JP5988199B2 - IgA nephropathy diagnostic method - Google Patents
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Description
本発明は、ＩｇＡ腎症を他の腎症と区別して診断する方法に関する。 The present invention relates to a method for diagnosing IgA nephropathy in distinction from other nephropathy.
ＩｇＡ腎症は、世界で最も多い慢性糸球体腎炎であり、糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡの沈着を主体とする顆粒状沈着を特徴とするメサンギウム増殖性腎炎、と定義され、約２５年の経過で約半数が末期腎不全へと進行する予後不良な疾患である。メサンギウム領域には、しばしばＩｇＧの共沈着がみられる。その発症機序はいまだ十分に解明されておらず、その治療方法も、食事療法、抗血小板薬、降圧薬、副腎皮質ステロイド等による薬物治療が行なわれているが、十分な治療効果は得られていない。 IgA nephropathy is the most common chronic glomerulonephritis in the world and is defined as mesangial proliferative nephritis characterized by granular deposition mainly consisting of IgA deposition in the glomerular mesangial region. About half of them have a poor prognosis that progresses to end-stage renal failure. IgG co-deposition is often seen in the mesangial region. The mechanism of its onset has not yet been fully elucidated, and its treatment has been performed with diet therapy, antiplatelet drugs, antihypertensive drugs, corticosteroids, etc., but sufficient therapeutic effects have been obtained. Not.
ＩｇＡ腎症は、前記の定義に従い、現在、腎生検により診断されている。しかし、腎生検は、入院を要し、出血・感染のリスクを伴うために患者に対する負担が大きい、片腎の患者には腎生検施行が困難である等の問題がある。従って、採血や採尿などの非侵襲的な検者データによってＩｇＡ腎症を診断することは重要課題である。 IgA nephropathy is currently diagnosed by renal biopsy according to the above definition. However, renal biopsy requires hospitalization and is associated with a risk of bleeding / infection, resulting in a heavy burden on the patient, and it is difficult for a single kidney patient to perform a renal biopsy. Therefore, diagnosing IgA nephropathy based on noninvasive examiner data such as blood collection and urine collection is an important issue.
しかし、ＩｇＡ腎症には、ＩｇＡ及びＩｇＧがともに沈着する症例、ＩｇＡのみが沈着する症例が混在し、非侵襲的診断は困難である。また、ＩｇＡ腎症患者の血中には、糖鎖不全型ＩｇＡ１が増加している（非特許文献１）ことが知られている。しかし、糖鎖不全ＩｇＡ１だけで、本症の病態を説明することは困難であり、糖鎖不全ＩｇＡ１が高分子の免疫複合体を形成し、腎臓に沈着することが病態において重要であると考えられる。免疫複合体を形成するＩｇＡは糖鎖不全ＩｇＡ１であり、患者血中には、糖鎖不全ＩｇＡ１−ＩｇＡ、および糖鎖不全ＩｇＡ１−ＩｇＧ免疫複合体が増加していることが判明し、近年本発明者らは、糖鎖不全ＩｇＡ１を特異的に認識するＩｇＧ抗体を同定し、測定系を樹立した（非特許文献２）。これまでに、ＩｇＡ腎症患者の血中で増加していると報告がある血中糖鎖不全ＩｇＡ１や免疫複合体値でも、健常人やＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者群の血中の値とオーバーラップが認められ、これらのバイオマーカーでは診断に用いることが困難である。 However, in IgA nephropathy, cases where both IgA and IgG are deposited and cases where only IgA is deposited are mixed, and noninvasive diagnosis is difficult. Further, it is known that sugar chain-deficient IgA1 is increased in the blood of IgA nephropathy patients (Non-patent Document 1). However, it is difficult to explain the pathology of this disease only with sugar chain-deficient IgA1, and it is important in the pathological condition that sugar chain-deficient IgA1 forms a macromolecular immune complex and deposits in the kidney. It is done. IgA that forms an immune complex is sugar chain-deficient IgA1, and it has been found that sugar chain-deficient IgA1-IgA and sugar chain-deficient IgA1-IgG immune complexes are increasing in patient blood. The inventors identified an IgG antibody that specifically recognizes sugar chain-deficient IgA1, and established a measurement system (Non-patent Document 2). So far, blood sugar chain deficiency IgA1 and immune complex values that have been reported to increase in the blood of IgA nephropathy patients can also be obtained from healthy individuals and kidney disease patients other than IgA nephropathy. These biomarkers are difficult to use for diagnosis.
