JP5977737B2 - 癌の補助薬物療法でリステリアを使用する方法および組成物 - Google Patents

Description

（優先権および利益の主張）
本発明は、２０１０年５月２３日に出願された米国特許仮出願番号６１／３４７，４４７号の優先権を主張し、その表、図面および請求項をすべて含むその全体を本明細書に組み込むものとする。

（連邦政府の支援による研究に関する記述）
米国政府は、国立癌研究所助成番号ＮＨＩ１Ｋ２３ＣＡ１０４１６０−０１の条件によって規定されるように、本発明における一括払い方式の実施権と、妥当な条件に基づいて他に実施権を供与することを本特許所有者に要求する限定された状況下での権利とを有する。

特定の病原体に対して強い細胞性免疫を確立することは、望ましいと考えられる。同じワクチンによる反復投与（同種追加免疫）は、体液性応答の追加免疫に効果的であることが判明した。しかしながら、ベクターに対する事前免疫は、強い抗原提示と適切な炎症シグナルの生成を損なう傾向があるために、このアプローチは、細胞性免疫の追加免疫時に比較的非効率的である。この問題を回避する一アプローチは、異なる抗原-送達系（異種追加免疫）を使用するワクチンの連続投与であった。この戦略は、「初回・追加免疫」と呼ばれる。

以下は、異種初回・追加免疫法の例である。ＤＮＡ初回免疫を含む該療法としては、ＤＮＡ初回免疫；ウイルス抗原に対するＤＮＡ初回免疫／細菌追加免疫（リステリア）（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（Ｂｏｙｅｒ，ら（２００５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３３：８８−１０１）；細菌抗原に対するＤＮＡ初回免疫／細菌ベクター（バチルス）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）追加免疫（Ｆｅｒｒａｚ，ら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７２：６９４５−６９５０）；腫瘍抗原に対するＤＮＡ初回免疫／ウイルスベクター追加免疫（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，ら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １１：８１１４−８１２１；Ｓｍｉｔｈ，ら（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１３：２５９−２６６）；ウイルス抗原に対するＤＮＡ初回免疫／ウイルス追加免疫（Ｔｏｕｓｓａｉｎｔら，（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：５０７３−５０８１；Ｃｅｂｅｒｅ，ら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４１７−４２５；Ｃｏｕｐａｒ，ら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：１３７８−１３８８）；ウイルス抗原に対するＤＮＡ初回免疫／タンパク質追加免疫（Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ，ら （２００６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４６：１５１−１６８；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：２３２４−２３３２）；寄生体抗原に対するＤＮＡ初回免疫／ウイルス追加免疫（寄生虫の抗原に対する）（Ｇｉｌｂｅｒｔ，ら（２００６） Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：４５５４−４５６１；Ｗｅｂｓｔｅｒ，ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：４８３６−４８４１）；腫瘍抗原に対するＤＮＡ初回免疫／補助タンパク質追加免疫（腫瘍抗原（Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ（２００５）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．７：３−１７）；ウイルス抗原に対するＤＮＡ初回免疫／ウイルス追加免プラスタンパク質追加免疫（Ｓｔａｍｂａｓ，ら（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：２４５４−２４６４）；およびウイルス抗原に対するＤＮＡ初回免疫（ナノ粒子）／タンパク質追加免疫（Ｃａｓｔａｌｄｅｌｌｏ，ら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：５６５５−５６６９）が挙げられる。

以下の異種初回・追加免疫法は、ＤＮＡを含んでいない初回組成物を使用する；細菌抗原に対する樹状細胞（ＤＣ）初回免疫／細菌（リステリア）追加免疫、およびＤＣ初回免疫／ウイルス追加免疫（Ｂａｄｏｖｉｎａｃ，ら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７４８−７５６）；細菌抗原に対する細菌ベクター（サルモネラ菌）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）初回免疫／タンパク質追加免疫（Ｖｉｎｄｕｒａｍｐｕｌｌｅ，ら（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３７４４−３７５０；Ｌａｓａｒｏ，ら（２００５）Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：２４３０−２４３８）；ウイルス抗原に対する補助タンパク質初回免疫／ＤＮＡ追加免疫（Ｓｕｇａｕｃｈｉ，ら（２００６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９３：５６３−５７２；Ｐａｌ，ら（２００６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４８：３４１−３５３）；ウイルス抗原に対するタンパク質初回免疫／細菌ベクター（サルモネラ菌）追加免疫（Ｌｉｕ，ら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ２４：５８５２−５８６１）；ウイルス抗原に対するタンパク質初回免疫／ウイルスベクター追加免疫（Ｐｅａｃｏｃｋ，ら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１３１６３−１３１７２）；ウイルス抗原または腫瘍抗原に対する、異なるウイルスベクターを用いる異種ウイルス初回免疫／ウイルス追加免疫（ウイルス抗原または腫瘍抗原に対する）（Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ，ら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：５８８１−５８９５；Ｋａｕｆｍａｎ，ら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２１２２−２１３２；Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈ，ら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４４９７−４５０５）；細菌抗原に対する異種初回免疫／リピドベシクルを用いる追加免疫（Ｌｕｉｊｋｘ，ら（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：１５６９−１５７７）。

