JP6018817B2 - Fat accumulation inhibitor - Google Patents
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Description
本発明は、海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類を有効成分として配合した脂肪蓄積抑制剤に関するものである。 The present invention relates to a fat accumulation inhibitor containing an acidic mucopolysaccharide produced by marine bacteria as an active ingredient.
現代の生活様式は過食の機会が多く、さらに、ストレス、ホルモンバランスの乱れ、老化などの様々な要因によって生体内での脂肪代謝がうまく行われず、その結果、脂肪の異常な蓄積を起こす。体脂肪の増加および肥大は、肥満症を引き起こし、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、虚血性心疾患など様々な生活習慣病の要因となっている。また、最近の健康や美容への関心の高まりから、老若男女を問わず体を健康的でスリムにしたいと願う人も増加しており、肥満症でない人においても、局所の脂肪蓄積に関して非常に高い関心が持たれている。 In modern lifestyles, there are many occasions of overeating, and furthermore, fat metabolism in the living body is not performed well due to various factors such as stress, disorder of hormone balance, and aging, resulting in abnormal accumulation of fat. Increased body fat and hypertrophy cause obesity and contribute to various lifestyle-related diseases such as diabetes, hypertension, arteriosclerosis, and ischemic heart disease. In addition, with the recent increase in interest in health and beauty, the number of people who want to make their bodies healthy and slim, regardless of age or gender, is increasing. High interest.
肥満を細胞レベルで見ると、体脂肪の蓄積は、脂肪細胞中への脂肪の取り込みによるものである。すなわち、この脂肪細胞の減少が調節可能ならば肥満を防止することができるであろうと期待されている。 Looking at obesity at the cellular level, the accumulation of body fat is due to the uptake of fat into the fat cells. In other words, it is expected that obesity can be prevented if this decrease in adipocytes can be controlled.
従来、上記肥満を解消する抗肥満剤としては、蓄積した脂肪を分解することにより脂肪蓄積抑制効果を示すものが多かった。しかし、脂肪細胞数の増加を抑制することにより脂肪蓄積抑制効果を示す抗肥満剤はあまり知られていなかった。 Conventionally, many anti-obesity agents for eliminating obesity have an effect of suppressing fat accumulation by decomposing accumulated fat. However, anti-obesity agents that show an effect of suppressing fat accumulation by suppressing an increase in the number of fat cells have not been well known.
脂肪細胞数の増加を抑制することにより脂肪蓄積抑制効果を示す抗肥満剤としては、ペプチド(特許文献1)、キノコや植物抽出物(特許文献2)、活性化乳清(特許文献3)、多糖類の誘導体(特許文献4)等に前駆脂肪細胞分化抑制作用のあることが提案されている。 Anti-obesity agents that show an effect of suppressing fat accumulation by suppressing an increase in the number of fat cells include peptides (Patent Document 1), mushrooms and plant extracts (Patent Document 2), activated whey (Patent Document 3), It has been proposed that polysaccharide derivatives (Patent Document 4) and the like have a preadipocyte differentiation inhibitory action.
しかしながら、上記の従来の抗肥満剤では効果が十分でなかったり、効果が認められる高い濃度まで配合すると安全上の問題が生じるおそれがあった。そのため、抗肥満剤に用いられる成分として脂肪細胞数の増加を抑制することにより十分な脂肪蓄積抑制効果を示す天然の安全な脂肪蓄積抑制剤が求められていた。 However, the above-mentioned conventional anti-obesity agents are not effective enough, and there is a possibility that a safety problem may occur when blended to a high concentration where the effect is recognized. Therefore, there has been a demand for a natural and safe fat accumulation inhibitor that exhibits a sufficient fat accumulation inhibitory effect by suppressing an increase in the number of fat cells as a component used in an anti-obesity agent.
そこで、本発明は、今まで探索の遅れていた海洋微生物の産生する安全性の高い天然物の中から、脂肪蓄積抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分とする脂肪蓄積抑制剤を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a fat accumulation inhibitor that has a fat accumulation inhibitory action from among highly safe natural products produced by marine microorganisms, which have been delayed until now, and uses it as an active ingredient. The purpose is to do.
本発明者らは、上記課題を解決するために、未利用資源の豊富な海洋微生物の産生する安全な多糖類の中から、前駆脂肪細胞分化抑制作用を有するものについて鋭意研究を重ねた結果、海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類が前駆脂肪細胞の分化を抑制して脂肪蓄積抑制作用を有すること、そして、それを有効成分とすることにより、脂肪蓄積抑制および肥満の予防または改善に有効な脂肪蓄積抑制剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive research on what has a preadipocyte differentiation inhibitory action among safe polysaccharides produced by marine microorganisms rich in unused resources, Acidic mucopolysaccharides produced by marine bacteria have the effect of inhibiting the accumulation of preadipocytes to suppress fat accumulation, and by using it as an active ingredient, they are effective in inhibiting fat accumulation and preventing or improving obesity. The present inventors have found that a fat accumulation inhibitor can be obtained and have completed the present invention.
