JP6003645B2 - Fluorescence detection apparatus and fluorescence detection method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、光源より励起光を照射することで反射面より生じたエバネッセント波を用いて、アナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を検出することで高精度なアナライト検出を可能とする蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法に関する。 The present invention excites a fluorescent substance labeled with an analyte using an evanescent wave generated from a reflection surface by irradiating excitation light from a light source, and detects the excited fluorescence to provide a highly accurate analyte. The present invention relates to a fluorescence detection apparatus that enables detection and a fluorescence detection method using the same.
従来より、全反射条件下で反射する反射面に光源より励起光を照射することで、この反射面からエバネッセント波が生ずるという原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした蛍光検出装置が用いられている。 Conventionally, based on the principle that an evanescent wave is generated from a reflecting surface by irradiating a reflecting surface that reflects under total reflection conditions from a light source, for example, detection of extremely small analytes in a living body is performed. The fluorescence detection apparatus which was made is used.
このような蛍光検出装置としては、例えば表面プラズモン増強蛍光センサ１００が挙げられ、その基本的な構造は図７に示したように、まず誘電体部材１０２と、誘電体部材１０２の主面上に形成された金属薄膜１０４と、金属薄膜１０４の上面に形成され、流路１０８上の所定位置にリガンドが固定化された反応エリア１１０を備えた反応層１０６と、を有するチップ構造体１１２を備えている。本図における反応エリア１１０は、流路１０８の形成された範囲よりも小さい範囲であり、さらに金属薄膜１０４に励起光が照射される領域である励起エリアよりも小さい範囲である（図８参照）。 As such a fluorescence detection device, for example, a surface plasmon enhanced fluorescence sensor 100 can be cited, and its basic structure is as follows. First, as shown in FIG. 7, a dielectric member 102 and a main surface of the dielectric member 102 are provided. A chip structure 112 having a formed metal thin film 104 and a reaction layer 106 formed on the upper surface of the metal thin film 104 and including a reaction area 110 in which a ligand is immobilized at a predetermined position on the flow path 108 is provided. ing. The reaction area 110 in this figure is a range that is smaller than the range in which the flow path 108 is formed, and is a range that is smaller than an excitation area that is an area where the metal thin film 104 is irradiated with excitation light (see FIG. 8). .
そして、チップ構造体１１２の誘電体部材１０２側には、誘電体部材１０２内に入射され、金属薄膜１０４に向かって全反射条件で励起光１１４を照射する光源１１６を備え、さらに光源１１６から照射され金属薄膜１０４で反射した反射光１１８を受光する受光手段１２０が備えられている。 The chip structure 112 includes a light source 116 that is incident on the dielectric member 102 and irradiates the excitation light 114 toward the metal thin film 104 under total reflection conditions on the dielectric member 102 side. Light receiving means 120 for receiving the reflected light 118 reflected by the metal thin film 104 is provided.
一方、チップ構造体１１２の反応層１０６側には、反応層１０６の反応エリア１１０で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光１２２を受光する光検出手段１２４が設けられている。 On the other hand, on the reaction layer 106 side of the chip structure 112, a light detection means 124 that receives the fluorescence 122 emitted from the fluorescent substance labeled with the analyte immobilized in the reaction area 110 of the reaction layer 106 is provided.
なお、反応層１０６の反応エリア１１０と光検出手段１２４との間には、蛍光１２２を効率良く集光するための集光部材１２６と、蛍光１２２以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光１２２のみを選択する波長選択機能部材１２８が設けられている。 In addition, between the reaction area 110 of the reaction layer 106 and the light detection means 124, the light collecting member 126 for efficiently condensing the fluorescence 122 and the light included other than the fluorescence 122 are removed, and the necessary fluorescence is removed. A wavelength selection function member 128 that selects only 122 is provided.
そして、表面プラズモン増強蛍光センサ１００の使用においては、反応層１０６の反応エリア１１０内に、流路１０８を介してアナライトを有する試料溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に流路１０８を介して流入させることで、反応エリア１１０に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。 Then, in the use of the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 100, a sample solution having an analyte is caused to flow into the reaction area 110 of the reaction layer 106 via the flow path 108, and then a fluorescent substance for labeling the analyte is added. Similarly, the analyte labeled with the fluorescent substance is fixed in the reaction area 110 by being caused to flow through the flow path 108.
そして、この状態で光源１１６より誘電体部材１０２を介して金属薄膜１０４に全反射条件で励起光１１４を照射することで、金属薄膜１０４の表面からエバネッセント波を放出させ、このエバネッセント波により反応エリア１１０の全面にわたって、固定化されたアナライトを標識する蛍光１２２を励起させる。 In this state, the excitation light 114 is irradiated from the light source 116 to the metal thin film 104 through the dielectric member 102 under the total reflection condition, whereby an evanescent wave is emitted from the surface of the metal thin film 104, and the reaction area is generated by the evanescent wave. The fluorescence 122 that labels the immobilized analyte is excited over the entire surface of 110.
このとき、図８に示したように反応エリア１１０の全面にわたって、固定化されたアナライトを標識する蛍光１２２が励起されるように、光源１１６から金属薄膜１０４に照射される励起光１１４の励起エリア１３０は、反応エリア１１０の全範囲またはそれ以上の範囲の大きさに設定されている。 At this time, as shown in FIG. 8, excitation of the excitation light 114 irradiated from the light source 116 to the metal thin film 104 is excited so that the fluorescence 122 that labels the immobilized analyte is excited over the entire reaction area 110. The area 130 is set to the size of the entire range of the reaction area 110 or a range beyond it.
なお励起エリア１３０を金属薄膜１０４の形成されたエリアよりも内側の範囲に設定している理由としては、励起エリア１３０を金属薄膜１０４の形成されたエリアよりも大きく設定した場合、誘電体部材１０２などからの自家蛍光の影響を受け、感度が下がるためであり、これを防止するためである。 The reason why the excitation area 130 is set in a range inside the area where the metal thin film 104 is formed is that the dielectric member 102 is set when the excitation area 130 is set larger than the area where the metal thin film 104 is formed. This is because the sensitivity is lowered due to the influence of autofluorescence from, and the like, to prevent this.