免疫系を調節するのに有用である試薬は、リステリアであり、具体的にはリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。リステリア・モノサイトゲネスは、肝臓と脾臓、および小腸などの他の組織に対してある程度の自然指向性を有する（例えば、Ｄｕｓｓｕｒｇｅｔ，ら（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：５８７−６１０；Ｇｏｕｉｎ，ら（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：３５−４５；Ｃｏｓｓａｒｔ（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：４０１−４０９；ａｚｑｕｅｚ−Ｂｏｌａｎｄ， ら（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４：５８４−６４０；Ｓｃｈｌｕｔｅｒ，ら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．２０１：１８８−１９５を参照されたい）。細菌が腸内に留まる場合、血流への移動はＡｃｔＡおよびインターナリンＡなどのリステリアタンパク質によって媒介される（例えば、Ｍａｎｏｈａｒ，ら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：３５４２−３５４９；Ｌｅｃｕｉｔ，ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：６１５２−６１５７；Ｌｅｃｕｉｔ ａｎｄ Ｃｏｓｓａｒｔ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８：５３７−５４２を参照されたい）。一旦、細菌が宿主細胞に入ると、リステリア・モノサイトゲネスのライフサイクルはファゴリソソームからサイトゾルへの脱出を含む。このライフサイクルは、ファゴリソソームの内部に残存するマイコバクテリアのそれと対照をなす（例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓ，ら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７０：５８００−５８０７；Ｓｃｈｌｕｔｅｒ，ら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６６：５９３０−５９３８；Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，ら（２００４）Ｃｅｌｌ １１９：７５３−７６６を参照されたい）。ファゴリソソームからのリステリア・モノサイトゲネスの脱出は、リステリオリジン（ＬＬＯ）、ＰＩ−ＰＬＣおよびＰＣ−ＰＬＣなどのリステリアタンパク質によって媒介される（Ｐｏｒｔｎｏｙ，ら（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５８：４０９−４１４を参照されたい）。

免疫療法が一次治療として用いられる上述の免疫療法アプローチと対照的に、補助療法とは、一次療法が原発腫瘍を除去または破壊することを目的とする手術または放射線照射などの一次療法の前に（「術前補助」）または該療法に続く（「補助」）二次治療の使用を呼ぶ。例として、補助療法は、検出可能な疾患が除去されたが、潜在性疾患のために再発の統計的なリスクが残っている場合、手術後に行われ得る。補助全身療法および放射線療法は、大腸癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌および一部の婦人科癌を含む多くの種類の癌の手術の後で、行われることが多い。

本発明は、癌の二次治療のためにリステリア属細菌を用いる補助療法戦略を提供する。1種類または複数種の一次治療を投与する前または後に、癌関連抗原を発現するリステリアワクチの有効量を被験者に投与する。本発明は、好適な容器にパッケージされたリステリアベースのワクチンを含有するキットを含み、かつ使用説明書を含むこともある。

第1の態様では、本発明は、癌を患う哺乳類の補助薬物治療のための方法に関し、癌抗原を発現する癌細胞を除去するまたは死滅させるために、該哺乳類に投与される一次療法の前または後に、補助薬物療法として投与が与えられる場合、該方法は、癌抗原の発現できる、免疫学的に活性な部分をコードする、弱毒化された代謝的に活性のリステリアを含む有効量の組成物を該哺乳類に投与することを含む。

