JP6032737B2 - Method for detecting bifidobacteria - Google Patents
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Description
本発明は、ビフィズス菌の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting bifidobacteria.
Bifidobacterium bifidum OLB6378(ビフィズス菌OLB6378)は、乳幼児に由来するビフィズス菌の中から、IgA産生刺激活性を指標に選抜された菌株であり（特許文献１）、乳幼児用プロバイオティクスとしての利用が期待されている。当該ビフィズス菌OLB6378は、腸管上皮細胞などの粘膜上皮細胞からの分泌成分の産生を誘導し、かつ、パイエル板細胞をはじめとする粘膜関連リンパ組織におけるIgA産生を高レベルに誘導することが知られている（特許文献１）。また、ビフィズス菌OLB6378は、腸管における主要な抗菌物質であるβ-ディフェンシンの発現を増強し、腸管上皮細胞からのIgA分泌促進因子であるpIgRの産生促進作用も有する（非特許文献１、２）ことから、腸管の感染防御に有効であり、極めて安全性が高いことも確認されている。そこで、当該菌株を用いた乳幼児への介入試験が実施されており、被験者の糞便中に存在するビフィズス菌OLB6378の菌数を測定することが求められている。 Bifidobacterium bifidum OLB6378 (Bifidobacterium OLB6378) is a strain selected from among bifidobacteria derived from infants using IgA production stimulating activity as an index (Patent Document 1), and is expected to be used as probiotics for infants ing. The Bifidobacterium OLB6378 is known to induce the production of secretory components from mucosal epithelial cells such as intestinal epithelial cells and to induce high levels of IgA production in mucosal-related lymphoid tissues including Peyer's patch cells. (Patent Document 1). Bifidobacteria OLB6378 also enhances the expression of β-defensin, which is a major antibacterial substance in the intestine, and also has the effect of promoting the production of pIgR, an IgA secretion promoting factor from intestinal epithelial cells (Non-Patent Documents 1 and 2) Therefore, it has been confirmed that it is effective in protecting the intestinal tract and is extremely safe. Therefore, an intervention test for infants using the strain has been carried out, and it is required to measure the number of Bifidobacterium OLB6378 in the stool of the subject.
ビフィズス菌OLB6378の菌数測定方法として、例えば、特許文献２には、凍結乾燥菌末中の生菌数を測定した試験例が記載されている。当該方法は、ビフィズス菌培養に通常用いられる培地であるＢＬ寒天培地で培養する方法である。 As a method for measuring the number of Bifidobacterium OLB6378, for example, Patent Document 2 describes a test example in which the number of viable bacteria in a lyophilized powder is measured. This method is a method of culturing on a BL agar medium, which is a medium usually used for bifidobacteria culture.
しかしながら、例えば糞便中にはビフィズス菌OLB6378以外のビフィズス菌も含まれているので、前記ＢＬ寒天培地はもとより、Bifidobacterium属の細菌を選択的に培養し得る選択培地、例えばＴＯＳプロピオン酸寒天培地を用いたとしても、ビフィズス菌OLB6378のみを選択的に培養できず、また、コロニーの形状や色などの形態を加味したとしてもビフィズス菌OLB6378のみの菌数を測定することができない。 However, for example, since feces include bifidobacteria other than bifidobacteria OLB6378, not only the BL agar medium but also a selective medium that can selectively cultivate bacteria of the genus Bifidobacterium, such as a TOS propionic acid agar medium, is used. Even if only Bifidobacterium OLB6378 cannot be cultured selectively, the number of Bifidobacterium OLB6378 alone cannot be measured even if the shape such as the shape and color of the colony is taken into consideration.