そして、エバネッセント波によって励起された反応エリア１１０全面の蛍光１２２を光検出手段１２４で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。 Then, by detecting the fluorescence 122 on the entire surface of the reaction area 110 excited by the evanescent wave by the light detection means 124, it is possible to detect an extremely small amount and / or an extremely low concentration of the analyte.
このような表面プラズモン増強蛍光センサ１００に代表される蛍光検出装置は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察するのに好適である。 Such a fluorescence detection apparatus typified by the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 100 is particularly suitable for observing minute molecular activities such as between biomolecules.
ところで、上述したような従来の表面プラズモン増強蛍光センサ１００では、流路１０８を介して反応層１０６の反応エリア１１０にアナライトを有する試料溶液を流入させた際、流路１０８が一方向送液系（Onepass,循環送液系）であると、流路上流側に位置する反応エリア１１０の端部に反応量が偏ってしまう場合があった。また、流路１０８が双方向の往復送液系であると、流路上流側と下流側に位置する反応エリア１１０の両端部に反応量が偏ってしまう場合があった。 By the way, in the conventional surface plasmon enhanced fluorescence sensor 100 as described above, when the sample solution having the analyte flows into the reaction area 110 of the reaction layer 106 via the flow channel 108, the flow channel 108 is supplied in one direction. In the case of the system (Onepass, circulation liquid feeding system), the reaction amount may be biased toward the end of the reaction area 110 located on the upstream side of the flow path. Further, when the flow path 108 is a bidirectional reciprocating liquid feeding system, the reaction amount may be biased at both ends of the reaction area 110 located on the upstream side and the downstream side of the flow path.
これは、送液される試料溶液が、例えば流路の高さ又は流路の幅が数１０μｍ程度のマイクロ流路内では層流となるため、反応エリア１１０の上流から下流に進むにしたがって、反応エリア１１０の表面近傍と表面から離れた位置とでアナライトの濃度差が生じ、反応エリア１１０の上流に比べて下流の反応量が低くなるためである。 This is because the sample solution to be sent becomes a laminar flow in, for example, a micro flow channel having a flow channel height or flow channel width of about several tens of μm. This is because there is a difference in analyte concentration between the vicinity of the surface of the reaction area 110 and a position away from the surface, and the downstream reaction amount is lower than that upstream of the reaction area 110.
このように流路１０８を介して試料溶液を反応エリア１１０に供給するようにしたフローアッセイ系の表面プラズモン増強蛍光センサ１００では、反応量が反応エリア１１０の端部に偏った状態で、反応エリア１１０の全面に励起光１１４を照射して反応エリア１１０の蛍光１２２を励起させ、励起された蛍光１２２を光検出手段１２４で検出している。 In the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 100 of the flow assay system in which the sample solution is supplied to the reaction area 110 through the channel 108 in this way, the reaction area is biased toward the end of the reaction area 110. 110 is irradiated with excitation light 114 to excite the fluorescence 122 in the reaction area 110, and the excited fluorescence 122 is detected by the light detection means 124.
このことは、図９および図１０に示した一方向の循環送液系と双方向の往復送液系との反応エリアにおける反応量の分布状況のグラフからも明らかであり、反応エリア１１０の端部に反応量が偏って反応量分布のバラツキが大きくなってしまうと、励起エリア１３０に対して蛍光標識物質が存在する「量」及び蛍光標識物質が存在する「流路中の位置」がバラツキ、測定結果が安定しないという問題があった。なお、図９および図１０の符号１３２は、反応量が偏った箇所を示したものである。 This is apparent from the graph of the reaction amount distribution in the reaction area of the one-way circulating liquid feeding system and the two-way reciprocating liquid feeding system shown in FIGS. If the reaction amount is biased toward the part and the variation in the reaction amount distribution becomes large, the “amount” in which the fluorescent labeling substance is present and the “position in the flow path” in which the fluorescent labeling substance is present vary with respect to the excitation area 130. There was a problem that the measurement result was not stable. In addition, the code | symbol 132 of FIG. 9 and FIG. 10 shows the location where the reaction amount was biased.
このような問題は、極微少なアナライトの検出を目的とする表面プラズモン増強蛍光センサのような蛍光検出装置にとって、非常に重大な問題となる。 Such a problem becomes a very serious problem for a fluorescence detection apparatus such as a surface plasmon-enhanced fluorescence sensor for the purpose of detecting an extremely small analyte.
本発明はこのような現状に鑑みなされたものであって、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことのできる蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such a current situation, and provides a fluorescence detection apparatus capable of suppressing variations in measurement results and capable of detecting an analyte with high accuracy, and a fluorescence detection method using the same. The purpose is to provide.
本発明は、前述したような従来技術における問題点を解決するために発明されたものであって、
本発明の蛍光検出装置は、
光源より励起光を照射して反射面からエバネッセント波を放出させ、前記反射面上に固定化されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を光検出手段で検出するようにした蛍光検出装置であって、
前記蛍光検出装置は、
反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
前記反応層の流路が、往復送液系であり、
前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。
The present invention was invented to solve the problems in the prior art as described above,
The fluorescence detection apparatus of the present invention is
An excitation light is emitted from a light source to emit an evanescent wave from a reflecting surface, a fluorescent substance labeled with an analyte immobilized on the reflecting surface is excited, and the excited fluorescence is detected by a light detecting means. A fluorescence detection device,
The fluorescence detection device comprises:
A chip structure having a reflective surface and a reaction layer formed on the reflective surface is configured to be used by being attached to and detached from the apparatus body, or fixed to the apparatus body,
The reaction layer includes a flow path and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path.
The flow path of the reaction layer is a reciprocating liquid feeding system;
The relationship between the reaction area formed in the flow path and the excitation area, which is a range for irradiating excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area,
The size of each area is defined to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The excitation area has an end portion positioned in the flow path upstream side of the reaction area deviation of the distribution is large reaction volume, and an end portion positioned on deviation is large flow path downstream of the distribution of the reaction volume, both end portions of the It is an area where the deviation of the distribution of the reaction amount excluding is small .
