JP6038774B2 - タンパク性物質結合性低分子化合物 - Google Patents

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Description

本発明は、抗体に特異的に結合する低分子化合物を利用して、タンパク性物質の分離、精製、特徴付け、同定または定量等を行う方法に関する。
近年、生体高分子であるタンパク質、酵素、核酸等は、バイオ医薬品用途での需要が急激に増加している。一般に、バイオ医薬品の製造は、培養工程と、その後の分離・精製工程とに大別されるため、目的物質の発現レベルを向上させる培養技術はもとより、簡便で大規模な精製技術の確立が切望されている。
タンパク質の精製には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離技術の利用が一般的であるが、培養工程後には、多種類のタンパク質が混在しているため、一つの精製技術を用いて目的タンパク質を純粋に得ることは極めて困難である。そのため、通常は、いくつかの技術を複合させた精製プロセスが採用されている（特許文献１）。
近年、開発が盛んに行われている医療用タンパク質の一つに抗体医薬がある。抗体医薬とは、抗体の有する機能を利用した医薬品であり、標的分子に対して特異的に働くために、従来の医薬品が有していた副作用を軽減させ、かつ、高い治療効果が期待されている。
抗体医薬は、実際に様々な病態の改善に寄与している一方、生体に大量に投与されることから、他の医療用タンパク質と比べた場合に純度が品質に与える影響が大きいと言われている。
純度の高い抗体を製造するためには、抗体に対して特異的に結合する分子をリガンドとして利用する、アフィニティークロマトグラフィー等の手法が一般的であるが、抗体医薬として開発されているのは、基本的にモノクローナルIgG抗体であり、IgG抗体にアフィニティーを有するリガンドとして、スタフィロコッカス（Staphylococcus）が生産するプロテインＡがよく知られている。
そこで、抗体医薬製造工程における初期精製工程（キャプチャー工程）には、プロテインＡがリガンドとして水不溶性担体に固定化された、アフィニティークロマトグラフィー用カラム（以下、プロテインＡカラム）が一般的に利用されている（非特許文献１、非特許文献２）。
しかしながら、プロテインＡは製造コストが高いため、カラムの性能を改良するための様々な技術開発もなされている。例えば、タンパク質工学的にリガンドの改変を行うことで、抗体のカラムへの結合容量の向上（特許文献２、特許文献３）や、洗浄時に有利であるアルカリ耐性の向上（特許文献４、特許文献５）などが進められている。
一方で、プロテインＡの代替物も開発されており、抗体への結合性を有する合成低分子化合物を固定化した担体（MAbsorbent（商標）、プロメティック・バイオサイエンス社）が上市されている。
抗体への結合性を有する低分子化合物としては、他にも、スルホン誘導体（特許文献６）、トリアジン誘導体（特許文献７）、メルカプト複素環式化合物（特許文献８）、４−ピリジルエチルチオアルキル誘導体（非特許文献３）、チアゾール誘導体（特許文献９）などが知られており、化学的、物理的な安定性において優れている。
しかしながら、これらプロテインＡの代替物には各基本構造に特有の非特異吸着が懸念されている。
ＷＯ2004/087761号公報 米国特許第6399750号 特開2007-252368号公報 欧州特許第1123389号 ＷＯ03/080655号公報 米国特許第4696980号 特表2009-531653号公報 特許第3844496号公報 特開2009-244252号公報
J. Chromatogr. B., 848, 48-63（2007） J. Chromatogr. A., 1160, 44-55（2007） Bioseparation，9，211−221（2000）
現在までに開発されているプロテインＡ代替物リガンドは、トリアジンやチアゾールといった各基本構造から誘導された関連化合物であり、タンパク質の分析、精製、特徴付け、同定または定量に使用するリガンドとしてはまだまだ不十分であった。そこで、化学的安定性が高く汎用的で多様なリガンドの幅広い探索を課題とした。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、一般式（１）：
（式中、ArXは、置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表し、ArYHBは、プロトンドナーを有する置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表す。また、（Linker）は、ArXとArYHBを結合する４〜３０の原子団を表す。）で表される低分子化合物が、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分（IgG-Fc）と特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
[1]一般式（１）：
（式中、ArXは、置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表し、ArYHBは、プロトンドナーを有する置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表す。また、（Linker）は、ArXとArYHBを結合する４〜３０の原子団を表す。）で表される低分子化合物の、タンパク性物質結合性低分子化合物としての使用。
[1]上記式（１）で表される低分子化合物とタンパク性物質とを接触させて、タンパク性物質を低分子化合物に結合させる方法。
[2]前記低分子化合物におけるArYHBが、芳香族６員環又はその側鎖に水酸基もしくはアミノ基が直接結合した構造を有することを特徴とする、[1]に記載の使用又は方法。