上で述べたように、本発明の組成物は、術前補助療法として提供されてもよいが、しかし好ましい実施形態では、本発明の組成物は、一次療法の後に投与される。種々の実施形態では、一次療法は、哺乳類から癌細胞を除去するための手術と、哺乳類において癌細胞を死滅させるための放射線照射と、または手術と放射線照射の両療法とを含む。

リステリアは病原生物であり得るので、特に、免疫力がない場合、該投与ステップは、癌抗原の発現できる、免疫学的に活性な部分をコードする、弱毒化された代謝的に活性のリステリアを複数回投与で投与することを含むことが好ましい。「弱毒化」とは、細菌がその病原性を減少させる、または除去するが、関心の疾患に対する予防または治療として作用するその能力を保持するように修飾されるプロセスをいう。細菌弱毒化は、異なる機序によって達成されることができる。一例は、１つまたは複数の代謝経路に変異を一つ以上の代謝経路に導入することであり、その機能は細菌が疾患を引き起こすために生存して、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖するために不可欠である。リステリアの場合、特定の実施形態では、細菌は変異導入され、増殖して細胞内に拡散する能力を減少させる、または阻止される。好ましいリステリアは、ＡｃｔＡを不活性化する変異；ＩｎｌＢを不活性化する変異；または両変異を含むことができる。最も好ましくは、その未変性のＡｃｔＡ遺伝子とｉｎｌＢ陰電子の両方（ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢ）を欠失した、弱毒化された代謝的に活性なリステリアが本発明で用いられる。特定の実施形態では、該方法は、死滅したが、代謝的に活性である（「ＫＢＭＡ」）リステリアを用いる。

種々の癌抗原のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸が、組み換え発現のために本発明の組成物によって提供される。特定の実施形態では、癌抗原は、メソテリンのすべてまたは一部である。他の好適な抗原は、以下に詳述するが、治療される癌の種類と、その癌によって発現される抗原とに依存することがある。種々の実施形態では、治療される癌は、膵臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および中皮腫からなる群から選択される。このリストは、限定することを意味するものではない。

記述したように手術または放射線照射が好ましい一次療法に加えて、本発明の組成物は、初回・追加免疫法の一部として送達されてもよい。例えば、本発明のリステリア組成物の投与の前に、哺乳類は、関心の癌抗原を発現するヒト株細胞由来の細胞を前もって投与されてもよく、前述の細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を産生して分泌するように組み換え修飾されており、かつ前述の細胞は、細胞***を防ぐために放射線照射によって修飾されている（すなわち、ＧＶＡＸ（登録商標）ワクチン、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．）。

本発明は、構造の詳細および以下の説明に記載するまたは図面に示すコンポーネントの再配列へのその応用において限定されないことを理解すべきである。本発明は、記載された実施形態に加えて、種々の方法で実践され、実施される実施形態の能力がある。また、本明細書ならびに要約で用いられている表現および専門用語は、説明を目的としており、限定すると見なされるべきではないことを理解すべきである。

このように、本開示が基づいている概念が、本発明のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法およびシステムを設計の基本として容易に利用され得ることを当業者は認識するであろう。したがって、それらが本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、請求項がそのような同等の構築体を含むと見なすことが重要である。

