JP6014091B2 - Method for measuring component to be measured in sample and measurement kit - Google Patents

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Description

本発明は、検体中の測定対象成分の測定方法及び測定用キットに関する。   The present invention relates to a method for measuring a component to be measured in a specimen and a measurement kit.

検体中の成分を測定する方法として、免疫学的な測定法が利用されている。免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法（放射免疫測定法）、ＥＩＡ法（酵素免疫測定法）、ＣＬＩＡ法（化学発光免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＬＡ法（ラテックス凝集法）、ＴＩＡ法（免疫比濁法）、イムノクロマトグラフィー法などの多くの方法がある。これらの測定法では、免疫学的手法により測定する場合、検体中の成分（または抗体）とそれに対する抗体（または抗原）との間における抗原抗体反応を利用している。また、これらの免疫学的測定法においては、予め、濃度のわかっている標準物質を測定して得られた数値（吸光度）とそれぞれに対する測定値（濃度）との関係をグラフにプロットした検量線（標準曲線）を作成し、目的とする検体中の成分の測定値を求める。これらの測定において用いる標準物質には、原料の入手が容易であり、多量に調製することが可能なリコンビナント抗原が多く用いられている。   An immunological measurement method is used as a method for measuring components in a specimen. Immunological measurement methods include RIA (radioimmunoassay), EIA (enzyme immunoassay), CLIA (chemiluminescence immunoassay), CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay), LA method (latex). There are many methods such as an agglutination method), a TIA method (immunoturbidimetry), and an immunochromatography method. These measurement methods utilize an antigen-antibody reaction between a component (or antibody) in a specimen and an antibody (or antigen) against the component when measured by an immunological technique. In these immunoassays, a calibration curve in which the relationship between the numerical value (absorbance) obtained by measuring a standard substance with a known concentration in advance and the measured value (concentration) for each is plotted in a graph. (Standard curve) is created, and the measured values of the components in the target specimen are obtained. Recombinant antigens that can easily be obtained in large quantities and can be prepared in large quantities are often used as standard substances used in these measurements.

しかしながら、リコンビナント抗原は検体中の成分であるネイティブ抗原と必ずしも免疫反応性が一致しているとは限らず、測定する際の緩衝液や添加剤によっても反応性が異なることがある。特に、抗原抗体反応時の反応温度が変動した場合には両者の反応性の相違が顕著となり、温度による測定値の変動を生じるという問題がある（特許文献１〜２参照）。   However, the recombinant antigen does not necessarily have the same immunoreactivity as that of the native antigen, which is a component in the specimen, and the reactivity may differ depending on the buffer or additive used for the measurement. In particular, when the reaction temperature at the time of the antigen-antibody reaction varies, the difference in reactivity between the two becomes remarkable, and there is a problem that the measured value varies depending on the temperature (see Patent Documents 1 and 2).

ＭｘＡ蛋白質は、Ｉ型インターフェロン（インターフェロンα／β）により誘導される一連のタンパク質の一つで、分子量78kDa、Dynaminスーパーファミリーに属し、GTPase活性を有し、白血球、特に単核球の細胞質内に発現する。機能としては、ウイルスの増殖を阻害することによる抗ウイルス作用を有していることが知られており、ウイルス感染初期における生体の抗ウイルス状態の確立に関与していると言われている（非特許文献１〜４参照）。   MxA protein is one of a series of proteins induced by type I interferon (interferon α / β). It has a molecular weight of 78 kDa, belongs to the Dynamin superfamily, has GTPase activity, and is contained in the cytoplasm of leukocytes, particularly mononuclear cells. To express. As a function, it is known to have an antiviral effect by inhibiting the growth of viruses, and is said to be involved in the establishment of an antiviral state of a living body in the early stage of viral infection (non- (See Patent Documents 1 to 4).

いくつかの動物種でもみられるＭｘＡ蛋白質は、そのアミノ酸末端に特徴的なアミノ酸配列をもつ。Ｎ末ＧドメインはGTPaseとしての活性や抗ウイルス作用必須の部分であり、Ｃ末領域は、αヘリックス構造に富み、ロイシンジッパー構造を有する。この両部分は、分子内で相互に反応したり、分子間で相互に結合して自己凝集を引き起こすことが報告されている（非特許文献５参照）。   The MxA protein found in some animal species has a characteristic amino acid sequence at its amino acid terminus. The N-terminal G domain is a part essential for GTPase activity and antiviral action, and the C-terminal region is rich in α-helical structure and has a leucine zipper structure. It has been reported that these two parts react with each other within a molecule or bond with each other to cause self-aggregation (see Non-Patent Document 5).

特開２００８−１０１９２４号公報JP 2008-101924 A 国際公開第２００６／０７３０７３号パンフレットInternational Publication No. 2006/073073 Pamphlet

J. Interferon Res., vol.7, p.331-343 (1987).J. Interferon Res., Vol.7, p.331-343 (1987). Mol. Cell. Biol., vol.9, p.5062-5072 (1989).Mol. Cell. Biol., Vol. 9, p.5062-5072 (1989). J. Virol., vol.64, p.1171-1181 (1990).J. Virol., Vol.64, p.1171-1181 (1990). Traffic, vol.3, p.710-717 (2002).Traffic, vol.3, p.710-717 (2002). J. Biological Chem., vol.273, p.28365-28370 (1998).J. Biological Chem., Vol.273, p.28365-28370 (1998).

本発明の目的は、抗原等の検体中の測定対象成分を測定するに際して、反応温度等の影響を受けずに正確な測定を可能とする、検体中の測定対象成分の測定方法及び測定用キットを提供することにある。   An object of the present invention is to provide a method for measuring a measurement target component in a sample and a measurement kit that enable accurate measurement without being affected by reaction temperature or the like when measuring the measurement target component in a sample such as an antigen. Is to provide.

本発明者らは、本課題を解決すべく鋭意検討し、検体中の測定対象成分の免疫測定法において、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させることにより、また、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させることにより、反応温度等の影響を受けずに、正確な測定が可能となることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［２８］に関する。   The present inventors diligently studied to solve this problem, and in an immunoassay method for a measurement target component in a sample, the measurement target component in the sample and the first antibody that binds to the measurement target component are mixed with a fatty acid. By reacting in the presence of alkanolamide, and after reacting the measurement target component in the sample with the first antibody that binds to the measurement target component, the second antibody that binds to the measurement target component is labeled. It has been found that by reacting the bound labeled second antibody in the presence of a polyoxyethylene nonionic surfactant, accurate measurement can be performed without being affected by the reaction temperature, etc. Was completed. That is, the present invention relates to the following [1] to [28].

［１］ 検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させた後、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を反応させて、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法。
［２］ 標識化第２抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させる、［１］記載の方法。
［３］ 検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法。
［４］ 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドである［１］又は［２］記載の方法。
［５］ ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である［２］又は［３］記載の方法。
［６］ 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドであり、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である［２］記載の方法。 [1] After reacting a measurement target component in a sample and a first antibody that binds to the measurement target component in the presence of a fatty acid alkanolamide, a label is bound to the second antibody that binds to the measurement target component. Reacting a labeled second antibody to generate an immune complex comprising the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody, and measuring the amount of label in the generated immune complex. A method for measuring a component to be measured.
[2] The method according to [1], wherein the labeled second antibody is reacted in the presence of a polyoxyethylene-based nonionic surfactant.
[3] After reacting the measurement target component in the sample with the first antibody that binds to the measurement target component, a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the measurement target component, In the presence of the polyoxyethylene-based nonionic surfactant, an immune complex comprising the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody is generated, A method for measuring a component to be measured, comprising measuring a labeling amount.
[4] The method according to [1] or [2], wherein the fatty acid alkanolamide is fatty acid diethanolamide.
[5] The polyoxyethylene nonionic surfactant is selected from the group consisting of a polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, a polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and an ethylenediamine polyoxyethylene polyoxypropylene condensate. The method according to [2] or [3], which is a polyoxyethylene-based nonionic surfactant.
[6] The fatty acid alkanolamide is fatty acid diethanolamide, and the polyoxyethylene nonionic surfactant is a polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and ethylenediamine polyoxyethylene. The method according to [2], which is a polyoxyethylene nonionic surfactant selected from the group consisting of polyoxypropylene condensates.

［７］ 胆汁酸誘導体を添加して検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させる［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［７］記載の方法。
［９］ 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホネートである［８］記載の方法。
［１０］ 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［７］記載の方法。
［１１］ 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−グルコンアミドプロピル）コールアミド又はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドである［１０］記載の方法。
［１２］ 第１抗体が、不溶性担体に不動化されている［１］〜［１１］のいずれかに記載の測定方法。
［１３］ 検体が、全血である［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］ 測定対象成分が、ＭｘＡ蛋白質である［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。 [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein a bile acid derivative is added to react the component to be measured in the specimen with the first antibody that binds to the component to be measured.
[8] The method according to [7], wherein the bile acid derivative is a bile acid derivative having an amphoteric surfactant activity.
[9] A bile acid derivative having an amphoteric surfactant activity is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate or 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropane. The method according to [8], which is a sulfonate.
[10] The method according to [7], wherein the bile acid derivative is a bile acid derivative having a nonionic surfactant activity.
[11] The bile acid derivative having a nonionic surfactant activity is N, N-bis (3-gluconamidopropyl) coleamide or N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycholamide. [10] The method described.
[12] The measurement method according to any one of [1] to [11], wherein the first antibody is immobilized on an insoluble carrier.
[13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the specimen is whole blood.
[14] The method according to any one of [1] to [13], wherein the measurement target component is an MxA protein.

［１５］ 測定対象成分に結合する第１抗体、及び、脂肪酸アルカノールアミドを含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用キット。
［１６］ 第２試薬が、更にポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む［１５］記載のキット。
［１７］ 測定対象成分に結合する第１抗体を含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中の測定対象成分の測定用キット。
［１８］ 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドである［１５］又は［１６］記載のキット。
［１９］ ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である［１６］又は［１７］記載のキット。
［２０］ 脂肪酸アルカノールアミドが、脂肪酸ジエタノールアミドであり、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である［１６］記載のキット。 [15] A first reagent that binds to the measurement target component and a first reagent that contains a fatty acid alkanolamide; a second reagent that includes a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the measurement target component; A kit for measuring a component to be measured in a specimen, comprising:
[16] The kit according to [15], wherein the second reagent further contains a polyoxyethylene-based nonionic surfactant.
[17] A first reagent containing a first antibody that binds to the component to be measured, a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the component to be measured, and a polyoxyethylene-based nonionic surfactant A kit for measuring a component to be measured in a specimen, comprising a second reagent containing an agent.
[18] The kit according to [15] or [16], wherein the fatty acid alkanolamide is fatty acid diethanolamide.
[19] The polyoxyethylene-based nonionic surfactant is selected from the group consisting of a polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, a polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and an ethylenediamine polyoxyethylene polyoxypropylene condensate. The kit according to [16] or [17], which is a polyoxyethylene-based nonionic surfactant.
[20] The fatty acid alkanolamide is fatty acid diethanolamide, and the polyoxyethylene nonionic surfactant is a polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and ethylenediamine polyoxyethylene. The kit according to [16], which is a polyoxyethylene nonionic surfactant selected from the group consisting of polyoxypropylene condensates.

［２１］ 第１試薬が更に、胆汁酸誘導体を含む［１５］〜［２０］のいずれかに記載のキット。
［２２］ 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［２１］記載のキット。
［２３］ 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホネートである［２２］記載のキット。
［２４］ 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請［２１］記載のキット。
［２５］ 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−グルコンアミドプロピル）コールアミド又はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドである［２４］記載のキット。
［２６］ 第１抗体が、不溶性担体に不動化されている［１５］〜［２５］のいずれかに記載のキット。
［２７］ 検体が、全血である［１５］〜［２６］のいずれかに記載のキット。
［２８］ 測定対象成分が、ＭｘＡ蛋白質である［１５］〜［２７］のいずれかに記載のキット。 [21] The kit according to any one of [15] to [20], wherein the first reagent further contains a bile acid derivative.
[22] The kit according to [21], wherein the bile acid derivative is a bile acid derivative having an amphoteric surface activity.
[23] A bile acid derivative having an amphoteric surfactant activity is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate or 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropane. The kit according to [22], which is a sulfonate.
[24] The kit according to [21], wherein the bile acid derivative is a bile acid derivative having a nonionic surfactant activity.
[25] The bile acid derivative having a nonionic surfactant activity is N, N-bis (3-gluconamidopropyl) coleamide or N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycholamide. [24] The kit according to [24].
[26] The kit according to any one of [15] to [25], wherein the first antibody is immobilized on an insoluble carrier.
[27] The kit according to any one of [15] to [26], wherein the specimen is whole blood.
[28] The kit according to any one of [15] to [27], wherein the component to be measured is an MxA protein.

本発明により、反応温度等の影響を受けずに、正確な測定を可能とする検体中の測定対象成分の測定方法及び測定用キットが提供される。   According to the present invention, there are provided a measuring method and a measuring kit for a component to be measured in a specimen that enables accurate measurement without being affected by reaction temperature or the like.

（１）検体
本発明において使用される検体としては、本発明による測定を可能とする検体であれば特に制限はなく、例えば全血（血液）、血球、血清、血漿、髄液、尿、組織、培養細胞が挙げられる。尚、全血には、全血由来の血球分画に血漿が混合している検体も含まれる。全血としては、被検者より採取した血液そのものでもよいが、採取した血液を処理したものでもよく、処理した血液が好ましい。当該処理としては、例えば抗凝固処理、溶血処理等が挙げられ、これらの処理を組み合わせてもよい。 (1) Specimen The specimen used in the present invention is not particularly limited as long as it is a specimen capable of measurement according to the present invention. For example, whole blood (blood), blood cells, serum, plasma, spinal fluid, urine, tissue And cultured cells. The whole blood includes a sample in which plasma is mixed with a blood cell fraction derived from whole blood. The whole blood may be the blood itself collected from the subject, or may be the processed blood, and the processed blood is preferred. Examples of the treatment include anticoagulation treatment and hemolysis treatment, and these treatments may be combined.

成分（測定対象物）が血球の細胞内成分である場合は、全血として、溶血処理した血液が好ましく、抗凝固処理と溶血処理の両処理を行った血液が特に好ましい。抗凝固処理としては、例えば採取した血液にＥＤＴＡ、ヘパリン等を添加する処理等が挙げられる。溶血処理としては、例えば界面活性剤またはサポニン類溶液の添加、低張液との混合、凍結融解、超音波処理等が挙げられる。   When the component (measuring object) is an intracellular component of a blood cell, hemolyzed blood is preferable as whole blood, and blood subjected to both anticoagulation and hemolysis is particularly preferable. Examples of the anticoagulation treatment include a treatment of adding EDTA, heparin, etc. to the collected blood. Examples of the hemolysis treatment include addition of a surfactant or a saponin solution, mixing with a hypotonic solution, freeze thawing, ultrasonic treatment, and the like.

