JP5980785B2 - 新規ビフィズス菌及びその利用 - Google Patents
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Description
さらに、本発明は、腸管細胞への接着能及びムチン資化能を指標としてビフィドバクテリウム属細菌を選抜することを特徴とする腸管に留まり、腸管内で増殖可能なビフィドバクテリウム属細菌のスクリーニング方法を提供するものである。
本菌は健康成人より分離され、科学的性質は、グラム陽性多形性桿菌、偏性嫌気性菌、至適生育温度37℃である。YIT 11926より得られた16S rDNA塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム YIT 11926の16S rDNA塩基配列は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムDSM20456(accession No.M38018)と99.5%の相同性を示し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムと同定された。
本菌は健康成人より分離され、科学的性質は、グラム陽性多形性桿菌、偏性嫌気性菌、至適生育温度37℃である。YIT 11939より得られた16S rDNA塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム YIT 11939の16S rDNA塩基配列は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムDSM20456(accession No.M38018)と99.6%の相同性を示し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムと同定された。
(1)ムチン資化能
B.adolescentis、B.bifidum、B.breve、B.catenulatum、B.longum、B.pseudocatenulatum、B.angulatum、B.animalis、B.infantis、B.globosum、B.lactis、B.dentium、L.rhamnosusの13菌種の試験菌株を使用した。
ビフィズス菌は0.7%グルコース添加GAM嫌気液体培地に凍結保存した試験菌液を1%接種し、24時間前培養した。乳酸菌(L.rhamnosus)はMRS液体培地に凍結保存した試験菌液を1%接種し、24時間前培養した。M−ILSの乳糖をムチン(和光、ブタ胃製)に置換した培地(ムチン添加量は1%)に前培養菌を1%接種し(初発菌数は107/ml・培地となる)、48時間後にクレット値を測定した。また糖質を加えないM−ILS培地でも48時間培養を行い、クレット値を測定した。
(1)と同様の13菌種の試験菌株を使用した。
ヒト大腸がん由来の細胞HT−29は10%FBS添加RPMI−1640培地で培養し、使用した。
ビフィズス菌は0.7%グルコース添加GAM嫌気液体培地で、乳酸菌(L.rhamnosus)はMRS液体培地で24時間培養し、PBSで2回洗浄したのち、10%FBS添加RPMI−1640培地にDAPI染色法による菌数が5×108/ml・培地となるように懸濁した。
HT−29をチャンバー付スライドグラスにコンフルエントになるまで培養後、10%FBS添加RPMI−1640に懸濁した菌懸濁液を400μl加えた(HT−29細胞1個当たりの試験菌株菌数は300個となる)。37℃、5%CO2下で2時間インキュベートした後、10%FBS添加RPMI−1640培地で2回、PBSで1回洗浄し、非接着の細菌を取り除き、2%PFAを加えて4℃で一晩固定した。96%エタノール処理後、ビフィズス菌に対しては蛍光色素Cy5で標識したビフィドバクテリウム特異的プローブBif153(腸内細菌学雑誌 18:141−146、2004)、乳酸菌に対しては蛍光色素Cy5で標識した乳酸菌特異的プローブLab158(Microb.Ecol.Health Dis.11:3−12、1999)を用いてハイブリダイゼーションし、DAPI染色剤の添加された封入剤で封入し蛍光顕微鏡システムにて蛍光画像を取得し、画像処理ソフトを用いてHT−29細胞1個当たりの各試験菌株の接着菌数を定量化した。
表1及び表2に各試験菌株のムチン資化能と接着能を示した。図1、2にHT−29細胞への接着能を有する菌株の画像、図3、4に接着能のない菌株の画像を示した。
上記の2菌株以外にムチン資化能を有するビフィズス菌の菌株が3株(Y11077、YIT11082、A−43)あったが、これらの3菌株はいずれも腸管細胞への接着能が低かった。また、腸管細胞への接着能は、YIT 11926、YIT 11939以外にYIT10155、31−2、YIT 4044、YIT 4018が有していたが、これらの4菌株はいずれもムチン資化能が低かった。ムチン資化能、腸管細胞への接着能は、同一の種においても菌株毎のバラツキが非常に大きく、同一の種が有する特有の傾向は見られなかった。
L.ラムノーサス GGは腸管への接着能を有する乳酸菌として知られているが(特許文献1)、今回の試験系でもYIT 11939と同等の腸管細胞への接着能を示した。
一方、GG株のムチン資化能について、糖質なしの培地でのクレット値が76を示したことから、GG株は糖源が存在しなくても増殖できる菌と判断され、ムチン添加培地でのクレット値(97)から上記の値(76)を差し引いた値(21)で判定すると、ムチン資化能を有しないと判断された。
上記以外に、多数のビフィズス菌を用いて、ムチン資化能(合計340株)、腸管細胞への接着能(合計60株)を調べたが、上記の選抜基準を満たす菌株は、YIT 11926、YIT 11939以外には得られなかった。
15%脱脂乳に3%グルコースを添加して殺菌し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムYIT 11939を1%接種し、37℃で24時間培養してヨーグルトベース210gを得た。一方、砂糖97g、乳化鉄0.2gを水に溶解し、全量を790gとして殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を1g添加した後、15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳飲料を得た。得られた発酵乳飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
全粉乳124gを水506gに溶解し、135℃で3秒間殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベを0.5%、ビフィドバクテリウム・ビフィダム YIT 11926を1%、ラクトバチルス・アシドフィルスを0.001%接種し、37℃でpH5.3まで培養し、15MPaで均質化して、菌液630gを得た。一方、パラチノース98g、ニンジンジュース8g、DHA含有油2.5g、乳化カルシルム7g、ラクトフェリン0.1g、ビタミンD0.02g、香料1gを水に溶解し、水を加えて全量を370gとした後、120℃で3秒間殺菌してシロップ液を得た。菌液、シロップ液を混合し、テトラブリック容器に充填して、pH;5.6、酸度;3.4、無脂乳固形分;8.7%、乳脂肪分;3.2%の発酵乳を得た。得られた発酵乳飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
下記の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
本発明の細菌菌体の乾燥物1) 20
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
1)ビフィドバクテリウム・ビフィダム YIT 11926の生菌体を凍結乾燥して製造した。
下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。得られた清涼飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
(処方) (g)
本発明の細菌菌体の乾燥物1) 5
香料 0.8
水 100
還元澱粉糖化物 24
果糖 18
1)ビフィドバクテリウム・ビフィダム YIT 11939の生菌体を凍結乾燥して製造した。
Claims (4)
- ビフィドバクテリウム・ビフィダムYIT11926(FERM BP -11504)又はビフィドバクテリウム・ビフィダムYIT11939(FERM BP -11505)。
- 請求項1記載のビフィドバクテリウム・ビフィダムを含有することを特徴とする飲食品。
- 発酵乳食品である請求項2記載の飲食品。
- 更に、甘味料を含有するものである請求項2又は3記載の飲食品。
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