リステリ・モノサイトゲネスと、抗原を発現するワクシニアウイルスとを用いた初回・追加免疫法の結果生じた標的抗原（ＯＶＡ）に対するＯＶＡ特異的細胞免疫応答を示すグラフである。ＩＣＳアッセイにおいて、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１））を用いてワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスでＯＶＡ特異的応答が示された。 リステリア・モノサイトゲネスと、標的抗原（ヒトメソテリン）を発現するアデノウイルスとを用いた初回・追加免疫レジメンの結果、生じたヒトメソテリン特異的細胞免疫応答を示すグラフである。 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてリステリア・モノサイトゲネス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスを用いた初回・追加免疫レジメンの結果、生じたヒトメソテリン特異的細胞免疫応答を示すグラフである。また、初回・追加免疫レジメンを図示する。 Ｃ５７ＢＬ／６（ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック）マウスにおいて初回免疫のアデノウイルスのレベルを増加し、追加免疫のリステリア・モノサイトゲネスのレベルを一定にして用いた、初回・追加免疫レジメンの結果、生じたヒトメソテリン特異的細胞免疫応答を示すグラフである。（脾細胞をプールしたメソテリンペプチドで刺激した。） Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて初回免疫のアデノウイルスのレベルを増加し、追加免疫のリステリア・モノサイトゲネスのレベルを一定にして用いた、初回・追加免疫法の結果、生じたヒトメソテリン特異的細胞免疫応答を示すグラフである。（脾細胞をプールしたメソテリンペプチドで刺激した。）、また、初回・追加免疫レジメンを図示する。 アデノウイルスに対して既存の免疫を有するマウスにおいてアデノウイルスの初回免疫の結果生じたヒトメソテリン特異的細胞免疫応答を左のグラフで示す。また、図４Ａ（右のグラフ）は、クラスＩ Ｈｅｘ３エピトープ（アデノウイルス特異的エピトープ）を用いて測定したアデノウイルス特異的応答を示す。また、初回・追加免疫レジメンを図示する。 アデノウイルスに対して既存の免疫を有するマウスにおいてアデノウイルスの初回免疫の結果、生じたヒトメソテリン特異的細胞免疫応答と、アデノウイルス特異的抗体を中和する力価とを示すグラフである。また、初回・追加免疫レジメンを図示する。 ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ） ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）またはＡＨＩをコードするリステリア・モノサイトゲネスのいずれかを初回免疫で、ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ） ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）またはＡＨ1をコードするリステリア・モノサイトゲネスのいずれかを追加免疫で用いた結果、生じたＡＨ1特異的細胞免疫応答を示すグラフである。 メソテリンペプチド１３１〜１３９で刺激した樹状細胞またはヒトメソテリンをコードするアデノウイルスによる初回免疫と、ヒトメソテリンをコードするリステリア・モノサイトゲネスによる追加免疫との結果、生じたメソテリンのパーセント、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞間の特異的応答を示すグラフである。初回免疫は、試験当日に行い、追加免疫は８日目に行った。脾細胞を１３日目に採取した。 メソテリンペプチド１３１〜１３９で刺激した樹状細胞またはヒトメソテリンをコードするアデノウイルスによる初回免疫と、ヒトメソテリンをコードするリステリア・モノサイトゲネスによる追加免疫との結果生じた、１脾臓あたりのメソテリン１３１−１３９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示すグラフである。初回免疫は、試験当日に行い、追加免疫は８日目に行った。脾細胞を１３日目に採取した。 メソテリンペプチド１３１〜１３９で刺激した樹状細胞による初回免疫と、ヒトメソテリンをコードする、リステリア・モノサイトゲネス、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスの病原体のうちの１つによる追加免疫との結果生じた、ＣＤ８＋Ｔ細胞間のメソテリン特異的応答のパーセントを示すグラフである。 マウスメソテリンペプチドライブラリーの各ペプチドに対する免疫応答を評価した脾細胞におけるマウスメソテリン特異的免疫応答を示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、マウスメソテリンをコードするネイキッドＤＮＡベクターによる初回免疫を、次いでマウスメソテリンをコードするリステリア・モノサイトゲネスによる追加免疫を投与した。 マウスメソテリンペプチドライブラリーの各ペプチドに対する免疫応答を評価した脾細胞におけるマウスメソテリン特異的免疫応答を示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、マウスメソテリンをコードするアデノウイルスによる初回免疫を、次いでマウスメソテリンをコードするリステリア・モノサイトゲネスによる追加免疫を投与した。また、初回・追加免疫レジメンを図示する。 マウスから採取した脾細胞（その研究結果を図７Ｂに示す）をメソテリンペプチド番号２７８（配列番号２）、２７９（配列番号３）または２８０（配列番号４）に曝露したエリスポットアッセイの結果を示す、ウェルの写真をハーフトーンで再生したものである。 初回免疫としてＯＶＡをコードするＫＢＭＡリステリア・モノサイトゲネスを用い、追加免疫としてリステリア・モノサイトゲネス、ワクシニアウイルスまたは「生」リステリア・モノサイトゲネスを用いた初回・追加免疫レジメンの結果として生じたＯＶＡ特異的細胞免疫応答を示すグラフである。すべての「追加免疫」ベクターは、ＯＶＡをコードした。 ワクチン接種したマウスにおけるＡＨ特異的Ｔ細胞およびＡＨ１／Ａ５特異的Ｔ細胞の応答を示す。 ワクチン接種したマウスにおけるメソテリン特異的Ｔ細胞の応答を示す。 ＣＴ２６腫瘍を投与された後の、ワクチン接種したマウスの関する生存データを示す。