（２）測定対象成分
本発明における測定対象成分としては、本発明による測定を可能とする測定対象成分であれば特に制限はなく、例えば核酸、蛋白質、脂質、ビタミン、多糖類等が挙げられる。核酸としてはDNA、RNA、ATP、ADP、AMP、サイクリックAMP等が挙げられる。また、蛋白質としては酵素、ホルモン、各種ペプチド等が挙げられる。 (2) Component to be measured The component to be measured in the present invention is not particularly limited as long as it is a component to be measured that enables measurement according to the present invention, and examples thereof include nucleic acids, proteins, lipids, vitamins, polysaccharides and the like. Examples of the nucleic acid include DNA, RNA, ATP, ADP, AMP, cyclic AMP and the like. Examples of proteins include enzymes, hormones, and various peptides.

本発明において好適な測定対象成分としては、細胞内に含まれる物質、代謝産物等が挙げられ、インターフェロン等の各種サイトカインによって細胞内に誘発される蛋白質等が好ましい。具体的な測定対象成分としては、Ｉ型インターフェロンによって細胞質内に誘導されるＭｘＡ蛋白質（前述の非特許文献２〜３参照）等が挙げられる。   In the present invention, suitable components to be measured include substances contained in cells, metabolites and the like, and proteins induced in cells by various cytokines such as interferon are preferred. Specific components to be measured include MxA protein induced in the cytoplasm by type I interferon (see Non-Patent Documents 2 to 3 above) and the like.

（３）脂肪酸アルカノールアミド
本発明における脂肪酸アルカノールアミドとしては、例えば脂肪酸ジエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸Ｎ−メチルエタノールアミド、脂肪酸モノイソプロパノールアミド、脂肪酸ジイソプロパノールアミド等が挙げられ、脂肪酸ジエタノールアミドが好ましい。脂肪酸ジエタノールアミドとしては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド、カプリン酸ジエタノールアミド、カプリル酸ジエタノールアミド、デカン酸ジエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノールアミド、パルミチン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、イソステアリン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、リノール酸ジエタノールアミド、オクチルデカン酸ジエタノールアミド、ココナッツ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ脂肪酸ジエタノールアミド、牛脂脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルアルカノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミドが挙げられる。これらの中で、オレイン酸ジエタノールアミド、ヤシ脂肪酸ジエタノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミドが好ましい。オレイン酸ジエタノールアミドの具体例（市販品）としては、例えばスタホームＤＯ、スタホームＤＯＳ（以上、日油社製）等、ヤシ脂肪酸ジエタノールアミドの具体例（市販品）としては、スタホームＦ、スタホームＤＦＣ、スタホームＤＦ４（以上、日油社製）等、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミドの具体例（市販品）としては、アミノーンＰＫ−０２Ｓ、アミノーンＰＫ−０３Ｓ（以上、花王社製）等が挙げられる。 (3) Fatty acid alkanolamide Examples of the fatty acid alkanolamide in the present invention include fatty acid diethanolamide, fatty acid monoethanolamide, fatty acid N-methylethanolamide, fatty acid monoisopropanolamide, fatty acid diisopropanolamide, and the like. preferable. Examples of the fatty acid diethanolamide include lauric acid diethanolamide, capric acid diethanolamide, caprylic acid diethanolamide, decanoic acid diethanolamide, myristic acid diethanolamide, palmitic acid diethanolamide, stearic acid diethanolamide, isostearic acid diethanolamide, oleic acid diethanolamide. Linoleic acid diethanolamide, octyldecanoic acid diethanolamide, coconut oil fatty acid diethanolamide, coconut fatty acid diethanolamide, beef tallow fatty acid diethanolamide, alkyl alkanolamide, palm kernel oil fatty acid diethanolamide. Among these, oleic acid diethanolamide, coconut fatty acid diethanolamide, and palm kernel oil fatty acid diethanolamide are preferable. As specific examples (commercial products) of oleic acid diethanolamide, for example, Stahome DO, Stahome DOS (above, manufactured by NOF Corporation), etc., specific examples (commercial products) of coconut fatty acid diethanolamide include Stahome F, Specific examples (commercial products) of palm kernel oil fatty acid diethanolamide, such as Stahome DFC, Stahome DF4 (above, manufactured by NOF Corporation), Aminone PK-02S, Aminone PK-03S (above, manufactured by Kao Corporation), etc. Is mentioned.

脂肪酸アルカノールアミドの抗原抗体反応における濃度としては、本発明の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、例えば０．１〜１．４％である。本発明においては、脂肪酸アルカノールアミドを単独（１種類）で用いることもできるが、２種以上組み合わせて用いることもできる。   The concentration of the fatty acid alkanolamide in the antigen-antibody reaction is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the present invention, but is 0.1 to 1.4%, for example. In the present invention, fatty acid alkanolamides can be used alone (one kind), or two or more kinds can be used in combination.

（４）ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤
本発明におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、本発明の測定方法を可能とするものであれば特に制限はなく、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と記す）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルと記す）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルフェニルエーテルと記す）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテルと記す）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ多環フェニルエーテルと記す）、または、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、エチレンジアミンＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と記す）等が挙げられ、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、エチレンジアミンＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物が好ましく、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物が特に好ましい。 (4) Polyoxyethylene nonionic surfactant The polyoxyethylene nonionic surfactant in the present invention is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the present invention. For example, polyoxyethylene Polyoxypropylene condensate (hereinafter referred to as POE / POP condensate), polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether (hereinafter referred to as POE / POP alkyl ether), polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl phenyl ether (hereinafter referred to as POE)・ POP alkylphenyl ether), polyoxyethylene polycyclic phenyl ether (hereinafter referred to as POE polycyclic phenyl ether), polyoxyethylene polyoxypropylene polycyclic phenyl ether (hereinafter referred to as POE / POP polycyclic phenyl ether) ), Or , Ethylenediamine polyoxyethylene polyoxypropylene condensate (hereinafter referred to as ethylenediamine POE / POP condensate) and the like, POE / POP condensate, POE / POP alkyl ether, ethylenediamine POE / POP condensate are preferable, and POE • POP condensates are particularly preferred.

ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物は、ブロック共重合体、ランダム共重合体いずれでもよい。ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の具体例（市販品）としては、例えばプロノン１０２、プロノン１０４、プロノン２０１、プロノン２０２Ｂ、プロノン２０４、プロノン２０８、プロノン４０３（以上、日油社製）、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０（以上、花王社製）、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＬ−１０３、プルロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２２、プルロニックＦ−１０８（以上、旭電化工業社製）等が挙げられる。   The POE / POP condensate may be either a block copolymer or a random copolymer. Specific examples of POE / POP condensates (commercially available products) include, for example, Pronon 102, Pronon 104, Pronon 201, Pronon 202B, Pronon 204, Pronon 208, Pronon 403 (above, NOF Corporation), Emulgen PP-230, Emulgen PP-250, Emulgen PP-290 (above, manufactured by Kao Corporation), Pluronic L-101, Pluronic L-103, Pluronic L-121, Pluronic L-122, Pluronic F-108 (above, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) Etc.

ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばユニルーブ５０ＭＢ−１６８、ユニルーブ７５ＤＥ−２５、ユニルーブ７５ＤＥ−３８００、ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（以上、日油社製）、ユニセーフＰＫＡ−５０１５、ユニセーフＰＫＡ−５０１６（以上、日油社製）、ＥＭＡＬＥＸ ＤＡＰＥ−２２０、ＥＭＡＬＥＸ ＤＡＰＥ−２３０（以上、日本エマルジョン社製）、ノイゲンＸＬ−４００、ノイゲンＸＬ−１０００Ｆ（以上、第一工業製薬社製）等が挙げられる。   Specific examples of POE / POP alkyl ethers (commercially available products) include, for example, UNILOVE 50MB-168, UNILOVE 75DE-25, UNILOVE 75DE-3800, UNILOVE MT-0620B (above, manufactured by NOF Corporation), Unisafe PKA-5015, Unisafe PKA-5016 (above, manufactured by NOF Corporation), EMALEX DAPE-220, EMALEX DAPE-230 (above, manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.), Neugen XL-400, Neugen XL-1000F (above, manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), etc. Is mentioned.

ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルフェニルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばエマルゲンＬ４０（花王社製）、ディスパノールＫＰ１８９−４０、ディスパノールＫＰ１８９Ｒ−４０（以上、日油社製）等が挙げられる。   Specific examples (commercially available products) of POE / POP alkylphenyl ether include, for example, Emulgen L40 (manufactured by Kao Corporation), Dispanol KP189-40, Dispanol KP189R-40 (manufactured by NOF Corporation) and the like.

ＰＯＥ多環フェニルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばニューコール７１４、ニューコール７０７、ニューコール２６０９、ニューコール２６１４（以上、日本乳化剤社製）、エマルゲンＡ−６０、エマルゲンＡ−９０、エマルゲンＢ−６６（以上、花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−９、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−１２．５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５、ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−１６（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。   Specific examples (commercially available) of POE polycyclic phenyl ether include, for example, New Coal 714, New Coal 707, New Coal 2609, New Coal 2614 (above, manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), Emulgen A-60, Emulgen A-90, Emulgen B-66 (above, manufactured by Kao Corporation), BLAUNON DSP-9, BLAUNON DSP-12.5, BLAUNON TSP-5, BLAUNON TSP-16 (above, manufactured by Aoki Yushi Co., Ltd.) and the like.

ＰＯＥ・ＰＯＰ多環フェニルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばニューコール２６１６Ｆ、ニューコール７１０−Ｆ、ニューコール２６０８Ｆ、ニューコール７０７−Ｆ（以上、日本乳化剤社製）、ニューカルゲンＣＰ−１６０、ニューカルゲンＧＰ−１２０（以上、竹本油脂社製）等が挙げられる。   Specific examples (commercially available products) of POE / POP polycyclic phenyl ether include, for example, New Coal 2616F, New Coal 710-F, New Coal 2608F, New Coal 707-F (manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Calgen CP- 160, New Calgen GP-120 (manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.) and the like.

エチレンジアミンＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の具体例（市販品）としては、例えばエチレンジアミンＰＯ４０ＥＯ４０（日油社製）、プルロニックＴＲ−７０４（旭電化工業社製）等が挙げられる。   Specific examples (commercially available) of ethylenediamine POE / POP condensate include ethylenediamine PO40EO40 (manufactured by NOF Corporation), Pluronic TR-704 (manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.), and the like.

本発明の測定方法におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の濃度としては、本発明の測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば0.01〜1%であり、0.05〜0.2%が好ましい。本発明においては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を単独（1種類）で用いることもできるが、2種以上組み合わせて用いることもできる。   The concentration of the polyoxyethylene-based nonionic surfactant in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the measurement method of the present invention, and is 0.01 to 1%, for example, 0.05 to 0.2. % Is preferred. In the present invention, polyoxyethylene-based nonionic surfactants can be used alone (one kind), or two or more kinds can be used in combination.

（５）胆汁酸誘導体
本発明における胆汁酸誘導体としては、本発明の測定を可能とするものであれば特に制限はないが、例えば両性界面活性剤作用を有する胆汁酸誘導体、非イオン性界面活性剤作用を有する胆汁酸誘導体等が挙げられる。両性界面活性剤作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート{3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid}（以下、ＣＨＡＰＳと略記する）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート{3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonic acid}（以下、ＣＨＡＰＳＯと略記する｝等が挙げられる。 (5) Bile acid derivative The bile acid derivative in the present invention is not particularly limited as long as it enables the measurement of the present invention. For example, a bile acid derivative having an amphoteric surfactant action, a nonionic surfactant Examples thereof include bile acid derivatives having an agent action. Examples of bile acid derivatives having an amphoteric surfactant action include 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate {3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid} (hereinafter abbreviated as CHAPS). 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate {3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonic acid} (hereinafter abbreviated as CHAPSO), etc. Can be mentioned.

非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体としては、例えばＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド[N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide]（以下、ＢＩＧＣＨＡＰと略記する）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド[N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide]（以下、ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰと略記する）等が挙げられる。   As a bile acid derivative having a nonionic surfactant function, for example, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) coleamide [N, N-Bis (3-D-gluconamidopropyl) cholamide] (hereinafter, N, N-Bis (3-D-gluconamidopropyl) deoxycholamide (hereinafter abbreviated as deoxy-BIGCHAP) and the like. Can be mentioned.

本発明の測定方法における胆汁酸誘導体の濃度としては、臨界ミセル濃度(cmc)の１倍〜５０倍の範囲の濃度で用いるとよく、特にｃｍｃ濃度の１倍〜１０倍が好ましい。本発明においては、胆汁酸誘導体を単独（１種類）で用いることもできるが、２種以上組み合わせて用いることもできる。   The concentration of the bile acid derivative in the measurement method of the present invention is preferably used at a concentration in the range of 1 to 50 times the critical micelle concentration (cmc), and particularly preferably 1 to 10 times the cmc concentration. In the present invention, the bile acid derivative can be used alone (one type), or two or more types can be used in combination.

（６）抗体および標識化抗体
本発明における抗体としては、測定対象成分に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明における抗体としては、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)2、ペプシン処理−還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメントも使用できる。抗体フラグメントとしては、F(ab’)2が好ましい。 (6) Antibody and Labeled Antibody The antibody in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to the component to be measured. Either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, but a monoclonal antibody is preferred. In addition, the antibody in the present invention includes an antibody fragment from which an Fc portion such as Fab obtained by papain treatment, F (ab ′) 2 obtained by pepsin treatment, Fab ′ obtained by pepsin treatment-reduction treatment, etc. is removed. Can be used. As the antibody fragment, F (ab ′) 2 is preferable.

本発明における抗体は、測定対象成分またはそのエピトープに相当するペプチドを抗原として用いて通常の方法により取得することができるが、市販品としても入手可能である。   The antibody in the present invention can be obtained by a usual method using a peptide corresponding to the component to be measured or its epitope as an antigen, but can also be obtained as a commercial product.

測定対象成分がＭｘＡ蛋白質である場合、ＭｘＡ蛋白質に特異的に結合する抗体としては、例えば、国際公開公報ＷＯ９６／０５２３０に記載された、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２９）、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３０）、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３１）がそれぞれ産生する抗ヒトＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５等が挙げられる。   When the measurement target component is MxA protein, examples of the antibody that specifically binds to MxA protein include hybridoma cell lines KM1122, KM1123, KM1124 (FERM BP-4729) described in International Publication WO96 / 05230, KM1125, KM1126, KM1127, KM1128, KM1129, KM1130, KM1131, KM1132 (FERM BP-4730), KM1133, KM1134, KM1135 (FERM BP-4731) produced by anti-human MxA protein monoclonal antibodies KM1123, KM112K, 2512 , KM1126, KM1127, KM1128, KM1129, KM1130, KM1131, KM1132, KM1133, KM1134 KM1135 and the like.

本発明における標識化抗体は、本発明の測定方法において使用され得るものであり、上記の抗体と後述の標識物質とを用いて、後述の方法により作製することができる。   The labeled antibody in the present invention can be used in the measurement method of the present invention, and can be prepared by the method described later using the above-described antibody and the labeling substance described later.