即ち、本発明は海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有することを特徴とする脂肪蓄積抑制剤に関する。 That is, the present invention relates to a fat accumulation inhibitor characterized by containing an acidic mucopolysaccharide produced by marine bacteria or a physiologically acceptable salt or derivative thereof as an active ingredient.
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、下記式(1)により表わされる本酸性ムコ多糖類またはその生理学的に許容される塩もしくは誘導体(以下「本酸性ムコ多糖類」と記す)を有効成分として含有することを特徴とする。 The fat accumulation inhibitor of the present invention contains the present acidic mucopolysaccharide represented by the following formula (1) or a physiologically acceptable salt or derivative thereof (hereinafter referred to as “the present acidic mucopolysaccharide”) as an active ingredient. It is characterized by doing.
海洋細菌が産生する本酸性ムコ多糖類を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤は、前駆脂肪細胞に対して細胞毒性を示すことなく前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制する。 The fat accumulation inhibitor containing the present acidic mucopolysaccharide produced by marine bacteria as an active ingredient suppresses differentiation of preadipocytes into adipocytes without showing cytotoxicity to the preadipocytes.
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、海洋細菌の産生する本酸性ムコ多糖類を含有することにより、安全性が高く、優れた脂肪蓄積抑制作用を発揮することができるため、脂肪蓄積抑制剤および抗肥満剤としてこれまでの多糖類にない有用性を備えている。 Since the fat accumulation inhibitor of the present invention contains the present acidic mucopolysaccharide produced by marine bacteria, it is highly safe and can exhibit an excellent fat accumulation inhibitory action. As an obesity agent, it has utility not found in conventional polysaccharides.
以下に実施形態を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されない。 The present invention will be described below with reference to embodiments, but the present invention is not limited to the following embodiments.
本酸性ムコ多糖類は、マウスメラノーマ細胞のメラニン生成抑制作用を有し、その誘導体が抗ウイルス作用を有することが知られているが、これを脂肪蓄積抑制剤として使用したという報告は、現在までに全く知られていないものである。 The acidic mucopolysaccharide has a melanin production inhibitory effect on mouse melanoma cells, and its derivative is known to have an antiviral effect. However, there have been reports that it has been used as a fat accumulation inhibitor. Is not known at all.
本発明において、脂肪蓄積抑制剤とは、前駆脂肪細胞の分化を抑制することによって、脂肪蓄積抑制および肥満の予防または改善に有効な組成物である。本発明の脂肪蓄積抑制剤は、皮膚外用剤組成物または経口用組成物であって、化粧品や医薬部外品としてのローション、乳液、クリーム、パック剤、石鹸等の薬用化粧品、および医薬品としてのローション、乳液、クリーム、軟膏等の皮膚外用剤、ならびに美容用飲食品などの経口剤を含むものである。 In the present invention, the fat accumulation inhibitor is a composition effective for inhibiting fat accumulation and preventing or improving obesity by inhibiting differentiation of preadipocytes. The fat accumulation-suppressing agent of the present invention is a skin external preparation composition or an oral composition, and is used as a cosmetic or quasi-drug lotion, milky lotion, cream, pack, soap and other medicinal cosmetics, and as a pharmaceutical product. It includes oral preparations such as lotions, emulsions, creams, ointments and the like, as well as cosmetic foods and drinks.
本発明の脂肪蓄積抑制用皮膚外用剤組成物は、有効成分である本酸性ムコ多糖類と、皮膚外用剤に一般に用いられている各種成分、例えば、油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、アルコール、保湿剤、防腐剤、殺菌剤、色剤、香料、増粘剤、緩衝剤などを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。
また、本発明の脂肪蓄積抑制用経口用組成物は、有効成分である本酸性ムコ多糖類と、経口用組成物に一般的に用いられている各種成分、例えば、賦形剤、防腐剤、色剤、香料などとを、その剤形に合わせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。
The skin external preparation composition for fat accumulation suppression according to the present invention comprises the present acidic mucopolysaccharide as an active ingredient and various components generally used in skin external preparations, such as oils, surfactants, ultraviolet absorbers, alcohols. , Moisturizers, preservatives, bactericides, colorants, fragrances, thickeners, buffering agents, and the like are prepared by appropriately blending the dosage forms within a range not impairing the effects of the present invention.
The oral composition for fat accumulation suppression according to the present invention comprises the present acidic mucopolysaccharide as an active ingredient and various components commonly used in oral compositions, such as excipients, preservatives, It is prepared by blending a coloring agent, a fragrance, and the like as appropriate in accordance with the dosage form as long as the effects of the present invention are not impaired.
本発明の脂肪蓄積抑制用皮膚外用剤組成物に、本酸性ムコ多糖類を配合するに当たっては、これら化合物の脂肪蓄積抑制作用ならびに皮膚の角質透過性等を考慮することが好ましく、一般にはこれら化合物を有効成分として少なくとも0.001重量%以上、好ましくは0.01〜20.0重量%程度添加すればよい。必ずしも有効成分を単離して使用する必要はなく、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の化合物を含む粗精製物を使用することができる。 In blending the acidic mucopolysaccharide with the skin external preparation composition for inhibiting fat accumulation according to the present invention, it is preferable to consider the fat accumulation inhibiting action of these compounds and the keratin permeability of the skin. May be added as an active ingredient at least 0.001% by weight or more, preferably about 0.01 to 20.0% by weight. It is not always necessary to isolate and use the active ingredient, and a crude product containing the compound of the present invention can be used as long as the effects of the present invention are not impaired.