[3]前記低分子化合物におけるArXが、ハロゲン基、アミノ基、水酸基、もしくは、メチル基のいずれかを置換基として有するか、または、ArXが、ベンゼン環、ナフタレン環、もしくは、１,２-メチレンジオキシベンゼンのいずれかを含む構造を有するか、或いはそれらの両方であることを特徴とする、[1]または[2]に記載の使用又は方法。
[4]前記(Linker）が、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、置換されていてもよいチアゾール、もしくは置換されていてもよいピリミジンを含む構造であるか、或いは（Linker）を（-U-CZ-V-）で表したとき、CZが置換されていてもよいベンゼン環を含む構造、もしくは、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子で構成される[1]〜[3]のいずれかに記載の使用又は方法。
[5]前記低分子化合物が、以下の構造式で示される化合物（２）〜（１７）；
のいずれかである、[1]〜[4]のいずれかに記載の使用又は方法。
[6]タンパク性物質が、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片であることを特徴とする、[1]〜[5]のいずれかに記載の使用又は方法。
[7]タンパク性物質が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、[1]〜[6]のいずれかに記載の使用又は方法。
[8]タンパク性物質が、IgG-Fc、または、Fc融合タンパク質であることを特徴とする、[1]〜[7]のいずれかに記載の使用又は方法。
[9]タンパク性物質が細胞培養物中に含まれることを特徴とする、[1]〜[8]のいずれかに記載の使用又は方法。
[10][1]〜[9]のいずれかに記載の低分子化合物の(Linker）に結合するスペーサーを介して、水不溶性の基材からなる担体に前記低分子化合物が固定化されたことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックス。
本発明にて提示した低分子化合物は、タンパク性物質、特に免疫グロブリンの分離、取り出し、単離、精製、特徴付け、同定または定量のための、有用かつ耐久性に富むリガンドとして使用することができる。また、汎用的で多様性のあるこれらの低分子化合物を使用することによって、タンパク性物質、特に免疫グロブリンの選択的な脱吸着剤の安価な製造が可能となり、工業的な精製へ有利に活用できる。
実施例２におけるBiacore測定実験によって得られた、低分子化合物（２）〜（５）（IgG-Fc結合性低分子化合物）の結合曲線である。 実施例２におけるBiacore測定実験によって得られた、低分子化合物（６）〜（９）（IgG-Fc結合性低分子化合物）の結合曲線である。 実施例２におけるBiacore測定実験によって得られた、低分子化合物（１０）〜（１３）（IgG-Fc結合性低分子化合物）の結合曲線である。 実施例２におけるBiacore測定実験によって得られた、低分子化合物（１４）〜（１７）（IgG-Fc結合性低分子化合物）の結合曲線である。
本明細書中の定義について、以下に記載する。
本発明において使用される低分子化合物は下式（１）：
に示される化合物である。
なお、式中のArXは置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表し、ArYHBはプロトンドナーを有する置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表す。
また、（Linker）は、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいピリミジン（５−ニトロピリミジンなど）、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、もしくは、置換されていてもよいチアゾールを含む構造、または、（Linker）を（-U-CZ-V-）で表したとき、CZが置換されていてもよいベンゼン環を含む構造、もしくは、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子で構成される。
上記（１）式で示された化合物は、タンパク性物質、特に免疫グロブリンの分離、取り出し、単離、精製、特徴付け、同定または定量のための、有用かつ耐久性に富むリガンドとして使用することができる。また、汎用的で多様性のあるこれらの低分子化合物を使用することによって、タンパク性物質、特に免疫グロブリンの選択的な脱吸着剤を安価に製造することが可能となり、工業的な精製へ有利に活用できる。
（１）式で示す構造とタンパク性物質との結合特性の関係については解明されていないが、IgG-Fcと相互作用するプロテインＡ（Protein A）の構造の一部に、隣接したフェニルアラニン−チロシンという構造があり、（１）式において芳香族６員環２つをArX及びArYHBとして含む構造が影響している可能性が考えられる。
以下、(１)式で示されたArX、ArYHB，Linkerについて説明する。
「ArX」は、置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表すが、その置換基の位置、種類、数については特に限定されず、さらには芳香族６員環部分を含む限り、縮環型芳香族構造であってもよく、炭化水素環、複素環のいずれであってもよい。さらに芳香族６員環には、種々の置換基、例えば、ハロゲン基（フッ素基、塩素基、臭素基、ヨウ素基など）、非プロトン性極性基（ニトロ基、ニトリル基、カルボン酸エステル基、スルホン酸エステル基、アルコキシ基など）、プロトンドナー（アミノ基、水酸基、チオール基、カルボン酸基、スルホン酸基など）、炭化水素基（メチル基、エチル基など）などが結合していてもよい。