本発明の課題は、腎生検に頼ることなく、ＩｇＡ腎症を高確率で診断できる手段を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a means capable of diagnosing IgA nephropathy with high probability without relying on a renal biopsy.
そこで本発明者は、ＩｇＡ腎症の正確な診断手段を開発すべく、種々の血中バイオマーカー、尿中マーカー等を組み合わせて検討してきたが、従来知られている種々のマーカーを組み合わせても腎生検の結果との相関性は向上しなかった。そこでさらに検討した結果、特定の血中バイオマーカーと尿中マーカーとを組み合わせ、これを変数としてロジスティック回帰モデルによる解析を行ったところ、９０％以上の正確さでＩｇＡ腎症の診断ができることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventor has investigated various blood biomarkers, urine markers, etc. in order to develop an accurate diagnostic means for IgA nephropathy. Correlation with renal biopsy results did not improve. As a result of further investigation, when a specific blood biomarker and urine marker were combined and analyzed using a logistic regression model as a variable, it was found that IgA nephropathy can be diagnosed with an accuracy of 90% or more. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の［１］〜［４］に関するものである。
［１］少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析することを特徴とするＩｇＡ腎症診断のための検査法。
［２］ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、年齢及び性別を加えて解析する［１］記載の検査法。
［３］ロジスティック回帰モデルの変数としてさらに、血中クレアチニン値を加えて解析する［１］又は［２］記載の検査法。
［４］被験者由来、及びＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者由来の各測定値のロジスティック回帰モデル解析結果を対比することにより判定するものである［１］〜［３］のいずれか１項記載の検査法。
That is, the present invention relates to the following [1] to [4].
[1] At least five kinds of measured values of blood IgA value, blood sugar chain deficiency IgA1 value, blood IgA-IgG immune complex value, blood sugar chain deficiency IgA1 specific IgA value and urinary protein value are logistically A test method for diagnosing IgA nephropathy, characterized by analyzing by a regression model.
[2] The test method according to [1], wherein analysis is further performed by adding age and sex as variables of the logistic regression model.
[3] The test method according to [1] or [2], wherein a blood creatinine value is further added as a variable of the logistic regression model for analysis.
[4] The determination according to any one of [1] to [3], wherein the determination is made by comparing the logistic regression model analysis results of each measurement value derived from a subject and from a renal disease patient other than IgA nephropathy. Inspection method.
本発明によれば、採血及び採尿により得られる非侵襲的な検査データのみから、ＩｇＡ腎症を正確に診断できる。これにより、早期の治療が可能になるとともに、治療中の経過観察も患者に負担をかけずに行うことができる。 According to the present invention, IgA nephropathy can be accurately diagnosed only from noninvasive test data obtained by blood collection and urine collection. Thereby, early treatment is possible and follow-up during treatment can be performed without burdening the patient.
本発明の検査法は、少なくとも血中ＩｇＡ値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１値、血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値及び尿中タンパク値の５種の測定値をロジスティック回帰モデルにより解析する。本発明の検査法においては、診断をより正確にするために、上記５種に加えて、年齢及び性別をロジスティック回帰モデルの解析変数として追加するのが好ましい。さらに、上記５又は７種に加えて、血中クレアチニン値、血尿の有無を当該解析変数として追加するのが好ましい。 The test method of the present invention comprises at least 5 kinds of blood IgA values, blood sugar chain deficiency IgA1 values, blood IgA-IgG immune complex values, blood sugar chain deficiency IgA1-specific IgA values, and urinary protein values. Analyze the measured values with a logistic regression model. In the test method of the present invention, in order to make the diagnosis more accurate, it is preferable to add age and sex as analysis variables of the logistic regression model in addition to the above five types. Further, in addition to the above 5 or 7, it is preferable to add the blood creatinine value and the presence or absence of hematuria as the analysis variables.