特許文献３や特許文献４には、RAPD-PCR（Random Amplified Polymorphic DNA-PCR）により、目的とする菌種の乳酸菌であるかどうかを判別する方法が開示されている。しかしながら、当該方法は定量的な方法とは言えず、菌数の検出には適切な方法とは言えない。また、当該方法はPCRによる増幅と増幅産物の電気泳動による確認という２工程が必要であり、簡便な方法であるとは言えなかった。そして、特許文献３や特許文献４に記載の方法はそれぞれビフィズス菌OLB6378以外の細菌を対象とするものであり、ビフィズス菌OLB6378を選択的に検出する方法ではない。 Patent Document 3 and Patent Document 4 disclose a method for determining whether or not a lactic acid bacterium is a target bacterial species by RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-PCR). However, this method is not a quantitative method and is not an appropriate method for detecting the number of bacteria. In addition, this method requires two steps of amplification by PCR and confirmation of the amplification product by electrophoresis, and it cannot be said that it is a simple method. The methods described in Patent Document 3 and Patent Document 4 are intended for bacteria other than Bifidobacterium OLB6378, and are not methods for selectively detecting Bifidobacterium OLB6378.
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、簡便な方法により、糞便など種々のビフィズス菌が存在することが想定される検体からビフィズス菌OLB6378を選択的に検出し、また定量的に把握する方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above background art, and an object of the present invention is to selectively detect Bifidobacterium OLB6378 from a sample in which various bifidobacteria such as feces are assumed to exist by a simple method. And to provide a method of quantitatively grasping.
本発明の検出方法は、配列番号１に記載された塩基配列からなる核酸及び配列番号２に記載された塩基配列からなる核酸をプライマーセットとしてPCR法を適用して、ビフィズス菌OLB6378を選択的に検出し、又は定量的PCR法を適用して検体中のビフィズス菌OLB6378の菌数を測定する方法である。 The detection method of the present invention selectively applies bifidobacteria OLB6378 by applying a PCR method using a nucleic acid consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 as a primer set. In this method, the number of Bifidobacteria OLB6378 in the sample is measured by detecting or applying a quantitative PCR method.
本発明によると、糞便など種々のビフィズス菌が存在することが想定される検体からでもビフィズス菌OLB6378の存否を確実に把握し、又は検体に存在する菌数を迅速かつ正確に把握できる。 According to the present invention, the presence / absence of bifidobacteria OLB6378 can be ascertained even from a sample in which various bifidobacteria such as feces are assumed to exist, or the number of bacteria present in the sample can be grasped quickly and accurately.
本発明に係る検出方法は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸をプライマー（プライマーセット）としてPCR法を適用し、検体（被験物質）中のビフィズス菌OLB6378を選択的に検出し、又は検体中のビフィズス菌OLB6378の菌数を測定する方法である。 In the detection method according to the present invention, a PCR method is applied using a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a primer (primer set), and in a sample (test substance) In this method, the Bifidobacterium OLB6378 is selectively detected or the number of Bifidobacterium OLB6378 in the sample is measured.
本発明において「PCR」とは当業者に通常用いられる意味で用いられ、目的とする核酸を増幅する手段である。本発明においては、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸がプライマーセットとして用いられる。両プライマーを用いてPCRを適用すると、ビフィズス菌OLB6378が存在した場合にはビフィズス菌OLB6378に特有の約480bpsのDNA断片が増幅される。このDNA断片は、ビフィズス菌OLB6378が存在した場合にのみ増幅され、ビフィズス菌OLB6378が存在しない場合にはその他のビフィズス菌やその他の乳酸菌、その他の菌が存在しているとしても、この約480bpsのDNA断片は増幅されず検出されない。 In the present invention, “PCR” is used in the meaning usually used by those skilled in the art, and is a means for amplifying a target nucleic acid. In the present invention, a nucleic acid consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are used as the primer set. When PCR is applied using both primers, a DNA fragment of about 480 bps unique to Bifidobacterium OLB6378 is amplified when Bifidobacterium OLB6378 is present. This DNA fragment is amplified only in the presence of Bifidobacterium OLB6378, and in the absence of Bifidobacterium OLB6378, even if other Bifidobacterium, other lactic acid bacteria, and other bacteria are present, this DNA fragment of about 480 bps DNA fragments are not amplified and are not detected.
すなわち、本発明の検出方法は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸をプライマーとして前記約480bpsのDNA断片をPCRにより増幅させ、増幅された該DNA断片を検出することによって、ビフィズス菌OLB6378の存否及びビフィズス菌OLB6378の存在量を検出する方法である。 That is, in the detection method of the present invention, the DNA fragment of about 480 bps was amplified by PCR using a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as primers, and amplified. In this method, the presence or absence of bifidobacteria OLB6378 and the abundance of bifidobacteria OLB6378 are detected by detecting the DNA fragment.