特に、免疫グロブリンと良好な結合性を示すArXとしては、（ｉ）ハロゲン基（好ましくはフッ素基、塩素基、臭素基など。特にフッ素基、塩素基）、プロトンドナー（好ましくはアミノ基、水酸基）、もしくは、Ｃ1-4炭化水素基（好ましくはメチル基）のいずれかを置換基として有するか、または、（ii）ベンゼン環単位を有する構造、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、もしくは、下式（１８）：
で示される１,２-メチレンジオキシベンゼンのいずれかの構造を有するものが好ましく、（i）（ii）の両方の特徴を備えるものも好ましい。特に好ましいArXは、ベンゼン環、ナフタレン環などの炭化水素環であり、かつ当該炭化水素環にはプロトンドナー（アミノ基、水酸基など）が結合していないものである。
「ArYHB」は、プロトンドナーを有する置換されていてもよい芳香族６員環を表す。プロトンドナーとしては、ArXと同様のものが例示でき、アミノ基、水酸基などが好ましい。プロトンドナー（基）は、芳香族６員環に直接結合していてもよく、芳香族６員環の側鎖に結合していてもよいが、好ましくは芳香族６員環に直接結合する。またArYHBの置換基の種類は特に限定されず、例えばArXと同様のもの（プロトンドナーを除く）が例示でき、その位置、数についても特に限定されない。好ましい置換基は、ハロゲン基（好ましくはフッ素基、塩素基、臭素基など。特に臭素基）である。
また、ArYHBの芳香族６員環は、縮環型芳香族構造であってもよく、環状炭化水素環（ベンゼン環など）の他、例えばピリミジンのような複素芳香族６員環でもよい。好ましい芳香族６員環は、非縮環型の炭化水素環又は複素環である。
特に、免疫グロブリンと良好な結合性を示す構造としては、IgG-Fcと相互作用するプロテインＡの構造の一部にプロトンドナーを有するチロシンが存在することから、プロトンドナーとなる水酸基またはアミノ基が環構造に直接結合している非縮環型の芳香族６員環が好ましい。
「Linker」とは、（１）式において、ArXとArYHBを結合する４〜３０の原子団を意味し、直鎖状、分岐状、環構造のいずれの形態であってもよく、Linker間およびArXとArYHBとの結合の種類も問わない。またLinkerとArX又はArYHBのそれぞれとは、１箇所で結合してもよく、２箇所で結合してもよい。特に、本発明において免疫グロブリンと良好な結合性を示す構造としては、平面性をもち自由な構造をとりにくいという観点から、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいピリミジン（５−ニトロピリミジンなど）、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、置換されていてもよいチアゾールを含む構造、又は（-U-CZ-V-）で表される構造などの環状構造を有するものが好ましい。なお前記CZは、置換されていてもよいベンゼン環、または、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＣＨ2−、−ＣＨＲ−、−ＣＲ2−など。好ましくは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、ＳＯ2−、−ＮＲ−、−ＣＲ2−などの連結鎖上に水素原子が結合していない基。なおＲはメチル基などのアルキル基を含む有機基である）であり、該非水素原子は、１つでもよく、２つ以上（特に２つ）が連続してU又はVを構成してもよい。
また、（１）式で表される低分子化合物は、化学修飾することで、免疫グロブリンとの結合性をさらに向上させることが可能である。
また、先行技術で述べた低分子リガンドについては、抗体以外の成分の非特異吸着が報告されている（J.Chromatogr.A 2007, 1162, 24-33）が、（１）式で示す化合物、特に（６）、（７）、（９）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）式で示される構造は、非特異的な吸着、例えば培養上清中における免疫グロブリン以外の物質との非特異な吸着が抑制できる。これは、ArXおよびArYHB以外に、Linker部分もIgG-Fcとの相互作用に影響を及ぼすことにより、IgG-Fcへの結合能や選択性が向上することが理由の１つと考えられる。
好ましい低分子化合物（１）には、下記化合物（１０１）、（２０１）、（３０１）、（４０１）などが含まれる。
化合物（１０１）は、下記式で表される。
式中、ArX1は前記ArXと同じである。Linker 1は、前記Linkerとして例示の環状構造又は当該環状構造に−Ｓ−が結合した２価の基を示す。Ｒ11は、炭素原子又は酸素原子を表し、炭素原子の場合には、この炭素原子にＲ12が結合している。Ｒ12は、水素原子又はＲ11と環を形成する有機基である。Ｒ13〜Ｒ15は、同一又は異なって、水素原子又はプロトンドナー（特にアミノ基、水酸基）であり、Ｒ13〜Ｒ15のうち少なくとも１つはプロトンドナーである。
好ましいArX1は、ベンゼン環又はナフタレン環などの芳香族炭化水素環である。
好ましいLinker 1は、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジンである。なおLinker 1とArX1とは、直接結合していてもよく、他の結合（例えば、エーテル結合、チオエーテル結合、メチレン鎖、及びこれらの組合せ。好ましくはチオエーテル結合、或いはチオエーテル結合とメチレン鎖からなる結合）を介して結合してもよく、さらにはArX1とLinkerとが２箇所で結合しており、その１箇所では直接結合し、残りの１箇所では他の結合を介して結合してもよい。