さらに、本発明の蛍光検出方法は、
反射面とその反射面の一方側に形成された反応層とを有し、前記反応層が、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備えたチップ構造体の前記反応エリアでアナライトを捕捉し、前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記反応層の流路が、往復送液系であり、
前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように前記励起光を照射し、
前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。
Furthermore, the fluorescence detection method of the present invention comprises:
A reflective surface and a reaction layer formed on one side of the reflective surface, wherein the reaction layer includes a flow path, and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path. Capturing the analyte in the reaction area of the chip structure comprising: and labeling the analyte with a fluorescent material;
Irradiating excitation light from the other side of the reflecting surface of the chip structure to excite the fluorescent material in the reaction area;
Measuring the excited fluorescence with a light detection means;
A fluorescence detection method having at least
In the step of labeling the analyte with a fluorescent substance,
The flow path of the reaction layer is a reciprocating liquid feeding system;
In the step of exciting the fluorescent material in the reaction area,
The relationship between the reaction area and the excitation area, which is a range in which the excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area is irradiated,
Irradiate the excitation light so as to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The excitation area has an end portion positioned in the flow path upstream side of the reaction area deviation of the distribution is large reaction volume, and an end portion positioned on deviation is large flow path downstream of the distribution of the reaction volume, both end portions of the It is an area where the deviation of the distribution of the reaction amount excluding is small .
このように反応エリアと励起エリアを規定して、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所（反応量の差が大きい箇所）を除いた箇所を励起エリアとすることで、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
また、双方向の往復送液系であるので、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）よりも反応量の分布が少なく（反応エリアの端部と反応エリアの中央部との反応量の差が出難くなり）、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）と比べてさらに測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
さらに、前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであるので、流路が双方向の往復送液系であっても、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所が除かれるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
Thus defining the reaction zone of the excitation area, by the anti-reaction amount of the distribution is large portion of the response area end pumping a portion excluding the (location difference of the reaction volume is large) area, the measurement results Analytical detection can be performed with high accuracy by greatly suppressing variations.
In addition, since it is a bidirectional reciprocating liquid delivery system, there is less reaction volume distribution than the one-way liquid delivery system (Onepass, circulation liquid delivery system) (reaction between the end of the reaction area and the center of the reaction area). This makes it difficult to produce a difference in volume), and it is possible to detect analytes with high accuracy by greatly suppressing variation in measurement results compared to a one-way liquid feeding system (Onepass, circulation liquid feeding system).
Furthermore, since the excitation area is an area excluding an end portion located on the upstream side of the flow channel of the reaction area and an end portion located on the downstream side of the flow channel, the flow path is a bidirectional reciprocating solution. Even in the system, since the portion where the reaction amount distribution at the end of the reaction area is large is excluded, variation in the measurement result can be drastically suppressed, and the analyte can be detected with high accuracy.
また、本発明の蛍光検出装置は、
光源より励起光を照射して反射面からエバネッセント波を放出させ、前記反射面上に固定化されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を光検出手段で検出するようにした蛍光検出装置であって、
前記蛍光検出装置は、
反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
前記反応層の流路が、循環送液系であり、
前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。
In addition, the fluorescence detection apparatus of the present invention,
An excitation light is emitted from a light source to emit an evanescent wave from a reflecting surface, a fluorescent substance labeled with an analyte immobilized on the reflecting surface is excited, and the excited fluorescence is detected by a light detecting means. A fluorescence detection device,
The fluorescence detection device comprises:
A chip structure having a reflective surface and a reaction layer formed on the reflective surface is configured to be used by being attached to and detached from the apparatus body, or fixed to the apparatus body,
The reaction layer includes a flow path and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path.
The flow path of the reaction layer is a circulating liquid feeding system;
The relationship between the reaction area formed in the flow path and the excitation area, which is a range for irradiating excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area,
The size of each area is defined to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The excitation area is an area having a small deviation in the distribution of the reaction amount except for an end portion located on the upstream side of the flow path of the reaction area where the deviation in the distribution of the reaction amount is large .
さらに、本発明の蛍光検出方法は、
反射面とその反射面の一方側に形成された反応層とを有し、前記反応層が、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備えたチップ構造体の前記反応エリアでアナライトを捕捉し、前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記反応層の流路が、循環送液系であり、
前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように前記励起光を照射し、
前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。
Furthermore, the fluorescence detection method of the present invention comprises:
A reflective surface and a reaction layer formed on one side of the reflective surface, wherein the reaction layer includes a flow path, and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path. Capturing the analyte in the reaction area of the chip structure comprising: and labeling the analyte with a fluorescent material;
Irradiating excitation light from the other side of the reflecting surface of the chip structure to excite the fluorescent material in the reaction area;
Measuring the excited fluorescence with a light detection means;
A fluorescence detection method having at least
In the step of labeling the analyte with a fluorescent substance,
The flow path of the reaction layer is a circulating liquid feeding system;
In the step of exciting the fluorescent material in the reaction area,
The relationship between the reaction area and the excitation area, which is a range in which the excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area is irradiated,
Irradiate the excitation light so as to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The excitation area is an area having a small deviation in the distribution of the reaction amount except for an end portion located on the upstream side of the flow path of the reaction area where the deviation in the distribution of the reaction amount is large .
このように反応エリアと励起エリアを規定して、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所（反応量の差が大きい箇所）を除いた箇所を励起エリアとすることで、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。 By defining the reaction area and the excitation area in this way, and excluding the place where the reaction amount distribution at the end of the reaction area is large (the place where the difference in reaction amount is large) as the excitation area, the variation in the measurement results This makes it possible to detect analytes with high accuracy.
また、励起エリアが、少なくとも前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いたエリアであるので、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）であっても、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所が除かれるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。 Further, since the excitation area is an area excluding at least the end located on the upstream side of the flow path of the reaction area, even if it is a one-way liquid feeding system (Onepass, circulation liquid feeding system) Since the portion where the reaction amount distribution of the part is large is excluded, variation in the measurement result can be remarkably suppressed, and the analyte can be detected with high accuracy.
また、本発明の蛍光検出装置は、 In addition, the fluorescence detection apparatus of the present invention,
前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであることを特徴とする。 The excitation area is an area excluding both ends of an end located on the upstream side of the reaction area and an end located on the downstream side of the flow path.