（７）測定方法
本発明の測定方法は、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させた後、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を反応させて、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法である。また、本発明の測定方法は、検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定することを特徴とする、測定対象成分の測定方法である。本発明の測定方法の具体的態様を以下に示す。 (7) Measurement method The measurement method of the present invention is a method in which a measurement target component in a sample and a first antibody that binds to the measurement target component are reacted in the presence of a fatty acid alkanolamide and then bound to the measurement target component. A labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody to be reacted to generate an immune complex comprising the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody, and the generated immune complex It is the measuring method of a measuring object component characterized by measuring the amount of label | markers in it. In addition, the measurement method of the present invention is a method in which a measurement target component in a sample is reacted with a first antibody that binds to the measurement target component, and then a label is bound to the second antibody that binds to the measurement target component. The second antibody was reacted in the presence of a polyoxyethylene-based nonionic surfactant to produce an immune complex comprising the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody. A method for measuring a component to be measured, comprising measuring the amount of a label in the immune complex. Specific embodiments of the measurement method of the present invention are shown below.

(1)該測定対象成分と該測定対象成分に結合する第１抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させ（第１反応工程）、次いで、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を反応させて（第２反応工程）、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定する（検出工程）方法。
(2)該測定対象成分と該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させ（第１反応工程）、次いで、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて（第２反応工程）、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定する（検出工程）方法。
(3)該測定対象成分と該測定対象成分に結合する第１抗体とを、脂肪酸アルカノールアミド存在下に反応させ（第１反応工程）、次いで、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させて（第２反応工程）、第１抗体、該測定対象成分、及び、標識化第２抗体からなる免疫複合体を生成させ、生成した該免疫複合体中の標識量を測定する（検出工程）方法。 (1) The measurement target component and the first antibody that binds to the measurement target component are reacted in the presence of a fatty acid alkanolamide (first reaction step), and then the second antibody that binds to the measurement target component is labeled The labeled second antibody to which is bound is reacted (second reaction step) to generate an immune complex composed of the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody, and the generated immune complex Method of measuring the amount of label in the (detection step).
(2) reacting the component to be measured with the first antibody that binds to the component to be measured (first reaction step), and then labeling the second antibody that binds to the second antibody that binds to the component to be measured The antibody is reacted in the presence of a polyoxyethylene nonionic surfactant (second reaction step) to generate an immune complex comprising the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody. A method for measuring the amount of label in the produced immune complex (detection step).
(3) The measurement target component and the first antibody that binds to the measurement target component are reacted in the presence of a fatty acid alkanolamide (first reaction step), and then the second antibody that binds to the measurement target component is labeled The labeled second antibody to which is bound is reacted in the presence of a polyoxyethylene nonionic surfactant (second reaction step), and the first antibody, the component to be measured, and the labeled second antibody are used. A method for measuring the amount of labeling in the generated immune complex (detection step).

上記(1)〜(3)において、第１反応工程は、胆汁酸誘導体を添加して行うこともできる。   In said (1)-(3), a 1st reaction process can also be performed by adding a bile acid derivative.

上記(1)〜(3)において、第１反応工程において、測定対象成分と第１抗体の免疫複合体が生成する。第２反応工程において、第１反応工程で生成した第１抗体と測定対象成分との免疫複合体と、標識化第２抗体とが反応し、第１抗体、測定対象成分及び標識化第２抗体の免疫複合体が生成する。検出工程において、第２反応工程で生成した第１抗体、測定対象成分及び標識化第２抗体の免疫複合体中の標識量が測定される。用いた検体中の測定対象成分の濃度は、既知濃度の測定対象成分である標準物質を用いて同様の測定を行い、濃度と標識由来の情報量との関係を表す検量線を作成し、作成した検量線と検出工程での標識量とを関連付けることにより決定することができる。   In the above (1) to (3), in the first reaction step, an immune complex of the measurement target component and the first antibody is generated. In the second reaction step, the immune complex of the first antibody produced in the first reaction step and the measurement target component reacts with the labeled second antibody, and the first antibody, the measurement target component, and the labeled second antibody. The immune complex is produced. In the detection step, the amount of label in the immune complex of the first antibody, the measurement target component and the labeled second antibody produced in the second reaction step is measured. The concentration of the measurement target component in the sample used was measured using a standard substance that is a measurement target component with a known concentration, and a calibration curve representing the relationship between the concentration and the amount of information derived from the label was created. This can be determined by associating the calibration curve with the labeled amount in the detection step.

標準物質としては生体試料から調製することもできるが、遺伝子組み換え法により作製したリコンビナント抗原を用いて調製することもできる。標準物質は、溶液形態、凍結乾燥形態等のいずれの形態でもよく、形態に応じて、使用時に後述の水性媒体等に溶解させて用いることができる。また、標準物質の調製に際しては、後述の水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、蛋白類、蛋白類安定化剤等を使用することもできる。   The standard substance can be prepared from a biological sample, but can also be prepared using a recombinant antigen prepared by a genetic recombination method. The standard substance may be in any form such as a solution form or a freeze-dried form, and can be used after being dissolved in an aqueous medium to be described later at the time of use depending on the form. In preparing the standard substance, an aqueous medium, metal ions, salts, saccharides, surfactants, proteins, protein stabilizers and the like which will be described later can also be used.

上記(1)及び(3)の測定方法においては、予め、検体と脂肪酸アルカノールアミドとを混合、又は、検体と脂肪酸アルカノールアミド、胆汁酸誘導体とを混合して検体を前処理し、その後、前処理された検体を第１抗体との反応に供してもよい。上記(2)の測定方法においては、予め、検体と胆汁酸誘導体とを混合して検体を前処理し、その後、前処理された検体を第１抗体との反応に供してもよい。   In the measurement methods of (1) and (3) above, the specimen is pretreated by mixing the specimen and the fatty acid alkanolamide in advance, or by mixing the specimen with the fatty acid alkanolamide and the bile acid derivative. The treated specimen may be subjected to a reaction with the first antibody. In the measurement method of (2) above, the specimen and the bile acid derivative may be mixed in advance to pretreat the specimen, and then the pretreated specimen may be subjected to the reaction with the first antibody.

本発明の測定方法は、ドライケミストリーでも溶液中の反応でも適用可能である。第１反応工程及び第２反応工程における反応温度としては、本発明の測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、例えば0〜50℃が挙げられ、4℃〜40℃が好ましい。反応時間としては、本発明の測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、例えば1分間〜72時間であり、5分間〜20時間が好ましい。   The measurement method of the present invention can be applied to both dry chemistry and reactions in solution. There is no restriction | limiting in particular as reaction temperature in a 1st reaction process and a 2nd reaction process, if it is reaction temperature which enables the measuring method of this invention, For example, 0-50 degreeC is mentioned, for example, 4-40 degreeC is preferable. . The reaction time is not particularly limited as long as it is a reaction time enabling the measurement method of the present invention, and is, for example, 1 minute to 72 hours, preferably 5 minutes to 20 hours.

第１反応工程と第２反応工程との間には、洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。また、第２反応工程と検出工程との間には、洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。第１抗体は不溶性担体に不動化（固定化）されていなくても、不動化（固定化）されていてもよいが、不動化（固定化）されていることが好ましい。第１抗体が不溶性担体に不動化（固定化）されている場合、第１反応工程後の不溶性担体を洗浄することにより、第１反応工程で生成した第１抗体と測定対象成分の免疫複合体を、未反応成分（検体由来の成分、過剰の第１抗体等）から分離することができる。同様に、第２反応工程後の不溶性担体を洗浄することにより、第２反応工程で生成した第１抗体、測定対象成分及び標識化第２抗体の免疫複合体を、未反応成分（過剰の標識化第２抗体等）から分離することができる。洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水［0.15mol/L塩化ナトリウムを含有する10mmol/L リン酸緩衝液、pH7.2（以下、ＰＢＳと記す）］、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等をあげることができる。当該界面活性剤としては、例えばツイーン(Tween)２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。   Although a cleaning process may or may not be provided between the first reaction process and the second reaction process, it is preferable to provide a cleaning process. In addition, although a cleaning step may or may not be provided between the second reaction step and the detection step, it is preferable to provide a cleaning step. The first antibody may be immobilized (immobilized) or not immobilized on an insoluble carrier, but is preferably immobilized (immobilized). When the first antibody is immobilized (immobilized) on the insoluble carrier, the insoluble carrier after the first reaction step is washed to wash the immune complex of the first antibody produced in the first reaction step and the component to be measured. Can be separated from unreacted components (sample-derived components, excess first antibody, etc.). Similarly, by washing the insoluble carrier after the second reaction step, the immune complex of the first antibody, the component to be measured and the labeled second antibody produced in the second reaction step is converted into an unreacted component (excess labeling). Second antibody etc.). The washing solution includes phosphate buffered saline [10 mmol / L phosphate buffer containing 0.15 mol / L sodium chloride, pH 7.2 (hereinafter referred to as PBS)], PBS containing a surfactant, which will be described later. Examples of the aqueous medium are as follows. Examples of the surfactant include nonionic surfactants such as Tween 20.

不溶性担体としては、第１抗体を不動化（固定化）し、抗原抗体反応、検出反応を可能とするものであれば特に制限はない。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられ、９６ウェル／枚のポリスチレン製マイクロタイタープレート等が好ましい。   The insoluble carrier is not particularly limited as long as the first antibody is immobilized (immobilized) to enable the antigen-antibody reaction and the detection reaction. Preferred materials for the insoluble carrier include polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose acetate, polyethylene terephthalate, and other polymer materials, Examples thereof include glass, ceramics, magnetic particles and metals. Preferable shapes of the insoluble carrier include tubes, beads, plates, fine particles such as latex, sticks, and the like, and a 96-well / sheet polystyrene microtiter plate is preferable.

第１抗体の不溶性担体への不動化（固定化）方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。例えば、ポリスチレン製マイクロタイタープレートを不溶性担体として使用する場合には、プレート内のウェルに第１抗体の溶液を添加して、1時間から1日間、4℃〜30℃でインキュベートすることにより、物理吸着させ固定化する方法をあげることができる。   As a method for immobilizing (immobilizing) the first antibody on an insoluble carrier, a known method such as a method using physical bonding, a method using chemical bonding, or a combination thereof is used. Examples of physical bonds include electrostatic bonds, hydrogen bonds, and hydrophobic bonds. Examples of the chemical bond include a covalent bond and a coordination bond. For example, when a polystyrene microtiter plate is used as an insoluble carrier, the solution of the first antibody is added to the wells in the plate and incubated at 4 ° C. to 30 ° C. for 1 hour to 1 day. The method of adsorbing and immobilizing can be mentioned.

第１抗体は、直接、不溶性担体に不動化（固定化）してもよいし、間接的に不溶性担体に不動化（固定化）してもよい。間接的な不動化（固定化）方法としては、例えばアビジンを固定化した不溶性担体に、ビオチン化した第１抗体の溶液を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、第１抗体を不溶性担体に固定化する方法が挙げられる。また、不溶性担体に、第１抗体に特異的に結合する抗体を固定化し、この抗体を介して第１抗体を不溶性担体に固定化してもよい。あるいは、第１抗体は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。リンカーとしては、例えば、第１抗体の官能基と不溶性担体がその表面に保持している官能基の両者と共有結合できる分子等が挙げられ、第１抗体の官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体がその表面に保持している官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同一分子内に持つ分子が好ましく、その中でも、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が特に好ましい。第１抗体の官能基および不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。   The first antibody may be directly immobilized (immobilized) on an insoluble carrier or indirectly immobilized (immobilized) on an insoluble carrier. As an indirect immobilization (immobilization) method, for example, a solution of a biotinylated first antibody is added to an insoluble carrier on which avidin is immobilized, and the first antibody is bound via specific binding between biotin and avidin. And a method of immobilizing to a non-soluble carrier. Alternatively, an antibody that specifically binds to the first antibody may be immobilized on an insoluble carrier, and the first antibody may be immobilized on the insoluble carrier via this antibody. Alternatively, the first antibody may be immobilized on an insoluble carrier by a covalent bond via a linker. Examples of the linker include a molecule that can be covalently bonded to both the functional group of the first antibody and the functional group held on the surface of the insoluble carrier, and the like, which can react with the functional group of the first antibody. A molecule having one reactive group and the second reactive group capable of reacting with the functional group held on the surface of the insoluble carrier in the same molecule is preferable. Among them, the first reactive activity Molecules in which the group and the second reactive group are different are particularly preferred. The functional group of the first antibody and the functional group held on the surface of the insoluble carrier include carboxyl group, amino group, glycidyl group, sulfhydryl group, hydroxyl group, amide group, imino group, N-hydroxysuccinyl group, maleimide group Etc. Active reactive groups in the linker include allyl azide, carbodiimide, hydrazide, aldehyde, hydroxymethylphosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, pentafluorophenyl (PFP) ester, psoralen, pyridyl disulfide And groups such as vinyl sulfone.

第１抗体が不溶性担体に不動化（固定化）されていない場合には、第１反応工程後の反応液を、第１抗体と反応し得る物質が不動化（固定化）された不溶性担体に供し、その後、不溶性担体を洗浄することにより、第１抗体と測定対象成分の免疫複合体を未反応成分（検体由来の成分、過剰の第１抗体等）から分離することができる。第１抗体と反応し得る物質の不溶性担体への不動化（固定化）は、前述の第１抗体の不溶性担体への不動化（固定化）と同様の方法により行うことができる。   When the first antibody is not immobilized (immobilized) on the insoluble carrier, the reaction solution after the first reaction step is transferred to the insoluble carrier on which the substance capable of reacting with the first antibody is immobilized (immobilized). Then, by washing the insoluble carrier, the immune complex of the first antibody and the component to be measured can be separated from unreacted components (sample-derived component, excess first antibody, etc.). Immobilization (immobilization) of the substance capable of reacting with the first antibody to the insoluble carrier can be performed by the same method as the immobilization (immobilization) of the first antibody to the insoluble carrier.

第２抗体を標識する標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、FITC（フルオレッセイン イソチオシアナート）、RITC（ローダミンＢ−イソチオシアナート）等が挙げられる。その他の蛍光物質として、例えばquantum dot（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、GFP（Green fluorescent Protein）、RFP（Red fluorescent Protein）、YFP（Yellow fluorescent Protein）、BFP（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。発光物質としては、例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたものが好ましい。放射性同位元素としては、例えば、3H、14C、35S、32P、125I、131I等が挙げられる。 Examples of the labeling substance for labeling the second antibody include enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, radioisotopes, biotin, digoxigenin, polypeptides containing tag sequences, metal colloid particles, colored latex particles, and the like. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, galactosidase, glucuronidase, luciferase and the like. Examples of the fluorescent substance include FITC (fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine B-isothiocyanate) and the like. Other fluorescent substances include, for example, quantum dot (Science, 281, 2016-2018, 1998), phycobiliproteins such as phycoerythrin, GFP (Green fluorescent Protein), RFP (Red fluorescent Protein), YFP (Yellow fluorescent Protein), Examples of the fluorescent protein include BFP (Blue fluorescent Protein). Examples of the light-emitting substance include acridinium and its derivatives, ruthenium complex compounds, and lophine. Further, as the ruthenium complex compound, those shown in Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991, which emits light electrochemically together with an electron donor, are preferable. Examples of the radioisotope include 3 H, 14 C, 35 S, 32 P, 125 I, and 131 I.

タグ配列を含むポリペプチドとしては、FLAGペプチド（FLAGタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Hisタグ、His His His His His His）、mycエピトープペプチド（mycタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（HAタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等が挙げられる。   Polypeptides containing tag sequences include FLAG peptide (FLAG tag, Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys), polyhistidine (His tag, His His His His His), myc epitope peptide (myc tag, Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu), hemagglutinin epitope peptide (HA tag, Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) and the like.

