JP6038936B2 - Ｃｓｆにおけるｓｏｄ１の代謝 - Google Patents

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Description

連邦政府研究支援の承認
本発明は、少なくとも部分的に、国立衛生研究所からの資金、認可番号Ｔ３５ ＤＫ０７４３７５を用いて行われた。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
技術分野
本発明は、神経性および神経変性疾患、障害および関連する過程の診断および治療のための方法に関する。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで対象における中枢神経系由来の生体分子の代謝を測定する方法に関する。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脊髄および脳における運動ニューロンの進行性喪失を特徴とする神経変性疾患であり、脱力感、骨格筋の萎縮、運動機能の喪失、麻痺、および診断後３−５年の呼吸不全からの最終的な死をもたらす。ＡＬＳ症例の９０％は散発性である一方、約１０％が優性遺伝である。これらの家族性症例のうち、約２０％が銅，亜鉛−スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、過酸化水素および酸素分子へのスーパーオキシドアニオンの変換を触媒するホモ二量体金属酵素、における優性変異に起因する。触媒活性、銅および亜鉛結合部位、二量体化、分子内ジスルフィド結合形成、およびフォールディングなどの、その構造および機能の多くの側面に影響を与える、１５０を超える変異が、この１５３アミノ酸のタンパク質について特徴づけられている。このように、複数の仮説が、変異型ＳＯＤ１毒性の背後のメカニズムを説明するために提案されているが、未だ決定的に証明されていない。この普遍的に発現されるタンパク質が、どのように脊髄および一次運動野の運動ニューロンへの選択的な毒性を与えるのかは、不明のままである。
多くの神経変性疾患は、変異型タンパク質の蓄積の結果である。これらのタンパク質のいくつかの発現は、主にＣＮＳに限定されているが、ＳＯＤ１のように身体の全ての組織において普遍的に発現されるものもある。この普遍的な発現にもかかわらず、ＳＯＤ１変異体は運動ニューロンの選択的な死をもたらす。一つの興味を引く仮説は、ＣＮＳが、ミスフォールディングした変異体タンパク質に、他の非神経組織ほど効率的に対処できないというものである。確かに、安定同位体標識動態（ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を用いる、グローバルプロテオミクス法は、たとえ同一のタンパク質またはタンパク質複合体が組織間で比較されても、脳タンパク質が最も低い代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）速度を有することを示している。これらの研究から、ＣＮＳにおける効率の悪いタンパク質の代謝回転が、病状の進行を可能にするミスフォールディングされたＳＯＤ１蓄積のための段階を設定し得ることが示唆された。しかしながら、非神経と神経組織の間の野生型および変異型ＳＯＤ１の代謝回転速度の比較はこれまで研究されておらず、疾患の組織特異性に関する貴重な情報を得ることができるであろう。
したがって、ＣＮＳにおける生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ代謝を測定するための、高感度、正確かつ再現性のある方法に対する必要性が存在している。特に、神経変性疾患に関連するタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ分画合成速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒａｔｅ）およびクリアランス速度、例えば、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１の代謝を測定するための方法が必要とされる。
本発明の一実施態様は、ＳＯＤ１などの神経由来の生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ代謝（例えば合成速度、クリアランス速度）を測定するための方法を提供する。
本発明のさらなる実施態様は、対象における神経由来のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ代謝を測定するためのキットであって、それによってタンパク質の代謝が、神経性または神経変性疾患の予測因子、疾患の進行のモニタリング、または疾患に対する治療の有効性の指標として用いられ得るキットを包含する。
カラー図面の参照
本出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの写真を含む。カラー写真を有するこの特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