本発明における検出対象であるビフィズス菌OLB6378は、例えば特許文献１に開示された方法により取得される菌株であり、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号NITE P-31として寄託されている菌株又はこれに分類されるビフィズス菌である。 Bifidobacteria OLB6378, which is a detection target in the present invention, is a strain obtained by the method disclosed in Patent Document 1, for example, and is an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan). 1 strain 1 is the strain deposited as the deposit number NITE P-31 at the center 6) or bifidobacteria classified into this strain.
本発明において、「選択的に検出する」とは、検体中にビフィズス菌OLB6378が存在するかどうかを検出することを意味し、「選択的に検出する」場合として、ビフィズス菌OLB6378のみが存在することが既知である検体中からビフィズス菌OLB6378を検出する場合だけでなく、ビフィズス菌OLB6378の他に、ビフィズス菌OLB6378以外のビフィズス菌が存在することが既知である検体中から、ビフィズス菌OLB6378を検出する場合や、ビフィズス菌の存否や存在するビフィズス菌の種類が不明であるが、ビフィズス菌OLB6378をはじめとするビフィズス菌の存在が想定される検体中から、ビフィズス菌OLB6378を検出する場合があり得る。 In the present invention, “selectively detecting” means detecting whether or not Bifidobacterium OLB6378 is present in the sample. In the case of “selectively detecting”, only Bifidobacterium OLB6378 is present. In addition to detecting bifidobacteria OLB6378 in samples that are already known, Bifidobacteria OLB6378 is detected from samples in which bifidobacteria other than bifidobacteria OLB6378 are known in addition to bifidobacteria OLB6378 The presence or absence of bifidobacteria and the type of bifidobacteria are unknown, but bifidobacteria OLB6378 may be detected from samples that are expected to contain bifidobacteria such as bifidobacteria OLB6378. .
本発明において、定量的に測定するとは、検体中に存在するビフィズス菌OLB6378の存在量を測定することを意味し、「選択的かつ定量的に測定する」場合として、ビフィズス菌OLB6378のみが存在することが既知である検体中からビフィズス菌OLB6378の存在量を測定する場合だけでなく、ビフィズス菌OLB6378の他に、ビフィズス菌OLB6378以外のビフィズス菌が存在することが既知である検体中から、ビフィズス菌OLB6378の存在量を検出する場合や、ビフィズス菌の存否や存在するビフィズス菌の種類が不明であるが、ビフィズス菌OLB6378をはじめとするビフィズス菌の存在が想定される検体中における、ビフィズス菌OLB6378の存在量を測定する場合があり得る。 In the present invention, quantitative measurement means measuring the abundance of Bifidobacterium OLB6378 present in the specimen, and in the case of “selectively and quantitatively measuring”, only Bifidobacterium OLB6378 is present. Not only when measuring the abundance of bifidobacteria OLB6378 from a sample with known bifidobacteria OLB6378, but also bifidobacteria When detecting the abundance of OLB6378, the presence or absence of bifidobacteria and the type of bifidobacteria present are unknown, but the presence of bifidobacteria OLB6378 in the sample where bifidobacteria such as bifidobacteria OLB6378 are expected There may be cases where the abundance is measured.
本発明において対象となる検体は、特に制約されるものではないが、好ましくはビフィズス菌、特にビフィズス菌OLB6378の存在が想定される検体である。当該検体は、例えば、ヨーグルトやチーズなどの乳製品であり、乳酸菌飲料であり、乳酸菌タブレットのような乳酸菌を含む飲食品であり得る。また、抗アレルギー剤や乳酸菌製剤のような乳酸菌を含む医薬品であり、さらには前記のようにビフィズス菌、特にビフィズス菌OLB6378を摂取した動物（ヒトを含む）などの糞便などの***物でもあり得る。 The sample to be used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a sample in which the presence of bifidobacteria, particularly bifidobacteria OLB6378 is assumed. The sample is, for example, a dairy product such as yogurt or cheese, a lactic acid bacteria beverage, and a food or drink containing lactic acid bacteria such as a lactic acid bacteria tablet. Further, it is a medicine containing lactic acid bacteria such as antiallergic agents and lactic acid bacteria preparations, and may also be excrement such as feces of animals (including humans) ingesting bifidobacteria, especially bifidobacteria OLB6378 as described above .
