention containing 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof as an active ingredient is used, the action on normal cells is suppressed, and as a result, the normal cells receive small amounts. Side effects caused by ER stress can be reduced. That is, the prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention is a prophylactic or therapeutic agent that hardly acts on normal cells and has few side effects.
The preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline, glucose solution, buffered saline and the like.
Although the administration route is not limited, it can be administered by oral administration or parenteral administration such as subcutaneous, intramuscular and intravenous, rectal and the like. The dosage form can be administered in various forms, such as tablets, powders, granules, fine granules, capsules, syrups, fine granules, sprays, emulsions, suppositories, injections, ointments. And tape agents. For example, tablets, powders, granules, fine granules, capsules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol; disintegrants such as starch and sodium alginate; lubricants such as magnesium stearate and talc Agents; binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin; surfactants such as fatty acid esters; plasticizers such as glycerin may be included. Liquid preparations such as emulsions and syrups include saccharides such as water, sucrose, sorbitol and fructose; glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol; fats and oils such as olive oil, sesame oil and soybean oil; p-hydroxybenzoic acid Preservatives such as acid esters; flavors such as strawberry flavor and peppermint may be included. Furthermore, the injection is water; sugars such as sucrose, sorbitol, xylose, trehalose, and fructose; sugar alcohols such as mannitol, xylitol, and sorbitol; buffers such as phosphate buffer, citrate buffer, and glutamate buffer; It may contain a surfactant such as a fatty acid ester. The preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention further contains a pH adjuster, antioxidant, stabilizer, preservative, thickener, chelating agent, moisturizer, colorant, isotonic agent and the like. May be.
The dose can be appropriately set according to the administration method, the age, weight, medical condition, etc. of the patient to be applied, but is 0.005 to 1000 mg / kg body weight in terms of free body per administration, kg body weight is preferable, 100 to 400 mg / kg body weight is more preferable, 200 to 350 mg / kg body weight is more preferable, and 250 to 300 mg / kg body weight is more preferable. Although the administration method is not limited, in the case of intravenous injection, the above-mentioned amount can be dissolved in physiological saline or the like per administration.
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾及びサイトカイン刺激による転写活性化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）によるＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を検討した。培養細胞として、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた。２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地の組成は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に２−デオキシ−Ｄ−グルコースを終濃度で２５ｍＭ添加したものであった。
培養細胞を２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地処理及び無グルコース培地で処理し、一定時間ごとに培養細胞（ＭＥＦ）を採取し、ＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾のコントロールとして、培養細胞をＧｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＦ（ＧＰ−Ｆ）で処理したものを用いた。ＧＰ−ＦはＮ−グリコシド糖鎖とタンパク質の結合部位を特異的に切断する酵素である。図１Ａに示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理した受容体タンパク質がＧＰ−Ｆで処理したサンプルと同じ分子量を示している。このことから、Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾が外れていることがわかる。
同様に培養細胞を２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地で処理し、一定時間ごとに培養細胞（ＭＥＦ）を採取し、ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮＧＲα）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾のコントロールとして、培養細胞をＧＰ−Ｆで処理したものと、Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾阻害剤であるＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ（ＴＭ）で処理したものを用いた。図１Ｂに結果を示す。図１Ｂに示すように、ＩＬ−６受容体同様、ＩＦＮ−γ受容体でもＮ−グリコシド型糖鎖修飾が外れていることがわかる。
同様に培養細胞を２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地で処理し、一定時間ごとに培地を採取し、ＴＮＦ−α受容体（ＴＮＦＲ１）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾のコントロールとして、培養細胞をＧＰ−Ｆで処理したものを用いた。図１Ｃに結果を示す。図１Ｃに示すように、ＩＬ−６受容体同様、ＴＮＦ−α受容体でもＮ−グリコシド型糖鎖修飾が外れていることがわかる。
さらに、サイトカイン刺激による転写活性化に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果を検討した。培養細胞に２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理を行った後、（Ａ）ＩＬ−６、（Ｂ）ＴＮＦα、（Ｃ）ＩＬ−１、（Ｄ）ＬＰＳで刺激し、ルシフェラーゼアッセイにより、各刺激に対する転写活性化能が２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理により変化するかを調べた。結果を図２に示す。図２に示すように、各サイトカイン刺激による下流遺伝子の転写活性が、２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理によって全て抑制されていることがわかる。
２−デオキシ−Ｄ−グルコースは解糖系を阻害することが知られているが、無グルコース培地で解析してもＩＬ−６、ＩＦＮ−γ受容体分子の糖鎖修飾の抑制やこれらのサイトカインのシグナルの抑制が見られないことから、この現象は２−デオキシ−Ｄ−グルコースの解糖系の阻害効果によるものではないことも明らかになった（図１）。
上記の炎症性サイトカイン受容体は細胞膜表面への移動やそのリガンドとの結合に糖鎖修飾が必須であり、本実施例により、２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理によってこれらのサイトカインシグナルが顕著に抑制されること、ＩＬ−１作用やＴＮＦ−α、ＴＬＲ４の作用も抑制されることを、培養細胞を用いた実験で示された。Effect of 2-deoxy-D-glucose on N-glycoside type sugar chain modification and transcriptional activation by cytokine stimulation Inhibition of N-glycoside type sugar chain modification by 2-deoxy-D-glucose (2-DG) was examined. Mouse embryo fibroblasts (MEF) were used as cultured cells. The composition of the 2-deoxy-D-glucose-containing medium was obtained by adding 25 mM of 2-deoxy-D-glucose to Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) at a final concentration.