血中ＩｇＡ値は、例えばＥＬＩＳＡ、放射免疫定量法（ＲＩＡ）等の免疫測定法により測定することができる。このうち、ＥＬＩＳＡ法により測定するのが、方法論が確立されており好適である。血中ＩｇＡ値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度として得られるので、この数値（ｍｇ／ｍｌ）を直接解析に使用し、ロジスティックモデル解析に使用する。 The blood IgA value can be measured by immunoassay methods such as ELISA and radioimmunoassay (RIA). Among these, measurement by ELISA method is preferable because the methodology has been established. Since the blood IgA value is usually measured for plasma and obtained as a concentration in 1 ml of plasma, this numerical value (mg / ml) is directly used for analysis and used for logistic model analysis.
血中糖鎖不全ＩｇＡ１値は、例えばレクチンを用いたアフィニティクロマト法、ＥＬＩＳＡ等の免疫測定法により測定することができる。このうち、ＥＬＩＳＡにより測定するのが、正確であり好ましい。血中糖鎖不全ＩｇＡ１値は、精製された糖鎖不全ＩｇＡ１蛋白を対象として測定され、血中ＩｇＡ １００ｎｇ中に含まれる糖鎖異常ＩｇＡ１値が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値を血中ＩｇＡ値と掛け合わせ、血中の糖鎖異常ＩｇＡ１値を算出し（Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ロジスティックモデル解析に使用する。 The blood sugar chain deficiency IgA1 value can be measured by immunoassay methods such as affinity chromatography using lectin, ELISA, and the like. Among these, it is accurate and preferable to measure by ELISA. The blood sugar chain deficient IgA1 value is measured for the purified sugar chain deficient IgA1 protein, and the sugar chain abnormal IgA1 value contained in 100 ng of blood IgA is obtained as the absorbance (OD). Multiply it with the medium IgA value to calculate the abnormal sugar chain IgA1 value (Units / ml) and use it for logistic model analysis.
血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値は、ＥＬＩＳＡ法より測定することができる。血中ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。 The blood IgA-IgG immune complex value can be measured by the ELISA method. The blood IgA-IgG immune complex value is usually measured for plasma, and the concentration in 1 ml of plasma is obtained as absorbance (OD), so this value is used for logistic model analysis.
血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値は、ＥＬＩＳＡ法により測定することができる。ＥＬＩＳＡで測定するのが、正確であり好ましい。血中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度が吸光度（ＯＤ）として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。 The blood sugar chain-deficient IgA1-specific IgA value can be measured by an ELISA method. It is accurate and preferable to measure by ELISA. The blood sugar chain-deficient IgA1-specific IgA value is usually measured in plasma, and since the concentration in 1 ml of plasma is obtained as absorbance (OD), this value is used for logistic model analysis.
尿タンパク値は、例えば比濁法、色素比色法（ＰＲ法、ＣＢＢ法など）、Ｌｏｗｒｙ法により測定することができる。このうち、色素比色法（ＰＲ法）法による測定値を用いるのが簡便である点で好ましい。尿タンパク値は、通常尿１ｍｌ中の濃度として得られる。しかし、随時尿中の尿蛋白は尿の比重によって影響を受けるため、１日の尿蛋白***量を推定する方法として、通常尿中のクレアチニン値で補正をする。尿中クレアチニン値は、酵素法で測定され、通常１ｍｌ中の濃度として得られる。随時尿中の尿蛋白***量として、尿中蛋白／尿中クレアチニン値（ｇ／ｇ・Ｃｒ）として算出され、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。 The urine protein value can be measured by, for example, a turbidimetric method, a pigment colorimetric method (PR method, CBB method, etc.), or a Lowry method. Among these, it is preferable that the measured value by the dye colorimetric method (PR method) is used because it is simple. The urine protein value is usually obtained as a concentration in 1 ml of urine. However, since urine protein in urine is affected by the specific gravity of urine at any time, correction is usually made with the creatinine value in urine as a method for estimating the daily urinary protein excretion. The urinary creatinine value is measured by an enzymatic method and is usually obtained as a concentration in 1 ml. The amount of urinary protein excretion in the urine is calculated as urinary protein / urinary creatinine value (g / g · Cr), and this value is used for logistic model analysis.