第２抗体の標識化は、第２抗体の官能基と標識物質の官能基との間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等が挙げられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。   The labeling of the second antibody can be performed by a reaction that causes a covalent bond between the functional group of the second antibody and the functional group of the labeling substance, with or without a linker. Examples of the functional group include a carboxyl group, amino group, glycidyl group, sulfhydryl group, hydroxyl group, amide group, imino group, hydroxysuccinyl ester group, maleimide group, and isothiocyanate group. It is possible to cause a condensation reaction between these functional groups.

リンカーを介さない結合方法としては例えば、EDC等のカルボジイミド化合物を用いる方法等が挙げられる。この場合、NHSまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。   Examples of the bonding method without using a linker include a method using a carbodiimide compound such as EDC. In this case, it is also possible to use an active ester such as NHS or a derivative thereof. The condensation reaction between the isothiocyanate group and the amino group is preferable because it does not require other reagents and proceeds only by mixing under neutral to weakly alkaline conditions.

リンカーとしては、例えば、第２抗体の官能基に反応する官能基と、標識物質の官能基に反応する官能基の両方の官能基を分子内に有するものが挙げられ、第２抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子が好ましく、その中でも、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基である分子が特に好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基が挙げられる。   Examples of the linker include those having in the molecule both functional groups that react with the functional group of the second antibody and functional groups that react with the functional group of the labeling substance. A molecule having a first functional group capable of reacting with a group and a second functional group capable of reacting with a functional group of a labeling substance in the same molecule is preferred, and among these, the first functional group and Molecules in which the second functional group is a different group are particularly preferred. As a functional group of a linker, the above-mentioned functional group is mentioned, for example.

放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、例えば文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990）記載の方法が挙げられる。
標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従って、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするDNAは、抗体および標識物質をそれぞれコードするDNAをPCR等でクローニングし、それぞれのDNAをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。 Examples of the method for chemically combining radioisotopes include the method described in the literature (Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990).
When the labeling substance is a polypeptide such as an enzyme, avidin, a fluorescent protein, a phycobiliprotein, or a polypeptide containing a tag sequence, a known genetic recombination technique (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring) According to Harbor Laboratory Press, 2001), an expression vector containing a DNA encoding a fusion protein of a labeling substance and an antibody is prepared, the expression vector is introduced into a suitable host, and the host is cultured. DNA encoding the fusion protein can be obtained by cloning the DNA encoding the antibody and the labeling substance by PCR or the like, and ligating each DNA by ligase reaction.

検出工程において、第２反応工程で生成した第１抗体、測定対象成分及び標識化第２抗体の免疫複合体中の標識量を測定する。標識量の測定は、標識物質に応じて適切な方法を選択することができる。標識物質が発色物質、すなわち、ある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により測定することができる。   In the detection step, the amount of label in the immune complex of the first antibody, the measurement target component and the labeled second antibody produced in the second reaction step is measured. For the measurement of the labeling amount, an appropriate method can be selected according to the labeling substance. When the labeling substance is a coloring substance, that is, a substance that absorbs light of a certain wavelength, a spectrophotometer, a multiwell plate reader, or the like can be used. When the labeling substance is a fluorescent substance, a fluorometer, a fluorescent multiwell plate reader, or the like can be used. When the labeling substance is a luminescent substance, a luminescence photometer, a luminescent multiwell plate reader, or the like can be used. When the labeling substance is a radioisotope, the amount of radioisotope can be measured by measuring the radioactivity with a scintillation counter, a γ-well counter, or the like.

標識が酵素である場合、標識量の測定とは、酵素活性を測定することを意味する。酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法、発光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。   When the label is an enzyme, measuring the amount of label means measuring the enzyme activity. The amount of labeling can be measured by reacting an enzyme substrate with the enzyme and measuring the produced substance. When the enzyme is a peroxidase, the peroxidase activity can be measured by, for example, an absorbance method, a fluorescence method, a luminescence method, or the like. As a method for measuring peroxidase activity by an absorbance method, for example, a reaction of peroxidase with a combination of hydrogen peroxide and an oxidative coloring chromogen as its substrate is performed, and the absorbance of the reaction solution is measured using a spectrophotometer, a multiwell plate reader, etc. The method etc. which measure by are mentioned. Examples of the oxidative coloring chromogen include a leuco chromogen and an oxidative coupling coloring chromogen.

ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。   A leuco chromogen is a substance that is converted into a pigment by itself in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase. Specifically, tetramethylbenzidine, o-phenylenediamine, 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7- Bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (MCDP), N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt (DA-64), 4,4′-bis (dimethylamino) ) Diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA), and the like.

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。   The oxidative coupling chromogen is a substance that forms a dye by oxidative coupling of two compounds in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase. Examples of the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aniline (Trinder reagent), a combination of a coupler and a phenol. Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine. Examples of anilines include N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy). -3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N, N-dimethyl-3-methylaniline, N , N-di (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-ethyl- -(3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N- (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N -(3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3- Sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-succinylethylenediamine (EMSE), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-acetylethylenediamine, N-ethyl- N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -4-fluoro-3,5-dimethoxyaniline (F-DAOS) and the like can be mentioned. Examples of phenols include phenol, 4-chlorophenol, 3-methylphenol, 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid (HTIB) and the like.

蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。   As a method for measuring peroxidase activity by a fluorescence method, for example, reacting peroxidase with a combination of its substrate hydrogen peroxide and a fluorescent substance, and measuring the intensity of fluorescence generated by a fluorometer, a fluorescent multiwell plate reader, etc. And the like. Examples of the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.

発光法によるペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等が挙げられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。   As a method for measuring peroxidase activity by the luminescence method, for example, the peroxidase is reacted with a combination of hydrogen peroxide and a luminescent substance as a substrate, and the intensity of luminescence generated by a luminescence intensity meter or a luminescence multiwell plate reader is measured. And the like. Examples of the luminescent substance include a luminol compound and a lucigenin compound.

酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ ＡＰＳ−５）等が挙げられる。 When the enzyme is alkaline phosphatase, alkaline phosphatase activity can be measured by, for example, a luminescence method. Examples of the method for measuring alkaline phosphatase activity by a luminescence method include a method in which alkaline phosphatase and its substrate are reacted and the luminescence intensity of the produced luminescence is measured with a luminescence intensity meter, a luminescence multiwell plate reader, or the like. Examples of alkaline phosphatase substrates include 3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3′-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt (AMPPD), 2-chloro- 5- {4-Methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan] -4-yl} phenyl phosphate disodium salt (CDP-Star ™ ), 3- {4-methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan] -4-yl } Phenylphosphate disodium salt (CSPD ™ ), [10-methyl-9 (10H) -acridinylidene] phenoxymethyl phosphate disodium salt (Lumigen) TM APS-5) and the like.

酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法等によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］またはその類似化合物等が挙げられる。蛍光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。   When the enzyme is β-D-galactosidase, β-D-galactosidase activity can be measured by, for example, an absorbance method (colorimetric method), a luminescence method, or a fluorescence method. Examples of the method for measuring β-D-galactosidase activity by an absorbance method (colorimetric method) include o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside. As a method for measuring β-D-galactosidase activity by a luminescence method, for example, a method in which β-D-galactosidase and its substrate are reacted and the luminescence intensity of the reaction solution is measured with a luminescence intensity meter, a luminescence multiwell plate reader or the like. Etc. Examples of the substrate for β-D-galactosidase include galacton-plus (Galacton-Plus, manufactured by Applied Biosystems) or an analog thereof. As a method of measuring β-D-galactosidase activity by a fluorescence method, for example, a method of reacting β-D-galactosidase and its substrate and measuring the fluorescence of the reaction solution with a fluorometer, a fluorescent multiwell plate reader, or the like Etc. Examples of the substrate for β-D-galactosidase include 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside.

酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。   When the enzyme is luciferase, the luciferase activity can be measured by, for example, a luminescence method. Examples of the method for measuring luciferase activity by the luminescence method include a method of reacting luciferase with its substrate and measuring the luminescence intensity of the reaction solution with a luminescence intensity meter, a luminescence multiwell plate reader, or the like. Examples of the luciferase substrate include luciferin and coelenterazine.

標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の物質（物質Ａとする）である場合は、物質Ａに特異的に結合する物質（物質Ｂ）を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識化物質Ｂと、第２反応工程で生成した第１抗体、測定対象成分及び標識化第２抗体（すなわち、物質Ａで標識化された第２抗体）の免疫複合体とを反応させて、第１抗体、測定対象成分、標識化第２抗体（すなわち、物質Ａで標識化された第２抗体）及び標識化物質Ｂの免疫複合体を生成させて、生成したこの免疫複合体中の標識量を前述の方法により測定することにより、検体中の測定対象成分を測定することができる。物質Ｂとしては、例えば物質Ａに対する抗体、アビジン（物質Ａが、ビオチンの場合）、ストレプトアビジン（物質Ａが、ビオチンの場合）、ビオチン（物質Ａが、アビジン、ストレプトアビジンの場合）等が挙げられる。物質Ａに対する抗体としては、抗体フラグメントでもよく、抗体フラグメントとしては、例えば前述のFab、F(ab’)2、Fab’等が挙げられる。 When the labeling substance is a substance other than a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioisotope, and an enzyme (referred to as substance A), the substance (substance B) that specifically binds to substance A is a fluorescent substance, a luminescent substance, or a radioisotope. Immunoconjugate of labeled substance B labeled with element, enzyme, etc., first antibody generated in the second reaction step, component to be measured and labeled second antibody (ie, second antibody labeled with substance A) And an immune complex of the first antibody, the component to be measured, the labeled second antibody (that is, the second antibody labeled with the substance A) and the labeled substance B were generated and reacted. By measuring the amount of label in this immune complex by the above-described method, the measurement target component in the sample can be measured. Examples of the substance B include an antibody against the substance A, avidin (when the substance A is biotin), streptavidin (when the substance A is biotin), biotin (when the substance A is avidin, streptavidin), and the like. It is done. The antibody against the substance A may be an antibody fragment, and examples of the antibody fragment include the aforementioned Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′ and the like.

尚、本発明の測定方法(1)及び(2)の第１反応工程は、競合法にも適用することができる。競合法としては、具体的には以下の態様が挙げられる。
(4)測定対象成分を、脂肪酸アルカノールアミドの存在下、競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、該測定対象成分と標識化競合物質の両者に結合する抗体と反応させ（競合反応工程）、生成した該標識化競合物質と該抗体の免疫複合体中の標識量を測定する（検出工程）方法。
(5)測定対象成分を、脂肪酸アルカノールアミドの存在下、競合物質、及び、該測定対象成分と該競合物質の両者に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体と反応させ（競合反応工程）、生成した該競合物質と該標識化抗体の免疫複合体中の標識量を測定する（検出工程）方法。 The first reaction step of the measurement methods (1) and (2) of the present invention can also be applied to the competition method. Specific examples of the competition method include the following modes.
(4) The component to be measured is reacted with a labeled competitor having a label bound to the competitor in the presence of fatty acid alkanolamide, and an antibody that binds to both the component to be measured and the labeled competitor (competitive reaction). Step), a method of measuring the amount of label produced in the immunocomplex of the labeled competitive substance and the antibody (detection step).
(5) The component to be measured is reacted with a competitive substance in the presence of a fatty acid alkanolamide, and a labeled antibody in which a label is bound to an antibody that binds to both the component to be measured and the competitive substance (competitive reaction step). A method of measuring the amount of label in the immune complex of the produced competitive substance and the labeled antibody (detection step).

競合反応工程は、胆汁酸誘導体を添加して行ってもよい。また、競合反応工程と検出工程との間に洗浄工程を設けても、設けなくてもよいが、洗浄工程を設けることが好ましい。洗浄工程としては、例えば前述の測定方法(1)〜(3)での洗浄工程等が挙げられる。   The competitive reaction step may be performed by adding a bile acid derivative. In addition, although a washing process may or may not be provided between the competitive reaction process and the detection process, it is preferable to provide a washing process. Examples of the washing step include the washing step in the above-described measurement methods (1) to (3).

上記(4)の方法においては、測定対象成分と標識化競合物質の両者に結合する抗体は、不溶性担体に不動化（固定化）されていても、不動化（固定化）されていなくてもよいが、不動化（固定化）されていることが好ましい。また、上記(5)の方法においては、競合物質は、不溶性担体に不動化（固定化）されていなくても、不動化（固定化）されていてもよいが、不動化（固定化）されていることが好ましい。   In the method (4) above, the antibody that binds to both the component to be measured and the labeled competitor can be immobilized (immobilized) on the insoluble carrier or not (immobilized). Although it is good, it is preferably immobilized (immobilized). In the above method (5), the competitor may be immobilized (immobilized) or not immobilized to the insoluble carrier, but may be immobilized (immobilized). It is preferable.

競合反応工程は、水性媒体存在下で行っても、水性媒体非存在下で行ってもよいが、水性媒体存在下で行うことが好ましい。水性媒体としては、例えば後述の水性媒体等が挙げられる。ここで、競合物質とは、「測定対象成分に結合する抗体」に結合できる物質であって、かつその結合が、該測定対象成分と競合的であるような物質を意味し、測定対象成分そのものも含まれる。競合物質は、検体中の測定対象成分を競合法により測定する際に使用されるものである。従って、競合法において用いる測定対象成分に結合する抗体は、測定対象成分および競合物質に結合する抗体であり、該測定対象成分と結合して免疫複合体を生成するとともに、競合物質とも結合して免疫複合体を生成する。   The competitive reaction step may be performed in the presence or absence of an aqueous medium, but is preferably performed in the presence of an aqueous medium. As an aqueous medium, the below-mentioned aqueous medium etc. are mentioned, for example. Here, the competing substance means a substance that can bind to the “antibody that binds to the measurement target component”, and that binding is competitive with the measurement target component, and the measurement target component itself Is also included. The competing substance is used when measuring the component to be measured in the specimen by the competing method. Therefore, the antibody that binds to the measurement target component used in the competition method is an antibody that binds to the measurement target component and the competitive substance. The antibody binds to the measurement target component to form an immune complex and also binds to the competitive substance. Generate immune complexes.

競合物質としては、成分に結合する抗体が認識するエピトープの構造と同じ構造を有している物質が好ましく、さらに測定対象成分に結合する抗体に対する結合の強さが、該抗体に対する該成分の結合の強さと同程度であるものが好ましい。測定対象成分そのものは競合物質として好ましい。標識化競合物質は、競合物質と前述の標識物質とを用いて、前述の標識化第２抗体と同様の方法により調製することができる。   The competitive substance is preferably a substance having the same structure as the epitope recognized by the antibody that binds to the component, and the strength of binding to the antibody that binds to the component to be measured is determined by the binding of the component to the antibody. Those having the same degree of strength are preferred. The component to be measured itself is preferable as a competitive substance. The labeled competitor can be prepared by the same method as that for the labeled second antibody, using the competitor and the aforementioned labeling substance.

本発明において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。   Examples of the aqueous medium used in the present invention include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable. The buffer used for preparing the buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffering capacity. For example, a lactic acid buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, a succinate buffer, and phthalic acid having a pH of 1 to 11 are used. Buffer, phosphate buffer, triethanolamine buffer, diethanolamine buffer, lysine buffer, barbitur buffer, imidazole buffer, malate buffer, oxalate buffer, glycine buffer, borate buffer, Examples include carbonate buffer, glycine buffer, and Good buffer.

グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。   Examples of the good buffer include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer, bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer, and tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris). Buffer, N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer, piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) buffer, 2- [N- (2-acetamido) Amino] ethanesulfonic acid (ACES) buffer, 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) buffer, 2- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] ethanesulfonic acid (BES) buffer Agent, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer, 2- {N- [tris (hydroxymes L) Methyl] amino} ethanesulfonic acid (TES) buffer, N- (2-hydroxyethyl) -N ′-(2-sulfoethyl) piperazine (HEPES) buffer, 3- [N, N-bis (2- Hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPSO) buffer, 2-hydroxy-3-{[N-tris (hydroxymethyl) methyl] amino} propanesulfonic acid (TAPSO) buffer, piperazine-N, N′-bis (2-hydroxypropane-3-sulfonic acid) (POPSO) buffer, N- (2-hydroxyethyl) -N ′-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) piperazine (HEPPSO) buffer, N- (2-hydroxyethyl) -N ′-(3-sulfopropyl) piperazine (EPPS) buffer, tricine [N-tris Hydroxymethyl) methylglycine] buffer, bicine [N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine] buffer, 3- [N-tris (hydroxymethyl) methyl] aminopropanesulfonic acid (TAPS) buffer, 2 -(N-cyclohexylamino) ethanesulfonic acid (CHES) buffer, 3- (N-cyclohexylamino) -2-hydroxypropanesulfonic acid (CAPSO) buffer, 3- (N-cyclohexylamino) propanesulfonic acid (CAPS) ) Buffering agents and the like.

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0mol/Lが好ましく、0.005〜1.0mol/Lがより好ましく、0.01〜0.1mol/Lが特に好ましい。   The concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L, and particularly preferably 0.01 to 0.1 mol / L.

本発明の測定方法においては、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を共存させることができる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等が挙げられる。   In the measurement method of the present invention, metal ions, salts, saccharides, preservatives, proteins, protein stabilizers and the like can coexist. Examples of the metal ion include magnesium ion, manganese ion, zinc ion and the like. Examples of the salts include sodium chloride and potassium chloride. Examples of the saccharide include mannitol and sorbitol. Examples of preservatives include sodium azide, antibiotics (streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.), Bioace, Procrine 300, Proxel GXL, and the like. Examples of the protein include bovine serum albumin (BSA), fetal bovine serum (FBS), casein, block ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and the like. Examples of the protein stabilizer include peroxidase stabilizing buffer (Peroxidase Stabilizing Buffer, manufactured by DakoCytomation).

（８）測定用キット
本発明の測定用キットは、検体中の測定対象成分の免疫学的測定用キットであって、本発明の測定方法に使用することができる。 (8) Measurement kit The measurement kit of the present invention is a kit for immunological measurement of components to be measured in a sample, and can be used in the measurement method of the present invention.

本発明の測定用キットは、測定対象成分に結合する第１抗体、及び、脂肪酸アルカノールアミドを含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を含む第２試薬とを含むことを特徴とする測定用キットである。また、本発明の測定用キットは、測定対象成分に結合する第１抗体を含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第２試薬とを含むことを特徴とする測定用キットである。本発明の測定用キットの具体的態様を以下に示す。   The measurement kit of the present invention comprises a first antibody that binds to a component to be measured, a first reagent containing a fatty acid alkanolamide, and a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the component to be measured. A measurement kit comprising a second reagent. Further, the measurement kit of the present invention includes a first reagent containing a first antibody that binds to a measurement target component, a labeled second antibody in which a label is bound to a second antibody that binds to the measurement target component, and polyoxy And a second reagent containing an ethylene-based nonionic surfactant. Specific embodiments of the measurement kit of the present invention are shown below.

(1)測定対象成分に結合する第１抗体、及び、脂肪酸アルカノールアミドを含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を含む第２試薬とを含む、検体中の測定対象成分の測定用キット。
(2)測定対象成分に結合する第１抗体を含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第２試薬とを含む、検体中の測定対象成分の測定用キット。
(3)測定対象成分に結合する第１抗体、及び、脂肪酸アルカノールアミドを含む第１試薬と、測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体、及び、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含む第２試薬とを含む、検体中の測定対象成分の測定用キット。 (1) a first reagent that binds to a measurement target component and a first reagent that contains a fatty acid alkanolamide; a second reagent that includes a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the measurement target component; A kit for measuring a component to be measured in a sample.
(2) a first reagent containing a first antibody that binds to the component to be measured, a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the component to be measured, and a polyoxyethylene nonionic surfactant A kit for measuring a component to be measured in a specimen, comprising a second reagent containing an agent.
(3) a first antibody that binds to the component to be measured, a first reagent that contains a fatty acid alkanolamide, a labeled second antibody in which a label is bound to the second antibody that binds to the component to be measured, and polyoxyethylene And a second reagent containing a nonionic surfactant, a measurement kit for a component to be measured in a specimen.

第１試薬には、胆汁酸誘導体が含まれていてもよい。   The first reagent may contain a bile acid derivative.

上記(1)及び(3)のキットにおいては、第１試薬は、脂肪酸アルカノールアミドを含む試薬［第１試薬（Ａ）］と、測定対象成分に対する第１抗体を含有する試薬［第１試薬（Ｂ）］とが別々に保存される試薬形態を取ることもできる。上記(1)及び(3)のキットにおいて、胆汁酸誘導体が第１試薬に含まれる場合は、第１試薬は、脂肪酸アルカノールアミドと胆汁酸誘導体とを含む試薬［第１試薬（Ａ）］と、測定対象成分に対する第１抗体を含有する試薬［第１試薬（Ｂ）］とが別々に保存される試薬形態を取ることもできる。また、上記(2)のキットにおいて、胆汁酸誘導体が第１試薬に含まれる場合は、第１試薬は、胆汁酸誘導体を含む試薬［第１試薬（Ａ）］と、測定対象成分に対する第１抗体を含有する試薬［第１試薬（Ｂ）］とが別々に保存される試薬形態を取ることもできる。ここで、第１試薬（Ａ）は、検体前処理液として使用することができる。   In the kits of (1) and (3), the first reagent is a reagent containing a fatty acid alkanolamide [first reagent (A)] and a reagent containing a first antibody against the component to be measured [first reagent ( B)] can also be in the form of a reagent stored separately. In the kits of (1) and (3) above, when the bile acid derivative is contained in the first reagent, the first reagent is a reagent [first reagent (A)] containing a fatty acid alkanolamide and a bile acid derivative; In addition, a reagent form in which the reagent [first reagent (B)] containing the first antibody against the component to be measured is stored separately can be used. In the kit of (2), when the bile acid derivative is contained in the first reagent, the first reagent is a reagent containing the bile acid derivative [first reagent (A)] and the first component for the measurement target component. It is also possible to take a reagent form in which the antibody-containing reagent [first reagent (B)] is stored separately. Here, the first reagent (A) can be used as a sample pretreatment liquid.

本発明のキットの形態は、溶液形態、凍結乾燥形態等、いかなる形態でもよい。本発明のキットにおける第１抗体、標識化第２抗体、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤、胆汁酸誘導体としては、ぞれぞれ、例えば前述のものが挙げられる。また、本発明のキットは、必要に応じて、前述の水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を含有することができる。   The form of the kit of the present invention may be any form such as a solution form or a lyophilized form. Examples of the first antibody, the labeled second antibody, the fatty acid alkanolamide, the polyoxyethylene nonionic surfactant, and the bile acid derivative in the kit of the present invention include those described above, for example. Moreover, the kit of this invention can contain the above-mentioned aqueous medium, a metal ion, salts, saccharides, antiseptic | preservative, protein, protein stabilizer, etc. as needed.

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, these do not limit the scope of the present invention at all.

［１］抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体の調製
以下のようにして、エピトープの異なる２種類の抗ヒトＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４（ＷＯ９６／０５２３０）およびＫＭ１１３５（ＷＯ９６／０５２３０）を調製した。なお、ＫＭ１１２４は、ヒトＭｘＡ蛋白質のアミノ末端から２２０〜２９７残基中に存在するエピトープ、ＫＭ１１３５はヒトＭｘＡ蛋白質のアミノ末端から１０〜２２０残基中に存在するエピトープとそれぞれ結合するマウスモノクローナル抗体である。 [1] Preparation of anti-MxA protein monoclonal antibody Two types of anti-human MxA protein monoclonal antibodies KM1124 (WO96 / 05230) and KM1135 (WO96 / 05230) having different epitopes were prepared as follows. KM1124 is a mouse monoclonal antibody that binds to an epitope present in residues 220 to 297 from the amino terminus of human MxA protein, and KM1135 is a mouse monoclonal antibody that binds to an epitope present in residues 10 to 220 from the amino terminus of human MxA protein. is there.

プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb／c）に、モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７２９）およびモノクローナル抗体ＫＭ１１３５を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７３１）をそれぞれ5〜20×106細胞／匹ずつ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマ株が腹水癌化し、腹水のたまったマウスから腹水を採取した。採取した腹水を3,000rpmで5分間、遠心分離して固形分を除去し、上清を回収した。この上清から、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）により精製したモノクローナル抗体を、ＭｘＡ蛋白質の免疫測定方法に用いた。 Pristane-treated 8-week-old nude female mice (Balb / c) were each supplied with 5 hybridoma strains KM1124 (FERM BP-4729) producing monoclonal antibody KM1124 and 5 hybridoma strains KM1135 (FERM BP-4731) producing monoclonal antibody KM1135. -20 × 10 6 cells / mouse were injected intraperitoneally. Ten to 21 days later, the hybridoma strain became ascites tumor, and ascites was collected from the mice with ascites. The collected ascites was centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids, and the supernatant was collected. A monoclonal antibody purified from this supernatant by the caprylic acid precipitation method (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) was used for the immunoassay of MxA protein.

［２］リコンビナントＭｘＡ蛋白質の調製
ヒトＭｘＡ蛋白質をコードするcDNAを含むNdeI-BamHI断片（GenbankにBC032602として登録されている塩基配列を基に調製）を、ベクターpET-14b［ノバジェン（Novagen）、ＥＭＤバイオサイエンシズ（EMD Biosciences）社製］のNdeI-BamHI間に挿入して作製したヒトＭｘＡ蛋白質発現ベクターpET14b-MxA（Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004）でEscherichia coli BL21 (DE3) pLysS株を形質転換した。この形質転換体は、Ｎ末端にHisタグが付加したＭｘＡ蛋白質を発現する。 [2] Preparation of recombinant MxA protein NdeI-BamHI fragment containing cDNA encoding human MxA protein (prepared based on nucleotide sequence registered as Gen03 BC032602) was used in vector pET-14b [Novagen, EMD Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS strain with human MxA protein expression vector pET14b-MxA (Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004) prepared by inserting between NdeI and BamHI of EMD Biosciences Was transformed. This transformant expresses an MxA protein with a His tag added to the N-terminus.

得られた形質転換体を、アンピシリンを含むLB培地5mLに植菌し、600nmの吸光度(OD600)が0.5になるまで37℃で振とう培養した。この培養液をアンピシリンを含むLB培地250mLに植菌し、600nmでの吸光度が0.3〜0.5になるまで37℃で振とう培養した。ここに、イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を終濃度0.4mmol/Lになるように添加し、さらに37℃で2時間振とう培養した。得られた培養液を4℃で3,000rpm、10分間遠心分離して菌体を回収した。菌体はＭｘＡ蛋白質の調製まで-80℃で保存した。   The obtained transformant was inoculated into 5 mL of LB medium containing ampicillin and cultured with shaking at 37 ° C. until the absorbance at 600 nm (OD600) reached 0.5. This culture was inoculated into 250 mL of LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. with shaking until the absorbance at 600 nm reached 0.3 to 0.5. To this, isopropylthiogalactoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.4 mmol / L, and further cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours. The obtained culture solution was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the cells were collected. The cells were stored at −80 ° C. until preparation of MxA protein.

ＭｘＡ蛋白質は菌体内に不溶体（inclusion body）の状態で存在していたので、菌体を氷上で融解させ、氷冷した結合緩衝液（5mmol/Lイミダゾール、0.5mol/L塩化ナトリウム、20mmol/L Tris-HCl、pH7.9）20mLを添加し、懸濁させた。菌体懸濁液に30秒ずつ5回の超音波処理をして菌体を破砕した後、4℃で4,000rpmで10分間遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に氷冷した結合緩衝液20mLを添加して懸濁させ、再び同様に超音波処理と遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に6mol/L尿素を含む結合緩衝液20mLを添加し、懸濁させた。同様に超音波処理を行った後、氷上で30分間静置して不溶体を溶解させ、4℃で10,000rpmで30分間遠心分離を行った。上清を回収して0.45nmミリポアフィルターでろ過した。   Since the MxA protein was present as an inclusion body in the microbial cells, the microbial cells were thawed on ice and ice-cooled binding buffer (5 mmol / L imidazole, 0.5 mol / L sodium chloride, 20 mmol / 20 mL of L Tris-HCl, pH 7.9) was added and suspended. The bacterial cell suspension was sonicated 5 times for 30 seconds to crush the bacterial cells, and then centrifuged at 4 ° C. and 4,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed, and 20 mL of ice-cooled binding buffer was added to the precipitate to suspend it, and sonication and centrifugation were again performed in the same manner. The supernatant was removed, and 20 mL of binding buffer containing 6 mol / L urea was added to the precipitate and suspended. Similarly, after sonication, the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes to dissolve insoluble matter, and centrifuged at 4 ° C. and 10,000 rpm for 30 minutes. The supernatant was collected and filtered through a 0.45 nm Millipore filter.

得られた溶液にNi-NTA His・Bindレジン（ノバジェン、ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）0.5mLを添加し、4℃で2時間回転させながら混和させ、Hisタグを介してレジンにＭｘＡ蛋白質を結合させた。4℃で3,000rpmで2分間遠心分離し、レジンを回収した。レジンに氷冷した6mol/L尿素を含む結合緩衝液10mLを添加した後、4℃で3,000rpmで2分間遠心分離し、レジンを回収した。この洗浄操作を再度繰り返した後、さらにレジンに氷冷した洗浄緩衝液（6mol/L尿素、60mmol/Lイミダゾール、0.5mol/L塩化ナトリウム、20mmol/L Tris-HCl、pH7.9）10mLを添加し、4℃で3,000rpmで2分間遠心分離し、レジンを回収した。   Add 0.5 mL of Ni-NTA His • Bind resin (Novagen, manufactured by EMD Biosciences) to the resulting solution, mix while rotating for 2 hours at 4 ° C., and bind the MxA protein to the resin via the His tag. It was. The resin was collected by centrifugation at 3,000 rpm for 2 minutes at 4 ° C. After adding 10 mL of a binding buffer containing 6 mol / L urea cooled with ice to the resin, the resin was centrifuged at 3,000 rpm for 2 minutes at 4 ° C. to recover the resin. After repeating this washing operation again, add 10 mL of ice-cooled washing buffer (6 mol / L urea, 60 mmol / L imidazole, 0.5 mol / L sodium chloride, 20 mmol / L Tris-HCl, pH 7.9) to the resin. The resin was then recovered by centrifugation at 3,000 rpm for 2 minutes at 4 ° C.