検体によってはそのままPCRを適用することが可能な場合もあるが、多くの場合、これらの検体には、PCRを適用するために必要な前処理が施される。前処理は、通例、検体中に存在する細菌から核酸、特にDNAを抽出する工程を含み、場合によっては検体中から細菌を取り出す工程や細菌から抽出したDNAを精製する工程を含む。これらの前処理には、当業者により検体に適切な方法が適宜選択され得る。 Although it may be possible to apply PCR as it is depending on the sample, in many cases, these samples are subjected to pretreatment necessary for applying PCR. The pretreatment usually includes a step of extracting nucleic acid, particularly DNA, from bacteria present in the specimen, and in some cases, includes a step of removing bacteria from the specimen and a step of purifying DNA extracted from the bacteria. For these pretreatments, a person skilled in the art can appropriately select a method suitable for the specimen.
PCRは前処理して得られたサンプル（または検体）中の核酸を増幅する方法であって、PCRの条件は適宜当業者により決定され得る。PCRにより増幅された増幅産物中に前記約480bpの核酸が検出されると、ビフィズス菌OLB6378が存在していると判断し得る。また、増幅された前記約480bpの核酸を定量することで、検体中に存在するビフィズス菌OLB6378の菌数を測定し得る。 PCR is a method of amplifying nucleic acid in a sample (or specimen) obtained by pretreatment, and PCR conditions can be appropriately determined by those skilled in the art. If the nucleic acid of about 480 bp is detected in the amplification product amplified by PCR, it can be determined that Bifidobacterium OLB6378 is present. Further, by quantifying the amplified nucleic acid of about 480 bp, the number of Bifidobacteria OLB6378 existing in the specimen can be measured.
増幅産物中に存在する約480bpの核酸を検出する方法は公知であり、その方法は特に制約されるものではない。例えば、PCR適用後の増幅産物を電気泳動することにより検出する方法が例示される。また、前処理して得られたサンプルに定量的PCR法を適用して、その増幅曲線のカーブから検出する方法が例示される。また、前処理して得られたサンプルに定量的PCR法を適用してＣｔ値（Threshold Cycle）を求め、菌数が既知である検体から測定されたＣｔ値との対比を行うことによって検体中に存在するビフィズス菌OLB6378の存在量（菌数）を測定する方法が例示される。 A method for detecting an about 480 bp nucleic acid present in the amplification product is known, and the method is not particularly limited. For example, a method of detecting an amplified product after application of PCR by electrophoresis is exemplified. Moreover, the method of detecting from the curve of the amplification curve by applying the quantitative PCR method to the sample obtained by the pretreatment is exemplified. In addition, a quantitative PCR method is applied to a sample obtained by pretreatment to obtain a Ct value (Threshold Cycle), and the sample is compared with a Ct value measured from a sample with a known number of bacteria. Is exemplified by a method for measuring the abundance (the number of bacteria) of bifidobacteria OLB6378 present in the above.
定量的PCR法はPCRの一方法であり、PCRによる核酸の増幅と増幅された核酸の検出を同時に行う方法であって、公知の方法である。当該方法は迅速に測定できる点から好ましい方法である。定量的PCR法における増幅条件や、増幅された核酸の検出方法や検出条件は適宜当業者により決定され得る。 The quantitative PCR method is a method of PCR, and is a method of performing amplification of nucleic acid by PCR and detection of the amplified nucleic acid at the same time, and is a known method. This method is a preferable method because it can be measured quickly. The amplification conditions in the quantitative PCR method and the detection method and detection conditions of the amplified nucleic acid can be appropriately determined by those skilled in the art.