Ｒ11とＲ12が環を形成する場合、当該環としては、５又は６員環が好ましく、さらにはテトラデヒドロ−δ−バレロラクトン環が好ましい。
Ｒ13〜Ｒ15は、少なくとも２つがプロトンドナーであるのが好ましく、さらには隣接する２つがプロトンドナーであるのが好ましい。
なお後述する化合物（２）、（３）、（４）、（５）がこの化合物（１０１）の具体例として例示される。
化合物（２０１）は、下記式で表される。
Linker 2は、前記Linkerとして例示の環状構造又は当該環状構造に前記基U、基Vが結合した２価の基を示す。Ｒ21〜Ｒ26は、同一又は異なって、水素原子又はプロトンドナー（特にアミノ基、水酸基）であり、Ｒ24〜Ｒ26のうち少なくとも１つはプロトンドナーである。
好ましいLinker 2は（-U-CZ-V-）、置換されていてもよいピリミジン（特に５−ニトロピリミジン）、置換されていてもよいピリジン（例えば、フッ素原子などのハロゲン原子、パラアミノフェニレンオキシドなどのアルコキシ基で置換されていてもよいピリジン）などである。なお化合物（２０１）では、前記ピリミジン、ピリジンには、それぞれ、基U、基Vが結合している。U, Vは、好ましくは、−Ｏ−、ＳＯ2−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＣＲ2−などの１つ又は２つであり、より好ましくは−Ｏ−、ＳＯ2−、−ＮＲ−、−ＣＲ2−などの１つ又は２つである。また（-U-CZ-V-）のCZは、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、置換ナフタレン環（特に１位と８位が架橋されて５又は６員環を形成する置換ナフタレン環、例えば、１位と８位が−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−で架橋されたナフタレン環）である。
Ｒ21〜Ｒ23は、少なくとも１つがプロトンドナーであることが好ましい。Ｒ21〜Ｒ23のずれかがプロトンドナーであるとき、Ｒ21〜Ｒ23とＲ24〜Ｒ26とは、同じプロトンドナーを有するのが好ましい。
なお後述する化合物（６）、（７）、（８）、（１１）、（１２）がこの化合物（２０１）の具体例として例示される。
化合物（３０１）は、下記式で表される。
式中、Linker 3は前記Linkerとして例示の環状構造を示す。Ｒ31、Ｒ32は、同一又は異なって、前記非水素原子の１つ、又は＝ＣＨ−基を示す。またＲ31が複数存在する場合、それぞれ異なっていてもよい。Ｒ32が複数存在する場合も同様である。ａ、ｂは、０又は１以上の整数である。Ｒ33〜Ｒ38は、同一又は異なって、水素原子、プロトンドナー（特にアミノ基、水酸基）、ハロゲン原子（塩素基、臭素基など）、炭化水素基（特にメチル基）であり、Ｒ36〜Ｒ38のうち少なくとも１つはプロトンドナーである。
好ましいLinker 3は、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいチアゾールなどである。好ましい（Ｒ31）a、（Ｒ32）bは、−ＣＨ2−、＝ＣＨ−、−ＳＯ2−、−Ｎ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−Ｓ−などである。
なお後述する化合物（９）、（１０）、（１４）、（１６）がこの化合物（３０１）の具体例として例示される。
化合物（４０１）は、下記式で表される。
式中、Linker 4及びLinker 5は、前記Linkerとして例示の環状構造を示す。Ｒ41は、前記非水素原子の１つを示す。ｃは０又は１であり、ｄ及びｅは、いずれか一方が１で他方が０である。Ｒ42〜Ｒ49は、同一又は異なって、水素原子、プロトンドナー（特にアミノ基、水酸基）、ハロゲン原子（特にフッ素基）、炭化水素基（特にメチル基）、アルコキシ基であり、Ｒ42〜Ｒ44のうちの２つがつながって環を形成してもよく、Ｒ47〜Ｒ48のうちの２つがつながって環を形成してもよい。なおＲ47〜Ｒ49のうち少なくとも１つはプロトンドナーである。
好ましいLinker 4及びLinker 5は、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいピロール（特にジメチルピロール）である。好ましいＲ41は−ＣＨ2−である。
なお後述する化合物（１３）、（１５）、（１７）がこの化合物（４０１）の具体例として例示される。
本発明の低分子化合物は、下式（２）〜（１７）：
で示される構造に代表される。
なお、各式におけるArX, ArYHB, (Linker)は、以下の通りである。
（２）ArX＝ベンゼン環、ArYHB＝水酸基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、
（３）ArX＝ベンゼン環、ArYHB＝水酸基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、
（４）ArX＝ベンゼン環、ArYHB＝水酸基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝トリアゾール、
（５）ArX＝ナフタレン環、ArYHB＝水酸基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝１，３，４−チアジアゾール、
（６）ArX＝水酸基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝水酸基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝ベンゼン環、
（７）ArX＝水酸基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝水酸基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝ニトロピリミジン、
（８）ArX＝アミノ基を置換基として有している芳香族６員環、ArYHB＝アミノ基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝ベンゼン環、
（９）ArX＝ハロゲン基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝水酸基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝ヒダントイン、
（１０）ArX＝ベンゼン環、ArYHB＝水酸基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝チアゾール、
（１１）ArX＝水酸基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝水酸基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝置換されたナフタレン環、
（１２）ArX＝アミノ基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝アミノ基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝ピリジン、
（１３）ArX＝ハロゲン基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝水酸基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝テトラゾール、
（１４）ArX＝ベンゼン環、ArYHB＝水酸基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝チアゾール、
（１５）ArX＝メチル基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝水酸基が結合した芳香族６員環、(Linker)＝テトラゾール、
（１６）ArX＝メチル基を置換基として有する芳香族６員環、ArYHB＝アミノ基が結合した、置換されている芳香族６員環、(Linker)＝チアゾール、
（１７）ArX＝（１８）式を含む構造、ArYHB＝アミノ基が結合したピリミジン（複素芳香族６員環）、(Linker)＝ピロール。
本発明における低分子化合物としては、化合物（１０１）、化合物（２０１）などが特に好ましく、この化合物（２０１）は、Linker 2が置換されていてもよいベンゼン環又は置換されていてよいピリミジン環に基U、基Vが結合したものであるのが好ましい。最も好ましい低分子化合物は、化合物（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）である。これら好ましい低分子化合物は、IgG-Fcとの結合能が特に高い。
本発明は、免疫グロブリンのFc領域に対する高い親和性を利用した、（１）式に示す低分子化合物のタンパク性物質低分子化合物としての様々な使用方法にも関する。
なお、本発明における「タンパク性物質」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を指し、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖を含めてタンパク性物質と定義する。このタンパク性物質としては、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、モノクロナール抗体、免疫グロブリンのFc領域（IgG-Fc)を含むタンパク質、Fc融合タンパク質などが含まれる。これらのタンパク性物質は、細胞培養中に含まれていても良い。
なお、抗体の立体構造はすでに既知であるので、タンパク質工学的に立体構造を保持した上で、Fab領域やFc領域にさらなる改変（断片化など）を施すことは可能であり、Fab領域、および、Fc領域を、不足なく含有する免疫グロブリン分子、または、その誘導体に限定されるものではない。
したがって、「免疫グロブリンのFc領域(IgG-Fc)を含むタンパク質」とは、Fc領域側の部位を含むタンパク質のことであり、該低分子化合物が結合できれば、Fc領域を完全に保持している必要はない。また、Fc領域を有するものであれば、合成等によって得られたFc領域融合化合物、Fc領域融合無機化合物などでも良い。
免疫グロブリンに対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたBiacoreシステム(GEヘルスケア社)などのバイオセンサーや、結合によって生じる発熱・吸熱変化を検出する等温滴定型カロリメータ(ITC)などの、生体分子間相互作用検出・解析装置によって評価できる。
本発明には、上記低分子化合物の特性を利用したアフィニティーリガンドも含まれる。すなわち、該リガンド（低分子化合物）の(Linker）部分を、スペーサーを介して、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックスも本発明に含まれる。
「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指し、本発明においては、特に、免疫グロブリンに対して特異的に結合する上記式（１）の低分子化合物を指す。
本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」を意味する。
本発明に用いる、水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリウレタンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。
