JP6031658B2 - 根管充填材 - Google Patents
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Description
本実施形態に係る発明は、根管内の歯組織を再生する歯組織再生方法において、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞と、歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有する根管充填材を注入することを特徴とする。再生する歯組織は、例えば根管内の血管、神経、歯髄、象牙質等である。本実施形態に係る発明は、抜歯後又は感染根管の根管拡大清掃後、抜髄及び消毒し、根尖部を切断して開口して根管充填材を移植する。本実施形態に係る発明では、無菌化され空洞となった根管内に、人工の充填材又は血餅を移植するのではなく、歯髄組織を模倣した、生体親和性に優れ、為害性及び免疫原性のないscaffoldに歯髄幹細胞を含有する細胞を付着させて充填する。根管充填材は、根尖部の1/4〜2/5に充填するのが望ましく、より望ましくは根尖部の1/3に充填する。
以下、図2A〜図2Cを参照しながら、実施形態2に係る歯組織再生方法を説明する。実施形態2に係る根管充填材200の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで60μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させた混合コラーゲン(I型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合割合は1:1)を30μリットル〜40μリットルを吸い込み、次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを20μリットル〜30μリットル吸い込む。実施形態2においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図2Aに示す根管充填材200が製造される。このように、根管充填材200は、歯髄幹細胞を含む細胞220を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側(例えば根管の上部1/2〜2/3)に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子230を付着させている。歯髄幹細胞を含む細胞220を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子230を付着させる理由は、歯髄幹細胞を含む細胞220を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している歯髄幹細胞を含む細胞が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図2Aに示すように、根管充填材200の根管の歯冠側に細胞外基質210を残しておくことも可能である。
〈細胞分取と特徴化〉
ブタ歯胚を摘出後、37℃で1時間半、コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離した後、2%血清を含むDMEM中に1×106cells/mlで細胞を分散させ、5μg/ml Hoechst33342でラベルした。ついで、CD31及びCD146の抗体を用いて4℃で30分ラベル後、フローサイトメトリーを行った。図3に、SP細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す。ブタ歯髄由来のSP細胞は全体の0.2%を占めた。
図4に示されるように、歯髄由来CD31−;CD146−,CD31+;CD146−及びCD31+;CD146+ SP細胞の3分画を得た。CD31及びCD146抗体でラベルしてSP細胞をさらに分画すると、CD31−;CD146−SP細胞,CD31+;CD146−SP細胞,CD31+;CD146+SP細胞は、それぞれ、50%、48%、2%を占めた。EGF及びIGF−Iが添加された10%ウシ胎児血清を含むEBM2培地中で培養した。
Matrigel上で血管誘導を行うとCD31−;CD146−SP細胞は24時間後には網目状の管腔構造を呈した。CD31+SP細胞は明らかな管腔構造を形成しなかった。さらに10日後にCD31−;CD146−SP細胞はMatrigel内部に血管様構造を形成し、血管様構造物周囲の細胞はCEACAM1、CD146及びoccludin mRNAの内皮細胞の分化マーカーを発現していた。またVEGF、bFGF存在下で培養すると10日目にはCD31、vWF、VE−cadherinの内皮細胞の分化マーカーを発現するようになった。さらにCD31−;CD146−SP細胞は、内皮細胞の機能的な性質であるヒスタミンによるvWFの放出やac−LDLの取り込み能を示した。また、CD31−;CD146−SP細胞は、多分化能を有し、試験管内で軟骨、脂肪、神経、象牙芽細胞に分化誘導された。
試験管内で、CD31−;CD146−SP細胞は他の2画分と比較してbFGF及びEGF刺激により高い増殖能を示した。また、CD31−;CD146−SP細胞は他の2画分と比較してVEGF及びSDF1により誘導され2倍高い遊走能を示した。