本発明ではビフィズス菌OLB6378に特有の核酸を増幅させることができるプライマーセットが用いられるので、簡単な手法であるPCR、特に定量的PCR法を適用することによって、多種類のビフィズス菌を含む検体中におけるビフィズス菌OLB6378の存否を検出し、また、その存在量を検出することができる。特に定量的PCR法は短時間で結果が判明するので、治療等の目的で乳幼児に投与した場合には、ビフィズス菌OLB6378の投与による効果をほぼリアルタイムに近い状況で把握することができる。 In the present invention, a primer set capable of amplifying a nucleic acid peculiar to bifidobacteria OLB6378 is used. Therefore, by applying a simple technique, particularly a quantitative PCR method, in a sample containing many types of bifidobacteria. The presence or absence of bifidobacteria OLB6378 can be detected, and the abundance thereof can be detected. In particular, since the quantitative PCR method reveals the results in a short time, when administered to an infant for the purpose of treatment or the like, the effect of administration of Bifidobacterium OLB6378 can be grasped in a nearly real-time situation.
次に本発明について下記の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。なお、下記の実施例はあくまでも実施例にすぎず、本発明は以下の実施例に限定されないのは言うまでもない。 Next, the present invention will be described in more detail based on the following examples. In addition, the following Example is only an Example to the last, and it cannot be overemphasized that this invention is not limited to the following Example.
（プライマーセットの決定）
まず、RAPD-PCRによりB. bifidum OLB6378において特異的に増幅されるDNA産物について検討した。43株のB. bifidum（表１参照）をGAM培地に接種し、37℃で18時間嫌気培養した。DNAの抽出には、QIAamp DNA stool Mini Kit(Qiagen)を用いた。抽出方法は、ジルコニアビーズを用いた以外は付属のプロトコルに従った。集菌した菌にASL溶解バッファー及びジルコニアビーズを添加し、TissueLyser(Qiagen)で細胞を破砕した。また、抽出したDNAを、QIAcube(Qiagen)を用い付属のプロトコルに従って精製した。抽出したDNAは水に懸濁し、NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific Inc.)によってDNA濃度を測定した。
(Determination of primer set)
First, DNA products specifically amplified in B. bifidum OLB6378 by RAPD-PCR were examined. 43 strains of B. bifidum (see Table 1) were inoculated into GAM medium and cultured anaerobically at 37 ° C. for 18 hours. QIAamp DNA stool Mini Kit (Qiagen) was used for DNA extraction. The extraction method followed the attached protocol except that zirconia beads were used. ASL lysis buffer and zirconia beads were added to the collected bacteria, and the cells were disrupted with TissueLyser (Qiagen). The extracted DNA was purified using QIAcube (Qiagen) according to the attached protocol. The extracted DNA was suspended in water, and the DNA concentration was measured by NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific Inc.).
12塩基長の57種のRAPDプライマー(BEX common primers)と10塩基長の40種のRAPDプライマー(ツクバカスタムオリゴサービス)をRAPD-PCRに供した。10ngの上記精製したDNA（テンプレートDNA）、10pmolのRAPDプライマー、250μMのdNTP、1unitのEx Taq DNAポリメラーゼ(タカラ)を混合し、GeneAmp PCR system 9700(ABI)を用いて増幅を行った。PCRプログラムは、95℃で5分、(95℃で30秒+35℃で30秒+72℃で30秒)を40サイクル、72℃で7分の最終伸長反応とした。増幅したPCR産物は1.5％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によりバンドを検出した。その結果を図１に示す。 57 types of 12-base long RAPD primers (BEX common primers) and 40 types of 10-base RAPD primers (Tsukuba Custom Oligo Service) were subjected to RAPD-PCR. 10 ng of the purified DNA (template DNA), 10 pmol of RAPD primer, 250 μM dNTP, and 1 unit of Ex Taq DNA polymerase (Takara) were mixed and amplified using GeneAmp PCR system 9700 (ABI). The PCR program was a final extension reaction at 95 ° C. for 5 minutes, (95 ° C. for 30 seconds + 35 ° C. for 30 seconds + 72 ° C. for 30 seconds) for 40 cycles and 72 ° C. for 7 minutes. The amplified PCR product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, and the band was detected by ethidium bromide staining. The result is shown in FIG.