発明は、物質と、リステリア抗原でない標的抗原に対する免疫応答を誘発する方法とに関する。標的抗原は、好ましくは、疾患に関連するものであり、したがって該標的抗原に対する免疫応答が治療効果をもたらすことになる。本発明は、癌の補助薬物療法のためのワクチンのセットを提供する。リステリア・モノサイトゲネスをベースにした該ワクチンは、それが投与される宿主において発現する標的抗原の免疫学的に活性な部分をコードする代謝的に活性なリステリア・モノサイトゲネスである。

本発明は、一部分において、いくつかの一次癌治療がメソテリンなどの癌関連の抗原をコードする弱毒化された生リステリア・モノサイトゲネスを含んだワクチンの補助的使用で増強され得るという所見に基づく。

本発明の実践は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、免疫学、細胞生物学、生化学および薬務での従来の技術を使用する。そのような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｒｏｗｅら，編）；Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ， ２００３）；およびＶａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｒｏｂｉｎｓｉｎ， Ｃｒａｎａｇｅ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， ２００３）などの文献に十分に説明されている。

定義
遺伝子における変異、または遺伝子を含む細菌における変異を示すのに用いられる省略形は、以下の通りである。例として、省略形「リステリアΔａｃｔＡ」とは、ａｃｔＡ遺伝子の一部または全体が欠失したことを意味する。デルタ記号（Δ）は、欠失を意味する。上付きのマイナス符号（リステリアａｃｔＡ−）を含む省略形は、ａｃｔＡ遺伝子が、例えば、欠失、点変異またはフレームシフト変異として変異したことを意味するが、これらの変異の種類に限定されるものではない。指数関数は、省略されることもあり、例えば、「３ｅ７」は３×１０^７を意味する。

添付の特許請求の範囲を含めて、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの語は、文脈で明記しない限り、それらの対応する複数形の参照を含む。本明細書に引用したすべての参照は、個々の刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ
受入番号によって利用できる配列、特許出願、特許、配列表、配列表中のヌクレオチド配列またはオリゴペプチドもしくはポリペプチド配列、ならびに前述の刊行物および特許文献中の図および図面が、参照によって具体的に、かつ個別に組み込まれることがあたかもの示されているかのように同じ程度に、それら全体を参照により組み込まれる。

「投与」とは、ヒト、哺乳類、哺乳類被験者、動物、獣医学的被験者、プラセボ被験者、研究被験者、実験被験者、細胞、組織、器官または生体液に適用する場合、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬または組成物を被験者、細胞、組織、臓器または生体液などに接触させることをいう、がこれらに限定されない。「投与」は、例えば、治療方法、予防方法、薬物動態的方法、研究方法、プラセボ方法、および実験的方法を指すことがあり得る。細胞への「投与」は、細胞への試薬の接触、ならびに体液が細胞と接触している場合、該体液への試薬の接触を包含する。また、「投与」は、試薬、結合組成物による、または別の細胞による、例えば、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの方法を包含する。投与の結果は、プラセボ投与または無投与と比較すると、例えば、生存期間の増加（例えば、生命にかかわる増殖障害に対して）、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の数の減少、特定の組織からの転移の減少、特定の組織への転移の減少、感染体などの力価の減少によって評価されることができる。「治療」は、予想される有効性がある投与を含む。「治療」は、防止的（予防的）および治療的な投与を含む。

「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、抗原をＴ細胞に提示するために使用される免疫系の細胞である。ＡＰＣとしては、樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｉｎｔｏ ａｎｄ Ｍｏｒｅｎｏ（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０９７−１１０５を参照されたい）。樹状細胞は、少なくとも２つの系統で生じる。第１の系統は、プレＤＣ１、骨髄ＤＣ１および成熟ＤＣ１を包含する。第２の系統は、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ−初期前駆多能性細胞、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋＋ＣＤ４＋ ＩＬ−３α++プロＤＣ２細胞、ＣＤ４＋ＣＤ１Ｉｃ 形質細胞様プレＤＣ２、リンパ様ヒトＤＣ２、形質細胞様由来ＤＣ２および成熟ＤＣ２を包含する（例えば、Ｇｉｌｌｉｅｔ ａｎｄ Ｌｉｕ（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：６９５−７０４；Ｂａｕｅｒ，ら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５０００−５００７；Ａｒｐｉｎａｔｉ，ら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：２４８４−２４９０；Ｋａｄｏｗａｋｉ，ら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９；Ｌｉｕ（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６３ １０６７−１０７１；ＭｃＫｅｎｎａ，ら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１７−２７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，ら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４：２２３５−２２４６ Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｙｏｕｎ（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１３７３−１３８１ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ａｎｄ Ｐａｌｕｃｋａ（２００５ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６を参照されたい）。