本発明の脂肪蓄積抑制用皮膚外用剤組成物の剤型は任意であり、例えば化粧水等の可溶化系、乳液またはクリーム等の乳化系、あるいは軟膏または分散液などの剤型をとることができる。
また、本発明の脂肪蓄積抑制用経口剤の剤型は任意であり、例えば錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、粉末剤、ゼリー剤などの剤型をとることができる。
こうして所望の脂肪蓄積抑制効果、例えば、皮膚外用剤であれば顔や二の腕、太ももなど局所の脂肪蓄積の改善効果、経口剤であれば全身における体脂肪の脂肪蓄積の改善効果が得られる脂肪蓄積抑制剤が提供される。
The dosage form of the skin external preparation composition for fat accumulation suppression according to the present invention is arbitrary, and may be a solubilizing system such as lotion, an emulsifying system such as emulsion or cream, or an ointment or dispersion. it can.
Moreover, the dosage form of the oral preparation for fat accumulation suppression of this invention is arbitrary, For example, dosage forms, such as a tablet, a capsule, a liquid agent, a syrup agent, a powder agent, a jelly agent, can be taken.
In this way, the desired fat accumulation suppression effect, for example, an external skin preparation, an improvement effect on the local fat accumulation such as face, upper arm and thigh, and an oral preparation, an accumulation improvement effect on the fat accumulation of body fat in the whole body is obtained. An inhibitor is provided.
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、かかる脂肪蓄積抑制剤を添加しない場合に比べ、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を有意に抑制することができる。 The fat accumulation inhibitor of the present invention can significantly suppress the differentiation of preadipocytes into adipocytes, compared to the case where such a fat accumulation inhibitor is not added.
本発明の脂肪蓄積抑制剤は、前駆脂肪細胞分化を有効に抑制すると共に、安定性および生体に対する高い安全性を併せ持つ。そのため、抗肥満効果が期待される医薬分野、食品分野および化粧品分野において有効に使用され得る。特に肥満、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、虚血性心疾患、高尿酸血症を含む生活習慣病に起因する疾病の予防または治療に有効である。また、睡眠時無呼吸症候群、リポジストロフィー、バセドウ病眼症などにも利用可能である。更に皮膚のシワやたるみ、糖尿病由来の合併症などの様々な前駆脂肪細胞の分化誘導作用に関わる疾患の予防または治療にも利用可能である。 The fat accumulation inhibitor of the present invention effectively suppresses preadipocyte differentiation, and has both stability and high safety for living bodies. Therefore, it can be effectively used in the pharmaceutical field, food field and cosmetic field where anti-obesity effect is expected. It is particularly effective for the prevention or treatment of diseases caused by lifestyle-related diseases including obesity, diabetes, hypertension, arteriosclerosis, ischemic heart disease, and hyperuricemia. It can also be used for sleep apnea syndrome, lipodystrophy, Graves' ophthalmopathy and the like. Furthermore, it can also be used for the prevention or treatment of various diseases related to differentiation-inducing action of preadipocytes such as skin wrinkles and sagging and complications derived from diabetes.
(有効成分)
本酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤は、PPARγアゴニスト活性化阻害作用を有する。本発明で使用される本酸性ムコ多糖類は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。本ムコ多糖類の調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水を寒天で固めた培地で培養して産生する多糖類を採取、精製して得ることができる。
(Active ingredient)
The fat accumulation inhibitor containing the present acidic mucopolysaccharide as an active ingredient has a PPARγ agonist activation inhibitory action. As the acidic mucopolysaccharide used in the present invention, those prepared by various methods can be used as long as they are purified to such an extent that they can be used as pharmaceuticals. Various methods are known as methods for preparing the present mucopolysaccharide. For example, it can be obtained by collecting and purifying polysaccharides produced by culturing marine microorganisms as sucrose as a carbon source, peptone as a nitrogen source, and seawater containing yeast extract in a medium solidified with agar.
本酸性ムコ多糖類の産生に用いられる微生物としては、本酸性ムコ多糖類を産生しうるものであれば特に制限なく使用することができる。好ましくは海洋微生物、さらに好ましくは本酸性ムコ多糖類を産生する能力のある海洋微生物が用いられる。具体的にはコベチア(Cobetia)属細菌が挙げられ、より具体的にはコベチア(Cobetia)属に属し寄託番号がFERM P-21297として寄託されている菌株またはその変異株が挙げられる。本菌株は本発明者らが瀬戸内海において海水より分離した海洋性細菌であり、その分類学的特性は、特許文献5に記載されている。 The microorganism used for production of the present acidic mucopolysaccharide can be used without particular limitation as long as it can produce the present acidic mucopolysaccharide . Preferably, marine microorganisms, more preferably marine microorganisms capable of producing the present acidic mucopolysaccharide are used. Specific examples include bacteria belonging to the genus Covetia, and more specifically, strains belonging to the genus Cobecia and deposited with a deposit number of FERM P-21297 or mutants thereof. This strain is a marine bacterium isolated from seawater by the present inventors in the Seto Inland Sea, and its taxonomic characteristics are described in Patent Document 5.