この結果、BEX common primerの中のC89 (5′-TCC CAC GTT TGG-3′)を用いた場合に、43株のB. bifidumの中でOLB6378に特異的な1074bpのバンドが検出された（図１のLane1）。このバンドのRAPD断片を、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GE Healthcare)を用いて精製し、pGEM-TとpGEM-T Easy Vector Systems(Promega)を用いてクローニングした。リコンビナントのベクターはDH5ocに形質転換し、plasmidPrep Mini Spin Kit(GE healthcare)を用いてプラスミドの抽出を行い、BigDye Terminator vl.1Cycle Sequencing Kit(ABI)とABI 3100 DNA Analyzer(ABI)を用いてシークエンスした。得られた配列情報（配列番号３）を基に、Primer3 software(Whitehead Institute)を用いて13種のプライマーセットの設計を行った。当該13種のプライマーセットを表２に示す。 As a result, when C89 (5′-TCC CAC GTT TGG-3 ′) in the BEX common primer was used, a 1074 bp band specific to OLB6378 was detected in 43 strains of B. bifidum ( Lane 1 in FIG. The RAPD fragment of this band was purified using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) and cloned using pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems (Promega). Recombinant vector was transformed into DH5oc, plasmid extracted using plasmidPrep Mini Spin Kit (GE healthcare), and sequenced using BigDye Terminator vl.1Cycle Sequencing Kit (ABI) and ABI 3100 DNA Analyzer (ABI) . Based on the obtained sequence information (SEQ ID NO: 3), 13 types of primer sets were designed using Primer3 software (Whitehead Institute). The 13 kinds of primer sets are shown in Table 2.
次に設計した13種のプライマーセットを用いたPCRを行い、OLB6378に特有なバンドを検出した。OLB6378を含む10株のB.bifidumを用いて、上記方法によりテンプレートDNAを得た。10ngのテンプレートDNA、0.08μMのプライマーセット、0.01unitのMightyAmp DNA ポリメラーゼ(タカラ)を混合し、GeneAmp PCR system 9700(ABI)を用いて増幅を行った。PCRプログラムは、95℃で5分、(98℃で10秒+68℃で55秒)を40サイクルとした。増幅したPCR産物は1.5％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色によりバンドを検出した（図示せず）。 Next, PCR using 13 designed primer sets was performed, and a band specific to OLB6378 was detected. Template DNA was obtained by the above method using 10 strains of B. bifidum containing OLB6378. Ten ng of template DNA, 0.08 μM primer set, and 0.01 unit of MightyAmp DNA polymerase (Takara) were mixed and amplified using GeneAmp PCR system 9700 (ABI). The PCR program was 95 cycles at 5 minutes and 98 cycles at 98 ° C for 10 seconds + 68 ° C for 55 seconds. The amplified PCR product was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, and a band was detected by ethidium bromide staining (not shown).
この結果、IB-3プライマーセット(IB-F1: 5′-TCC CAC GTT TGG GTA AAG GAT-3′ and IB-R3: 5′-TCA ATT CTG GAG GTT CCT TGT TAT-3′)を用いた場合にOLB6378に特異的な約480bpのバンドが検出され、図２に示す矢印の部分（483bp）が増幅されることが明らかとなった。 As a result, when using IB-3 primer set (IB-F1: 5′-TCC CAC GTT TGG GTA AAG GAT-3 ′ and IB-R3: 5′-TCA ATT CTG GAG GTT CCT TGT TAT-3 ′) In addition, a band of about 480 bp specific to OLB6378 was detected, and it was clarified that the part indicated by the arrow (483 bp) shown in FIG. 2 was amplified.