血中クレアチニン値は、例えば酵素法、Ｊａｆｆｅ法等により測定することができる。このうち、酵素法による測定値を用いるのが簡便であり好ましい。血中クレアチニン値は、通常血漿を対象として測定され、血漿１ｍｌ中の濃度として得られるので、この数値をロジスティックモデル解析に使用する。 The blood creatinine value can be measured by, for example, an enzyme method, a Jeff method, or the like. Among these, it is convenient and preferable to use a measurement value by an enzyme method. Since the blood creatinine value is usually measured for plasma and obtained as a concentration in 1 ml of plasma, this value is used for logistic model analysis.
血尿の程度は尿中赤血球数で判断する。尿中赤血球数は、通常顕微鏡下で目視することで測定できる。尿中赤血球数は、１〜５個／視野を０、６〜１０個／視野を１、１１〜１５個／視野を２、１６〜２０個／視野を３、２１〜２５個／視野を４、２６〜３０個／視野を５、多数／視野を６と定量化してロジスティックモデル解析に使用する。また、年齢はそのままロジスティックモデル解析に使用し、性別は男性を１、女性を２としてロジスティックモデル解析に使用する。 The degree of hematuria is determined by the number of red blood cells in the urine. The urinary red blood cell count can be usually measured by visual observation under a microscope. The number of red blood cells in urine is 1 to 5 / field 0, 6 to 10 / field 1, 1, 11 to 15 / field 2, 16 to 20 / field 3, 21 to 25 / field 4 26-30 / field of view is quantified as 5, and multiple / field of view is quantified as 6, which is used for logistic model analysis. The age is used for logistic model analysis as it is, and the gender is used for logistic model analysis with 1 for male and 2 for female.
ロジスティック回帰モデルによる解析は、市販の統計解析ソフトに含まれる多変量解析（ロジスティック回帰モデル）を用いて、前記５種〜９種の変数を入力して解析すればよい。ロジスティック回帰モデルは、ＪＭＰ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｊａｐａｎ株式会社）より入手できる。具体的には、ロジスティック回帰モデルの変数として、血中ＩｇＡ値、糖鎖異常ＩｇＡ１値、ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体値、糖鎖異常ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ値、尿中蛋白量（尿中蛋白／尿中クレアチニン値）、血中クレアチニン値、尿中赤血球数、年齢、性別を入力し、ＩｇＡ腎症患者とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の各々の数値を定量化する。 The analysis using the logistic regression model may be performed by inputting the 5 to 9 variables using multivariate analysis (logistic regression model) included in commercially available statistical analysis software. The logistic regression model can be obtained from JMP software (SAS Institute Japan Co., Ltd.). Specifically, as variables of the logistic regression model, blood IgA value, abnormal sugar chain IgA1 value, IgA-IgG immune complex value, abnormal sugar chain IgA1 specific IgA value, urinary protein amount (urinary protein / urine (Medium creatinine value), blood creatinine value, urinary red blood cell count, age, and sex are input, and the numerical values of IgA nephropathy patients and patients with renal diseases other than IgA nephropathy are quantified.
得られた解析結果を、健常者についての解析結果、他の腎疾患患者の解析結果と対比すれば、さらに正確な診断が可能である。また、健常者の解析結果、ＩｇＡ腎症の患者の解析結果、他の腎疾患患者の解析結果を多数データベース化すれば、より正確な診断が可能となる。 If the obtained analysis results are compared with the analysis results of healthy subjects and the analysis results of other renal disease patients, a more accurate diagnosis is possible. Further, if a large number of analysis results of healthy subjects, analysis results of IgA nephropathy patients, and analysis results of other renal disease patients are compiled into a database, a more accurate diagnosis can be made.