本酸性ムコ多糖類を産生する微生物を培養する基本培地としては、多糖類を産生しうる微生物が生育できるものであって、少なくとも炭素源と、窒素源と、各種無機塩と、微量元素とを適量含有するものが用いられる。さらに好ましくは、前記基本培地として、コベチア(Cobetia)属に属する微生物が生育できるものが用いられる。炭素源としては、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シュクロース等の糖、あるいは糖蜜や廃糖蜜が挙げられる。炭素源として1種または2種以上を単独で、または組み合わせて用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の化合物やペプトン、酵母エキス、アミノ酸などの天然物が挙げられる。窒素源として1種または2種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。無機塩として1種または2種以上を単独でまたは組み合わせて用いることができる。固体培地の場合には寒天を用いる。 As a basic medium for culturing microorganisms that produce this acidic mucopolysaccharide, microorganisms capable of producing polysaccharides can grow, and at least a carbon source, a nitrogen source, various inorganic salts, and trace elements are contained. What contains an appropriate amount is used. More preferably, as the basic medium, one capable of growing microorganisms belonging to the genus Cobetia is used. Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, galactose, and sucrose, and molasses and molasses. One or two or more carbon sources can be used alone or in combination. Nitrogen sources include compounds such as nitrates and ammonium salts, and natural products such as peptone, yeast extract and amino acids. One or two or more nitrogen sources can be used alone or in combination. Examples of the inorganic salt include phosphate, magnesium salt, potassium salt and the like. One or two or more inorganic salts can be used alone or in combination. In the case of a solid medium, agar is used.
使用する培地、培地のpH、培地への添加物、培養温度などの培養条件は、通常微生物の培養の際に用いられている条件に従って設定することができる。 Culture conditions such as the medium to be used, the pH of the medium, the additive to the medium, and the culture temperature can be set according to the conditions normally used for culturing microorganisms.
本発明における培養条件は、培養時のpHは微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、通常は6から7.5の範囲のpHが好ましい。培養温度については微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、25℃から30℃の範囲が多糖類の産生には良好である。培養期間は培養のpHや温度により変化するが、通常2日間から5日間が適切である。 The culture conditions in the present invention are not limited as long as the pH during culture is a range in which microorganisms can grow and produce polysaccharides, but a pH in the range of 6 to 7.5 is usually preferable. The culture temperature is not limited as long as microorganisms grow and produce polysaccharides, but a range of 25 ° C. to 30 ° C. is good for producing polysaccharides. The culture period varies depending on the pH and temperature of the culture, but usually 2 to 5 days is appropriate.
上述した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより、本発明の有効成分である本酸性ムコ多糖類が効率的に産生されることとなる。 By culturing microorganisms using the above-described medium and microorganisms using a conventional method, the present acidic mucopolysaccharide, which is an active ingredient of the present invention, is efficiently produced.
本発明に用いられる本酸性ムコ多糖類は、構成糖のモル比がN−アセチル−D−グルコサミン:D−グルクロン酸:L−グルタミン酸が2:1:1(モル濃度比)で、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として100〜150万であることが好ましい。構成成分の分析には、セルロースアセテート膜電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。この構成成分の分析には、多糖類を2Mのトリフルオロ酢酸(TFA)または4N-HClで100℃、12時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでTFAまたはHClを除いたものを検体とし、中性糖、ウロン酸、有機酸、アミノ酸およびアミノ糖の分析を行う。構成有機酸の分析にはこの他に酵素法を用いることができる。 The acidic mucopolysaccharide used in the present invention has a constituent sugar molar ratio of N-acetyl-D-glucosamine: D-glucuronic acid: L-glutamic acid of 2: 1: 1 (molar concentration ratio) and gel filtration chromatography. It is preferable that the average molecular weight measured by lithography is 100 to 1,500,000 with pullulan as a standard. Cellulose acetate membrane electrophoresis or high performance liquid chromatography can be used for the analysis of the constituent components. For analysis of this component, a polysaccharide was hydrolyzed with 2M trifluoroacetic acid (TFA) or 4N-HCl at 100 ° C. for 12 hours, and TFA or HCl was removed with a rotary evaporator as a sample. Analyzes sugars, uronic acids, organic acids, amino acids and amino sugars. In addition to this, an enzymatic method can be used for analysis of constituent organic acids.
本酸性ムコ多糖類の分子量の測定は、ゲル濾過クロマトグラフィー法を用いることができる。具体的には、Asahipak GFA-7M(昭和電工社製)をカラムとする高速液体クロマトグラフィー(島津製作所社製)を使用し、0.1M-NaClを移動相とし、分子量既知のプルラン(Shodex STANDARD KIT P-82、昭和電工社製)を標準サンプルとして作成した分子量保持時間標準曲線を使用して測定することができる。 The molecular weight of the present acidic mucopolysaccharide can be measured by gel filtration chromatography. Specifically, high-performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation) using Asahipak GFA-7M (manufactured by Showa Denko) as a column, 0.1M-NaCl as a mobile phase, and pullulan (Shodex STANDARD with a known molecular weight). KIT P-82 (manufactured by Showa Denko KK) can be measured using a molecular weight retention time standard curve prepared as a standard sample.