図１は、トランスジェニックラット由来の皮質における、ＳＯＤ１ ＷＴ（ＳＯＤ１ＷＴ）の標識の成功を示す図およびグラフである。Ａ）ＳＯＤ１ ＷＴラット皮質からの、抗ＳＯＤ１抗体での免疫沈降を示すウェスタンブロット。Ｂ）ラット皮質からのＳＯＤ１のギ酸溶出およびトリプシン消化。Ｃ）脳および肝臓における、ＳＯＤ１ トリプシン分解断片ＴＬＶＶＨＥＫにおける１３Ｃ−ロイシンの時間依存的取り込み。ＦＳＲ＝分画合成速度；Ｔ１／２＝ＳＯＤ１ ＷＴ半減期。
図２は、ＳＯＤ１ Ｇ３９Ａ（ＳＯＤ１Ｇ３９Ａ）代謝回転における組織特異的な違いを示すグラフを表す。ＦＣＲ＝分画クリアランス速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅ）；Ｔ１／２＝ＳＯＤ１ Ｇ３９Ａ半減期。ＳＣ＝脊髄。
図３は、１３Ｃ６−ロイシン標識ヒトＣＳＦからのＳＯＤ１の質量分析データを示すグラフを表す。Ｙ軸上にグラフ化されたのが面積（Ａｒｅａ）である；Ｘ軸上にグラフ化されたのが時間（時間）である。グラフは、標識されたヒトＣＳＦ試料が、最後の時点でさえ、非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率の継続的な増加を示したことを示す。
Ｙ軸に沿ってＨ：Ｌ比を、Ｘ軸に沿って時間（時間）をプロットする質量分析データを示すグラフである。試料はヒトＣＳＦ試料であり、四角はトリプシンペプチド断片ＴＬＶＶＨＥＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号１）を表す。
図５は、ＴＬＶＶＨＥＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号１）の検量線を示すグラフである。予測された値に対する標識された値のパーセントが線形回帰直線で示されている。低偏差に加えて、良好な線形適合に留意すること。
図６は、Ｙ軸に沿ってＨ：Ｌ比を、Ｘ軸に沿って時間（時間）をプロットする質量分析データを示すグラフである。試料はヒトＣＳＦ試料である。赤四角はトリプシンペプチド断片ＨＶＧＤＬＧＮＶＴＡＤＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号２）を表し、青四角はＴＬＶＶＨＥＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号１）を表す。
図７は、Ｙ軸に沿ってＨ：Ｌ比を、Ｘ軸に沿って時間（時間）をプロットする質量分析データを示すグラフである。試料はヒトＣＳＦ試料であり、四角はトリプシンペプチド断片ＨＶＧＤＬＧＮＶＴＡＤＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号２）を表す。
図８は、ＨＶＧＤＬＧＮＶＴＡＤＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号２）の検量線を示すグラフである。予測された値に対する標識された値のパーセントが線形回帰直線で示されている。低偏差に加えて、良好な線形適合に留意すること。
図９は、Ｙ軸に沿って面積比を、Ｘ軸に沿って時間（時間）をプロットする質量分析データを示すグラフである。試料はヒトＣＳＦ試料である。赤四角はトリプシンペプチド断片ＨＶＧＤＬＧＮＶＴＡＤＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号２）を表し、青四角はＴＬＶＶＨＥＫ＿Ｃ１３Ｎ１４（配列番号１）を表す。注；四角は完全に重複する。
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、ＳＯＤ１の合成速度およびクリアランス速度を決定することに関する。また、治療が神経性および神経変性疾患に関連するＣＮＳでのＳＯＤ１の産生またはクリアランス速度に影響を及ぼしているかどうかを評価するための方法を提供する。本発明の有用性は、治療がＳＯＤ１の合成またはクリアランス速度を変化させるかどうかを判定し得るという点で、当業者にとって明らかであろう。最終的に、この方法は、神経性および神経変性疾患の出現のための予測試験を提供し、より正確な診断のための方法、およびかかる疾患の進行をモニタリングする手段を提供し得る。
Ｉ．神経由来の生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ代謝をモニタリングするための方法
本発明は、ＳＯＤ１のｉｎ ｖｉｖｏ代謝を測定するための方法を提供する。この方法を用いることにより、当業者は、特定の疾患状態におけるＳＯＤ１の代謝（合成およびクリアランス）における可能な変化を研究することができる。加えて、本発明は、対象における疾患修飾性治療の薬力学的効果の測定を可能にする。
特に、本発明は；標識ＳＯＤ１および非標識ＳＯＤ１を含有する生体試料を収集するために；それがｉｎ ｖｉｖｏで中枢神経系において合成されるように、ＳＯＤ１を標識する方法、および経時的にＳＯＤ１の標識を測定する手段を提供する。これらの測定を用いて、ＣＮＳ内での合成およびクリアランス速度などの代謝パラメータ、ならびにその他を算出してもよい。
（ａ）変性疾患