Cultured cells were treated with 2-deoxy-D-glucose-containing medium and glucose-free medium, and cultured cells (MEF) were collected at regular intervals, and the expression of IL-6 receptor (gp130) was examined by the immunoblot method. . As a control for N-glycoside-type sugar chain modification, a cultured cell treated with Glycopeptidase F (GP-F) was used. GP-F is an enzyme that specifically cleaves the binding site between an N-glycoside sugar chain and a protein. As shown in FIG. 1A, the 2-deoxy-D-glucose treated receptor protein shows the same molecular weight as the sample treated with GP-F. From this, it can be seen that the N-glycoside type sugar chain modification is removed.
Similarly, the cultured cells were treated with a medium containing 2-deoxy-D-glucose, cultured cells (MEF) were collected at regular intervals, and expression of IFN-γ receptor (IFNGRα) was examined by an immunoblot method. As controls for N-glycoside sugar chain modification, cultured cells treated with GP-F and those treated with N-glycoside sugar chain modification inhibitor Tunicamycin (TM) were used. The results are shown in FIG. 1B. As shown in FIG. 1B, it can be seen that the N-glycoside type sugar chain modification is removed in the IFN-γ receptor as well as the IL-6 receptor.
Similarly, the cultured cells were treated with a 2-deoxy-D-glucose-containing medium, the medium was collected at regular time intervals, and the expression of TNF-α receptor (TNFR1) was examined by the Immunoblot method. As a control for N-glycosidic sugar chain modification, cultured cells treated with GP-F were used. The results are shown in FIG. 1C. As shown to FIG. 1C, it turns out that N-glycoside type | mold sugar_chain | carbohydrate modification remove | deviates also in TNF- (alpha) receptor like IL-6 receptor.
Furthermore, the effect of 2-deoxy-D-glucose on transcriptional activation by cytokine stimulation was examined. The cultured cells were treated with 2-deoxy-D-glucose, then stimulated with (A) IL-6, (B) TNFα, (C) IL-1, and (D) LPS, and luciferase assay was performed for each stimulation. It was examined whether the transcription activation ability was changed by 2-deoxy-D-glucose treatment. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, it can be seen that the transcriptional activity of the downstream gene by each cytokine stimulation is all suppressed by the 2-deoxy-D-glucose treatment.
2-Deoxy-D-glucose is known to inhibit the glycolytic system, but even when analyzed in a glucose-free medium, suppression of sugar chain modification of IL-6 and IFN-γ receptor molecules and these cytokines It was also clarified that this phenomenon was not due to the inhibitory effect of 2-deoxy-D-glucose glycolysis (FIG. 1).
The above-mentioned inflammatory cytokine receptor requires sugar chain modification for movement to the cell membrane surface and binding to its ligand. According to this example, these cytokine signals are remarkably suppressed by 2-deoxy-D-glucose treatment. It was shown by experiments using cultured cells that IL-1 action, TNF-α, and TLR4 action are also suppressed.