(有効成分の製造方法)
次に、本発明の脂肪蓄積抑制剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類の製造方法について、好ましい実施形態を挙げて説明する。尚、本酸性ムコ多糖類の生産方法は以下の製法に限定されない。
好ましい一実施形態としての本酸性ムコ多糖類の製造方法は、(a)培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程と、(b)産生された本酸性ムコ多糖類を抽出・回収する工程とを有する。
(Method for producing active ingredient)
Next, a method for producing the present acidic mucopolysaccharide, which is an active ingredient of the fat accumulation inhibitor of the present invention, will be described with reference to preferred embodiments. In addition, the production method of this acidic mucopolysaccharide is not limited to the following production method.
The method for producing the present acidic mucopolysaccharide as one preferred embodiment includes (a) a step of culturing a microorganism in a medium to produce a polysaccharide, and (b) a step of extracting and recovering the produced present acidic mucopolysaccharide. And have.
続いて、上述の実施形態を各工程毎に詳細に説明していく。
上述した本発明の脂肪蓄積抑制剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類の製造に適した培地を用いることが望ましく、その際に炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを用いることがより望ましい。
(a)培地において微生物を培養し多糖類を産生する工程
上述のようにして調製した培地を用いて微生物を培養して目的の多糖類を産生させるわけであるが、本酸性ムコ多糖類を得るためには微生物としてコベチア(Cobetia)属の細菌を用いることが好ましい。さらに好ましくはコベチア(Cobetia)属に属し寄託番号がFERM P-21297として寄託されている菌株またはその変異株を用いることが望ましい。微生物として該菌株またはその変異株を用いることで、本酸性ムコ多糖類を効率的に産生することができる。
そして、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度の本酸性ムコ多糖類を高収率で得ることが可能となる。
Subsequently, the above-described embodiment will be described in detail for each step.
It is desirable to use a medium suitable for the production of the present acidic mucopolysaccharide, which is an active ingredient of the above-described fat accumulation inhibitor of the present invention. In this case, sucrose is used as the carbon source, peptone is used as the nitrogen source, and yeast extract is used. More desirable.
(A) Step of culturing microorganisms in medium to produce polysaccharides The microorganisms are cultured using the medium prepared as described above to produce the desired polysaccharides, and the present acidic mucopolysaccharides are obtained. Therefore, it is preferable to use a bacterium belonging to the genus Cobetia as a microorganism. More preferably, it is desirable to use a strain belonging to the genus Cobetia and deposited with a deposit number of FERM P-21297 or a mutant thereof. The acidic mucopolysaccharide can be efficiently produced by using the strain or a mutant thereof as a microorganism.
And it becomes possible to obtain this acidic mucopolysaccharide of high purity by a high yield by passing through the extraction and collection | recovery process demonstrated below.
(b)産生された所定の多糖類を抽出・回収する工程
上記製造方法で得られた培養液から本酸性ムコ多糖類を抽出する方法としては、当技術分野において知られている方法を用いることができる。例えば、培養液をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、2〜3倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは1〜15%塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を2〜3回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥機や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、本酸性ムコ多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや、第4級アンモニウム塩による沈殿や塩析などを用いることができる。
(B) Step of extracting and recovering the produced predetermined polysaccharide As a method for extracting the acidic mucopolysaccharide from the culture solution obtained by the above production method, a method known in the art should be used. Can do. For example, after sterilizing the culture solution as it is or at a high temperature, the microbial cells are removed by centrifugation, and after adding or concentrating this, add 2-3 times the amount of ethanol, isopropanol, or acetone, This causes precipitation. After this precipitate is dissolved again in water or 1-15% sodium chloride solution, precipitation with alcohol or the like is repeated 2-3 times, dialyzed with water, and using a spray dryer or freeze dryer, etc. The acidic mucopolysaccharide is obtained by drying. In addition, electrodialysis and ultrafiltration can be used. For further purification, various types of chromatography such as ion exchange and gel filtration, precipitation with quaternary ammonium salts, salting out, and the like can be used.
かくして本酸性ムコ多糖類が産生および回収されることになる。本発明により得られる本酸性ムコ多糖類は特に制限なく種々の用途に使用されうるものであるが、好ましくは上述の脂肪蓄積抑制剤として好適に用いられる。 Thus, the acidic mucopolysaccharide will be produced and recovered. The acidic mucopolysaccharide obtained by the present invention can be used for various applications without any particular limitation, but is preferably used as the above-described fat accumulation inhibitor.