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の遺伝子における変異は、優性遺伝性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）症例の２０％を説明する。これらの遺伝的変異は、最終的に毒性を有するタンパク質を生産する。現在、家族性ＡＬＳのために利用可能な治療は無いが、ＳＯＤ１産生を阻害することが、毒性タンパク質の産生および疾患進行を制限し得ると考えられている。いくつかの治療は、脳および脊髄におけるＳＯＤ１タンパク質レベルを低下させることに焦点を当てる。脳および脊髄における減少したＳＯＤ１は、脳脊髄液（ＣＳＦ）における減少したＳＯＤ１に反映される。それゆえ、ＣＳＦ ＳＯＤ１は、ＳＯＤ１合成を低減させるのに治療有効性のバイオマーカーとして用いられ得る。
当業者は、ＡＬＳが本発明によって診断またはモニタリングされ得る例示的な疾患であるが、本発明はＡＬＳに限定されないことを理解するであろう。本発明の方法は、いくつかの神経性および神経変性疾患、障害、またはＳＯＤ１代謝に関連する過程の治療効果の診断および評価に用いてもよいことが想定される。本発明の方法はまた、ＣＮＳの正常な生理機能、代謝、および機能を研究するために用いてもよいことが想定される。
ＳＯＤ１のｉｎ ｖｉｖｏ代謝がヒト対象において、特定の実施形態では、ＡＬＳを発症するリスクを有するヒト対象において、またはＡＬＳと診断されたヒト対象において、測定されることが想定される。あるいは、生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ代謝は、他の哺乳類対象において測定されてもよい。別の実施形態では、対象は、イヌまたはネコなどのコンパニオンアニマルである。別の代替実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたはヤギなどの家畜動物である。さらに別の代替実施形態では、対象は動物園の動物である。別の実施形態では、対象は非ヒト霊長類または齧歯類などの研究用動物である。
（ｂ）標識された部分
いくつかの異なる部分を用いてＳＯＤ１を標識してもよい。一般的に言えば、本発明の方法において典型的に利用される２種類の標識部分は、放射性同位体および非放射性（安定）同位体である。好ましい実施形態では、非放射性同位体が用いられ、質量分析法によって測定され得る。好ましい安定同位体には、重水素２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ，１７または１８Ｏ，３３，３４，または３６Ｓが含まれるが、一般的な天然型において見られるよりも多いまたは少ない中性子によって原子の質量を変化させる多数の他の安定同位体も有効であることが認識される。適した標識は、一般に、質量分析計において検出することができるように研究対象のＳＯＤ１の質量を変化させる。一実施形態では、標識された部分は非放射性同位体（例えば、１３Ｃ）を含むアミノ酸である。別の実施形態では、測定される生体分子は核酸であり、標識された部分は非放射性同位体（例えば、１５Ｎ）を含むヌクレオシド三リン酸である。あるいは、放射性同位体を用いてもよく、標識された生体分子は質量分析計によるだけでなくシンチレーションカウンターで測定してもよい。一以上の標識された部分が同時にまたは順番に用いられてもよい。
好ましい実施形態では、本方法を使用してタンパク質の代謝を測定する場合、標識された部分は、典型的にはアミノ酸である。当業者であれば、いくつかのアミノ酸を用いてＳＯＤ１の標識を提供できることを理解すると考えられる。一般に、アミノ酸の選択は、以下などの種々の要因に基づく：（１）アミノ酸は一般に、目的のタンパク質またはペプチドの少なくとも一つの残基に存在する。（２）アミノ酸は一般に、タンパク質合成の部位に迅速に到達し、血液脳関門を横切って迅速に平衡に達し得る。ロイシンは、実施例で実証されるように、ＣＮＳで合成されるタンパク質を標識するための好ましいアミノ酸である。（３）より高い割合の標識が達成できるように、アミノ酸は、理想的には、（体内で産生されない）必須アミノ酸である。非必須アミノ酸を用いてもよい；しかしながら、測定値はおそらくあまり正確にはならない。（４）アミノ酸標識は一般に、対象のタンパク質の代謝に影響を与えない（例えば、非常に多量のロイシンは、筋肉代謝に影響を与える場合がある）。および（５）所望のアミノ酸の利用可能性（すなわち、アミノ酸のなかには、他のアミノ酸よりも非常に高価または製造困難なものもある）。一実施形態では、６個の１３Ｃ原子を含有する１３Ｃ６−フェニルアラニンを用いて、神経由来タンパク質を標識する。好ましい実施形態では、１３Ｃ６−ロイシンを用いて、神経由来タンパク質を標識する。例示的な実施形態では、１３Ｃ６−ロイシンを用いてＳＯＤ１を標識する。
非放射性同位体および放射性同位体の両方の、標識されたアミノ酸の商業的供給源が数多く存在する。一般に、標識されたアミノ酸は、生物学的または合成的のいずれかで作製できる。生物学的に作製されるアミノ酸は、生物がタンパク質を産生する際にアミノ酸に取り込まれる１３Ｃ、１５Ｎ、または別の同位体の濃縮合物中で生育させた生物（例えば、昆布／海藻）から得てもよい。アミノ酸を次いで分離し、精製する。あるいは、アミノ酸は公知の合成化学過程で作製されてもよい。
（ｃ）標識された部分の投与
標識された部分はいくつかの方法によって対象に投与することができる。投与の適した方法には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または経口が含まれる。好ましい実施形態では、標識された部分は標識されたアミノ酸であり、標識されたアミノ酸は、静脈内注入によって投与される。別の実施形態では、標識されたアミノ酸は経口的に摂取されてもよい。