「弱毒」および「弱毒化された」とは、宿主に対する毒性を低減するように修飾された細菌、ウイルス、寄生虫、感染性微生物、腫瘍細胞、感染性微生物中の遺伝子などを包含する。宿主は、ヒトもしくは動物宿主、または臓器、組織、もしくは細胞であり得る。非限定例を挙げると、細菌を弱毒化して、宿主細胞に対する結合を減少させる、一宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を減少させる、細胞外増殖を減少させる、または宿主細胞において細胞内増殖を減少させることができる。弱毒化は、例えば、毒性、５０％致死量、臓器からのクリアランスの速度、または競合指標を測定することによって評価することができる（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ，ら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６９：５９５３−５９５７を参照されたい）。一般的には、弱毒化は、５０％致死量の少なくとも２５％の増加；より一般的には少なくとも５０％；最も一般的には少なくとも１００％（２倍）；通常は、少なくとも５倍；より通常は、少なくとも１０倍；最も通常は、少なくとも５０倍；しばしば少なくとも１００倍；より頻繁には、少なくとも５００倍；および最も頻繁には、少なくとも１０００倍；通常、少なくとも５０００倍；より通常は、少なくとも１０，０００倍；および最も通常は、少なくとも5０，０００倍：および最も頻繁には、少なくとも１００，０００倍の増加をもたらす。

「弱毒化された遺伝子」とは、宿主、宿主内での増殖、または宿主内での生存に対して、毒性、病状、または病原性を媒介する遺伝子を包含し、遺伝子は毒性、病状または病原性を軽減する、減少させる、または排除する方法で変異される。「変異型遺伝子」とは、遺伝子の調節領域、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域またはその任意の組み合わせにおける欠失、点変異、挿入変異およびフレームシフト変異を包含する。

「癌状態」および「癌障害」とは、いずれの限定を意味することなく、癌、腫瘍、転移、腫瘍の血管新生、および異形成などの前癌性障害を包含する。癌、腫瘍、前癌性状態、前癌性障害または癌性障害などの哺乳類被験者とは、癌、前癌性障害または腫瘍を含む哺乳類被験者を包含するだけでなく、腫瘍が除去されている、癌が明らかに排除されている（例えば、化学療法もしくは手術によって、または被験者の免疫系だけによって）哺乳類被験者も包含する。

治療で用いる場合、「有効量」とは、医学的状態または障害の症状または兆候を寛解させる、逆転させる、軽減する、または予防することができる量を包含するが、これらに限定されるものではない。明白にまたはその逆に、特に明記されない限り、「有効量」とは、状態を寛解させるのに十分な必要最低限量に、または、状態の最適な寛解または最大の寛解をもたらす量に限定されない。初回免疫および／または追加免疫の投与の脈絡の中で、「有効量」は、哺乳類において免疫応答を引き起こす量である。

「細胞外液」とは、例えば、血清、血漿、血液、組織液、脳脊髄液、分泌液、リンパ液、胆汁、汗、***物および尿を包含する。「細胞外液」は、コロイドまたは懸濁液、例えば全血を含み得る。