ここで、本酸性ムコ多糖類は下記構造単位を有するものである。
本発明では、有効成分として少なくとも0.001重量%以上、好ましくは、0.01〜20重量%の本酸性ムコ多糖類を脂肪蓄積抑制剤に配合する。
この本酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する脂肪蓄積抑制剤は、通常使用されている皮膚外用剤基材を使用することにより、クリーム、乳液、化粧水等の適当な形態とすることができる。さらに、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、アルブチン等のメラニン合成抑制剤、その他の薬効成分、増粘剤、可塑剤、着色料、香料等、任意の添加物をこの脂肪蓄積抑制剤に含有させることができる。なお、本発明の脂肪蓄積抑制剤の有効成分である本酸性ムコ多糖類については、皮膚に対する毒性も刺激も無く、副作用も無い。
In the present invention, at least 0.001% by weight or more, preferably 0.01 to 20% by weight of the present acidic mucopolysaccharide is added to the fat accumulation inhibitor as an active ingredient.
The fat accumulation inhibitor containing this acidic mucopolysaccharide as an active ingredient can be made into a suitable form such as cream, emulsion, lotion, etc. by using a commonly used skin external preparation base material. . Furthermore, this fat accumulation inhibitor should contain arbitrary additives such as ultraviolet absorbers, ultraviolet scattering agents, melanin synthesis inhibitors such as arbutin, other medicinal ingredients, thickeners, plasticizers, colorants, and fragrances. Can do. The acidic mucopolysaccharide, which is an active ingredient of the fat accumulation inhibitor of the present invention, is neither toxic nor irritating to the skin and has no side effects.
本酸性ムコ多糖類は、脂肪蓄積抑制作用を有しており、安全性にも優れているため、美容用飲食品をはじめ、健康用飲食品や機能性飲食品などに配合するのにも好適である。 The acidic mucopolysaccharide has a fat accumulation-inhibiting action and is excellent in safety, so it is suitable for blending into health foods and drinks, functional foods and drinks, etc. It is.
本酸性ムコ多糖類を美容用飲食品に配合する場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して、成人1日あたりの本酸性ムコ多糖類の摂取量が約1〜1000mgになるようにするのが好ましい。 When the present acidic mucopolysaccharides are blended in cosmetic foods and drinks, the amount of active ingredients in them can be appropriately changed in consideration of the purpose of use, symptoms, sex, etc. In consideration of the correct intake, it is preferable that the intake of the present acidic mucopolysaccharide per day for an adult is about 1 to 1000 mg.
本発明の美容用飲食品は、本酸性ムコ多糖類をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、本酸性ムコ多糖類を主成分とする栄養補助飲食品であってもよい。 The cosmetic food / beverage product of the present invention may be a blend of the present acidic mucopolysaccharides in any food / beverage product that does not impede its activity, or a nutritional supplement food / drink comprising the present acidic mucopolysaccharides as the main component. It may be a product.
以上説明した本発明の脂肪蓄積抑制剤、皮膚外用剤および美容用飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対しても適用することもできる。 The fat accumulation inhibitor, the skin external preparation and the cosmetic food and drink of the present invention described above are preferably applied to humans. However, as long as each effect is exerted, it is applied to animals other than humans. It can also be applied to.
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるものではない。尚、特記しない限り、百分率(%)は重量基準である。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not restrict | limited at all to these Examples. Unless otherwise specified, percentages (%) are based on weight.
(実施例1)
ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、蔗糖3%の組成を有し海水で調製した培地を、温度121℃としたオートクレーブ中で15分間滅菌し、本菌株(FERM P-21297)の斜面培養から、1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10ml)に接種し、25℃の温度で24時間静置培養を行い、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成の培地100ml(121℃、15分間滅菌)に接種し、25℃の温度で3日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラヂオライト#500)を用いてGF-75濾紙(Advantec社製)で濾過し、菌体を除いた培養濾過液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を5〜6時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。
このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
Example 1
A medium prepared with seawater having a composition of 0.5% peptone, 0.1% yeast extract and 3% sucrose was sterilized in an autoclave at a temperature of 121 ° C. for 15 minutes, and the strain (FERM P-21297) From the slant culture, one platinum loop is inoculated into the above-mentioned sterilized medium (10 ml) in a test tube, and statically cultured at a temperature of 25 ° C. for 24 hours, and then this preculture solution is placed in a 500 ml Erlenmeyer flask. The medium was inoculated into 100 ml (121 ° C., sterilized for 15 minutes) and subjected to stationary culture at 25 ° C. for 3 days. After culturing, the culture broth is centrifuged, filtered through GF-75 filter paper (manufactured by Advantec) using a filter aid (Radiolite # 500), and the hollow fiber having a molecular weight of 50,000 cut from the culture filtrate from which the cells are removed. The polymer fraction obtained by a membrane filtration apparatus equipped with a UF membrane module (manufactured by Spectrum) was concentrated, desalted and recovered within 5 to 6 hours, treated with activated carbon, and powdered by freeze drying. The membrane filtration apparatus used was SYLS-SB04 manufactured by Toyobo Engineering.
The polysaccharide fraction obtained in this manner was confirmed by homogeneity using cellulose acetate membrane electrophoresis, and by using DEAE-cellulose ion exchange column chromatographic analysis, chemical analysis, and nuclear magnetic resonance analysis, The mucopolysaccharide was confirmed.