標識された部分は、選択される解析の種類に応じて、ある期間にわたってゆっくり、または大量単回用量として投与してもよい（例えば、定常状態またはボーラス／追跡）。標識された生体分子の定常状態レベルを達成するために、標識時間は一般に、標識された生体分子を確実に定量できるように十分な持続時間とすべきである。一実施形態では、標識された部分は標識されたロイシンであり、かつ標識されたロイシンは少なくとも９時間、静脈内投与される。別の実施形態では、標識されたロイシンは少なくとも１２時間、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、標識されたロイシンは、少なくとも９、１０、１１、または１２時間、静脈内投与される。他の実施形態では、標識されたロイシンは１２時間より長く静脈内に投与される。
当業者であれば、標識された部分の量（または用量）が変わり得るおよび変わるであろうことを理解すると考えられる。一般に、量は以下の要因に依存する（かつ以下の要因によって推定される）。（１）所望の解析の種類。例えば、血漿中に約１５％の標識されたロイシンの定常状態を達成するには、１０分間にわたる２ｍｇ／ｋｇの初回ボーラスの後に９時間にわたる約２ｍｇ／ｋｇ／時間を必要とする。対照的に、定常状態が必要とされなければ、標識されたロイシンの大量のボーラス（例えば、１または５グラムの標識されたロイシン）が最初に与えられてもよい。（２）解析対象のタンパク質。例えば、タンパク質が急速に産生されているなら、必要な標識時間は短くなり、必要な標識は少なくなり得る‐おそらく１時間で僅か０．５ｍｇ／ｋｇ。しかしながら、ほとんどのタンパク質は数時間から数日間（または数週間）の半減期を有するので、むしろ、なくとも４、９または１２時間の持続注入を０．５ｍｇ／ｋｇから４ｍｇ／ｋｇで用いてもよい。および（３）標識の検出の感度。例えば、標識検出の感度が増すと、必要となる標識量は少なくなり得る。
当業者であれば、１より多くの標識が単一の対象において用いられてもよいことを理解すると考えられる。これにより、同一の生体分子の多重標識が可能となり、異なる時間でのその生体分子の産生またはクリアランスに関する情報を提供することができる。例えば、第一の標識を最初のうちに対象に与え、続いて薬理学的物質（薬物）を与えることができ、さらにその後、第二の標識を投与することができる。一般に、この対象から得られる試料の解析は、薬物投与の前後での代謝の測定を提供し、同一の対象における薬物の薬力学的効果を直接的に測定するであろう。
あるいは、多重標識を同時に用いて、生体分子の標識を増大させ、並びに生体分子のより広い範囲の標識が得られ得る。
（ｄ）生体試料
発明の方法は、標識されたＳＯＤ１のｉｎ ｖｉｖｏ代謝を決定できるように、対象から生体試料を得ることを提供する。適した生体試料は、ＳＯＤ１が検出され得る体液または組織を含むが、これらに限定されない。例えば、一実施形態では、体液は脳脊髄液（ＣＳＦ）である。別の実施形態では、生体試料は組織試料である。生体試料の種類ごとに、当業者であれば、組織中のＳＯＤ１の半減期が、試料収集時間を選択するために決定されるべきであることを認識できる。
脊髄液は、留置ＣＳＦカテーテル有りまたは無しの腰椎穿刺によって得てもよい。他の種類の試料は、標準的な適正製造基準（ＧＭＰ）法を用いる直接収集によって収集してもよい。
一般に、研究対象の生体分子がタンパク質である場合、本発明は、対象のベースラインを提供するために、標識の投与の前に対象から第一の生体試料を採取できることを提供する。標識されたアミノ酸またはタンパク質の投与の後、一以上の試料が、一般に対象から採取され得る。当業者によって理解されるように、試料の数はおよび試料をいつ採取するかは一般に、解析の種類、投与の種類、対象のタンパク質、代謝の速度、検出の種類等などの多数の要因によると考えられる。
一実施形態では、生体分子はＳＯＤ１であり、ＣＳＦの試料は数日間にわたって採取される。ＣＳＦにおけるＳＯＤ１の半減期は一般に３週間より長いと考えられるので、ＣＦＳ試料は３、４、５、６、７、８、９、または１０日より長い間にわたって採取され得る。いくつかの実施形態では、１より多い試料が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または９週間、週一回、収集され得る。他の実施形態では、試料は、ＣＳＦにおけるＳＯＤ１の半減期の前の少なくとも一つの時点で、かつＳＯＤ１の半減期よりも長い少なくとも一つの時点で収集され得る。特定の実施形態では、少なくとも一つの試料が、約２０日から約３５日の間に収集され得る。別の実施形態では、少なくとも一つの試料が、約２０日から約３０日の間に収集され得る。さらに別の実施形態では、少なくとも一つの試料が、約２５日から約３５日の間に収集され得る。これに関連して、「約」は±１日を意味する。
他の実施形態では、生体分子はＳＯＤ１であり、肝臓組織の試料が数日間にわたって採取される。例えば、一以上の試料が、約１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日目に採取され得る。別の実施形態では、生体分子はＳＯＤ１であり、脳組織の試料が数日間にわたって採取され得る。例えば、一以上の試料が、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２日目に採取され得る。