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。 EXAMPLES Next, an Example is given and this invention is demonstrated in detail.
実施例
（１）血漿中糖鎖不全ＩｇＡ１の測定値を健常者群とＩｇＡ腎症（腎生検による）群とを対比した結果は、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００７，７１：１１４８−１１５４に報告されており、その選択性は９０．０％であるが、感度は７６．５％と報告されている。
一方、本発明者の以前の検討によれば、血漿中糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＧを用いて診断を行った結果、ＩｇＡ腎症と健常者で感度９５％、特異度８８％であった（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００９，１１９：１６６８−１６７７）。
（２）今回、ＩｇＡ腎症患者１３５名及び健常者７４名の以下のマーカーを用いてロジスティック回帰モデル解析を行った。
（ａ）ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ法）
以下ＥＬＩＳＡプレートはＮｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐプレートを使用することとする。
１）抗ヒトＩｇＡ抗体＜Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＡ （α ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）＞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加して作成した０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いてプレートを３回洗浄する。（以下特に記載がなければ、プレートの洗浄にはＰＢＳ−Ｔを使用するものとする）
３）ＰＢＳ−Ｔに１％のｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加して作成した１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔ溶液を２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体＜ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｇｏａｔ ＩｇＧ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）＞をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液＜０．０５Ｍのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて作成した、０．４ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ溶液＞を１００μＬずつ各ウェルに添加して５分間室温で待ち発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図１に示す。
Example (1) The result of comparing the measured value of plasma sugar chain insufficiency IgA1 with a group of healthy subjects and an IgA nephropathy (by renal biopsy) was reported in Kidney Int, 2007, 71: 1148-1154. The selectivity is 90.0%, but the sensitivity is reported to be 76.5%.
On the other hand, according to the previous study of the present inventor, as a result of diagnosis using plasma sugar chain-deficient IgA1-specific IgG, the sensitivity was 95% and the specificity was 88% for healthy subjects with IgA nephropathy ( J Clin Invest, 2009, 119: 1668-1677).
(2) This time, a logistic regression model analysis was performed using the following markers of 135 IgA nephropathy patients and 74 healthy subjects.
(A) IgA (ELISA method)
Hereinafter, a Nunc MaxiSorp plate is used as the ELISA plate.
1) Anti-human IgA antibody <F (ab ′) 2 fragment of goat anti-human IgA (α chain-specific) (Jackson ImmunoResearch Labs)> to 1 μg / ml using phosphate buffered saline (PBS) Adjust and add 100 μL to each well of the ELISA plate and incubate overnight at 4 ° C. to coat the plate.
2) The plate is washed 3 times with 0.05% PBS-Tween solution (PBS-T) prepared by adding 0.05% Tween 20 to PBS. (Unless otherwise specified, PBS-T is used to wash the plate)
3) 200 μL of 1% BSA + PBS-T solution prepared by adding 1% bovine serum albumin (BSA) (Sigma Aldrich) to PBS-T was added to each well and incubated overnight at 4 ° C. Blocking.
4) Wash the plate 5 times.
5) Add human serum diluted to the optimal concentration with PBS-T to each well and incubate overnight at 4 ° C.
6) Wash the plate 5 times.
7) Enzyme-labeled anti-human IgA antibody labeled with horseradish peroxidase (HRP) <HRP conjugated F (ab ') 2 fragment of goat IgG anti-human IgA (BioSource)> diluted 10,000-fold with PBS-T Add 100 μL to each well. Incubate at 37 ° C. for 2 hours to perform enzyme labeling.
8) Wash the plate 5 times.
9) 100 μL each of the coloring substrate solution <0.4 mg / ml OPD solution> prepared by adding o-phenylenediamine (OPD) (Sigma Aldrich) to 0.05 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) Add to each well and wait 5 minutes at room temperature to develop color. Stop the reaction with 1N sulfuric acid.