炎症性腸疾患に対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
マウスを用いて潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患のモデルであるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性腸炎に対する効果を調べた。ＤＳＳ腸炎発症にＩＬ−６やＩＦＮ−γが部分的に関与することは、それぞれの遺伝子欠損マウスの解析から知られていた（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１９３，ｐｐ．４７１−４７８，２００１）。
マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）を用い、ＩＬ−６欠損マウスは、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉ１６＜ｔｍ１Ｋｏｐｆ＞／Ｊ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．日本チャールズ・リバー）、ＩＦＮ−γ受容体欠損マウスは、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｉｆｎｇｒ１＜ｔｍ１Ａｇｔ＞／Ｊ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．日本チャールズ・リバー）を用いた。ＤＳＳ飲水によるマウスの体重変化及び大腸組織におけるＩＬ−６の発現量を調べた。
マウスに２％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを飲み水として自由に摂取させ、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを１日１回 腹腔内投与して、体重変化を観察した。実験終了時にマウスの大腸組織を摘出し、その大腸からＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によりｍＲＮＡレベルでのＩＬ−６の発現量を調べた。Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌとしてβ−Ａｃｔｉｎの発現量を使用した。図３Ａ及び図３Ｂに結果を示す。図３Ａはマウスの体重変化を示し、図３ＢはＩＬ−６（図３Ｂ（ａ））、ＩＬ−１（図３Ｂ（ｂ））及びハプトグロビン（ＨＰ）（図３Ｂ（ｃ））のｍＲＮＡ発現量（ｆｏｌｄ）を示す。
２％ＤＳＳを飲み水としてマウスに自由摂取させると、激しい下痢と血便がみられるようになり、７〜１０日程で死亡した。一方、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを２００ｍｇ／ｋｇ（報告では、ラットでのＬＤ５０は２０００ｍｇ／ｋｇ）腹腔内に１日１回連日投与したところ、ほとんど下痢、血便の症状を示さず、体重減少（ＤＳＳのみを投与した場合、一週間で体重は約３／４に減少する）もほとんど見られなかった（図３Ａ）。さらに、この大腸組織でのＩＬ−６のｍＲＮＡレベルでの発現を見たところ、ＤＳＳのみを投与した時に発現誘導されるＩＬ−６が２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与時は顕著に発現が抑制されていた（図３Ｂ）。
また、ＩＬ−６欠損マウス及びＩＦＮ−γ受容体欠損マウスを用いて解析しても、これらのマウスで限定的にみられていた腸炎症状が２−デオキシ−Ｄ−グルコースで抑制された。このことは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが単独の抗サイトカイン療法よりも効果が高いことを示している。
さらに、本実施例の検討に供したマウスの大腸組織を摘出し、Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色法で組織染色した。結果を図４に示す。図４に示すように、この大腸組織の組織病理学的解析でも、２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与群では、大腸粘膜の破壊はほとんど観察されず、非常に有効性の高い治療法であること考えられた。Effect of 2-deoxy-D-glucose on inflammatory bowel disease The effect on dextran sulfate sodium (DSS) -induced enteritis, which is a model of inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis and Crohn's disease, was examined using mice. It has been known from analysis of each gene-deficient mouse that IL-6 and IFN-γ are partially involved in the onset of DSS enteritis (Suzuki et al., J. Exp. Med., Vol. 193, pp. 471-478, 2001).
The mouse used was C57BL / 6J (Clea Japan), the IL-6 deficient mouse was B6.129S2-I16 <tm1Kopf> / J (The Jackson Lab. Japan Charles River), and the IFN-γ receptor deficient mouse was B6.129S7-Ifngr1 <tm1Agt> / J (The Jackson Lab., Charles River, Japan) was used. Changes in body weight of mice due to DSS drinking water and expression levels of IL-6 in colon tissues were examined.
Mice were allowed to freely take 2% (w / v) DSS as drinking water, and 2-deoxy-D-glucose was intraperitoneally administered once a day to observe changes in body weight. At the end of the experiment, mouse colon tissue was excised, RNA was extracted from the colon, and the expression level of IL-6 at the mRNA level was examined by Real Time PCR. The expression level of β-Actin was used as Internal Control. The results are shown in FIGS. 3A and 3B. FIG. 3A shows changes in body weight of mice, and FIG. 3B shows mRNA expression levels of IL-6 (FIG. 3B (a)), IL-1 (FIG. 3B (b)) and haptoglobin (HP) (FIG. 3B (c)). (Fold) is shown.
When mice were allowed to freely consume 2% DSS as drinking water, severe diarrhea and bloody stool were observed, and they died in about 7 to 10 days. On the other hand, 2-deoxy-D-glucose was administered to the abdominal cavity once daily for 200 mg / kg (in the report, LD50 in rats was 2000 mg / kg). Almost no symptoms of diarrhea or bloody stool were observed. (When only DSS was administered, body weight decreased to about 3/4 in one week) was hardly observed (FIG. 3A). Furthermore, when the expression of IL-6 at the mRNA level in the large intestine tissue was observed, the expression of IL-6 induced when DSS alone was administered was significantly suppressed when 2-deoxy-D-glucose was administered. (FIG. 3B).
Moreover, even when analyzed using IL-6-deficient mice and IFN-γ receptor-deficient mice, 2-deoxy-D-glucose suppressed the intestinal inflammation that was limited in these mice. This indicates that 2-deoxy-D-glucose is more effective than single anti-cytokine therapy.
Furthermore, the large intestine tissue of the mouse used for the examination of this example was excised and stained with a hematoxylin-eosin (HE) staining method. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 4, even in the histopathological analysis of the large intestine tissue, in the 2-deoxy-D-glucose administration group, almost no destruction of the large intestine mucosa was observed, and this is a very effective treatment method. it was thought.