一般的に言えば、少なくとも二つの試料が収集されるべきである。いくつかの実施形態では、２、３、または４つの試料が収集され得る。特定の実施形態では、４より多くの試料が収集され得る。
（ｅ）定義
本発明は、生体試料中の標識ＳＯＤ１の量および非標識ＳＯＤ１の量の検出を用いて、非標識ＳＯＤ１に対する標識生体分子の比率を決定し得る。一般に、非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率は、ＳＯＤ１の代謝に直接比例する。標識ＳＯＤ１および非標識ＳＯＤ１の検出に適した方法は、研究対象のＳＯＤ１の形態およびそれを標識するために用いられた標識された部分の種類に応じて、変わり得るおよび変わるであろう。対象の生体分子がタンパク質であり、標識された部分が非放射性に標識されたアミノ酸である場合、検出の方法は、典型的には、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の質量の変化を検出するのに十分に高感度であるべきである。好ましい実施形態では、質量分析法を用いて、標識ＳＯＤ１および非標識ＳＯＤ１の間の質量の違いを検出する。一実施形態では、ガスクロマトグラフィー質量分析法が用いられる。代替的な実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法が用いられる。好ましい実施形態では、高分解能タンデム質量分析法が用いられる。
さらなる技術を利用して、生体試料中の他のタンパク質および生体分子から対象のタンパク質を分離してもよい。一例として、免疫沈降を用いて、対象のタンパク質を、それが質量分析法によって解析される前に、単離および精製してもよい。あるいは、クロマトグラフィー装置を有する質量分析計を用いて、免疫沈降せずにタンパク質を単離してもよく、次いで、対象のタンパク質を直接測定してもよい。例示的な実施形態では、対象のタンパク質が免疫沈降され、次いで、エレクトロスプレーイオン化源を備えたタンデムＭＳユニットとインターフェースで接続された液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳ）によって解析される。
本発明はまた、同一の生体試料中の複数のタンパク質またはペプチドを同時に測定できることを提供する。すなわち、非標識タンパク質（および／またはペプチド）の量も標識タンパク質（および／またはペプチド）の量もともに、複数のタンパク質について別々にまたは同時に検出かつ測定することができる。そのため、本発明は、タンパク質の合成およびクリアランスにおける変化を大規模にスクリーニングするのに有用な方法（すなわち、プロテオミクス／メタボロミクス）を提供し、かつ根本的な病態生理に関わるタンパク質を検出および測定するための高感度の手段を提供する。あるいは、本発明はまた、複数の種類の生体分子を測定するための手段を提供する。これに関連して、例えば、タンパク質および糖質を同時にまたは順番に測定することができる。
（ｆ）代謝解析
標識ＳＯＤ１および非標識ＳＯＤ１の量が生体試料において検出されると、標識された生体分子の比率または割合を決定することができる。対象の生体分子がタンパク質であり、標識ＳＯＤ１および非標識ＳＯＤ１の量が生体試料において測定された場合、次いで、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の比率を算出することができる。タンパク質代謝（合成速度、クリアランス速度、遅延時間（ｌａｇ ｔｉｍｅ）、半減期、等）が、経時的に非標識タンパク質に対する標識タンパク質の比率から算出することができる。これらのパラメータを算出するための適した方法は多数存在する。本発明は、標識タンパク質（またはペプチド）および非標識タンパク質（またはペプチド）の同時測定を可能にし、その結果、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の比率ならびに他の算出を得ることができる。当業者であれば、本発明の方法で用いてもよい標識化の一次速度論モデルを熟知していると考えられる。例えば、分画合成速度（ＦＳＲ）を算出することができる。ＦＳＲは、前駆体の濃縮度（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）で割った、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の増加の初速度に等しい。同様に、分画クリアランス速度（ＦＣＲ）を算出することができる。また、遅延時間および同位体トレーサー定常状態などの他のパラメータを決定し、タンパク質の代謝および生理機能の測定値として用いることもできる。また、データに対してモデル化を行い、複数のコンパートメントモデルに適合させて、コンパートメント間の移動を推定してもよい。もちろん、選択される数学的モデル化の種類は、個々のタンパク質合成およびクリアランスのパラメータ（例えば、１−プール、マルチプール、定常状態、非定常状態、コンパートメントモデル化、等）に依存すると考えられる。