(実施例2)
前培養までは実施例1と同様に処理し、次いでこの前培養液を500ml容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地100ml(121℃、15分間)に接種し、25℃の温度で3日間振とう培養を行った。次いで培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラヂオライト#500)を用いてGF−75濾紙(Advantec社製)で濾過し、菌体を除いた培養濾液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を5〜6時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
(Example 2)
Until the preculture, the same treatment as in Example 1 was performed, and then this preculture was inoculated into a 500 ml Erlenmeyer flask to 100 ml of sterilized medium (121 ° C, 15 minutes) prepared from seawater having the above composition, and 25 ° C. The shaking culture was performed at the temperature of 3 days. Next, after centrifuging the culture solution, it was filtered through GF-75 filter paper (manufactured by Advantec) using a filter aid (Radiolite # 500), and the hollow fiber UF membrane having a molecular weight of 50,000 cut from the culture filtrate from which the cells were removed. The polymer fraction obtained by a membrane filtration apparatus equipped with a module (manufactured by Spectrum) was concentrated, desalted and recovered within 5 to 6 hours, treated with activated carbon, and pulverized by freeze drying. The membrane filtration apparatus used was SYLS-SB04 manufactured by Toyobo Engineering. The polysaccharide fraction obtained in this manner was confirmed by homogeneity using cellulose acetate membrane electrophoresis, and by using DEAE-cellulose ion exchange column chromatographic analysis, chemical analysis, and nuclear magnetic resonance analysis, The mucopolysaccharide was confirmed.
(実施例3)
前培養までは実施例1と同様に処理し、上記実施例2で述べた培地に寒天を1.5%添加した寒天平板培地250mlを平板(18×26cm)に広げて前培養液を塗沫し、25℃の温度で4日間培養を行った。寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、1%フェノール液に懸濁させ、遠心分離した後濾過助剤(ラヂオライト#500)を用いてGF-75濾紙で濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析した。次いで活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量5万カットの中空糸UF膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を5〜6時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。このようにして得られた多糖画分については、セルロースアセテート膜電気泳動を用いて均一性を確認すると共に、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマト分析、化学分析、核磁気共鳴分析により、公知の本酸性ムコ多糖類であることを確認した。
Example 3
Until the pre-culture, the same treatment as in Example 1 was performed, and 250 ml of agar plate medium obtained by adding 1.5% of agar to the medium described in Example 2 was spread on a flat plate (18 × 26 cm) and smeared with the pre-culture solution. The culture was performed at a temperature of 25 ° C. for 4 days. The sticky matter generated on the surface of the agar plate is scraped off, suspended in 1% phenol solution, centrifuged, and filtered through GF-75 filter paper using a filter aid (Radiolite # 500) to remove the cells. Fraction precipitated by adding ethanol to the supernatant was collected, dissolved in water, ethanol added again to collect the precipitated fraction, dissolved in water, and dialyzed. Subsequently, it was treated with activated carbon, and a polysaccharide fraction was obtained by freeze-drying. In addition, as a practical purification level, a polymer fraction obtained from a membrane filtrate equipped with a hollow fiber UF membrane module (Spectrum) having a molecular weight of 50,000 cut from the culture filtrate is obtained within 5 to 6 hours. Concentrated, desalted and recovered, treated with activated carbon, and powdered by lyophilization. The membrane filtration apparatus used was SYLS-SB04 manufactured by Toyobo Engineering. The polysaccharide fraction obtained in this manner was confirmed by homogeneity using cellulose acetate membrane electrophoresis, and by using DEAE-cellulose ion exchange column chromatographic analysis, chemical analysis, and nuclear magnetic resonance analysis, The mucopolysaccharide was confirmed.
(実施例4)
(脂肪蓄積抑制剤)
ヒト皮下前駆脂肪細胞におけるin vitroでの脂肪細胞への分化抑制活性について調べた。ヒト皮下脂肪細胞の脂肪蓄積抑制作用の測定は、ゼンバイオ社(Zen-Bio,Inc.、U.S.A.)のプロトコールに従い、以下の方法で行った。実施例1で得られた本酸性ムコ多糖類を使用して、ヒト皮下脂肪細胞の脂肪蓄積抑制作用を調べ、試料無添加の場合と比較して試料添加系での抑制率を求めた。脂肪細胞の脂肪蓄積抑制作用は脂肪細胞に蓄積したトリグリセリド濃度を指標とし、PPARγアゴニスト添加と本試料無添加とによる促進効果(対照)およびPPARγアゴニストとTNF-α(腫瘍壊死因子-α)との同時添加による抑制効果(P)と比較した。脂肪蓄積量の低いものほど前駆脂肪細胞の分化が低いことを示す。
この結果を図1に示す(平均値±SE)。
Example 4
(Fat accumulation inhibitor)
The in vitro differentiation inhibitory activity of human subcutaneous preadipocytes into adipocytes was examined. Measurement of the fat accumulation inhibitory action of human subcutaneous fat cells was performed by the following method according to the protocol of Zen-Bio, Inc. (USA). Using this acidic mucopolysaccharide obtained in Example 1, the effect of inhibiting fat accumulation in human subcutaneous adipocytes was examined, and the inhibition rate in the sample addition system was determined as compared with the case of no sample addition. The adipocyte fat accumulation-inhibiting action is based on the concentration of triglyceride accumulated in adipocytes as an index. The effect of the addition of the PPARγ agonist and the absence of this sample (control) and the PPARγ agonist and TNF-α (tumor necrosis factor-α) It compared with the inhibitory effect (P) by simultaneous addition. The lower the fat accumulation amount, the lower the differentiation of preadipocytes.