上記水不溶性担体は、市販品を用いることができ、例えば、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S-1000、アクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharose CL4B、および、セルロース系の架橋担体であるCellufineなどが挙げられる。
本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法としては、例えば、低分子化合物の(Linker)にアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を有するスペーサー分子を導入し、従来のカップリング法で担体に結合することができる。
前記「スペーサー」とは、より詳細には、上記低分子化合物とマトリックスとを結合させる分子を指し、例えばアミノ基、カルボキシル基、エーテル基、チオエーテル基などの反応性官能基を有する化合物が挙げられる。
また、スペーサー分子は複数の原子から構成されていてもよい。
カップリング法としては、例えば、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する低分子化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、または、担体とリガンドとして固定化する低分子化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、もしくは、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法などが挙げられる。
したがって、リガンドとして用いられる本発明の低分子化合物に対しては、担体を化学修飾して固定化しても良いし、固定化に有用なスペーサー分子を導入しても良い。本発明の本質は、低分子化合物をリガンドとして固定化したマトリックスにおいても低分子化合物の機能が同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように低分子化合物を修飾・改変しようが、本発明の範囲に含まれる。
本発明により見出された低分子化合物を水不溶性担体に固定化した上記アフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのFc領域(IgG-Fc)を含む抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離・精製・特徴付けすることが可能となる。
ここで、「抗体誘導体」とは、例えば、ヒトIgGの一部のドメインを他生物種のIgG抗体のドメインに置き換えて融合させたキメラ抗体や、ヒトIgGのCDR部分を他生物種抗体のCDR部分に置き換えて融合させたヒト型化抗体が挙げられ、「断片抗体」とは、例えば、ヒトIgGのFc領域(IgG-Fc)のみからなるタンパク質が挙げられ、「断片抗体誘導体」とは、例えば、ヒトIgGのFv領域とFc領域とを融合させた人工抗体が挙げられる。
これらの抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体の精製法は、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる（Roque A.C.A. 他、Journal of Chromatography A、2007年、1160号、44-55頁）。
すなわち、抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を吸着させる。
次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。
次いで、適切なpHに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。
同様の手法にて、本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着する抗体、抗体誘導体、断片抗体、および、断片抗体誘導体は、IgG-Fcを有するとの特徴づけが可能となる。
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド（低分子化合物）や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
本発明の低分子化合物をリガンドとして利用した場合、タンパク質、例えばプロテインＡをリガンドとして利用するよりもリガンドの化学的安定性が高まることが予想される。ここで化学的安定性とは、低分子化合物の機能を保持する性質を意味する。
本発明においては、「低分子化合物の機能を保持する」とは、免疫グロブリンのFc領域(IgG-Fc)への親和性を保持すること指すものであり、すなわち、リガンドの「化学的安定性」が高い程、種々の化学的処理を行っても免疫グロブリンのFc領域(IgG-Fc)への親和性が低下する度合いが小さい。
本願は、２０１１年３月２４日に出願された日本国特許出願第２０１１−０６６５８９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１１年３月２４日に出願された日本国特許出願第２０１１−０６６５８９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
（実施例１）
ヒト血漿由来Fcフラグメントの調製