本発明は、タンパク質の合成が、典型的には、経時的な標識／非標識タンパク質の比率の増加の速度に基づく（すなわち、傾き、指数適合曲線またはコンパートメントモデル適合がタンパク質合成の速度を規定する）、ということを提供する。これらの算出には、最低限一つの試料が、典型的には、必要とされ（ベースライン標識を推定することができる）、二つが好ましく、タンパク質への標識の取り込みに関する正確な曲線（すなわち、合成速度）を算出するためには、複数の試料がより好ましい。
反対に、標識されたアミノ酸の投与が終了した後には、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の比率の減少の速度が、典型的には、そのタンパク質のクリアランス速度を反映する。これらの算出には、最低限一つの試料が、典型的には、必要とされる（ベースラインレベルを推定することができる）、二つが好ましく、経時的なタンパク質由来の標識の減少に関する正確な曲線（すなわち、クリアランス速度）を算出するためには、複数の試料がより好ましい。所与の時点での、生体試料中の標識されたタンパク質の量は、合成速度（すなわち、産生）またはクリアランス速度（すなわち、除去または破壊）を反映し、通常は、対象におけるタンパク質の時間当たりの割合または質量／時間（例えば、ｍｇ／ｈｒ）として表される。
例示的な実施形態では、実施例に示されるように、ＳＯＤ１のｉｎ ｖｉｖｏ代謝は、９時間かけて対象に標識されたロイシンを投与し、標識の投与後４日目を超える時点で少なくとも一つの生体試料を収集することによって測定される。生体試料はＣＳＦから収集されてもよい。生体試料における標識ＳＯＤ１および非標識ＳＯＤ１の量は、典型的には、免疫沈降、続いてＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳによって決定される。これらの測定から、非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率を決定することができ、かつこの比率は、ＳＯＤ１の合成速度およびクリアランス速度などの代謝パラメータの決定を可能にする。
ＩＩ．神経性および神経変性疾患の進行または治療を診断またはモニタリングするためのキット
本発明は、ＳＯＤ１を測定する、または、対象における中枢神経系由来タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ代謝を測定することにより、ＳＯＤ１に関連する神経性または神経変性疾患の進行または治療をモニタリングするためのキットを提供する。一般に、キットは、標識されたアミノ酸、標識されたアミノ酸を投与するための手段、経時的に生体試料を収集するための手段、および非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率を検出し、決定して、その結果、代謝指標（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｉｎｄｅｘ）を算出し得るための使用説明書、を含む。代謝指標は、次いで、正常で健康な個体の代謝指標と比較してもよく、または前の時点で生成した同一対象からの代謝指標と比較してもよい。好ましい実施形態では、キットは１３Ｃ６−ロイシンまたは１３Ｃ６−フェニルアラニンを含み、標識されるタンパク質はＳＯＤ１であり、評価される疾患はＡＬＳである。
定義
特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、一般的に、本発明が属する分野の当業者によって理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄ ｅｄ． １９９４）； Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）； ａｎｄ Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）。本明細書で用いる場合、以下の用語は、特に断りのない限り、それらに帰する意味を有する。
「クリアランス速度」とは、対象の生体分子が除去される速度を指す。
「分画クリアランス速度」またはＦＳＲは、指定された期間にわたる標識された生体分子の比率の自然対数として算出される。
「分画合成速度（ＦＳＲ）」またはＦＳＲは、標識された前駆体の予想される定常状態の値で割った、指定された期間にわたる、標識された生体分子の増加速度の傾きとして算出される。
「同位体」とは、それらの核が同じ原子番号を有するが、それらが異なる数の中性子を含有するため異なる質量数を有する、所与の元素の全ての形態を指す。非限定的な例として、１２Ｃおよび１３Ｃは両方とも炭素の安定同位体である。
「遅延時間」とは、一般に、生体分子が最初に標識される時から標識された生体分子が検出されるまでの時間の遅延を指す。
「代謝」とは、生体分子の合成、輸送、分解、修飾、またはクリアランス速度の任意の組合せを指す。
「代謝指標」とは、対象の生体分子の分画合成速度（ＦＳＲ）および分画クリアランス速度（ＦＣＲ）を含む測定値を指す。正常個体および罹患個体からの代謝指標の比較は、神経性または神経変性疾患の診断またはモニタリングを助けることができる。
「神経由来の細胞」とは、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、脈絡叢細胞、上衣細胞、他のグリア細胞等を含む血液脳関門内の全ての細胞を含む。
「定常状態」とは、特定の期間にわたって測定されたパラメータにおいて、有意な変化がない間の状態を指す。