さらに、本発明の蛍光検出方法は、 Furthermore, the fluorescence detection method of the present invention comprises:
前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであることを特徴とする。 The excitation area is an area excluding both ends of an end located on the upstream side of the reaction area and an end located on the downstream side of the flow path.
このようにすれば、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）であっても、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所が除かれるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。In this way, even in a unidirectional liquid delivery system (Onepass, circulation liquid delivery system), the locations where the reaction amount distribution at the end of the reaction area is large are excluded, so the variation in the measurement results is dramatically increased. The detection of the analyte can be performed with high accuracy.
また、本発明の蛍光検出装置は、
前記光源より照射される励起光が、レーザ光であることを特徴とする。In addition, the fluorescence detection apparatus of the present invention,
The excitation light emitted from the light source is laser light.
このようにレーザ光であれば、励起エリアの位置および大きさの設定が容易であるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。 In this way, since the position and size of the excitation area can be easily set with laser light, it is possible to greatly suppress variations in measurement results and detect analytes with high accuracy.
また、本発明の蛍光検出装置は、
前記反射面が、誘電体部材上に形成された金属薄膜により形成されてなることを特徴とする。In addition, the fluorescence detection apparatus of the present invention,
The reflective surface is formed of a metal thin film formed on a dielectric member.
このような反射面であれば、金属薄膜によって生じたエバネッセント波で反応エリアの蛍光を励起することができ、高精度にアナライトの検出を行うことができる。 With such a reflection surface, the fluorescence in the reaction area can be excited by the evanescent wave generated by the metal thin film, and the analyte can be detected with high accuracy.
また、本発明の蛍光検出装置は、
表面プラズモン増強蛍光センサまたは全反射蛍光センサのいずれかであることを特徴とする。In addition, the fluorescence detection apparatus of the present invention,
It is either a surface plasmon enhanced fluorescence sensor or a total reflection fluorescence sensor.
このように表面プラズモン増強蛍光センサまたは全反射蛍光センサであれば、高精度に極微量および／または極低濃度のアナライトの検出を行うことができる。 As described above, the surface plasmon enhanced fluorescence sensor or the total reflection fluorescence sensor can detect an extremely small amount and / or an extremely low concentration of analyte with high accuracy.
本発明によれば、反応エリアに対する励起エリアの大きさを規定し、反応エリアに対して励起エリアを小さくしたので、例えば反応量の分布の少ない範囲のみ、すなわち反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所を除いた箇所を励起エリアとして測定するなど、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことのできる蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することができる。 According to the present invention, the size of the excitation area with respect to the reaction area is defined and the excitation area is reduced with respect to the reaction area. For example, only the range where the reaction amount distribution is small, that is, the reaction amount distribution at the end of the reaction area. Provides a fluorescence detection device that can suppress the variation in measurement results, such as measuring a place excluding a part with a large area as an excitation area, and can detect analytes with high accuracy, and a fluorescence detection method using the same. can do.
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail based on the drawings.
本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、光源より励起光を照射することで反射面より生じたエバネッセント波を用いてアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を検出することで高精度にアナライトを検出するものである。 The fluorescence detection apparatus and the fluorescence detection method of the present invention excite a fluorescent substance labeled with an analyte using an evanescent wave generated from a reflection surface by irradiating excitation light from a light source, and detect the excited fluorescence. Thus, the analyte is detected with high accuracy.
なお、本発明の実施の形態については、本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサを例にして説明を行う。 The embodiment of the present invention will be described by taking a surface plasmon enhanced fluorescence sensor as an example of the fluorescence detection apparatus of the present invention as an example.
また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」についても含まれるものである。 In addition, “surface plasmon” in the present specification is used in a broad sense, and includes “localized plasmon”.
＜表面プラズモン増強蛍光センサ１０＞
図１に示した本発明の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、基本的な構造について、先に図７を用いて説明した従来の表面プラズモン増強蛍光センサ１００と同じである。<Surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10>
The surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 according to one embodiment of the present invention shown in FIG. 1 is the same as the conventional surface plasmon enhanced fluorescence sensor 100 described above with reference to FIG.
このような表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、まず誘電体部材１２と、誘電体部材１２上に形成された金属薄膜１４と、金属薄膜１４上に形成され、流路１８上の所定位置にリガンドが固定化された反応エリア２０を備えた反応層１６と、を有するチップ構造体２２を備えている。 Such a surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 includes a dielectric member 12, a metal thin film 14 formed on the dielectric member 12, and a metal thin film 14 formed on the metal thin film 14. A chip structure 22 having a reaction layer 16 provided with a fixed reaction area 20 is provided.
なお、チップ構造体２２は、必ずしも表面プラズモン増強蛍光センサ１０（蛍光検出装置）に予め備えられている必要はなく、チップ構造体２２を、表面プラズモン増強蛍光センサ１０（蛍光検出装置）に設けた装填部（図示せず）に着脱可能な構成とし、例えば蛍光検出を行う度に新たなチップ構造体２２を装填部（図示せず）に装填した後、測定対象のサンプルをチップ構造体２２に供給して蛍光検出するような態様であっても良く、勿論本発明はそのような態様も包含するものである。 The chip structure 22 is not necessarily provided in advance in the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 (fluorescence detection device), and the chip structure 22 is provided in the surface plasmon enhancement fluorescence sensor 10 (fluorescence detection device). For example, after a new chip structure 22 is loaded into the loading unit (not shown) each time fluorescence detection is performed, a sample to be measured is placed on the chip structure 22. An embodiment in which the fluorescence is detected by supplying the light may be used. Of course, the present invention includes such an embodiment.
本実施の形態における反応エリア２０は、流路１８の形成された範囲と同じ範囲としている。しかしながら反応エリアの範囲は特に限定されるものではなく、例えば金属薄膜１４の全面に形成されたり、流路の途中に区画形成されるなど自由に位置や範囲を決めることが可能である。 The reaction area 20 in the present embodiment is the same range as the range where the flow path 18 is formed. However, the range of the reaction area is not particularly limited, and the position and range can be freely determined, for example, formed on the entire surface of the metal thin film 14 or formed in the middle of the flow path.