SCID(Sevefe Combined ImmunoDeficiency)マウスの下肢虚血モデルを作製し、CD31−;CD146−SP細胞を下肢虚血部位に移植すると、1週間後には血流が回復し、CD31+;CD146−SP細胞移植群と比較して、新生血管形成が約13倍に促進された。
イヌ歯髄組織よりCD31−;CD146−SP細胞をブタと同様に分取すると、SP細胞の約10%を占めていた。この歯髄由来CD31−;CD146−SP細胞1×106個をI型コラーゲン及びIII型コラーゲンを添加して三次元培養を行った。24時間後にイヌの生活歯髄切断面上に自家移植し、上部はスポンゼル及び燐酸セメントで充填し、さらに化学重合レジンで封鎖した。コントロールとしてCD31+SP細胞あるいはI型コラーゲン及びIII型コラーゲンのみを用いた。14日後、CD31−;CD146−SP細胞移植群では生活歯髄切断面上に歯髄が再生され、新生血管が連続して、図10及び図13に示すように、再生歯髄中にみられた。図10及び図13は、I型及びIII型コラーゲン中に1日三次元培養して自家移植後14日目のもので、CD31−;CD146−SP細胞を移植したものである。染色はH−E染色を使用した。図中において矢印は歯髄切断面を示す。図10及び図13に示すように、歯髄切断面上の窩洞内は再生歯髄組織に満たされており、リン酸セメントを充填した部位近くまで毛細血管が伸張していることが理解される。
実施例2では、CD31−;CD146−SP細胞及び細胞遊走因子SDF1を用いたイヌ抜髄後の歯髄再生を示す。イヌ歯髄組織よりCD31−;CD146−SP細胞をブタと同様に分取した。また、CD105+細胞を分取した。イヌ上顎前歯を抜去後、歯髄を除去して、培地中で#80まで拡大し、根尖部の根管の太さを0.8mm以上にした。抜去後30分以内に1×106個のCD31−;CD146−SP細胞をI型コラーゲン及びIII型コラーゲン10μlに混合し、根管の根尖側1/3に注入した。さらに、根管の歯冠部2/3にSDF1(200ng)を添加したI型コラーゲン及びIII型コラーゲンを20μl充填した。30分以内にイヌの抜歯窩300に再移植し、上部は燐酸セメントならびに化学重合レジンで封鎖した。14日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。
実施例3では、主に、ヒト永久歯歯髄CD31陰性CD146陰性SP細胞及びヒト永久歯歯髄CD105陽性細胞を用いた血管新生を示す。
ヒト歯髄を摘出後、37℃で1時間コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離後、2%血清を含むDMEM中に1×106cells/mlで細胞を分散させ、5μg/ml Hoechst33342でラベルしてさらにCD31抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、歯髄CD31−;CD146−SP細胞を分取した。一方、歯髄細胞を分離後、CD105抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、歯髄CD105+細胞を分取した。これらの細胞をEGF及びIGF−Iが添加された10%ウシ胎児血清を含むEBM2培地中で培養するとブタ歯髄由来のものと同等(約10%)の頻度で細胞はdishに付着し増幅した。この3代目のCD31−;CD146−SP細胞及び歯髄CD105+細胞をさらに細胞表面マーカーを用いてフローサイトメトリーを行い細胞の特徴を調べたところ、幹細胞のマーカーCD44はどちらもほぼ陽性であり、CD90はそれぞれほぼ陽性及び30%陽性であった。図30に、ヒトCD31−;CD146−SP細胞のフローサイトメトリーを示す。表4は、ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞とヒト歯髄CD105+SP細胞、ヒトtotal歯髄細胞、ヒトtotal乳歯細胞及びブタ歯髄CD31−;CD146−SP細胞の比較を示すものである。血管内皮細胞あるいは血管平滑筋細胞のマーカーCD146はヒトCD31−SP細胞は陰性、ヒトCD105+細胞はほぼ陰性であった。骨髄由来のangioblast及び末梢血中の血管内皮前駆細胞で陽性といわれるCD133は陰性であり、ブタ歯髄由来のCD31−;CD146−SP細胞と同様であったが、CD134はブタと異なり陰性であった。
110:根尖性歯周炎
200:根管充填材
210:細胞外基質
220:歯髄幹細胞を含む細胞
230:遊走因子
300:抜歯窩
400:血管
500:象牙質
610:スポンゼル(ゼラチン)
620:レジン
630:形態形成因子
Claims (2)
- 歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有して、抜髄後の根管内に充填される根管充填材であって、
前記歯髄幹細胞は、ヒト歯髄幹細胞集団から分取されたCD105陽性且つCD146陰性の細胞であり、
前記細胞外基質が、コラーゲン、又は、ゼラチンであり、
かつ、G-CSFが前記細胞外基質の少なくとも歯冠側に付着させてあることを特徴とする根管充填材。 - 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、前記歯髄幹細胞の含有率は、1×103セル/μl以上1×106セル/μl以下であることを特徴とする請求項1記載の根管充填材。
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