（プライマーセットによる検出特異性の確認）
次に、得られたIB-3プライマーセットを用いてその検出特異性を確認した。1株のOLB6378を含む47株のB.bifidum（表３）と20株のBifidobacterium種細菌（表４）から、上記13種のプライマーセットを用いた場合と同様にしてDNAの抽出及びPCRを行ったところ、OLB6378のみから上記約480bpの核酸増幅が検出され、他のB.bifidumからはその増幅が認められず、IB-3プライマーセットはOLB6378のみを検出することが確認された（図３及び図４）。これにより、IB-3プライマーセットを用いてPCRを適用すればOLB6378を特異的に検出できることが示された。
(Confirmation of detection specificity by primer set)
Next, the detection specificity was confirmed using the obtained IB-3 primer set. DNA extraction and PCR were performed from 47 B. bifidum (Table 3) containing 20 strains of OLB6378 and 20 Bifidobacterium species bacteria (Table 4) in the same manner as when using the above 13 primer sets. As a result, the nucleic acid amplification of about 480 bp was detected only from OLB6378, the amplification was not observed from other B. bifidum, and it was confirmed that the IB-3 primer set detects only OLB6378 (FIG. 3 and FIG. 3). FIG. 4). Thus, it was shown that OLB6378 can be specifically detected by applying PCR using the IB-3 primer set.
（定量的PCR法による定量性の確認）
IB-3プライマーセットを用いて定量的PCR法を行い、定量性を確認した。20ngのテンプレートDNA、0.1μMのプライマーセット、1XのMighty Amp for Real-time（SYBR Plus）、1XRox Reference Dye(Invitorogen)を含む50μlのサンプルを定量的PCR法に適用し、ABI 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems)を用いて増幅を行った。PCRプログラムは、98℃で2分、(98℃で10秒+68℃で55秒)を40サイクルとした。
(Confirmation of quantitativeness by quantitative PCR)
Quantitative PCR was performed using the IB-3 primer set to confirm the quantitativeness. ABI 7300 real-time PCR using 50 ng of sample containing 20 ng template DNA, 0.1 μM primer set, 1X Mighty Amp for Real-time (SYBR Plus) and 1X Rox Reference Dye (Invitorogen) for quantitative PCR Amplification was performed using system (Applied Biosystems). The PCR program was 40 cycles at 98 ° C. for 2 minutes and (98 ° C. for 10 seconds + 68 ° C. for 55 seconds).
菌数が既知であるOLB6378を含むヒト糞便を用いて定量的PCR法を適用したところ、図５に示すようにCt値と菌数との間に良好な直線関係が得られ、1gの糞便中107〜1011CellsのOLB6378を検出できることが確認された。また、OLB6378から得られた溶融曲線は安定した温度（Tm）を示したが、その他の菌株は溶融曲線が得られず、定量的PCR法の溶融曲線のみからもOLB6378のみを検出できることが確認された（図示せず）。なお、ヒト糞便からのテンプレートDNAは、実施例１に記載された方法に順じて調製した。すなわち、糞便にASL溶解バッファー及びジルコニアビーズを添加し、TissueLyser(Qiagen)で細胞を破砕した。その後、QIAamp DNA stool Mini Kit(Qiagen)を用いてDNAを抽出し、抽出したDNAを、QIAcube(Qiagen)を用い付属のプロトコルに従って精製した。 When a quantitative PCR method was applied using human feces containing OLB6378 with a known number of bacteria, a good linear relationship was obtained between the Ct value and the number of bacteria as shown in FIG. It was confirmed that 10 7 to 10 11 cells of OLB6378 could be detected. In addition, the melting curve obtained from OLB6378 showed a stable temperature (Tm), but other strains did not obtain a melting curve, and it was confirmed that only OLB6378 could be detected only from the melting curve of quantitative PCR. (Not shown). The template DNA from human feces was prepared according to the method described in Example 1. That is, ASL lysis buffer and zirconia beads were added to feces, and cells were disrupted with TissueLyser (Qiagen). Thereafter, DNA was extracted using QIAamp DNA stool Mini Kit (Qiagen), and the extracted DNA was purified using QIAcube (Qiagen) according to the attached protocol.
本発明によると、複数種のビフィズス菌の存在が想定される検体、例えば糞便等において、ビフィズス菌OLB6378を特異的に検出し、かつ定量的に測定できる。 According to the present invention, bifidobacteria OLB6378 can be specifically detected and quantitatively measured in a sample in which a plurality of types of bifidobacteria are assumed, for example, feces.
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