慢性関節リウマチモデルマウスに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
慢性関節リウマチを発症するモデルマウスであるＳＫＧマウス（ＩＬ−６が発症に関与することがＩＬ−６欠損マウスとの掛け合わせによって証明されている：Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．１１４，ｐｐ．５８２−５８８，２００４、日本クレアより入手、６週齢）に１週間、水（Ｃｏｎｔｒｏｌ）又は０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を自由摂取で与えた後、誘発性関節炎を発症させるためにβグルカンとしてラミナリン３０ｍｇ／匹を腹腔内投与し、その後も水又は０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を自由摂取で与え続け、８週後、関節炎の程度を観察した。
図５に結果を示す。図５Ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図５Ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの肢の状態を示す。図５に示すように、ＳＫＧマウスでのコラーゲン誘発性関節炎発症に対して、飲み水に０．５％（ｗ／ｖ）の２−デオキシ−Ｄ−グルコースを加えておくと、発症が顕著に抑えられた。
さらに、関節リウマチモデルマウスであるＳＫＧマウスを用いて、上記と同様の実験を行い、発現した関節炎のスコア及び体重の変化を１週ごとに観察した。なお、餌は全ての期間において自由摂取させた。結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。図６Ａはラミナリン投与後の関節スコアを示し、図６Ｂはラミナリン投与後の体重変化を示す。図に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したマウスでは、関節スコアが低く関節炎の発症が抑制され、体重増加も良好であった。
さらに、敗血症のモデルであるｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）腹腔内投与においても２−デオキシ−Ｄ−グルコース腹腔内投与により症状の緩和が観察された。Effect of 2-deoxy-D-glucose on rheumatoid arthritis model mice SKG mice that are model mice that develop rheumatoid arthritis (IL-6 is shown to be involved in the development by crossing with IL-6-deficient mice Hata et al., J. Clin. Invest., Vol. 114, pp. 582-588, 2004, obtained from CLEA Japan, 6 weeks old) for 1 week, water (Control) or 0.5% After giving 2-deoxy-D-glucose-containing water ad libitum, laminarin 30 mg / animal was intraperitoneally administered as β-glucan to develop induced arthritis, and then water or 0.5% 2-deoxy was added. -D-glucose-containing water was kept on ad libitum, and after 8 weeks, the degree of arthritis was observed.
The results are shown in FIG. FIG. 5A shows the limb state of a control SKG mouse fed with water, and FIG. 5B shows the limb state of a SKG mouse fed with 0.5% 2-deoxy-D-glucose-containing water. As shown in FIG. 5, for collagen-induced arthritis development in SKG mice, when 0.5% (w / v) 2-deoxy-D-glucose is added to drinking water, the onset is prominent. It was suppressed.
Furthermore, using the SKG mouse, which is a rheumatoid arthritis model mouse, the same experiment as described above was performed, and the changes in the score and body weight of the arthritis that developed were observed every week. The food was ingested freely throughout the period. The results are shown in FIGS. 6A and 6B. FIG. 6A shows the joint score after laminarin administration, and FIG. 6B shows the body weight change after laminarin administration. As shown in the figure, in the mice administered with 2-deoxy-D-glucose, the joint score was low, the onset of arthritis was suppressed, and the weight gain was good.
Furthermore, even in lipopolysaccharide (LPS) intraperitoneal administration, which is a sepsis model, symptom relief was observed by intraperitoneal administration of 2-deoxy-D-glucose.

慢性関節リウマチモデルマウスに対する２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果（その２）
実施例３の実験の再現性を確認した。結果を図１１及び図１２並びに図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。
図１１ａがラミナリンを投与し水を与えたコントロールＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｂがラミナリンを投与し０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの肢の状態を示し、図１１ｃがラミナリン無処置のＳＫＧマウスの肢の状態を示す。図１１ａ〜図１１ｃに示すように、ＳＫＧマウスでのコラーゲン誘発性関節炎発症に対して、飲み水に０．５％（ｗ／ｖ）の２−デオキシ−Ｄ−グルコースを加えておくと、発症が顕著に抑えられた。また、図１２に左後肢関節部をＨｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色法で組織染色した結果を示す。図１２ａが水を与えたコントロールＳＫＧマウスの結果であり、図１２ｂが０．５％の２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有水を与えたＳＫＧマウスの結果である。２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与群では、好中球やリンパ球の浸潤に伴う滑膜の破壊及び炎症性肉芽反応はほとんど観察されず、非常に有効性の高い治療法であることがわかった。
図１３Ａはラミナリン投与後の関節スコアを示し、図１３Ｂはラミナリン投与後の体重変化を示す。図に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを投与したマウスでは、投与１１週後においても関節スコアが低く関節炎の発症が抑制され、体重増加も良好であった。Effect of 2-deoxy-D-glucose on rheumatoid arthritis model mice (Part 2)
The reproducibility of the experiment of Example 3 was confirmed. The results are shown in FIGS. 11 and 12 and FIGS. 13A and 13B.