レジンに、氷冷した溶出緩衝液（6mol/L尿素、1mol/Lイミダゾール、0.5mol/L塩化ナトリウム、20mmol/L Tris-HCl、pH7.9）10mLを添加し、4℃で2時間回転させながら混和させ、レジンからＭｘＡ蛋白質を溶出させた。このレジンを含む混合液を4℃、3,000rpmで2分間遠心分離し、上清のＭｘＡ蛋白質溶液を回収した。回収したＭｘＡ蛋白質溶液は、ＭｘＡ蛋白質の測定に用いる標準液を調製するために使用した。   Add 10 mL of ice-cold elution buffer (6 mol / L urea, 1 mol / L imidazole, 0.5 mol / L sodium chloride, 20 mmol / L Tris-HCl, pH 7.9) to the resin, and rotate at 4 ° C for 2 hours. The MxA protein was eluted from the resin. The mixture containing the resin was centrifuged at 3,000 rpm for 2 minutes at 4 ° C., and the supernatant MxA protein solution was recovered. The recovered MxA protein solution was used to prepare a standard solution used for measurement of MxA protein.

［３］ネイティブＭｘＡ蛋白質の調製
接着性のヒトグリア芽細胞種由来の細胞株T98G（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社より購入、J. Cell. Physiol., 99, 43-54, 1979）を、10%ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、1%非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）、1mmol/Lピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社製）を添加したE-MEM培地（和光純薬工業社製）10mLを添加した細胞培養用の10mLフラスコ内で、コンフルエントになるまで、炭酸ガス培養装置（5%CO2、37℃）を用いて2〜3日間培養した。細胞がコンフルエントになったところで、細胞を150cm2フラスコに移して同様に培養を行った。150cm2フラスコ内で細胞がコンフルエントになったところで、培地を吸引除去し、ＰＢＳ(−)（カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液）で洗浄し、0.02%ＥＤＴＡを加え洗浄した。次に0.25%トリプシン溶液を添加して細胞をはがした後、等量の培養用培地を加えてトリプシンの作用を止め、細胞を回収し、25℃3分間遠心分離(1,400rpm)した。細胞数をカウントし、新しい培養用培地を添加した150cm2フラスコに1×105細胞/mL程度に細胞を懸濁し、Interferon alpha A protein（フナコシ）を2,000U/mLになるよう添加した。24時間炭酸ガス培養装置を用いて培養し、培地を吸引除去し、ＰＢＳ(−)洗浄し、0.02%ＥＤＴＡを加え洗浄した。次に0.25%トリプシン溶液を添加して細胞をはがした後、等量の培養用培地を加えてトリプシンの作用を止め、細胞を回収し、25℃3分間遠心分離(1,400rpm)した。上清を除去し、0.5mLの低張緩衝液(10mmol/L ＨＥＰＥＳ、1.5mmol/L MgCl2、10mmol/L KCl)を添加して細胞を懸濁し溶液を回収し、使用するまで-80℃で保存した。 [3] Preparation of native MxA protein 10% bovine cell line T98G (purchased from DS Pharma Biomedical Co., Ltd., J. Cell. Physiol., 99, 43-54, 1979) derived from an adherent human glioblastoma cell type For cell culture supplemented with 10 mL of E-MEM medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) supplemented with fetal serum (FBS), 1% non-essential amino acid (Invitrogen Corp.) and 1 mmol / L sodium pyruvate (Invitrogen Corp.) In a 10 mL flask, the cells were cultured for 2 to 3 days using a carbon dioxide culture apparatus (5% CO 2 , 37 ° C.) until they became confluent. When the cells became confluent, the cells were transferred to a 150 cm 2 flask and cultured in the same manner. When the cells became confluent in the 150 cm 2 flask, the medium was removed by suction, washed with PBS (−) (phosphate buffer not containing calcium or magnesium), and washed with 0.02% EDTA. Next, after adding 0.25% trypsin solution to peel off the cells, an equal volume of culture medium was added to stop the action of trypsin, and the cells were collected and centrifuged (1,400 rpm) at 25 ° C. for 3 minutes. The number of cells was counted, cells were suspended at about 1 × 10 5 cells / mL in a 150 cm 2 flask to which a new culture medium was added, and Interferon alpha A protein (Funakoshi) was added to 2,000 U / mL. The cells were cultured using a carbon dioxide culture apparatus for 24 hours, the medium was removed by suction, washed with PBS (−), and washed with 0.02% EDTA. Next, after adding 0.25% trypsin solution to peel off the cells, an equal volume of culture medium was added to stop the action of trypsin, and the cells were collected and centrifuged (1,400 rpm) at 25 ° C. for 3 minutes. The supernatant is removed, 0.5 mL of hypotonic buffer (10 mmol / L HEPES, 1.5 mmol / L MgCl 2 , 10 mmol / L KCl) is added to suspend the cells, recover the solution, and use at −80 ° C. until use. Saved with.

［４］抗ＭｘＡ蛋白質抗体固相化プレートの調製
［１］で調製した抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５を5μg/mLになるように100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.5)で希釈し、96ウェルマイクロタイタープレート［ナルジェンヌンクインターナショナル（Nalge Nunc International）社製］に100μL/ウェルの量で分注した。3日間放置後、上清を吸引除去し、1%ブロックエース（大日本製薬社製）、50mmol/L塩化ナトリウムを含むpH7.2リン酸緩衝液300μLを各ウェルに分注し室温で一晩静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、ＰＢＳで洗浄した。真空乾燥機で3日間乾燥したものを、抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体固相化プレートとして使用した。 [4] Preparation of anti-MxA protein antibody-immobilized plate The anti-MxA protein monoclonal antibody KM1135 prepared in [1] is 100 mmol / L phosphate buffer (pH 7. 5) containing 100 mmol / L sodium chloride so as to be 5 μg / mL. The product was diluted in 5) and dispensed into a 96-well microtiter plate (manufactured by Nalge Nunc International) in an amount of 100 μL / well. After leaving for 3 days, the supernatant is removed by aspiration, 300 μL of pH7.2 phosphate buffer containing 1% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 50 mmol / L sodium chloride is dispensed into each well overnight at room temperature. It left still and blocked. After removing the blocking solution, the plate was washed with PBS. What dried for 3 days with the vacuum dryer was used as an anti- MxA protein monoclonal antibody solid-phased plate.

［５］ペルオキシダーゼ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体の調製
［１］で調製した抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を以下のようにしてマレイミド法でペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）と結合させ、ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体を作製した。 [5] Preparation of peroxidase-labeled anti-MxA protein antibody The anti-MxA protein monoclonal antibody KM1124 prepared in [1] is bound to peroxidase (hereinafter abbreviated as POD) by the maleimide method as follows, and POD-labeled anti-MxA protein antibody Was made.

まず、［１］で調製したＫＭ１１２４(2mg)を含むリン酸緩衝液を0.1mol/Lホウ酸緩衝液(pH8.0)に置換し、アミコン（Amicon）攪拌式セル［ミリポア（Millipore）社製］を用いて1mLの容量に濃縮した。濃縮後の溶液に、2.15mg/mLの２−イミノチオラン塩酸塩［ピアース（Pierce）社製］を含む0.1mol/Lホウ酸緩衝液(pH8.0)40μLを添加し、攪拌後、30℃で30分間反応させた。上記の反応において２−イミノチオラン塩酸塩は、ＫＭ１１２４に対しモル比で50倍量を用いた。5mmol/Lエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を加えた0.1mol/Lのリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ２５（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラム（直径1.5cm×30cm）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応の２−イミノチオラン塩酸塩を除去し、スルフヒドリル化したＫＭ１１２４を回収した。回収した溶液をアミコン攪拌式セルを用いて、5mLの容量に濃縮した。   First, the phosphate buffer containing KM1124 (2 mg) prepared in [1] was replaced with 0.1 mol / L borate buffer (pH 8.0), and Amicon stirred cell [Millipore Co., Ltd. ] To a volume of 1 mL. To the solution after concentration, 40 μL of 0.1 mol / L borate buffer (pH 8.0) containing 2.15 mg / mL 2-iminothiolane hydrochloride (manufactured by Pierce) was added and stirred at 30 ° C. Reacted for 30 minutes. In the above reaction, 2-iminothiolane hydrochloride was used in a 50-fold molar ratio with respect to KM1124. Sephadex G25 (Amersham Biosciences) column equilibrated with 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 6.0) with 5 mmol / L disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA · 2Na) ( The solution after the reaction was subjected to gel filtration using a diameter of 1.5 cm × 30 cm), unreacted 2-iminothiolane hydrochloride was removed, and sulfhydrylated KM1124 was recovered. The collected solution was concentrated to a volume of 5 mL using an Amicon stirred cell.

一方、ＫＭ１１２４に対しモル比で5倍量にあたるＰＯＤ（東洋紡績社製、ペルオキシダーゼＩ−Ｃ）2.5mgを0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)250μLに溶解させた。この溶液を30℃で5分間加温した後、20mg/mLのＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所社製）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）溶液36μLを加えて攪拌し、30℃で30分間反応させた。上記の反応においてＥＭＣＳは、ＰＯＤに対しモル比で40倍量を用いた。0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化したセファデックスＧ２５カラム（直径1.5cm×30cm）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応のＥＭＣＳを除去し、マレイミド化したＰＯＤを回収した。回収した溶液をアミコン攪拌式セルを用いて濃縮した。   Meanwhile, 2.5 mg of POD (peroxidase IC, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) in a molar ratio of 5 times with respect to KM1124 was dissolved in 250 μL of 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 7.0). After this solution was heated at 30 ° C. for 5 minutes, N, N-dimethylformamide (manufactured by Dojindo Laboratories) of 20 mg / mL N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS, manufactured by Dojindo Laboratories) ) 36 μL of the solution was added and stirred, and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. In the above reaction, EMCS was used in a 40-fold molar ratio with respect to POD. Using a Sephadex G25 column (diameter 1.5 cm × 30 cm) equilibrated with 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 6.0), gel filtration of the solution after reaction was performed to remove unreacted EMCS, Maleimidated POD was recovered. The collected solution was concentrated using an Amicon stirred cell.

上記で得られたスルフヒドリル化したＫＭ１１２４の溶液とマレイミド化したＰＯＤの溶液を混合し、アミコン攪拌式セルを用いて、さらに容量を2mLに濃縮した後、30℃で1時間反応させた。得られた標識化抗体は、使用するまで-80℃で保存した。   The sulfhydrylated KM1124 solution obtained above and the maleimidated POD solution were mixed, and the volume was further concentrated to 2 mL using an Amicon stirred cell, followed by reaction at 30 ° C. for 1 hour. The resulting labeled antibody was stored at −80 ° C. until use.

［６］検体希釈液および標準液の調製
以下の組成からなる検体希釈液を調製した。
ＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所社製）（ｐＨ８．０） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所社製） ４．９％
界面活性剤 （第１表に記載の種類と濃度）
塩化ナトリウム １．５ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ［インタージェン（InterGen）社製］ ０．１％
アジ化ナトリウム ０．１％
前記［２］で調製したリコンビナントＭｘＡ蛋白質溶液を上記検体希釈液で希釈し、ＭｘＡ蛋白質の0（検体希釈液のみ）、0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24ng/mLの各濃度の溶液を調製し、標準液とした。 [6] Preparation of specimen dilution liquid and standard liquid A specimen dilution liquid having the following composition was prepared.
HEPES (manufactured by Dojindo Laboratories) (pH 8.0) 0.1 mol / L
CHAPS (Dojindo Laboratories) 4.9%
Surfactant (Types and concentrations listed in Table 1)
Sodium chloride 1.5 mol / L
BSA [manufactured by InterGen] 0.1%
Sodium azide 0.1%
The recombinant MxA protein solution prepared in [2] above is diluted with the above-mentioned sample diluent, and each concentration of MxA protein is 0 (sample diluent only), 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24 ng / mL. A solution was prepared and used as a standard solution.

［７］検量線の作製
前記［４］で作製した抗ＭｘＡ蛋白質抗体（ＫＭ１１３５）固定化プレートに、［６］で作製した標準液100μLを添加し、1時間インキュベートし、抗体にＭｘＡ蛋白質を結合させた。反応液を除去した後、洗浄液［0.05%ツイーン２０（関東化学社製）を含むＰＢＳ］を400μL添加して除去する洗浄操作を5回行った。次いで、［５］で作製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体（ＫＭ１１２４）を、ＰＯＤ標識抗体希釈液（液状組成）緩衝液[50mmol/L Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、0.1%ＢＳＡ（インタージェン（InterGen）社製）、0.01%４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ；埼京化成社製）、0.035%プロクリン３００（シグマ社製）、0.1%ノニデットＰ４０]にて800倍に希釈したものを調製し、これを100μL添加して30分間反応させた。反応液を除去し、前述の洗浄液を400μL添加してプレートを洗浄し、洗浄液を除去する洗浄操作を5回行った。暗所で、0.05%テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含むＰＯＤの発色基質ＴＭＢｌｕｅ［セロロジカル（Serological）社製］を100μL添加し、室温で10分間反応させた。0.5mol/L硫酸を100μL添加して室温で10分間インキュベーションして反応を停止させた。波長450nmでの吸光度をプレートリーダーで測定した。これらの一連の操作により、ＭｘＡ蛋白質濃度と吸光度との関係を表す検量線を作製した。 [7] Preparation of calibration curve To the anti-MxA protein antibody (KM1135) immobilized plate prepared in [4] above, add 100 μL of the standard solution prepared in [6], incubate for 1 hour, and bind the MxA protein to the antibody I let you. After removing the reaction solution, the washing operation [400 μL of PBS containing 0.05% Tween 20 (manufactured by Kanto Chemical Co.)] was added and removed five times. Next, the POD-labeled anti-MxA protein antibody (KM1124) prepared in [5] was mixed with a POD-labeled antibody diluent (liquid composition) buffer [50 mmol / L Bis-Tris (manufactured by Dojindo Laboratories), 0.1% BSA ( Intergen (manufactured by InterGen), 0.01% 4-aminoantipyrine (4-AA; manufactured by Saikyo Kasei Co., Ltd.), 0.035% procrine 300 (manufactured by Sigma), 0.1% nonidet P40] This was prepared, 100 μL of this was added and allowed to react for 30 minutes. The reaction solution was removed, 400 μL of the above-mentioned washing solution was added to wash the plate, and washing operation for removing the washing solution was performed 5 times. In a dark place, 100 μL of a POD chromogenic substrate TMBlue (manufactured by Serological) containing 0.05% tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide was added and allowed to react at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μL of 0.5 mol / L sulfuric acid and incubating at room temperature for 10 minutes. Absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with a plate reader. Through a series of these operations, a calibration curve representing the relationship between the MxA protein concentration and the absorbance was prepared.

次に、検体として、先の標準液の代わりに、培養細胞や全血検体を用いて同様の操作を行い、各検体における測定値を得、得られた測定値を予め作製した検量線と関連付け、各検体中のＭｘＡ蛋白質濃度を決定した。   Next, use the cultured cells or whole blood sample instead of the previous standard solution as the sample, perform the same operation, obtain the measured value for each sample, and associate the obtained measured value with the calibration curve prepared in advance. The MxA protein concentration in each specimen was determined.