そして、チップ構造体２２の誘電体部材１２側には、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって全反射条件で励起光２４を照射する光源２６を備え、さらに光源２６から照射され金属薄膜１４で反射した反射光２８を受光する受光手段３０が備えられている。 The chip structure 22 is provided on the dielectric member 12 side with a light source 26 that is incident on the dielectric member 12 and irradiates the excitation light 24 toward the metal thin film 14 under total reflection conditions. A light receiving means 30 for receiving the reflected light 28 reflected by the metal thin film 14 is provided.
光源２６から照射される励起光２４としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。特にレーザ光は、光の照射位置や照射面積の設定が容易であるため本発明に好適である。 The excitation light 24 emitted from the light source 26 is preferably laser light, and an LD laser having a wavelength of 200 to 900 nm and 0.001 to 1,000 mW, or a semiconductor laser having a wavelength of 230 to 800 nm and 0.01 to 100 mW is suitable. . In particular, laser light is suitable for the present invention because the light irradiation position and irradiation area can be easily set.
一方、チップ構造体２２の反応層１６側には、反応層１６の反応エリア２０で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光３２を受光する光検出手段３４が設けられている。 On the other hand, on the reaction layer 16 side of the chip structure 22, light detection means 34 that receives fluorescence 32 emitted from a fluorescent substance labeled with an analyte immobilized in the reaction area 20 of the reaction layer 16 is provided.
光検出手段３４としては、超高精度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。 As the light detection means 34, it is preferable to use an ultrahigh precision photomultiplier tube or a CCD image sensor capable of multipoint measurement.
なお、反応層１６の反応エリア２０と光検出手段３４との間には、蛍光３２を効率良く集光するための集光部材３６と、蛍光３２以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光３２のみを選択する波長選択機能部材３８が設けられている。 In addition, between the reaction area 20 of the reaction layer 16 and the light detection means 34, the light collecting member 36 for efficiently condensing the fluorescence 32 and the light contained other than the fluorescence 32 are removed, and the necessary fluorescence is obtained. A wavelength selection function member 38 for selecting only 32 is provided.
集光部材３６としては、光検出手段３４に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。 As the condensing member 36, any condensing system may be used as long as it aims at efficiently condensing the fluorescent signal on the light detecting means 34. As a simple condensing system, a commercially available objective lens used in a microscope or the like may be used. The magnification of the objective lens is preferably 10 to 100 times.
一方、波長選択機能部材３８としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。 On the other hand, as the wavelength selection function member 38, an optical filter, a cut filter, or the like can be used.
光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。 Examples of the optical filter include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、チップ構造体上に位置する構造物または付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。 Furthermore, as cut filters, external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), plasmon scattering light (excitation light originates from the chip) Scattered light generated by the influence of structures or deposits located on the structure), autofluorescence of the fluorescent substrate of the enzyme, and other types of noise light, such as interference filters and color filters. .
なお、図１に示した表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、チップ構造体２２を表面プラズモン増強蛍光センサ１０の構成の一部として説明したが、このような形態に限定されるものではなく、上述の光源２６及び光検出手段３４を少なくとも含み、さらに例えば集光部材３６や波長選択機能部材３８を表面プラズモン増強蛍光センサ１０の装置本体に備え、その装置本体に対してチップ構造体２２を着脱して使用する形態としても良く、チップ構造体２２を装置本体に対して固定して使用する形態であっても良いものである。 In the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 shown in FIG. 1, the chip structure 22 has been described as a part of the configuration of the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10, but is not limited to such a form. The light source 26 and the light detection means 34 are included at least. Further, for example, a light collecting member 36 and a wavelength selection function member 38 are provided in the device main body of the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10, and the chip structure 22 is attached to and detached from the device main body. The chip structure 22 may be used in a fixed form with respect to the apparatus main body.
そして、表面プラズモン増強蛍光センサ１０の使用においては、反応層１６の反応エリア２０内に流路１８を介してアナライトを有する試料溶液を流入させ、その後、同様にこのアナライトを標識する蛍光物質を、流路１８を介して流入させることで、反応エリア２０に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。 Then, in the use of the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10, a sample solution having an analyte flows into the reaction area 20 of the reaction layer 16 via the flow path 18, and thereafter, the fluorescent substance for labeling the analyte in the same manner. Is allowed to flow through the flow path 18 so that the analyte labeled with the fluorescent substance is immobilized in the reaction area 20.
そして、この状態で光源２６より誘電体部材１２を介して、反射面を形成する金属薄膜１４に全反射条件で励起光２４を反応エリア２０内の一部に照射することで、金属薄膜１４の表面からエバネッセント波を放出させ、このエバネッセント波により励起エリア４０に対応する位置に固定化されたアナライトを標識する蛍光３２を励起させる。 In this state, the excitation light 24 is irradiated to a part of the reaction area 20 from the light source 26 through the dielectric member 12 to the metal thin film 14 forming the reflection surface under the total reflection condition. An evanescent wave is emitted from the surface, and the fluorescence 32 that labels the analyte immobilized at a position corresponding to the excitation area 40 is excited by the evanescent wave.
そして、反応エリア２０内一部において、エバネッセント波によって励起された蛍光３２を光検出手段３４で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。 Then, in a part of the reaction area 20, the fluorescence 32 excited by the evanescent wave is detected by the light detection means 34, so that a trace amount and / or an extremely low concentration of the analyte can be detected. Yes.
なお、金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。 The metal thin film 14 is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably gold, and an alloy of these metals. That is.
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１４の材質として好適である。 Such a metal is suitable as a material for the metal thin film 14 because it is stable against oxidation and the electric field enhancement due to the dense wave (surface plasmon) increases.
また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。 Examples of the method of forming the metal thin film 14 include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. Among these, the sputtering method and the vapor deposition method are preferable because the thin film formation conditions can be easily adjusted.
さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。 Further, the thickness of the metal thin film 14 is in the range of gold: 5-500 nm, silver: 5-500 nm, aluminum: 5-500 nm, copper: 5-500 nm, platinum: 5-500 nm, and alloys thereof: 5-500 nm. It is preferable to be within.
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。 From the viewpoint of the electric field enhancement effect, within the range of gold: 20-70 nm, silver: 20-70 nm, aluminum: 10-50 nm, copper: 20-70 nm, platinum: 20-70 nm, and alloys thereof: 10-70 nm More preferably.