本発明における「Fc領域への親和性」については、免疫グロブリンのFab領域を含まないFcフラグメントを用いて調べた。ヒト血漿由来IgG製剤を原料として、これをパパインによってFabフラグメントとFcフラグメントに断片化し、Fcフラグメントのみを分離精製することでFcフラグメントを調製した。ヒト血漿由来IgG製剤のガンマガード（バクスター社製）を、パパイン消化用緩衝液（0.1 M AcOH-AcONa、2 mM EDTA、1 mM システイン、pH 5.5）に溶解し、Papain Agarose from papaya latex（パパイン固定化アガロース、SIGMA社製）を添加し、ローテーターで混和させながら、37℃で約8時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（FabフラグメントとFcフラグメントが混在）から、Protein Aカラム（MabSelect, GEヘルスケア社製）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、Fcフラグメント（以後、IgG-Fcと表記する）を分離精製した。具体的には、リン酸緩衝液（20 mM NaH2PO4-Na2HPO4, 150mM NaCl, pH 7.4）で、pH 7.4に近くなるよう希釈した反応溶液(FabフラグメントとFcフラグメントが混在)を、リン酸緩衝液にて平衡化したProtein Aカラムに添加し、リン酸緩衝液で洗浄後、溶出緩衝液B（100 mM クエン酸, pH 3.0）を利用し溶出されるIgG-Fcを分取し、IgG-Fc溶液を得た。なおクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、AKTAprime plusシステム（GEヘルスケア社製）を利用して実施した。
（実施例２）
低分子化合物のIgG-Fcとの親和性の解析
低分子化合物とIgG-Fcとの親和性の解析は表面プラズモン共鳴を利用したBiacore 3000（GEヘルスケア社製）を用いて、以下の様にして実施した。なお以下で用いたセンサーチップや試薬は全てGEヘルスケア社製である。またIgG-Fcとの結合力の評価を行った低分子化合物（２）〜（１７）はナミキ商事から入手した。
実施例１で得たIgG-Fcを固定化用緩衝液(10mM CH3COOH-CH3COONa, pH 4.5)で50倍に希釈し、Biacore3000付属のプロトコルに従い、IgG-FcをセンサーチップCM5に固定した。IgG-FcのセンサーチップCM5への固定化は、N-hydroxysuccinimide (NHS)、および、N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochroride(EDC)を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはEthanolamineを用いた。また、チップ上の別のフローセルに対して、EDC/NHSにより活性化した後にEthanolamineを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。
各種低分子化合物（２）〜（１７）のいずれか１つからなるリガンドを、前記センサーチップ上に流して相互作用を検出した。具体的には、まず測定する各種低分子化合物（２）〜（１７）について、ランニング緩衝液（20 mM NaH2PO4-Na2HPO4、150 mM NaCl、0.005 % P-20、5% DMSO, pH 7.4）を用いて、各々について濃度が異なる希釈溶液を25μM〜100μMの範囲内で3もしくは4種類を調製した。調製した各々の低分子化合物溶液を、流速30μL/minで120秒間センサーチップに添加した。測定温度25℃にて、添加時（結合相、120秒間）、および、添加終了後（解離相、120秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、40 mM NaOHを15秒間添加して、センサーチップを再生した。得られた結合曲線に対して、GEヘルスケア社製のBiacore補正ツールを用いて、DMSOを含むサンプルの結合反応曲線の補正を行った（図１〜４参照）（図中、横軸のＳは検出（測定）時間の経過（sec）を示し、縦軸のＲＵは検出強度を示す）。補正した結合反応曲線に対して、システム付属ソフトBIA evaluationを用いた1:1の結合モデルによるフィッティング解析を行い、結合定数（KA = kon / koff）を算出した。結果を表１に示す。
表１に示すように、各種低分子化合物（２）〜（１７）のIgG−Fcに対する結合定数KAは、103〜104M-1程度であり、IgG-Fcとの強い結合性を示す結果が得られた。

Claims (8)

  1. 化合物（１０１）：
    （式中、
    ArX1は、置換されていてもよい芳香族６員環を含む構造を表し、
    Linker 1は、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、置換されていてもよいチアゾール、もしくはニトロピリミジンを含む構造であるか、（-U-CZ-V-）（式中、CZが置換されていてもよいベンゼン環を含む構造、もしくは、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子を表す）、或いは、これら構造に−Ｓ−が結合した２価の基を表し、
    Ｒ 11 は、炭素原子又は酸素原子を表し、炭素原子の場合には、この炭素原子にＲ 12 が結合しており、
    Ｒ 12 は、水素原子又はＲ 11 と環を形成する有機基であり、
    Ｒ 13 〜Ｒ 15 は、同一又は異なって、水素原子又はプロトンドナーであり、Ｒ 13 〜Ｒ 15 のうち少なくとも１つはプロトンドナーである）、
    化合物（２０１）：
    （式中、
    Linker 2は、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、置換されていてもよいチアゾール、もしくはニトロピリミジンを含む構造であるか、（-U-CZ-V-）（式中、CZが置換されていてもよいベンゼン環を含む構造、もしくは、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子を表す）、或いは、これら構造に基U、基Vが結合した２価の基を表し、