「合成速度」とは、対象の生体分子が合成される速度を指す。
代謝トレーサー試験において、「安定同位体」は、最も豊富に天然に存在する同位体ほど豊富ではない非放射性同位体である。
本明細書で用いられる「対象」は、中枢神経系を有する生体を意味する。特に、対象は哺乳類である。適した対象は、研究用動物、コンパニオンアニマル、家畜、および動物園の動物を含む。好ましい対象はヒトである。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分に機能する、本発明者らによって見出された技術を表し、かつ、それゆえ、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者であれば理解できると考えられる。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、多くの変更が、開示された具体的な実施形態においてなされ、かつ本発明の要旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解できる。
実施例１．ＡＬＳのラットモデルにおける安定同位体ラベル動態
ヒトＳＯＤ１ ＷＴを過剰発現するトランスジェニックラットに、新規の食事にラットを順応させるために、１３Ｃ−ロイシンでの標識の前に、２週間、ロイシンのない餌を与えた。この馴化期間中、通常の１２Ｃ−ロイシン（１００ｍｇ／日）が、スクロースでわずかに甘くした飲料水に提供された。馴化期間の後、飲料水を１３Ｃ−ロイシン（１００ｍｇ／日）と交換し、動物を標識した。図１Ａおよび１Ｂに示されるデータは、７日間の標識期間が脳および肝臓に十分なＳＯＤ１標識をもたらすことを示す。７日間の標識期間後、通常の１２Ｃ−ロイシンで動物を追跡し、その後、動物を特定の時点で屠殺し、ＰＢＳ／ヘパリンで灌流し、かつ脳、脊髄、肝臓および腎臓を採取し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
ＳＯＤ１を、磁気ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に共有結合した抗ＳＯＤ１マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて組織溶解物から免疫沈降させた。簡潔には、組織を氷上で解凍し、ＮＰ−４０溶解バッファー（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭトリス、プロテアーゼ阻害剤）中でハンドブレンダーを用いて機械的にホモジナイズする。ＳＯＤ１を、オーバーナイトで５０μＬの抗ＳＯＤ１架橋ビーズを用いて５００μｇの総タンパク質から免疫沈降する。ビーズをＰＢＳ中で３回洗浄し、かつＳＯＤ１を５０μＬのギ酸でビーズから溶出する。ギ酸溶出物を真空によって凍結乾燥し、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー中に再懸濁する。４００ｎｇのシークエンスグレードのトリプシンが試料に添加され、１８時間、３７℃で消化を進行させる。試料を再び真空により凍結乾燥し、ＬＣ／ＭＳラン（Ｘｅｖｏ）に備えて、２０μＬの０．０５％ギ酸に再懸濁する。非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率が、１３Ｃ−ロイシン有りまたは無しで、それぞれ、ペプチドＴＬＶＶＨＥＫ（配列番号１）について、曲線下の面積を比較することによって決定される。これらの標識データから、分画合成速度（ＦＳＲ）および分画クリアランス速度（ＦＣＲ）が、組織がそれぞれ標識または追跡期間の間に採取されたかに応じて、算出できる。
実施例２．ＳＯＤ１ ＷＴトランスジェニックラットに関する組織特異的ＦＳＲ
図１Ｃに見られるように、二つの異なる組織（脳および肝臓）からのＳＯＤ１をヒトＳＯＤ１ ＷＴを過剰発現するトランスジェニックラットから免疫沈降し、消化し、かつ解析した。組織特異的な違いが脳と肝臓の間に存在することは、データから明らかである。具体的には、脳は、肝臓の６０％の速度でＳＯＤ１を合成する。ＦＳＲおよびＦＣＲが本質的に連結し、タンパク質の定常状態レベルを維持するので、脳および肝臓におけるＳＯＤ１ ＷＴの半減期は、それぞれ２９．３および１７．４日と推定することができる。脳に関する長い半減期は、トランスジェニックマウスの脊髄におけるＳＯＤ１−ＹＦＰ半減期を見た事前の研究と一致している。
実施例３．ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａトランスジェニックラットに関する組織特異的ＦＣＲ
ヒトＳＯＤ１ Ｇ９３Ａを過剰発現するトランスジェニックラットに、新規の食事にラットを順応させるために、１３Ｃ−ロイシンでの標識の前に、２週間、ロイシンのない餌を与えた。この馴化期間中、通常の１２Ｃ−ロイシン（１００ｍｇ／日）が、スクロースでわずかに甘くした飲料水に提供された。馴化期間の後、飲料水を１３Ｃ−ロイシン（１００ｍｇ／日）と交換し、動物を標識した。７日間の標識期間後、通常の１２Ｃ−ロイシンで動物を追跡し、その後、動物を標識後３日および１０日に屠殺し、ＰＢＳ／ヘパリンで灌流し、かつ脳、脊髄、肝臓および腎臓を採取し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。