10) Measure absorbance (490nm) using SpectraMax 340PC (Molecular Devices).
The results are shown in FIG.
（ｂ）糖鎖不全ＩｇＡ１（ＥＬＩＳＡ法）
１）抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳを用いて２．５μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔ溶液を２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートし、プレートをブロッキングする。
４）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄する。
５）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを用いて至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）を用いて１０ｍＵ／ｍｌに調整し、各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で３時間インキュベートする。
８）プレートを７回洗浄する。
９）ビオチンで標識されたＨｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎレクチン（ＨＡＡレクチン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡで５００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加して３７℃で２時間インキュベートする。
10）プレートを７回洗浄する。
11）Ｅｘｔｒａ−Ａｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１％ＢＳＡで２０００倍に希釈し、１００μＬずつウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートする。
12）プレートを５回洗浄する。
13）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で発色を停止する。
14）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図２に示す。
(B) Sugar chain deficiency IgA1 (ELISA method)
1) Adjust the anti-human IgA antibody to 2.5 μg / ml with PBS, add 100 μL to each well of the ELISA plate and incubate overnight at 4 ° C. to coat the plate.
2) Wash the plate 3 times.
3) Add 200 μL of 1% BSA + PBS-T solution to each well and incubate overnight at 4 ° C. to block the plate.
4) Wash once with 1% BSA + PBS-T.
5) Add human serum diluted to optimal concentration with 1% BSA + PBS-T to each well and incubate at 4 ° C. overnight.
6) Wash the plate 5 times.
7) Adjust Neurominidase (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) to 10 mU / ml with 0.1 M acetate buffer (pH 5), add 100 μL to each well, and incubate at 37 ° C. for 3 hours.
8) Wash the plate 7 times.
9) Helix aspersa agglutinin lectin (HAA lectin) (Sigma-Aldrich) labeled with biotin is diluted 500-fold with 1% BSA, and 100 μL is added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
10) Wash the plate 7 times.
11) Extra-Avidin (Sigma-Aldrich) is diluted 2000 times with 1% BSA, and 100 μL is added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
12) Wash the plate 5 times.
13) Color is developed for 15 minutes using a chromogenic substrate solution. Stop color development with 1N sulfuric acid.
14) Measure absorbance (490 nm) using SpectraMax 340PC (Molecular Devices).
The results are shown in FIG.
（ｃ）ＩｇＡ−ＩｇＧ免疫複合体（ＥＬＩＳＡ法）
１）抗ヒトＩｇＧ抗体＜Ｆ（ａｂ’）2 ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃγ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）＞をＰＢＳを用いて２μｇ／ｍｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加して４℃で一晩インキュベートし、プレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）１％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）ＨＲＰ酵素標識抗ヒトＩｇＡ抗体をＰＢＳ−Ｔを用いて１００００倍に希釈し、１００μＬずつ各ウェルに添加する。３７℃で２時間インキュベートし、酵素標識を行う。
８）プレートを５回洗浄する。
９）発色基質液を用いて５分間発色する。１規定の硫酸で反応を止める。
10）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図３に示す。
(C) IgA-IgG immune complex (ELISA method)
1) Adjust anti-human IgG antibody <F (ab ′) 2 fragments of goat anti-human IgG (Fcγ-specific) (Jackson ImmunoResearch Labs)> to 2 μg / ml using PBS, and add 100 μL to each well of the ELISA plate. Add in portions and incubate overnight at 4 ° C. to coat the plate.
2) Wash the plate 3 times.
3) Add 200 μL of 1% BSA + PBS-T to each well and incubate overnight at 4 ° C. to block the plate.
4) Wash the plate 5 times.
5) Add human serum diluted to the optimal concentration with PBS-T to each well and incubate overnight at 4 ° C.
6) Wash the plate 5 times.