FIG. 11a shows the limb state of control SKG mice given laminarin and given water, and FIG. 11b shows the limbs of SKG mice given laminarin and given 0.5% 2-deoxy-D-glucose-containing water. The state is shown, and FIG. As shown in FIGS. 11a to 11c, when 0.5% (w / v) 2-deoxy-D-glucose is added to drinking water for the onset of collagen-induced arthritis in SKG mice, the onset Was remarkably suppressed. FIG. 12 shows the result of tissue staining of the left hind limb joint by hematoxylin-eosin (HE) staining. FIG. 12a shows the results of control SKG mice fed with water, and FIG. 12b shows the results of SKG mice fed with 0.5% 2-deoxy-D-glucose-containing water. In the 2-deoxy-D-glucose administration group, the synovial membrane destruction and the inflammatory granulation reaction accompanying infiltration of neutrophils and lymphocytes were hardly observed, and it was found that the treatment method was very effective. .
FIG. 13A shows the joint score after laminarin administration, and FIG. 13B shows the body weight change after laminarin administration. As shown in the figure, in the mice administered with 2-deoxy-D-glucose, even after 11 weeks of administration, the joint score was low, the onset of arthritis was suppressed, and the weight gain was good.

２−デオキシ−Ｄ−グルコースの経口投与による効果
マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）の腹腔滲出性マクロファージを、３％チオグリコレート培地２ｍｌづつ腹腔内投与して無菌性炎症を引き起こす事により誘導した後、ゾンデを用いて２−デオキシ−Ｄ−グルコースを１０ｍｇづつ経口投与した。その後一定時間ごとに、マウスから腹腔滲出性マクロファージの調製を行い、得られたマクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害を調べた。
すなわち、マクロファージ上のＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
結果を図１４に示す。図１４に示すように２−デオキシ−Ｄ−グルコースを経口投与したマウスにおいては、マクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害が確認された。Effect of oral administration of 2-deoxy-D-glucose After induction of peritoneal exudating macrophages of mouse C57BL / 6J (CLEA Japan) in 2 ml of 3% thioglycolate medium and causing aseptic inflammation Then, 10 mg of 2-deoxy-D-glucose was orally administered using a sonde. Thereafter, peritoneal exudate macrophages were prepared from mice at regular intervals, and inhibition of sugar chain modification of IL-6 receptor (gp130) of the obtained macrophages was examined.
That is, the expression of IL-6 receptor (gp130) on macrophages was examined by the immunoblot method.
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 14, inhibition of glycosylation of macrophage IL-6 receptor (gp130) was confirmed in mice administered orally with 2-deoxy-D-glucose.

２−デオキシ−Ｄ−グルコースの副作用低減効果
実施例５と同様に、マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）の腹腔滲出性マクロファージをチオグリコレート培地で誘導した後、２−デオキシ−Ｄ−グルコース１０ｍｇずつを腹腔内注射により投与した。その後、一定時間ごとに滲出性マクロファージの調製を行い、得られたマクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
また、前処理なしのマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）に２−デオキシ−Ｄ−グルコース１０ｍｇずつを腹腔内注射により投与した。その後、滲出性マクロファージの調製時と同様の時間に、腹腔常在性マクロファージの調製を行い、得られたマクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
結果を図１５Ａに示す。図１５Ａに示すようにチオグリコレートによる炎症で誘導された滲出性マクロファージは、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの腹腔内投与により、マクロファージのＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾阻害が確認された。
一方、チオグリコレートで誘導しない常在性マクロファージでは、同様に２−デオキシ−Ｄ−グルコースで処理しても、ｇｐ１３０の糖鎖修飾阻害は起こらなかった（図１５Ｂ）。このことから、２−デオキシグルコースの作用は、正常細胞よりも炎症細胞で強く作用する事が示唆され、治療薬として正常細胞に小胞体ストレスダメージを与える事が少ないので、副作用の軽減が期待できる。Side effect reduction effect of 2-deoxy-D-glucose After inducing peritoneal exudate macrophages of mouse C57BL / 6J (CLEA Japan) with thioglycolate medium in the same manner as in Example 5, 10 mg of 2-deoxy-D-glucose each. Was administered by intraperitoneal injection. Thereafter, exudate macrophages were prepared at regular intervals, and inhibition of sugar chain modification of the obtained macrophages on IL-6 receptor (gp130) was examined by the immunoblot method.
In addition, 10 mg of 2-deoxy-D-glucose was administered by intraperitoneal injection to mouse C57BL / 6J (Clea Japan) without pretreatment. Thereafter, peritoneal resident macrophages were prepared at the same time as the preparation of exudative macrophages, and inhibition of sugar chain modification of IL-6 receptor (gp130) of the obtained macrophages was examined by the immunoblot method.
The results are shown in FIG. 15A. As shown in FIG. 15A, exudative macrophages induced by inflammation with thioglycolate were confirmed to inhibit the glycosylation modification of macrophage IL-6 receptor (gp130) by intraperitoneal administration of 2-deoxy-D-glucose. It was done.
On the other hand, in resident macrophages that were not induced with thioglycolate, even when treated with 2-deoxy-D-glucose, inhibition of gp130 sugar chain modification did not occur (FIG. 15B). This suggests that the action of 2-deoxyglucose acts more strongly on inflammatory cells than on normal cells, and it is less likely to cause endoplasmic reticulum stress damage to normal cells as a therapeutic agent, thus reducing side effects. .