図２に示されるように、肝臓におけるＧ９３ＡのＦＣＲは、１日当たり６．７０％であると決定され、これは７．４６日の半減期に変換される。脳および脊髄は、ＦＣＲの算出に信頼のおける時点の間で有意差は十分に認められなかったが、データは、これらの組織が肝臓におけるものよりもはるかに遅くＳＯＤ１Ｇ９３Ａを低下させることを示している。これは、特定のＣＳＦの実施形態のためには、収集時点の間隔が３日よりも大きくあるべきであることを示唆している。
実施例４．ヒトにおけるＳＯＤ１の安定同位体標識
ＣＳＦ試料が、安定同位体で標識されたアミノ酸（１３Ｃ６−ロイシン）の投与後の健康なボランティアから以前得られた。簡潔には、参加者は２回のＩＶと配置された一つの腰椎カテーテルを有した。１回のＩＶでは、１３Ｃ６−標識ロイシンが９または１２時間注入された。毎時間、血漿およびＣＳＦが、それぞれ、他方のＩＶおよび腰椎カテーテルを通して得られた。試料は、３６時間、１時間の時間間隔で採取された。さらなる詳細は、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｂａｔｅｍｅｎ ｅｔ． ａｌ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２００６に見出される。
モノクローナル抗スーパーオキシドジスムターゼ抗体を、プロテインＡ ＩｇＧ精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製し、Ｍ−２７０エポキシダイナビーズ抗体カップリングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて磁気ビーズに結合させた。ＳＯＤ１を、磁気ビーズに結合した抗ＳＯＤ１抗体を用いてＣＳＦ試料から免疫沈降させた。免疫沈降させたＳＯＤ１試料は、次いで、３７℃で１８時間、トリプシンで消化され、ＬＣ／ＭＳにかけられた。
トリプシン消化後、二つのＳＯＤ１ペプチド、ＴＬＶＶＨＥＫ（配列番号１）およびＨＶＧＤＬＧＮＶＴＡＤＫ（配列番号２）、が質量分析から最高強度を示し、その後の研究および解析のために用いられた。０時間、６時間、１２時間、１７時間、１８時間、２４時間、３０時間、および３６時間の時点で１３Ｃ−ロイシン標識ヒトＣＳＦ試料の質量分析が行われた。
以前、この安定アイソタイプ標識方法は、細胞外タンパク質、アミロイドベータで行われた。ＳＯＤ１は細胞内タンパク質であるため、ＣＳＦへのＳＯＤ１排出速度は予想されるよりも遅い、またはＳＯＤ１の半減期が非常に長い（何日から何週間も）可能性が高い。図３に示されるように、３６時間の時点内で、対象のペプチドに関する質量分析シグナルの強度のピークを検出することはできなかった。

Claims (9)

  1. 対象におけるＳＯＤ１のｉｎ ｖｉｖｏ代謝を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、ＳＯＤ１が中枢神経系において合成され、該方法が：
    対象由来の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中の標識ＳＯＤ１の量および非標識ＳＯＤ１の量を質量分析法により検出すること、および非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率を計算することを含み、
    ここで、該ＣＳＦ試料は、非放射性同位体で標識されたアミノ酸（標識されたアミノ酸）で標識されたＳＯＤ１画分および標識されたアミノ酸で標識されていないＳＯＤ１画分を含み、かつ該ＣＳＦ試料は、（ｉ）対象への標識されたアミノ酸の投与開始後２０日から３５日の間に、あるいは（ｉｉ）対象への標識されたアミノ酸の投与開始後２、３、４、または５週間、週一回、得られるものであり；
    該標識されたアミノ酸は血液脳関門を通過し、かつＳＯＤ１が対象の中枢神経系で合成されるので、ＳＯＤ１内に取り込むことができるものであり；かつ
    非標識ＳＯＤ１に対する標識ＳＯＤ１の比率は、対象におけるＳＯＤ１の代謝に直接比例するものである、
    方法。
  2. 非放射性同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、および３６Ｓからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 生体試料から標識ＳＯＤ１画分および非標識ＳＯＤ１画分を分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 標識ＳＯＤ１画分および非標識ＳＯＤ１画分が免疫沈降により分離される、請求項３に記載の方法。
  5. 対象が齧歯類である、請求項１に記載の方法。
  6. 対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
  7. 試料が、対象への標識されたアミノ酸の投与開始後２０日から３５日の間に得られる、請求項１に記載の方法。
  8. 試料が、対象への標識されたアミノ酸の投与開始後２、３、４、または５週間、週一回得られる、請求項１に記載の方法。
  9. 試料が、対象への標識されたアミノ酸の投与開始後３、４、または５週間、週一回得られる、請求項１に記載の方法。
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