7) The HRP enzyme-labeled anti-human IgA antibody is diluted 10,000 times with PBS-T, and 100 μL is added to each well. Incubate at 37 ° C. for 2 hours to perform enzyme labeling.
8) Wash the plate 5 times.
9) Color is developed for 5 minutes using a chromogenic substrate solution. Stop the reaction with 1N sulfuric acid.
10) Measure absorbance (490 nm) using SpectraMax 340PC (Molecular Devices).
The results are shown in FIG.
（ｄ）糖鎖不全ＩｇＡ１特異的ＩｇＡ（ＥＬＩＳＡ法）
１）糖鎖異常ＩｇＡ１のＦａｂ領域・ヒンジ部をＰＢＳで１．０μｇ／ｍｌに調整し、４℃で一晩インキュベートしプレートをコーティングする。
２）プレートを３回洗浄する。
３）２％ＢＳＡ＋ＰＢＳ−Ｔを２００μＬずつ各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをブロッキングする。
４）プレートを５回洗浄する。
５）ＰＢＳ−Ｔで至適濃度に希釈したヒト血清を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
６）プレートを５回洗浄する。
７）Ｆｃ領域特異的マウス抗ヒトＩｇＡ抗体＜ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＩｇＡ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．）＞をＰＢＳ−Ｔで０．５μｇ／ｍｌに調整し、各ウェルに１００μＬずつ添加し３７℃で２時間インキュベートする。
８）プレートを５回洗浄する。
９）ペルオキシダーゼで酵素標識された抗マウスＩｇＧ抗体＜Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）＞をＰＢＳ−Ｔで２００００倍に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃２時間でインキュベートする。
10）プレートを５回洗浄する。
11）発色基質液を用いて１５分間発色する。１規定の硫酸で反応を停止する。
12）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定する（４９０ｎｍ）。
結果を図４に示す。
(D) Sugar chain-deficient IgA1-specific IgA (ELISA method)
1) Abnormal sugar chain IgA1 Fab region / hinge is adjusted to 1.0 μg / ml with PBS and incubated overnight at 4 ° C. to coat the plate.
2) Wash the plate 3 times.
3) Add 200 μL of 2% BSA + PBS-T to each well and incubate overnight at 4 ° C. to block the plate.
4) Wash the plate 5 times.
5) Add human serum diluted to the optimal concentration with PBS-T to each well and incubate overnight at 4 ° C.
6) Wash the plate 5 times.
7) Fc region-specific mouse anti-human IgA antibody <mouse monoclonal antibody to human IgA (Fc specific) (Applied Biological Materials Inc.)> Was adjusted to 0.5 μg / ml with PBS-T to 100 μl, and L was added to each well. And incubate at 37 ° C. for 2 hours.
8) Wash the plate 5 times.
9) Peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody <Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch)> was diluted 20000 times with PBS-T, and 100 μL was added to each well. Incubate at 37 ° C for 2 hours.
10) Wash the plate 5 times.
11) Color is developed for 15 minutes using a chromogenic substrate solution. Stop the reaction with 1N sulfuric acid.
12) Measure absorbance (490 nm) using SpectraMax 340PC (Molecular Devices).
The results are shown in FIG.
（ｅ）血中クレアチニン（酵素法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｆ）尿タンパク（色素比色法（ＰＲ法）法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｇ）尿クレアチニン（酵素法）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｈ）血尿（顕微鏡による尿枕査検査）
病院内での通常診療における検査値を解析に用いた。
（ｉ）年齢
年齢は、そのまま解析に用いた。
（ｊ）性別
性別は、男性を１、女性を２として解析に用いた。
(E) Blood creatinine (enzymatic method)
The laboratory test values in the hospital were used for analysis.
(F) Urine protein (pigment colorimetric (PR) method)
The laboratory test values in the hospital were used for analysis.
(G) Urine creatinine (enzymatic method)
The laboratory test values in the hospital were used for analysis.
(H) Hematuria (urine pillow inspection with a microscope)
The laboratory test values in the hospital were used for analysis.
(I) Age Age was used for analysis as it was.