金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。 If the thickness of the metal thin film 14 is within the above range, close-packed waves (surface plasmons) are easily generated, which is preferable. Moreover, if it is the metal thin film 14 which has such thickness, a magnitude | size (length x width) will not be specifically limited.
さらに、アナライト検出時に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。 Furthermore, examples of specimens used at the time of analyte detection include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (eg, cerebrospinal fluid, ascites, pleural effusion).
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。 The analyte contained in the sample is, for example, a nucleic acid (DNA, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), which may be single-stranded or double-stranded, or nucleoside. , Nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or modified molecules thereof, Specific examples thereof include a complex, and may be a carcinoembryonic antigen such as AFP (α-fetoprotein), a tumor marker, a signal transduction substance, a hormone, and the like, and is not particularly limited.
さらに蛍光物質としては、所定の励起光２４を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光３２を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光３２とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。 Further, the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence 32 by being irradiated with predetermined excitation light 24 or excited by using a field effect. In addition, the fluorescence 32 as used in this specification includes various light emission, such as phosphorescence.
また、誘電体部材１２としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。As the dielectric member 12, various optically transparent inorganic substances, natural polymers, and synthetic polymers can be used. From the viewpoints of chemical stability, manufacturing stability, and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2). 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４による表面プラズモン共鳴の共鳴角を調整するため、角度可変部（図示せず）や、光検出手段３４に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。 Further, such a surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 adjusts the resonance angle of the surface plasmon resonance by the excitation light 24 irradiated from the light source 26 to the metal thin film 14, so that an angle variable unit (not shown), light detection, etc. A computer (not shown) for processing information input to the means 34 may be included.
ここで、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段３０と光源２６とを同期し、４５〜８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。 Here, the angle variable unit (not shown) synchronizes the light receiving means 30 and the light source 26 in order to obtain the total reflection attenuation (ATR) condition with a servo motor, and enables an angle change of 45 to 85 °, and the resolution. Is preferably 0.01 ° or more.
上記した構成を有する本実施の形態の表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、特に反応エリア２０で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光３２を励起する励起エリア４０が、反応エリア２０よりも小さく設定されている点において特徴的である。 In the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 of the present embodiment having the above-described configuration, the excitation area 40 that excites the fluorescence 32 emitted from the fluorescent substance labeled with the analyte immobilized in the reaction area 20 is more particularly than the reaction area 20. Is also characteristic in that it is set small.
以下、このように反応エリア２０と励起エリア４０とを設定してなる表面プラズモン増強蛍光センサ１０について説明する。 Hereinafter, the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 in which the reaction area 20 and the excitation area 40 are set as described above will be described.
＜反応エリア２０と励起エリア４０との関係＞
本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、図２に示したように、反応エリア２０に対して、光源２６より照射される励起光２４による励起エリア４０が小さく設定されている。<Relationship between reaction area 20 and excitation area 40>
As shown in FIG. 2, the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 which is an embodiment of the fluorescence detection apparatus of the present invention has a smaller excitation area 40 by the excitation light 24 irradiated from the light source 26 than the reaction area 20. Is set.
反応エリア２０の全面における反応量の分布は、図３に示したように、一方向の循環送液系の場合、流路上流に位置する反応エリア端部（図３では左側端部）において反応量が偏った状態となる。なお、図３において、横軸の「反応エリア端部からの相対位置」は、反応エリア２０の流路方向における全長を１として、一端を「０」、他端を「１」として表したものであり、縦軸の「分布（バラツキ具合）」は、反応エリア２０全体における全反応量を単位領域で平均した反応量の平均値を１として、その平均値に対する各単位領域の反応量の比率を表したものである。この単位領域は、反応エリア２０を流路方向全長の１／１００毎に区分けした領域である。 As shown in FIG. 3, the distribution of the reaction amount on the entire surface of the reaction area 20 is the reaction at the end of the reaction area (the left end in FIG. 3) located upstream of the flow path in the case of a unidirectional circulation liquid feeding system. The amount is biased. In FIG. 3, the “relative position from the end of the reaction area” on the horizontal axis represents the total length of the reaction area 20 in the flow path direction as 1, the one end as “0”, and the other end as “1”. The “distribution (variation degree)” on the vertical axis indicates the ratio of the reaction amount of each unit region to the average value, where 1 is the average value of the reaction amount obtained by averaging the total reaction amount in the entire reaction area 20 in the unit region. It represents. This unit area is an area obtained by dividing the reaction area 20 every 1/100 of the total length in the flow path direction.
したがって、この反応エリア２０の内、反応量の偏っていない箇所、すなわち図３に示したグラフ縦軸の分布（バラツキ具合）の幅が僅かとなるエリアを励起エリア４０に設定することにより、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度なアナライトの検出が可能である。 Therefore, by setting the excitation area 40 as a region where the reaction amount is not biased in the reaction area 20, that is, an area where the distribution (variation degree) of the vertical axis of the graph shown in FIG. Variations in results can be suppressed, and highly accurate analyte detection is possible.
なお、図２に示した反応エリア２０と励起エリア４０との関係では、励起エリア４０が、反応エリア２０の流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアに設定されているが、循環送液系は、流路１８の上流側に位置する反応エリア２０端部において反応量が偏り（反応量が局部的に多くなること）、流路１８の下流側では反応量の偏りは生じないため、図４および図５に示したように、励起エリア４０を反応エリア２０の上流側の端部のみを除いたエリアとしても良いものである。 In the relationship between the reaction area 20 and the excitation area 40 shown in FIG. 2, the excitation area 40 is located at both ends of the end portion located on the upstream side of the reaction area 20 and the end portion located on the downstream side of the flow path. However, in the circulating liquid feeding system, the reaction amount is biased at the end of the reaction area 20 located on the upstream side of the flow path 18 (the reaction amount increases locally), and the flow path As shown in FIGS. 4 and 5, the excitation area 40 may be an area excluding only the upstream end of the reaction area 20 because the reaction amount is not biased downstream of the reaction area 18.