The results are shown in FIG. 1 (mean value ± SE).
図1から明らかなように、PPARγアゴニストを添加し本酸性ムコ多糖類は無添加である対照では分化誘導が認められた。一方、本酸性ムコ多糖類の添加により濃度依存的に分化誘導を抑制し、ヒト皮下脂肪細胞の脂肪蓄積抑制作用のあることが認められた。また、PPARγアゴニストと、PPARγアゴニストを介した前駆脂肪細胞の分化抑制物質として知られているTNF-αとの同時添加による抑制効果(P)と比較して、本酸性ムコ多糖類を1000μg/ml添加した場合では、1/2程度の抑制値を示した。同濃度で細胞毒性に伴う細胞形態の変化は見られなかった。 As is clear from FIG. 1, differentiation induction was observed in the control in which the PPARγ agonist was added and the acidic mucopolysaccharide was not added. On the other hand, it was confirmed that the addition of the acidic mucopolysaccharide suppresses differentiation induction in a concentration-dependent manner and has an action of suppressing fat accumulation in human subcutaneous fat cells. Moreover, compared with the inhibitory effect (P) by simultaneous addition of PPARγ agonist and TNF-α known as a preadipocyte differentiation inhibitory substance via PPARγ agonist, the acidic mucopolysaccharide was added at 1000 μg / ml. When added, the suppression value was about 1/2. At the same concentration, there was no change in cell morphology associated with cytotoxicity.
本発明に係る脂肪蓄積抑制剤は種々の剤型で使用されるが、例示として、実施例1で得られた本酸性ムコ多糖類を使用した美容液、クリーム、乳液、石けん、乳化型ファンデーションおよび浴用剤の処方例を処方例1〜6、美容用飲食品の処方例を処方例7および8として下記に説明する。 The fat accumulation inhibitor according to the present invention is used in various dosage forms. As an example, a serum, a cream, a milky lotion, a soap, an emulsified foundation using the acidic mucopolysaccharide obtained in Example 1 and Formulation examples of bath preparations will be described below as Formulation Examples 1 to 6, and formulation examples of cosmetic foods and beverages as Formulation Examples 7 and 8.
処方例1(美容液)
下記成分により常法で美容液を調製した。
A cosmetic solution was prepared in the usual manner using the following components.
処方例2(クリーム)
下記成分A、別に成分Bを加温溶解させてそれぞれA液およびB液とし、A液にB液を加えて乳化し、撹拌しながら冷却し、クリームを調製した。
The following component A and component B were heated and dissolved to prepare A solution and B solution, respectively. The B solution was added to the A solution to emulsify, and cooled with stirring to prepare a cream.
処方例3(乳液)
下記成分A、別に成分Bを加温溶解させてそれぞれA液およびB液とし、A液にB液を加えて乳化し、撹拌しながら冷却し、乳液を調製した。
The following component A and component B were heated and dissolved to prepare A solution and B solution, respectively. The B solution was added to the A solution to emulsify, and cooled with stirring to prepare an emulsion.
処方例4(石けん)
石けん製造の常法により下記成分を混合して石けんを製造した。
The soap was manufactured by mixing the following components according to a conventional method for manufacturing soap.
処方例5(乳化型ファンデーション)
下記成分Aを充分に混合粉砕した粉末部Aとし、成分BをB液、成分CをC液とする。C液を加温攪拌後、Aを添加しホモミキサー処理し、さらに加温混合したB液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら室温まで冷却して乳化型ファンデーションを調製した。
The following component A is sufficiently mixed and pulverized into powder part A, component B is liquid B, and component C is liquid C. After the liquid C is heated and stirred, A is added and homomixed, and the liquid B which has been heated and mixed is added and homomixed. While stirring, the mixture was cooled to room temperature to prepare an emulsified foundation.
処方例6(浴用剤)
下記成分により常法により浴用剤を調製した。
A bath preparation was prepared by a conventional method using the following components.
処方例7(錠剤)
下記成分Aをそれぞれ篩過して混合し、次に成分Bを添加して混合した。その後、常法により打錠して、全量が600mgの錠剤を得た。
The following component A was sifted and mixed, and then component B was added and mixed. Thereafter, tableting was performed by a conventional method to obtain a tablet having a total amount of 600 mg.
処方例8(清涼飲料)
下記成分により常法により清涼飲料を調製した。
A soft drink was prepared by the conventional method using the following components.
なお、本実施例において用いられた上記のFERM P-21297菌株は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6 に寄託し、平成19年5月16日 受託番号 FERM P-21297として受託されたものである。 The above-mentioned FERM P-21297 strain used in the present example is the center of Japan National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center 1-5-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8586 Japan And deposited under the accession number FERM P-21297 on May 16, 2007.
Claims (3)
The fat accumulation inhibitor according to claim 1, which is a beauty food or drink.
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