    Ｒ 21 〜Ｒ 26 は、同一又は異なって、水素原子又はプロトンドナーであり、Ｒ 24 〜Ｒ 26 のうち少なくとも１つはプロトンドナーである）、
    化合物（３０１）：
    （式中、
    Linker 3は、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、置換されていてもよいチアゾール、もしくはニトロピリミジンを含む構造であるか、或いは（-U-CZ-V-）（式中、CZが置換されていてもよいベンゼン環を含む構造、もしくは、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子を表す）を表し、
    Ｒ 31 、Ｒ 32 は、同一又は異なって、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ 2 −、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＣＨ 2 −、−ＣＨＲ−又は−ＣＲ 2 −から選択される非水素原子の１つ（式中、Ｒはアルキル基を含む有機基を表す）、又は＝ＣＨ−基を示し、またＲ 31 が複数存在する場合、それぞれ異なっていてもよく、Ｒ 32 が複数存在する場合も同様であり、
    ａ、ｂは、０又は１以上の整数であり、
    Ｒ 33 〜Ｒ 38 は、同一又は異なって、水素原子、プロトンドナー、ハロゲン原子、炭化水素基であり、Ｒ 36 〜Ｒ 38 のうち少なくとも１つはプロトンドナーである）、
    または、
    化合物（４０１）：
    （式中、
    Linker 4及びLinker 5は、同一又は異なって、置換されていてもよいテトラゾール、置換されていてもよいヒダントイン、置換されていてもよいピロール、置換されていてもよいピリジン、置換されていてもよい１,３,４-チアジアゾール、置換されていてもよいトリアゾール、置換されていてもよいアミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、置換されていてもよいチアゾール、もしくはニトロピリミジンを含む構造であるか、或いは（-U-CZ-V-）（式中、CZが置換されていてもよいベンゼン環を含む構造、もしくは、置換されていてもよいナフタレン環を含む構造であり、UおよびVは、いずれも環構造を含まない非水素原子を表す）を表し、
    Ｒ 41 は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ 2 −、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＣＨ 2 −、−ＣＨＲ−又は−ＣＲ 2 −から選択される非水素原子の１つ（式中、Ｒはアルキル基を含む有機基を表す）を示し、
    ｃは０又は１であり、
    ｄ及びｅは、いずれか一方が１で他方が０であり、
    Ｒ 42 〜Ｒ 49 は、同一又は異なって、水素原子、プロトンドナー、ハロゲン原子、炭化水素基、アルコキシ基であり、Ｒ 42 〜Ｒ 44 のうちの２つがつながって環を形成してもよく、Ｒ 47 〜Ｒ 48 のうちの２つがつながって環を形成してもよく、Ｒ 47 〜Ｒ 49 のうち少なくとも１つはプロトンドナーであり、
    Ｚ 1 及びＺ 2 は、＝ＣＨ−又は＝Ｎ−である）、
    の、IgG-Fcを含むタンパク質結合性低分子化合物またはFc融合タンパク質結合性低分子化合物としての使用。
  2. 前記プロトンドナーが水酸基またはアミノ基であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
  3. 前記低分子化合物におけるArXが、ハロゲン基、アミノ基、水酸基、もしくは、メチル基のいずれかを置換基として有するか、または、ArXが、ベンゼン環、ナフタレン環、もしくは、１,２-メチレンジオキシベンゼンのいずれかを含む構造を有するか、或いはそれらの両方であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
  4. 前記低分子化合物が、以下の構造式で示される化合物（２）〜（１７）：
    のいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
  5. IgG-Fcを含むタンパク質またはFc融合タンパク質が、免疫グロブリン、または、免疫グロブリンのFc領域を含む断片であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
  6. IgG-Fcを含むタンパク質またはFc融合タンパク質が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
  7. IgG-Fcを含むタンパク質またはFc融合タンパク質が細胞培養物中に含まれることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
  8. 請求項１〜７のいずれかに記載の使用で用いられる化合物（１０１）、化合物（２０１）、化合物（３０１）または化合物（４０１）の（Linker 1）〜（Linker 5）のいずれかに結合するスペーサーを介して、水不溶性の基材からなる担体に前記化合物（１０１）、化合物（２０１）、化合物（３０１）または化合物（４０１）が固定化されたことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックス。
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