［８］ＭｘＡ蛋白質測定における測定値変動の検討１ （一次反応）
前記[３]で使用した接着性のヒトグリア芽細胞種由来の細胞株Ｔ９８Ｇをインターフェロンで刺激してＭｘＡ蛋白質を誘導させ、ネイティブＭｘＡ蛋白質を得た。得られたネイティブＭｘＡ蛋白質の反応性をリコンビナントＭｘＡ蛋白質と比較することにより、抗体のリコンビナントＭｘＡ蛋白質に対する反応性と、抗体のネイティブＭｘＡ蛋白質に対する反応性との相違について検討した。 [8] Examination of variation in measured value in MxA protein measurement 1 (Primary reaction)
The adherent human glioblastoma cell line T98G used in [3] above was stimulated with interferon to induce MxA protein to obtain native MxA protein. By comparing the reactivity of the obtained native MxA protein with the recombinant MxA protein, the difference between the reactivity of the antibody to the recombinant MxA protein and the reactivity of the antibody to the native MxA protein was examined.

前記[３]で作製したネイティブＭｘＡ蛋白質を［６］の検体希釈液で20倍希釈し、30分間静置することで細胞の可溶化を行ない、さらに検体希釈液で8倍に希釈して測定用試料とした。   The native MxA protein prepared in [3] above is diluted 20-fold with the sample diluent of [6] and allowed to stand for 30 minutes to solubilize the cells, and further diluted with the sample dilution solution to 8-fold. A sample was prepared.

この試料と実施例の［６］で調製した各濃度の標準液を検体として用いて、［７］に記載された操作に従い測定を行った。但し、一次反応は25℃と37℃の両温度で行い、二次反応および発色反応については25℃で行った。ここで、25℃反応時と37℃反応時におけるネイティブＭｘＡ蛋白質の測定値変動率は、以下の式（Ｉ）により算出した。結果を第１表に示す。   Measurement was performed according to the procedure described in [7] using this sample and the standard solution of each concentration prepared in [6] of Example as a specimen. However, the primary reaction was performed at both 25 ° C. and 37 ° C., and the secondary reaction and the color development reaction were performed at 25 ° C. Here, the measured value fluctuation rate of the native MxA protein during the 25 ° C. reaction and the 37 ° C. reaction was calculated by the following formula (I). The results are shown in Table 1.

Figure 0006014091
Figure 0006014091

〔比較例１〕
実施例１の[６]の検体希釈液の組成中、界面活性剤を1.2%ノニデットＰ４０（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）とすること以外は同じ組成の検体希釈液を用いて、実施例１と同様の方法により反応温度による測定値変動率を算出した。結果を第１表に示す。 [Comparative Example 1]
In the composition of the specimen diluent of [1] in Example 1, the specimen diluent of the same composition was used except that the surfactant was 1.2% nonidet P40 (polyoxyethylene alkylphenyl ether). The measured value fluctuation rate depending on the reaction temperature was calculated in the same manner. The results are shown in Table 1.

Figure 0006014091
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第１表に示すとおり、測定値変動率について、界面活性剤を用いなかった場合(+49.9%)、ＭｘＡ蛋白質の測定における使用が知られているノニデットＰ４０（国際公開公報第２００８／０５３９７３号パンフレット参照）を用いた場合(+45.8%)に比較して、脂肪酸アルカノールアミドを用いた場合、顕著に低下し、温度による測定値への影響が顕著に抑制されることが分かる。   As shown in Table 1, Nonidet P40 (International Publication No. 2008/053953 pamphlet) that is known to be used in the measurement of MxA protein when the surfactant is not used (+ 49.9%) for the measurement value fluctuation rate. It can be seen that when fatty acid alkanolamide is used, the influence on the measured value due to temperature is remarkably suppressed when using fatty acid alkanolamide, compared to the case using (see (4)).

ＭｘＡ蛋白質測定における測定値変動の検討２ （一次反応）
ウイルス感染が認められＭｘＡ蛋白質陽性を示す患者5例からＥＤＴＡ・２Ｎａ採血管を用いて採血した血液を検体として用いた。全血検体は試料希釈液で10倍希釈し、測定試料とした。 Examination of fluctuation of measured value in MxA protein measurement 2 (Primary reaction)
Blood collected from EDTA · 2Na blood collection tubes from 5 patients with virus infection and positive for MxA protein was used as a specimen. The whole blood specimen was diluted 10-fold with a sample diluent and used as a measurement sample.

検体希釈液として、1.2%スタホームＤＯを含む検体希釈液および1.2%ノニデットＰ４０を含む検体希釈液を用いる以外は実施例１と同様にして１次反応を25℃と37℃で行い、反応温度による測定値変動を検討した。結果を第２表に示す。   The primary reaction is performed at 25 ° C. and 37 ° C. in the same manner as in Example 1 except that the sample diluent containing 1.2% Stadom DO and the sample diluent containing 1.2% Nonidet P40 are used as the sample diluent. Measured value fluctuations due to. The results are shown in Table 2.

Figure 0006014091
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第２表に示すように、全血検体を用いた場合でも、測定値変動率は1.2%スタホームＤＯでは0〜+12%以内であり、1.2%ノニデットＰ４０の+8%〜23%に比較して反応温度による測定値への影響が顕著に抑制されていることが分かる。   As shown in Table 2, even when whole blood specimens are used, the measured value fluctuation rate is within 0 to + 12% with 1.2% STA DO DO, and is compared with + 8% to 23% of 1.2% Nonidet P40 Thus, it can be seen that the influence of the reaction temperature on the measured value is remarkably suppressed.

ＭｘＡ蛋白質測定における測定値変動の検討３ （二次反応）
以下の組成からなるＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）（ｐＨ７.０）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ（インタージェン（InterGen）社製） ０．１％
プロクリン３００（シグマ社製） ０．０３５％
界面活性剤 （第３表に記載の種類と濃度）
４−ＡＡ（埼京化成社製） ０．０１％
実施例１の[３]で作製したネイティブＭｘＡ蛋白質を実施例１の［６］の検体希釈液［但し、「界面活性剤」としてノニデットＰ４０を使用］で20倍希釈し、30分間静置することで細胞の可溶化を行ない、さらに8倍に希釈して測定用試料とした。 Examination of fluctuation of measured value in MxA protein measurement 3 (Secondary reaction)
A POD-labeled antibody dilution buffer having the following composition was prepared.
Bis-Tris (Dojindo Laboratories) (pH 7.0)
50 mmol / L
BSA (InterGen) 0.1%
Proclin 300 (manufactured by Sigma) 0.035%
Surfactant (type and concentration listed in Table 3)
4-AA (manufactured by Saikyo Kasei Co., Ltd.) 0.01%
The native MxA protein prepared in [3] of Example 1 is diluted 20-fold with the specimen diluent of [6] of Example 1 [however, using nonidet P40 as “surfactant”] and allowed to stand for 30 minutes. Thus, the cells were solubilized and further diluted 8-fold to obtain a measurement sample.

検体として、この試料、及び、実施例１の［６］で調製した各濃度の標準液を用いて、ＰＯＤ標識抗体として、実施例１の［５］で調製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体を上記ＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液にて800倍希釈したものを用いて、実施例１の［７］に記載された操作に従い測定を行った。但し、一次反応は25℃で、二次反応は25℃と37℃の両温度にて行った。25℃反応時と37℃反応時におけるネイティブＭｘＡ蛋白質の測定値変動率は、以下の式（Ｉ）により算出した。結果を第３表に示す。   Using the sample and the standard solution of each concentration prepared in [6] of Example 1 as a sample, the POD-labeled anti-MxA protein antibody prepared in [5] of Example 1 was used as the POD-labeled antibody. Measurement was performed according to the procedure described in [7] of Example 1 using a POD-labeled antibody dilution buffer diluted 800-fold. However, the primary reaction was performed at 25 ° C, and the secondary reaction was performed at both 25 ° C and 37 ° C. The measured value fluctuation rate of the native MxA protein during the 25 ° C. reaction and the 37 ° C. reaction was calculated by the following formula (I). The results are shown in Table 3.

Figure 0006014091
Figure 0006014091

〔比較例２〕
実施例３のＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液中の界面活性剤を0.1%ノニデットＰ４０とすること以外は実施例３と同様の方法により二次反応温度による測定値変動率を算出した。結果を第３表に記す。 [Comparative Example 2]
The variation rate of the measured value due to the secondary reaction temperature was calculated in the same manner as in Example 3 except that the surfactant in the POD-labeled antibody dilution buffer of Example 3 was changed to 0.1% nonidet P40. The results are shown in Table 3.

Figure 0006014091
Figure 0006014091

第３表に示すとおり、測定値変動率について、界面活性剤としてノニデットＰ４０を用いた場合(-28.4%)に比較して、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ多環フェニルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ多環フェニルエーテル、エチレンジアミンＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物を用いた場合、顕著に低下しており、反応温度の測定値への影響が顕著に抑制されることが分かる。   As shown in Table 3, POE / POP condensate, POE / POP alkyl ether, POE / POP alkylphenyl were compared with the case where Nonidet P40 was used as the surfactant (−28.4%) for the measured value fluctuation rate. When ether, POE polycyclic phenyl ether, POE / POP polycyclic phenyl ether, or ethylenediamine POE / POP condensate is used, it is significantly reduced, and the influence on the measured value of the reaction temperature is remarkably suppressed. I understand.

ＭｘＡ蛋白質測定における測定値変動の検討４ （二次反応）
ウイルス感染が認められＭｘＡ蛋白質陽性を示す患者4例からＥＤＴＡ・２Ｎａ採血管を用いて採血した血液を検体として用いた。全血検体は実施例１の［６］の検体希釈液［但し、「界面活性剤」としてノニデットＰ４０(1.2%)を使用］で10倍希釈し、測定用試料とした。 Examination of measurement value fluctuation in MxA protein measurement 4 (Secondary reaction)
Blood collected from 4 patients with virus infection and positive for MxA protein using EDTA · 2Na blood collection tube was used as a specimen. The whole blood sample was diluted 10-fold with the sample diluent of [6] of Example 1 (however, Nonidet P40 (1.2%) was used as “surfactant”) to obtain a measurement sample.

実施例３のＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液中、界面活性剤として0.1%プロノン４０３、0.1%プロノン１０２、0.1%ノニデットＰ４０をそれぞれ含むＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液を用いて、実施例３と同様にして測定を行い（但し、一次反応は25℃で、二次反応は25℃と37℃の両温度にて行った）、反応温度による測定値変動を検討した。結果を第４表に記す。   In the same manner as in Example 3, using the POD-labeled antibody dilution buffer containing 0.1% Pronon 403, 0.1% Pronon 102, and 0.1% Nonidet P40 as surfactants in the POD-labeled antibody dilution buffer of Example 3, respectively. Measurement was performed (however, the primary reaction was performed at 25 ° C. and the secondary reaction was performed at both 25 ° C. and 37 ° C.), and the variation in the measured value depending on the reaction temperature was examined. The results are shown in Table 4.

Figure 0006014091
Figure 0006014091

第４表に示すように、全血検体を用いた場合でも、測定値変動率はプロノン４０３では-4.5%〜+0.6%、プロノン１０２では-3.0%〜+2.0%であり、ノニデットＰ４０の-40.1%〜-23.6%に比較して、反応温度の測定値への影響が顕著に抑制されることが分かる。   As shown in Table 4, even when whole blood specimens were used, the measured value fluctuation rate was -4.5% to + 0.6% for Pronon 403, and -3.0% to + 2.0% for Pronon 102. It can be seen that the influence of the reaction temperature on the measured value is significantly suppressed as compared with 40.1% to -23.6%.

ＭｘＡ蛋白質測定における測定値変動の検討５ （二次反応）
ウイルス感染が認められＭｘＡ蛋白質陽性を示す患者５例からＥＤＴＡ・２Ｎａ採血管を用いて採血した血液を検体として用いた。全血検体は実施例１の［６］の検体希釈液［但し、「界面活性剤」としてノニデットＰ４０(1.2%)を使用］で10倍希釈し、測定用試料とした。 Examination of measurement value fluctuation in MxA protein measurement 5 (Secondary reaction)
Blood collected from EDTA · 2Na blood collection tubes from 5 patients with virus infection and positive for MxA protein was used as a specimen. The whole blood sample was diluted 10-fold with the sample diluent of [6] of Example 1 (however, Nonidet P40 (1.2%) was used as “surfactant”) to obtain a measurement sample.

実施例３のＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液中、界面活性剤として0.1%エマルゲンＰＰ−２５０、0.1%ユニルーブ５０ＭＢ−１６８、0.1%ディスパノールＫＰ１８９Ｒ−４０、0.1%ニューコール２６１６Ｆ、0.1%エチレンジアミンＰＯ４０ＥＯ４０をそれぞれ含むＰＯＤ標識抗体希釈緩衝液を用いて、実施例３と同様にして測定を行い（但し、一次反応は25℃で、二次反応は25℃と37℃の両温度にて行った）、反応温度による測定値変動を検討した。結果を第５表に記す。   In the POD-labeled antibody dilution buffer of Example 3, 0.1% Emulgen PP-250, 0.1% Unilube 50MB-168, 0.1% Dispanol KP189R-40, 0.1% New Coal 2616F, 0.1% ethylenediamine PO40EO40 were used as surfactants, respectively. Measurement was performed in the same manner as in Example 3 using the POD-labeled antibody dilution buffer contained therein (however, the primary reaction was performed at 25 ° C and the secondary reaction was performed at both 25 ° C and 37 ° C). The variation of measured value due to temperature was examined. The results are shown in Table 5.

Figure 0006014091
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第５表に示すように、全血検体を用いた場合でも、測定値変動率はエマルゲンＰＰ−２５０では-1%〜-11%、ユニルーブ５０ＭＢ−１６８では0〜-8%、ディスパノールＫＰ１８９Ｒ−４０では-5〜-15％、ニューコール２６１６Ｆでは-7〜-15％、エチレンジアミンＰＯ４０ＥＯ４０では-1〜-12%であり、ノニデットＰ４０の-33%〜-20%に比較して、反応温度の測定値への影響が顕著に抑制されることが分かる。   As shown in Table 5, even when whole blood samples were used, the measured value fluctuation rate was -1% to -11% for Emulgen PP-250, 0 to -8% for Unilube 50MB-168, and Dispanol KP189R- It is -5 to -15% for 40, -7 to -15% for Newcol 2616F, -1 to -12% for ethylenediamine PO40EO40, and compared with -33% to -20% for nonidet P40. It can be seen that the influence on the measured value is significantly suppressed.

以下の構成要素（ａ）〜（ｇ）からなるＭｘＡ蛋白質測定用キットを調製した。
（ａ）抗ＭｘＡ蛋白質抗体固定化プレート
実施例１［４］の方法に従い、抗ＭｘＡ蛋白質抗体固定化プレートを次の方法で調製した。先ず、5μg/mLの抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５の、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.5)溶液を、96ウェルマイクロタイタープレート［ナルジェンヌンクインターナショナル（Nalge Nunc International）社製］に100μL／ウェルの量で分注し、3日間放置後、上清を吸引除去した。次いで、1％ブロックエース（大日本製薬社製）の、100mmol/L塩化ナトリウムを含む100mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.5)溶液を各ウェルに300μL分注し、室温で一晩静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、真空乾燥機で3日間乾燥し、抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体固相化プレートを調製した。 A kit for measuring MxA protein comprising the following components (a) to (g) was prepared.
(A) Anti-MxA protein antibody-immobilized plate According to the method of Example 1 [4], an anti-MxA protein antibody-immobilized plate was prepared by the following method. First, a 100 mmol / L phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 100 mmol / L sodium chloride in 5 μg / mL anti-MxA protein monoclonal antibody KM1135 was added to a 96-well microtiter plate [Nalge Nunc International (Nalge Nunc International). The product was dispensed at a volume of 100 μL / well and allowed to stand for 3 days, and the supernatant was removed by aspiration. Next, 300 μL of 100 mmol / L phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 1% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 100 mmol / L sodium chloride was dispensed into each well and allowed to stand overnight at room temperature. And then blocked. After removing the blocking solution, the plate was washed with PBS and dried in a vacuum dryer for 3 days to prepare an anti-MxA protein monoclonal antibody-immobilized plate.