(J) Sex Gender was 1 for male and 2 for female.
用いたロジスティック回帰モデルは、実際には、透析解析ソフトに変数を入力し、自動的に算出されるものであるが、ロジスティックモデルの計算式を以下に示す。 The logistic regression model used is actually calculated automatically by inputting variables into the dialysis analysis software. The calculation formula of the logistic model is shown below.
Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌの式
ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］
＝１４．２３５０５４４８０１２１３＋７．１４９１９９４４２００６４３＊［ｌｏｇ１０［ＩｇＡ］］−８．１６３９７５３４２４３７３３＊［ｌｏｇ１０［ＩＣ］］−１１．５００６１９７４３００５＊［ｌｏｇ１０［Ｇｄ−ＩｇＡ１］］−１．６１６２４０６４２４７９３９＊［ｌｏｇ１０［ＩｇＡ＿Ａｂ］］＋０．０９６３５７４２００３１９８２７ ＊年齢＋Ｍａｔｃｈ（性，Ｆ，−０．１６８２０３０９０６８５０７７，Ｍ，０．１６８２０３０９０６８５０７７，．）＋０．９７００７４３２２２０１３１７＊［ＵＰｇ／ｇ・Ｃｒ］＋Ｍａｔｃｈ（［血尿（グレード）］，
１， ０，
２， −２．０６０８０９３４５３３２８，
３， −４．６５８３３９４３０３７７０８，
４， −３．５７２５２０３９５７３２９１，
５， −４．２５５７９７１１２０８７０１，
６， −２３．３６０５６０４１５６５６９，
７， −３．２８８５５５３５２５７９１２，
８， −４．７７１７１３３９５９７０５２，
．）
＋０．８８０１６５２５６５１９１１＊［ｌｏｇ１０［Ｓ−Ｃｒｅ］］
注１：Ｍａｔｃｈ（ｖａｒ，Ａ，ａ，Ｂ，ｂ，Ｃ，ｃ…ｚ）は、変数ｖａｒの値がＡならａ，Ｂならｂ，…，どれでもないのならｚをとる関数
注２：数字は出力リストの中でパラメータ推定値の表の中の推定値の欄の数字。資料とするなら桁数は小数点以下３桁程度にする。
Ｐｒｏｂ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］＝１／（１＋Ｅｘｐ（−［ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］］））
Ｐｒｏｂ［ＩｇＡＮ］＝１／（１＋Ｅｘｐ（［ｌｉｎｅａｒ［Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ］］））
Logistic Model expression linear [Disease controls]
= 14.2350544801213 + 7.149199444200643 * [log10 [IgA]]-8.169737534243333 * [log10 [IC]]-11.500619744305 * [log10 [Gd-IgA1]]-1.616624064747939 * [log10 [IgA_Ab]] + 0. 096357474200319827 * Age + Match (sex, F, -0.168203090685077, M, 0.1682030606885077,.) + 0.970000743222201317 * [UPg / g · Cr] + Match ([hematuria (grade)],
1, 0,
2, -2.06088099333528,
3, -4.5833943037708,
4, −3.57252539537291,
5, -4.25579711208701
6, −23.360605604156565,
7, -3.285855535257912,
8, -4.7717133997052,
. )
+ 0.88016552556511 * [log10 [S-Cre]]
Note 1: Match (var, A, a, B, b, C, c... Z) is a function that takes a if the value of the variable var is A, b if B, ..., z if none, Note 2: The number is the number in the estimated value column of the parameter estimated value table in the output list. If it is a document, the number of digits should be about 3 digits after the decimal point.
Prob [Disease controls] = 1 / (1 + Exp (− [linear [Disease controls]]))
Prob [IgAN] = 1 / (1 + Exp ([linear [Disease controls]]))
得られた結果を図５に示す。その結果、図５より、選択性８１％、感度９１％の高率でＩｇＡ腎症が判定できた。 The obtained results are shown in FIG. As a result, IgA nephropathy could be determined at a high rate of 81% selectivity and 91% sensitivity from FIG.
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