Ｎ−グリコシド型糖鎖修飾に対する２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースの効果
２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＦＤＧ）によるＮ−グリコシド型糖鎖修飾の阻害を検討した。培養細胞として、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いた。２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地の組成は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースを終濃度で２５ｍＭ添加したものであった。
培養細胞を２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地処理及びコントロールとして２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）培地で処理し、一定時間ごとに培養細胞（ＭＥＦ）を採取し、ＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の発現をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
結果を図１６に示す。２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いた場合も、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いた場合と同様の糖鎖修飾阻害活性が認められた。
比較例１ ２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの糖鎖修飾及び炎症性シグナル伝達に対する効果
２−デオキシ−Ｄ−グルコースと類似した構造（図７）を有するグルコサミンの糖鎖修飾及び炎症性シグナル伝達への効果を調べた。
培養細胞にＩＬ−６及び可溶性レセプターであるｓＩＬ−６Ｒを作用させると、細胞膜レセプターであるｇｐ１３０に作用し、その下流に存在するＪＡＫｋｉｎａｓｅ（ＪＡＫ１，ＪＡＫ２，Ｔｙｋ２）がリン酸化されて活性化型となり、Ｓｔａｔ３をリン酸化する。リン酸化されて活性化型となったＳｔａｔ３は２量体となり、ＩＬ−６標的遺伝子群の転写誘導を行う（図８）。本比較例においては、２−デオキシ−Ｄ−グルコース及びグルコサミンであらかじめ処理した培養細胞をＩＬ−６で刺激した際に、これら下流のシグナル伝達が生じているのかを確認した。
培養細胞を、通常の培地（ＤＭＥＭ）、２−デオキシ−Ｄ−グルコース含有培地、無グルコース培地及びグルコサミン含有培地で４時間処理し、その後ＩＬ−６及び可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を培地中に添加して刺激し、一定時間ごとにＩＬ−６受容体（ｇｐ１３０）の糖鎖修飾やＩＬ−６による下流のシグナル伝達の有無をＩｍｕｕｎｏｂｌｏｔ法により調べた。
結果を図９に示す。図９に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコースで処理した細胞に見られるｇｐ１３０の糖鎖修飾欠損がグルコサミン処理では確認できず、さらに下流のＪＡＫ ｋｉｎａｓｅ群のリン酸化が２−デオキシ−Ｄ−グルコース処理では減弱しているのに対し、グルコサミン処理群ではコントロール群と同様のＪＡＫ ｋｉｎａｓｅ群及びＳｔａｔ３の活性化が確認できた。この結果は、グルコサミンには２−デオキシ−Ｄ−グルコースと同様の効果はないことを示す。なおｇｐ１３０の研究において、ｇｐ１３０のＮ結合型糖鎖が付かない変異を入れた変異体では、細胞膜での安定性が悪くなり、下流へのシグナルが減弱されることが既にわかっており（Ｇｅｏｒｇ Ｈ．Ｗ．ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，１７８１−１７８９）、本比較例の２−デオキシ−Ｄ−グルコースによる処理でＮ結合型糖鎖修飾がなくなったことにより、変異体と同様の効果が起きているのではないかと推察される。
比較例２ ２−デオキシ−Ｄ−グルコースとグルコサミンの腸炎に対する効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週令）に２％（Ｗ／Ｖ）ＤＳＳを飲み水として自由摂取させ、ＤＳＳ誘導性腸炎を発症させた。このマウスに２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はグルコサミン（ＧＳ）を１０ｍｇ／日で腹腔内投与し、体重変化を確認した。結果を図１０に示す。図１０に示すように、２−デオキシ−Ｄ−グルコース投与群はＤＳＳ単独投与群よりも体重減少が抑えられたが、グルコサミン投与群には全く抑制効果は見られず、むしろＤＳＳ単独投与群よりも体重減少が確認された。
これまでに、炎症性サイトカインを抑制することで様々な疾患モデルの病態が緩和されることがこれらのサイトカイン遺伝子欠損マウスの解析から明らかとなっており、抗炎症性サイトカイン治療も開発されていた。しかし、これらの抗炎症性サイトカイン治療法は単独のサイトカインを標的としたものである。上記実施例は２−デオキシ−Ｄ−グルコースにより多種類の炎症性サイトカインを同時に抑制することができることを示し、さらにこの方法が従来の単独のサイトカインを標的とした場合よりも治療効果に優れていることを示している。また、従来の抗炎症性サイトカイン治療法はタンパク質を用いた治療法であり、その効果の持続性にも限界があった。また、抗炎症性サイトカインは非常に高価なものであり、治療コストも大きかった。これに比べると、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは安価であり、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを用いた治療はコストが小さく、さらに２−デオキシ−Ｄ−グルコースは副作用が少なく長期投与にも適した方法である。また、２−デオキシ−Ｄ−グルコースは経口投与でも効果がみられており、患者にとっても負担が少ない。Effect of 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose on N-glycoside sugar chain modification Inhibition of N-glycoside sugar chain modification by 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (2-FDG) was examined. . Mouse embryo fibroblasts (MEF) were used as cultured cells. The composition of the 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose-containing medium was obtained by adding 25 mM 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose at a final concentration to Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
Cultured cells were treated with 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose-containing medium and treated with 2-deoxy-D-glucose (2-DG) medium as a control, and cultured cells (MEF) were collected at regular intervals, The expression of IL-6 receptor (gp130) was examined by the immunoblot method.