一方、双方向の往復送液系の場合には図６に示したように、反応エリア２０の流路１８の上流側の端部と流路１８の下流側の端部において反応量が偏った状態となる。 On the other hand, in the case of a bidirectional reciprocating liquid feeding system, as shown in FIG. 6, the reaction amount is uneven at the upstream end of the flow path 18 and the downstream end of the flow path 18 in the reaction area 20. It becomes a state.
このため往復送液系の場合には、反応エリア２０の流路１８の上流側の端部と流路１８の下流側の端部とを除いたエリアを励起エリア４０とすることで、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことができる。 Therefore, in the case of a reciprocating liquid feeding system, the measurement result is obtained by setting the area excluding the upstream end of the flow channel 18 and the downstream end of the flow channel 18 as the excitation area 40. Variation can be suppressed, and the analyte can be detected with high accuracy.
循環送液系と往復送液系とを比べると、往復送液系の方が反応量の分布（バラツキ具合）が少ないため、表面プラズモン増強蛍光センサ１０に用いる送液系としては往復送液系の方が好適である。 Comparing the circulating and reciprocating liquid systems, the reciprocating liquid system has a smaller reaction amount distribution (variation), so that the reciprocating liquid system used as the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 is a reciprocating liquid system. Is preferred.
なお、往復送液系については、従来より公知の技術を用いることができ、例えば流路１８の上流側に往復送液ポンプ（図示せず）を設置するとともに、流路１８の下流側に試料溶液の混合部（図示せず）を設置し、往復送液ポンプ（図示せず）の駆動により、反応エリア２０内に試料溶液を流して流路１８の下流側の混合部（図示せず）へ試料溶液を移動させ、次いで再度往復送液ポンプ（図示せず）を駆動させて今度は混合部（図示せず）内の試料溶液を往復送液ポンプ（図示せず）側へ移動させることを複数回繰り返すことで、反応エリア２０に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化されることとなる。 For the reciprocating liquid supply system, a conventionally known technique can be used. For example, a reciprocating liquid pump (not shown) is installed on the upstream side of the flow path 18 and the sample is positioned on the downstream side of the flow path 18. A solution mixing unit (not shown) is installed, and a sample solution is caused to flow into the reaction area 20 by driving a reciprocating liquid pump (not shown), so that a mixing unit (not shown) downstream of the flow path 18 is flown. Next, the sample solution in the mixing section (not shown) is moved to the reciprocating solution pump (not shown) side by driving the reciprocating solution pump (not shown) again. By repeating a plurality of times, the analyte labeled with the fluorescent substance is immobilized in the reaction area 20.
また、本発明においては、金属薄膜１４の上面に形成された反応層１６において、金属薄膜１４が形成されたエリアよりも内側に反応エリア２０が形成されているが、このような構成に限定されるものではなく、金属薄膜１４の形成されたエリアの全面上に反応エリア２０を設けても良く、これらのエリアの関係は如何なるものであっても良いものである。 In the present invention, in the reaction layer 16 formed on the upper surface of the metal thin film 14, the reaction area 20 is formed inside the area where the metal thin film 14 is formed. However, the present invention is limited to such a configuration. Instead, the reaction area 20 may be provided on the entire surface of the area where the metal thin film 14 is formed, and the relationship between these areas may be anything.
なお、上記説明では本発明の蛍光検出装置の一実施例として表面プラズモン増強蛍光センサ１０を用いて説明したが、表面プラズモン増強蛍光センサ１０と同様の原理を用いた全反射蛍光センサ（図示せず）であっても、反応エリア２０よりも励起エリア４０を小さくすれば、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことができる。なお、励起エリア４０は反応エリア２０内に位置するよう設定することは勿論である。 In the above description, the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 has been described as an embodiment of the fluorescence detection apparatus of the present invention. However, a total reflection fluorescence sensor (not shown) using the same principle as the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 is used. However, if the excitation area 40 is made smaller than the reaction area 20, the variation in the measurement results can be suppressed, and the analyte can be detected with high accuracy. Of course, the excitation area 40 is set so as to be located in the reaction area 20.
表面プラズモン増強蛍光センサ１０と全反射蛍光センサ（図示せず）の構成の違いとして、表面プラズモン増強蛍光センサ１０は誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４が形成され、この上に反応層１６が形成されるのに対し、全反射蛍光センサ（図示せず）は誘電体部材の上面に直接反応層が形成される点が挙げられる。全反射蛍光センサ（図示せず）の場合には、誘電体部材と反応層との界面においてエバネッセント波が生ずるものであること以外、表面プラズモン増強蛍光センサと基本的な構成は同じであるため、その詳細な説明について本明細書では省略する。 As a difference in configuration between the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 and a total reflection fluorescence sensor (not shown), the surface plasmon enhanced fluorescence sensor 10 has a metal thin film 14 formed on the upper surface of a dielectric member 12, and a reaction layer 16 formed thereon. Whereas the total reflection fluorescent sensor (not shown) is formed, a reaction layer is directly formed on the upper surface of the dielectric member. In the case of a total reflection fluorescent sensor (not shown), the basic configuration is the same as that of the surface plasmon enhanced fluorescent sensor except that an evanescent wave is generated at the interface between the dielectric member and the reaction layer. Detailed description thereof is omitted in this specification.
上記したように本発明の蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法は、反応エリアに対する励起エリアの大きさを規定し、反応量の分布の少ない範囲のみ、すなわち反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所を除いた箇所のみを励起エリアとして測定するように各エリアの大きさを規定したので、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことができるものであって、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。 As described above, the fluorescence detection apparatus of the present invention and the fluorescence detection method using the same define the size of the excitation area relative to the reaction area, and only the range where the reaction amount distribution is small, that is, the reaction amount at the end of the reaction area. Since the size of each area is specified so that only the place excluding the place where the distribution is large is measured as the excitation area, the variation in the measurement result can be suppressed, and the analyte can be detected with high accuracy However, various modifications can be made without departing from the object of the present invention.