（ｂ）検体希釈液
以下の組成からなる検体希釈液を調製した。
Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）（ｐＨ８．５） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所社製） ２．５％
スタホームＤＯ １．２％
塩化ナトリウム ０．１ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ（生化学工業社製） ０．１％
アジ化ナトリウム ０．１％ (B) Sample dilution solution A sample dilution solution having the following composition was prepared.
Tris (manufactured by Dojindo Laboratories) (pH 8.5) 0.1 mol / L
CHAPS (Dojindo Laboratories) 2.5%
Stahome DO 1.2%
Sodium chloride 0.1 mol / L
BSA (manufactured by Seikagaku Corporation) 0.1%
Sodium azide 0.1%

（ｃ）ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体溶液
実施例１［５］の方法で調製されたＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体ＫＭ１１２４を、以下の組成からなるＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体希釈液で800倍希釈し、ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）（ｐＨ７．０）
０．０５ｍｏｌ／Ｌ
プロノン２０２Ｂ ０．１％
塩化ナトリウム ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ（生化学工業社製） ０．１％
４−ＡＡ（埼京化成社製） ０．０１％
プロクリン３００ ０．０３５％ (C) POD-labeled anti-MxA protein antibody solution POD-labeled anti-MxA protein antibody KM1124 prepared by the method of Example 1 [5] was diluted 800 times with a POD-labeled anti-MxA protein antibody dilution solution having the following composition, A POD-labeled anti-MxA protein antibody solution was prepared.
Bis-Tris (Dojindo Laboratories) (pH 7.0)
0.05 mol / L
Pronon 202B 0.1%
Sodium chloride 50mmol / L
BSA (manufactured by Seikagaku Corporation) 0.1%
4-AA (manufactured by Saikyo Kasei Co., Ltd.) 0.01%
Proclin 300 0.035%

（ｄ）発色液
ＴＭＢｌｕｅ（セロロジカル社製）
（ｅ）反応停止液
０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液
（ｆ）洗浄液
以下の洗浄液を調製した。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ツイーン２０ ０．０５％
塩化ナトリウム ０．１５ｍｏｌ／Ｌ (D) Coloring solution TMBlue (manufactured by Serological)
(E) Reaction stop solution 0.5 mol / L sulfuric acid aqueous solution (f) Cleaning solution The following cleaning solution was prepared.
Phosphate buffer solution (pH 7.2) 10 mmol / L
Tween 20 0.05%
Sodium chloride 0.15 mol / L

（ｇ）標準物質と標準液
実施例１［２］で調製したリコンビナントＭｘＡ蛋白質を、リン酸緩衝液で希釈した後、凍結乾燥し、ＭｘＡ蛋白質の標準物質を調製した。
調製した凍結乾燥状態の標準物質を上記（ｂ）の検体希釈液で希釈し、0（検体希釈液のみ）、0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24 ng/mLの各濃度のＭｘＡ蛋白質溶液を調製し、これらを標準液とした。 (G) Standard substance and standard solution The recombinant MxA protein prepared in Example 1 [2] was diluted with a phosphate buffer and then freeze-dried to prepare a standard substance for MxA protein.
Dilute the prepared lyophilized standard with the sample diluent in (b) above, and MxA at each concentration of 0 (sample diluent only), 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24 ng / mL. Protein solutions were prepared and used as standard solutions.

〔比較例３〕
以下の構成要素（ａ）〜（ｇ）からなるＭｘＡ蛋白質測定用キットを調製した。
（ａ）抗ＭｘＡ蛋白質抗体固定化プレート
実施例６の（ａ）と同じ抗ＭｘＡ蛋白質抗体固定化プレート。 [Comparative Example 3]
A kit for measuring MxA protein comprising the following components (a) to (g) was prepared.
(A) Anti-MxA protein antibody immobilization plate The same anti-MxA protein antibody immobilization plate as in (a) of Example 6.

（ｂ）検体希釈液
以下の組成からなる検体希釈液を調製した。
ＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所社製）（ｐＨ８．０） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所社製） ４．９％
ノニデットＰ４０ １．２％
塩化ナトリウム ０．１ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ（生化学工業社製） ０．１％
アジ化ナトリウム ０．１％ (B) Sample dilution solution A sample dilution solution having the following composition was prepared.
HEPES (manufactured by Dojindo Laboratories) (pH 8.0) 0.1 mol / L
CHAPS (Dojindo Laboratories) 4.9%
Nonidet P40 1.2%
Sodium chloride 0.1 mol / L
BSA (manufactured by Seikagaku Corporation) 0.1%
Sodium azide 0.1%

（ｃ）ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体溶液
実施例１［５］の方法で調製されたＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体ＫＭ１１２４を、以下の組成からなるＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体希釈液で800倍希釈し、ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体溶液を調製した。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）（ｐＨ６．０）
５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ノニデットＰ４０ ０．１％
塩化ナトリウム ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ（生化学工業社製） ０．１％
４−ＡＡ（埼京化成社製） ０．０１％
プロクリン３００ ０．０３５％ (C) POD-labeled anti-MxA protein antibody solution POD-labeled anti-MxA protein antibody KM1124 prepared by the method of Example 1 [5] was diluted 800 times with a POD-labeled anti-MxA protein antibody dilution solution having the following composition, A POD-labeled anti-MxA protein antibody solution was prepared.
Bis-Tris (Dojindo Laboratories) (pH 6.0)
50 mmol / L
Nonidet P40 0.1%
Sodium chloride 50mmol / L
BSA (manufactured by Seikagaku Corporation) 0.1%
4-AA (manufactured by Saikyo Kasei Co., Ltd.) 0.01%
Proclin 300 0.035%

（ｄ）発色液
ＴＭＢｌｕｅ（セロロジカル社製）
（ｅ）反応停止液
０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液
（ｆ）洗浄液
以下の洗浄液を調製した。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ツイーン２０ ０．０５％
塩化ナトリウム ０．１５ｍｏｌ／Ｌ (D) Coloring solution TMBlue (manufactured by Serological)
(E) Reaction stop solution 0.5 mol / L sulfuric acid aqueous solution (f) Cleaning solution The following cleaning solution was prepared.
Phosphate buffer solution (pH 7.2) 10 mmol / L
Tween 20 0.05%
Sodium chloride 0.15 mol / L

（ｇ）標準物質と標準液
実施例１［２］で調製したリコンビナントＭｘＡ蛋白質を、リン酸緩衝液で希釈した後、凍結乾燥し、ＭｘＡ蛋白質の標準物質を調製した。
調製した凍結乾燥状態の標準物質を上記（ｂ）の検体希釈液で希釈し、0（検体希釈液のみ）、0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24ng/mLの各濃度のＭｘＡ蛋白質溶液を調製し、これらを標準液とした。 (G) Standard substance and standard solution The recombinant MxA protein prepared in Example 1 [2] was diluted with a phosphate buffer and then freeze-dried to prepare a standard substance for MxA protein.
The prepared lyophilized standard is diluted with the sample diluent of (b) above, and MxA protein at each concentration of 0 (sample diluent only), 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 24 ng / mL Solutions were prepared and used as standard solutions.

測定用試料として、実施例１［３］で調製した細胞を、実施例６の検体希釈液で20倍希釈し、30分間静置した後、さらに検体希釈液で8倍希釈したものを用い、キットとして、実施例６のキットを用い、次の手順により、測定を行った。   As a measurement sample, the cells prepared in Example 1 [3] were diluted 20-fold with the sample diluent of Example 6 and allowed to stand for 30 minutes, and then further diluted 8-fold with the sample diluent. Using the kit of Example 6 as a kit, the measurement was performed according to the following procedure.

実施例６（ａ）の抗ＭｘＡ蛋白質抗体固定化プレートに、（ｇ）で調製したそれぞれの標準液100μLを添加し、所定の温度（22℃、25℃、28℃、30℃、32℃の各温度）で1時間反応させ、抗体にＭｘＡ蛋白質を結合させた。反応液を除去した後、（ｆ）の洗浄液400μLでプレートを5回洗浄した。次いで、（ｃ）で調製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白抗体溶液100μL添加し、所定の温度（22℃、25℃、28℃、30℃、32℃の各温度）で0.5時間反応させた。反応後、反応液を除去し、（ｆ）の洗浄液400μLでプレートを5回洗浄した。次いで、暗所にて、0.05%テトラメチルベンジジン及び過酸化水素を含む（ｄ）の発色液100μLを添加し、室温で10分間反応させた後、（ｅ）の反応停止液100μLを添加し、室温で10分間インキュベーションし、反応を停止させた。反応液の450nmでの吸光度をプレートリーダーで測定し、ＭｘＡ蛋白質濃度と吸光度との関係を表す検量線を作製した。   100 μL of each standard solution prepared in (g) was added to the anti-MxA protein antibody-immobilized plate of Example 6 (a), and a predetermined temperature (22 ° C., 25 ° C., 28 ° C., 30 ° C., 32 ° C.) was added. The reaction was carried out at each temperature for 1 hour to bind the MxA protein to the antibody. After removing the reaction solution, the plate was washed 5 times with 400 μL of the washing solution of (f). Next, 100 μL of the POD-labeled anti-MxA protein antibody solution prepared in (c) was added and reacted at a predetermined temperature (22 ° C., 25 ° C., 28 ° C., 30 ° C., 32 ° C.) for 0.5 hour. After the reaction, the reaction solution was removed, and the plate was washed 5 times with 400 μL of the washing solution (f). Next, in a dark place, 100 μL of the coloring solution (d) containing 0.05% tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide was added and reacted at room temperature for 10 minutes, and then 100 μL of the reaction stopping solution (e) was added, The reaction was stopped by incubation at room temperature for 10 minutes. The absorbance at 450 nm of the reaction solution was measured with a plate reader, and a calibration curve representing the relationship between MxA protein concentration and absorbance was prepared.

［比較例４］
実施例６のキットの代わりに比較例３のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により測定を行い、ＭｘＡ蛋白質濃度と吸光度との関係を表す検量線を作製した。
実施例７及び比較例４の測定の結果を第６表に示す。 [Comparative Example 4]
Measurement was performed in the same manner as in Example 7 except that the kit of Comparative Example 3 was used instead of the kit of Example 6, and a calibration curve representing the relationship between MxA protein concentration and absorbance was prepared.
The measurement results of Example 7 and Comparative Example 4 are shown in Table 6.

Figure 0006014091
Figure 0006014091

第６表には、各反応温度での反応における測定値と、22℃での反応における測定値を100とした場合の、各温度での測定値の相対値の両者を記載している。相対値が100に近い程、測定が反応温度の影響を受け難いことを意味する。第６表から明らかな様に、スタホームＤＯ（脂肪酸アルカノールアミド）とプロノン２０２Ｂ（ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物）とを含む実施例６のキットを用いる実施例７の測定方法は、ノニデットＰ−４０（ＰＯＥアルキルフェニルエーテル）を含む比較例３のキットを用いる比較例４の測定方法に比較して、顕著に測定値が安定していた。このことから、本発明の測定方法は、反応温度の影響を受け難い方法であることが分かる。   Table 6 shows both the measured value at the reaction temperature and the relative value of the measured value at the temperature when the measured value at the reaction at 22 ° C. is 100. The closer the relative value is to 100, the less the measurement is affected by the reaction temperature. As is apparent from Table 6, the measurement method of Example 7 using the kit of Example 6 containing stahome DO (fatty acid alkanolamide) and pronone 202B (POE / POP condensate) is Nonidet P-40 ( Compared with the measuring method of Comparative Example 4 using the kit of Comparative Example 3 containing POE alkylphenyl ether), the measured values were remarkably stable. From this, it can be seen that the measurement method of the present invention is a method which is hardly affected by the reaction temperature.

本発明により、感染症の診断等に有用な、検体中の測定対象成分の測定方法および測定用キットが提供される。   According to the present invention, there are provided a measurement method and a measurement kit for a component to be measured in a specimen, which are useful for diagnosis of infectious diseases.

Claims (10)

検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させた後、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体を反応させて、該測定対象成分に結合した標識量を測定する免疫測定法において、該測定対象成分に結合する第２抗体に標識が結合した標識化第２抗体をポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤存在下に反応させることを特徴とする、免疫測定法における反応温度の影響抑制方法。 After reacting the measurement target component in the sample and the first antibody binding to the measurement target component, reacting the labeled second antibody having a label bound to the second antibody binding to the measurement target component, In the immunoassay method for measuring the amount of label bound to the component to be measured, the labeled second antibody in which the label is bound to the second antibody bound to the component to be measured is present in the presence of a polyoxyethylene nonionic surfactant. A method for suppressing the influence of reaction temperature in an immunoassay, characterized in that ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及び、エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物からなる群より選ばれるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項１記載の抑制方法。 The polyoxyethylene-based nonionic surfactant is selected from the group consisting of a polyoxyethylene polyoxypropylene condensate, a polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, and an ethylenediamine polyoxyethylene polyoxypropylene condensate method of inhibiting according to claim 1, which is a system non-ionic surfactant. 胆汁酸誘導体を添加して検体中の測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１抗体とを反応させる請求項１又は２記載の抑制方法。 The suppression method according to claim 1 or 2 , wherein a bile acid derivative is added to react the measurement target component in the specimen with the first antibody that binds to the measurement target component. 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項３記載の抑制方法。 The method according to claim 3 , wherein the bile acid derivative is a bile acid derivative having an amphoteric surfactant activity. 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート又は３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシプロパンスルホネートである請求項４記載の抑制方法。 The bile acid derivative having an amphoteric surface active action is 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonate or 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate. The suppression method according to claim 4 . 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項３記載の抑制方法。 The method according to claim 3 , wherein the bile acid derivative is a bile acid derivative having a nonionic surfactant activity. 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−グルコンアミドプロピル）コールアミド又はＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミドである請求項６記載の抑制方法。 Bile acid derivative having nonionic surface active function, N, claim N- bis (3-gluconamidopropyl-propyl) call amide or N, N- bis (3-D-gluconic acid amidopropyl) deoxycholic amide 6 The suppression method of description. 第１抗体が、不溶性担体に不動化されている請求項１〜７のいずれかに記載の抑制方法。 The suppression method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the first antibody is immobilized on an insoluble carrier. 検体が、全血である請求項１〜８のいずれかに記載の抑制方法。 The suppression method according to any one of claims 1 to 8 , wherein the specimen is whole blood. 測定対象成分が、ＭｘＡ蛋白質である請求項１〜９のいずれかに記載の抑制方法。 The suppression method according to any one of claims 1 to 9 , wherein the measurement target component is an MxA protein.
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