The results are shown in FIG. When 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose was used, the same sugar chain modification inhibitory activity was observed as when 2-deoxy-D-glucose was used.
Comparative Example 1 Effect of 2-deoxy-D-glucose and glucosamine on sugar chain modification and inflammatory signal transduction Sugar chain modification and inflammatory signal transduction of glucosamine having a structure similar to 2-deoxy-D-glucose (FIG. 7) The effect on was investigated.
When IL-6 and sIL-6R, which is a soluble receptor, are allowed to act on cultured cells, it acts on gp130, which is a cell membrane receptor, and JAKkinase (JAK1, JAK2, Tyk2) existing downstream thereof is phosphorylated to become an activated form. , Phosphorylates Stat3. Stat3, which is phosphorylated and activated, becomes a dimer, and induces transcription of the IL-6 target gene group (FIG. 8). In this comparative example, when cultured cells pretreated with 2-deoxy-D-glucose and glucosamine were stimulated with IL-6, it was confirmed whether downstream signal transduction occurred.
The cultured cells are treated with normal medium (DMEM), 2-deoxy-D-glucose-containing medium, glucose-free medium and glucosamine-containing medium for 4 hours, and then IL-6 and soluble IL-6 receptor (sIL-6R) Was added to the medium for stimulation, and the presence or absence of sugar chain modification of IL-6 receptor (gp130) or downstream signal transduction by IL-6 was examined at regular intervals by the Immunoblot method.
The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, the glycosylation deficiency of gp130 seen in cells treated with 2-deoxy-D-glucose cannot be confirmed by glucosamine treatment, and phosphorylation of the downstream JAK kinase group is 2-deoxy-D -In the glucosamine treatment group, activation of the JAK kinase group and Stat3 similar to those in the control group was confirmed, while the glucose treatment attenuated. This result indicates that glucosamine does not have the same effect as 2-deoxy-D-glucose. In the study of gp130, it has already been known that a mutant containing a mutation that does not have an N-linked sugar chain of gp130 has poor stability at the cell membrane and attenuates downstream signals (Georg H W. et al (2010) J. Biol. Chem. 285, 1781-1789), the treatment with 2-deoxy-D-glucose in this comparative example eliminated the N-linked sugar chain modification. It is inferred that similar effects are occurring.
Comparative Example 2 Effect of 2-deoxy-D-glucose and glucosamine on enteritis C57BL / 6J mice (8 weeks old) were allowed to freely ingest 2% (W / V) DSS as drinking water to cause DSS-induced enteritis. . To this mouse, 2-deoxy-D-glucose or glucosamine (GS) was intraperitoneally administered at 10 mg / day, and changes in body weight were confirmed. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10, the 2-deoxy-D-glucose administration group showed less weight loss than the DSS single administration group, but the glucosamine administration group showed no inhibitory effect, rather than the DSS single administration group. Even weight loss was confirmed.
So far, it has been clarified from the analysis of these cytokine gene-deficient mice that the suppression of inflammatory cytokines alleviates the pathology of various disease models, and anti-inflammatory cytokine treatments have also been developed. However, these anti-inflammatory cytokine therapies target a single cytokine. The above examples show that 2-deoxy-D-glucose can simultaneously suppress many kinds of inflammatory cytokines, and further, this method is superior in the therapeutic effect compared with the case where a conventional single cytokine is targeted. It is shown that. Moreover, the conventional anti-inflammatory cytokine treatment method is a treatment method using protein, and there is a limit to the sustainability of the effect. In addition, anti-inflammatory cytokines are very expensive and costly for treatment. Compared to this, 2-deoxy-D-glucose is inexpensive, treatment with 2-deoxy-D-glucose is low in cost, and 2-deoxy-D-glucose has few side effects and is suitable for long-term administration. It is a method. In addition, 2-deoxy-D-glucose is effective even by oral administration, and the burden on the patient is small.