１０・・・表面プラズモン増強蛍光センサ
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・反応層
１８・・・流路
２０・・・反応エリア
２２・・・チップ構造体
２４・・・励起光
２６・・・光源
２８・・・反射光
３０・・・受光手段
３２・・・蛍光
３４・・・光検出手段
３６・・・集光部材
３８・・・波長選択機能部材
４０・・・励起エリア
４２・・・反応量が偏った箇所
１００・・・表面プラズモン増強蛍光センサ
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・反応層
１０８・・・流路
１１０・・・反応エリア
１１２・・・チップ構造体
１１４・・・励起光
１１６・・・光源
１１８・・・反射光
１２０・・・受光手段
１２２・・・蛍光
１２４・・・光検出手段
１２６・・・集光部材
１２８・・・波長選択機能部材
１３０・・・励起エリア
１３２・・・反応量が偏った箇所DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Surface plasmon enhancement fluorescence sensor 12 ... Dielectric member 14 ... Metal thin film 16 ... Reaction layer 18 ... Flow path 20 ... Reaction area 22 ... Chip structure 24 ... Excitation light 26 ... light source 28 ... reflected light 30 ... light receiving means 32 ... fluorescence 34 ... light detection means 36 ... light collecting member 38 ... wavelength selection function member 40 .. Excitation area 42 ... Location where reaction amount is biased 100 ... Surface plasmon enhanced fluorescence sensor 102 ... Dielectric member 104 ... Metal thin film 106 ... Reaction layer 108 ... Channel 110 ... Reaction area 112 ... chip structure 114 ... excitation light 116 ... light source 118 ... reflected light 120 ... light receiving means 122 ... fluorescence 124 ... light detecting means 126 ... collection Optical member 128 ... wavelength selection function section Material 130 ... excitation area 132 ... where the reaction amount is biased
Claims (9)
前記蛍光検出装置は、
反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
前記反応層の流路が、往復送液系であり、
前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出装置。 An excitation light is emitted from a light source to emit an evanescent wave from a reflecting surface, a fluorescent substance labeled with an analyte immobilized on the reflecting surface is excited, and the excited fluorescence is detected by a light detecting means. A fluorescence detection device,
The fluorescence detection device comprises:
A chip structure having a reflective surface and a reaction layer formed on the reflective surface is configured to be used by being attached to and detached from the apparatus body, or fixed to the apparatus body,
The reaction layer includes a flow path and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path.
The flow path of the reaction layer is a reciprocating liquid feeding system;
The relationship between the reaction area formed in the flow path and the excitation area, which is a range for irradiating excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area,
The size of each area is defined to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The excitation area has an end portion positioned in the flow path upstream side of the reaction area deviation of the distribution is large reaction volume, and an end portion positioned on deviation is large flow path downstream of the distribution of the reaction volume, both end portions of the A fluorescence detection apparatus, characterized in that it is an area in which the distribution of the reaction amount distribution is small .
前記蛍光検出装置は、
反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
前記反応層の流路が、循環送液系であり、
前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出装置。 An excitation light is emitted from a light source to emit an evanescent wave from a reflecting surface, a fluorescent substance labeled with an analyte immobilized on the reflecting surface is excited, and the excited fluorescence is detected by a light detecting means. A fluorescence detection device,
The fluorescence detection device comprises:
A chip structure having a reflective surface and a reaction layer formed on the reflective surface is configured to be used by being attached to and detached from the apparatus body, or fixed to the apparatus body,
The reaction layer includes a flow path and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path.
The flow path of the reaction layer is a circulating liquid feeding system;
The relationship between the reaction area formed in the flow path and the excitation area, which is a range for irradiating excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area,
The size of each area is defined to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The fluorescence detection apparatus according to claim 1, wherein the excitation area is an area with a small bias of the reaction amount distribution except for an end portion located on the upstream side of the flow path of the reaction area where the bias of the reaction amount distribution is large .
表面プラズモン増強蛍光センサまたは全反射蛍光センサのいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の蛍光検出装置。 The fluorescence detection device is
The fluorescence detection device according to claim 1, which is either a surface plasmon enhanced fluorescence sensor or a total reflection fluorescence sensor.
前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記反応層の流路が、往復送液系であり、
前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように前記励起光を照射し、
前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出方法。 A reflective surface and a reaction layer formed on one side of the reflective surface, wherein the reaction layer includes a flow path, and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path. Capturing the analyte in the reaction area of the chip structure comprising: and labeling the analyte with a fluorescent material;
Irradiating excitation light from the other side of the reflecting surface of the chip structure to excite the fluorescent material in the reaction area;
Measuring the excited fluorescence with a light detection means;
A fluorescence detection method having at least
In the step of labeling the analyte with a fluorescent substance,
The flow path of the reaction layer is a reciprocating liquid feeding system;
In the step of exciting the fluorescent material in the reaction area,
The relationship between the reaction area and the excitation area, which is a range in which the excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area is irradiated,
Irradiate the excitation light so as to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
The excitation area has an end portion positioned in the flow path upstream side of the reaction area deviation of the distribution is large reaction volume, and an end portion positioned on deviation is large flow path downstream of the distribution of the reaction volume, both end portions of the A fluorescence detection method characterized in that it is an area where the deviation of the distribution of the reaction amount excluding the is small .
前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記反応層の流路が、循環送液系であり、
前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように前記励起光を照射し、
前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出方法。 A reflective surface and a reaction layer formed on one side of the reflective surface, wherein the reaction layer includes a flow path, and a reaction area in which a ligand for capturing the analyte is formed in the flow path. Capturing the analyte in the reaction area of the chip structure comprising: and labeling the analyte with a fluorescent material;
Irradiating excitation light from the other side of the reflecting surface of the chip structure to excite the fluorescent material in the reaction area;
Measuring the excited fluorescence with a light detection means;
A fluorescence detection method having at least
In the step of labeling the analyte with a fluorescent substance,
The flow path of the reaction layer is a circulating liquid feeding system;
In the step of exciting the fluorescent material in the reaction area,
The relationship between the reaction area and the excitation area, which is a range in which the excitation light for exciting the fluorescent substance labeled with the analyte captured in the reaction area is irradiated,
Irradiate the excitation light so as to satisfy the relationship of reaction area> excitation area,
2. The fluorescence detection method according to claim 1, wherein the excitation area is an area having a small distribution of reaction amount except for an end located on the upstream side of the flow path of the reaction area where the distribution of reaction amount is large .
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