２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、炎症性サイトカインの機能を抑制することにより炎症反応を抑えるので、炎症性疾患の予防及び治療に用いることができる。２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、多種類の炎症性サイトカインの機能を抑制するので、強い抗炎症効果を発揮し得る。このような強い効果は構造が類似しているグルコサミンの作用からは予測し得なかったことである。さらに、２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、低コストで大量に製造することができるので、治療コストも下げることができ、さらに動物への安全性も確認されているので、安全な予防又は治療薬として用いることができる。
２−デオキシ−Ｄ−グルコース又はその誘導体は、効果的で、さらに安全かつ安価な抗炎症剤として用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。Since 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof suppresses the inflammatory reaction by suppressing the function of inflammatory cytokines, it can be used for the prevention and treatment of inflammatory diseases. Since 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof suppresses the functions of many kinds of inflammatory cytokines, it can exert a strong anti-inflammatory effect. Such a strong effect could not have been predicted from the action of glucosamine, which is similar in structure. Furthermore, since 2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof can be produced in a large amount at a low cost, the treatment cost can be reduced, and further, safety to animals has been confirmed. Or it can be used as a therapeutic agent.
2-deoxy-D-glucose or a derivative thereof can be used as an effective, safe and inexpensive anti-inflammatory agent.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (3)

2-デオキシ-D-グルコース、又はGDP-2-デオキシマンノース、2-デオキシマンノース-1-リン酸、2-デオキシマンノース-6-リン酸、2-フルオロ-2-デオキシグルコース、2-フルオロデオキシグルコース、2-フルオロ-デオキシグルコース-6-リン酸、2-フルオロ-デオキシグルコース-1-リン酸、2-フルオロ-デオキシマンノース、GDP-2-フルオロ-デオキシマンノース、2-フルオロ-デオキシマンノース-6-リン酸及び2-フルオロ-デオキシマンノース-1-リン酸からなる群から選択されるその誘導体を有効成分として含む、IL-6、IFN-γ及びTNF-αである炎症性サイトカインの受容体分子の糖鎖修飾を抑制し、前記炎症性サイトカインのシグナル伝達を抑制することにより炎症性サイトカインの機能を抑制する、経口投与用である、炎症性サイトカイン機能抑制剤。 2-deoxy-D-glucose, or GDP-2-deoxymannose, 2-deoxymannose-1-phosphate, 2-deoxymannose-6-phosphate, 2-fluoro-2-deoxyglucose, 2-fluorodeoxyglucose 2-fluoro-deoxyglucose-6-phosphate, 2-fluoro-deoxyglucose-1-phosphate, 2-fluoro-deoxymannose, GDP-2-fluoro-deoxymannose, 2-fluoro-deoxymannose-6- A receptor molecule for inflammatory cytokines, IL-6, IFN-γ and TNF-α, comprising as an active ingredient a derivative selected from the group consisting of phosphate and 2-fluoro-deoxymannose-1-phosphate An agent for suppressing inflammatory cytokine function , which is for oral administration , suppresses sugar chain modification and suppresses the function of inflammatory cytokines by suppressing signal transduction of said inflammatory cytokines. 2-デオキシ-D-グルコース、又はGDP-2-デオキシマンノース、2-デオキシマンノース-1-リン酸、2-デオキシマンノース-6-リン酸、2-フルオロ-2-デオキシグルコース、2-フルオロデオキシグルコース、2-フルオロ-デオキシグルコース-6-リン酸、2-フルオロ-デオキシグルコース-1-リン酸、2-フルオロ-デオキシマンノース、GDP-2-フルオロ-デオキシマンノース、2-フルオロ-デオキシマンノース-6-リン酸及び2-フルオロ-デオキシマンノース-1-リン酸からなる群から選択されるその誘導体を有効成分として含む、IL-6、IFN-γ及びTNF-αである炎症性サイトカインの受容体分子の糖鎖修飾を抑制し、前記炎症性サイトカインのシグナル伝達を抑制することにより炎症性サイトカインの機能を抑制する、炎症性サイトカイン機能抑制剤を含む、敗血症又は炎症性腸疾患である炎症性疾患の予防又は治療剤。 2-deoxy-D-glucose, or GDP-2-deoxymannose, 2-deoxymannose-1-phosphate, 2-deoxymannose-6-phosphate, 2-fluoro-2-deoxyglucose, 2-fluorodeoxyglucose 2-fluoro-deoxyglucose-6-phosphate, 2-fluoro-deoxyglucose-1-phosphate, 2-fluoro-deoxymannose, GDP-2-fluoro-deoxymannose, 2-fluoro-deoxymannose-6- A receptor molecule for inflammatory cytokines, IL-6, IFN-γ and TNF-α, comprising as an active ingredient a derivative selected from the group consisting of phosphate and 2-fluoro-deoxymannose-1-phosphate It suppresses glycosylation inhibit the function of inflammatory cytokines by inhibiting the signaling of the inflammatory cytokines, including inflammatory cytokine function inhibitor, in sepsis or inflammatory bowel disease Prophylactic or therapeutic agents of that inflammatory disease. 経口投与用である、請求項２記載の炎症性疾患の予防又は治療剤。 The preventive or therapeutic agent for inflammatory diseases according to claim 2 , which is for oral administration.