リステリア菌の「増殖」とは、リステリアの分野の用語であり、リステリ菌の細胞内の増殖、すなわち哺乳類細胞などの宿主細胞内部の増殖を包含する。リステリア菌の細胞内増殖（「増殖」）は、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイで測定されることができるが、増殖は、いずれの測定技法によっても限定されることはない。リステリア抗原の量、リステリア核酸配列、またはリステリア菌に脂質特異的などの生化学的パラメータを用いて、増殖を評価することができる。増殖を媒介する遺伝子は、特に細胞内増殖を媒介する遺伝子である。特に細胞内増殖を媒介する遺伝子は、その遺伝子の不活性化が細胞内増殖の速度を低下させるが、細胞外増殖（例えばブロス内の増殖）の速度を検出可能な程度に低下させない遺伝子、またはその遺伝子の不活性化が細胞内増殖の速度を、それが細胞外増殖の速度を低下させるよりもより大きな程度まで低下させる遺伝子を包含するが、これらに限定するものではない。非限定例を示すと、細胞内増殖を媒介する遺伝子は、その欠失が細胞内増殖を５０％未満まで、４０％未満まで、３０％未満まで、２０％未満まで、または１０％未満まで下げる遺伝子であり、該細胞内増殖は野生型リステリアによって示される。さらに非限定例を示すと、細胞内増殖を媒介する遺伝子は、その欠失が、野生型リステリアの細胞内増殖の５０％未満まで下げるが、野生型リステリアで見られる、細胞外増殖を約９５％、９０％、８５％または８０％まで下げるだけである遺伝子を包含する。これと関連して、用語「約」とは、±５％を指す。

「死滅しているが代謝的に活性な」（ＫＢＭＡ）細菌とは、例えば、ゲノム修飾がコロニー形成を防止するのには十分であるが、ゲノム修飾が実質的には代謝を防止または損なうのに十分ではない修飾ゲノムを含むいずれの細菌を包含する。ＫＢＭＡ細菌は、例えば、寒天上、または宿主細胞内でｉｎ ｖｉｖｏで測定可能であるコロニーを形成することができない。非限定例を示すと、ゲノムは、ソラレンなどの架橋剤で修飾されることができる。非限定例を示すと、代謝で全く損なわれないＫＢＭＡ細菌は、調節的機能、コーディング機能、構造機能または生体機能を持たない遺伝子間領域のみにゲノムが架橋を含む細菌である。これは、コロニーを形成することができる「生」細菌と対照的であるが、しかし一部の実施形態では、生細菌は弱毒化されることがある。

「試料」とは、ヒト、動物、プラセボに由来する試料、または研究試料、例えば、細胞、組織、臓器、体液、気体、エアゾール、スラリー、コロイドまたは凝固した物質を指す。また、「試料」は、例えば、体液試料もしくは組織試料を含む細胞、または体液試料もしくは組織試料から分離される細胞を指す。また、「試料」は、ヒトもしくは動物から新鮮に採取される細胞、組織、臓器もしくは体液を指す、または処理もしくは保存された細胞、組織、臓器または体液を指す。

細菌の「拡散」とは、「細胞間拡散」、すなわち第１の宿主細胞から第２の宿主細胞に、ベシクルによって一部は媒介される細胞の伝染を含有する。拡散に関する機能としては、例えば、アクチンテールの形成、仮足様の伸長の形成、および二重膜液胞の形成が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

「初回免疫用量」または「初回免疫投与量」の「有効量」は、抗原投与の非存在下の哺乳類被験者における免疫応答と比較して、哺乳類被験者において測定可能な免疫応答を誘発する標的抗原の量を指す。

本明細書で用いる場合、「ワクチン」とは、該ワクチンが哺乳類に投与されると、異種タンパク質が免疫応答を誘発する目的で、哺乳類内で発現するように、異種タンパク質を含む組成物、または異種タンパク質をコードする核酸を含む組成物を指す。免疫応答は、体液性、細胞性、またはその両方であり得る。

本明細書で用いる場合、「初回免疫ワクチン」とは、関心の抗原に対して免疫応答を誘発するようにその有効量を被験者または宿主に投与される薬剤（１種または複数種）を含むワクチンを指す。初回免疫ワクチンは、抗原をコードしてもよく、かつＧＭ−ＣＳＦなどの、抗原提示細胞を動員して活性化するように作用する種々の免疫刺激サイトカインをコードしてもよい。

本明細書で用いる場合、「追加免疫ワクチン」とは、標的抗原の免疫学的に活性の部分を有する抗原をコードする薬剤を含むワクチンを指し、かつ標的抗原を含んでもよく、その断片でもよく、および／または通常、標的抗原に存在しない領域に連結される標的抗原の少なくとも免疫学的に活性の部分を含む融合ポリペプチドでもよい。「追加免疫用量」または「追加免疫投与量」の「有効量」とは、標的抗原の初回免疫用量を前もって投与されている哺乳類に投与されると該標的抗原に対して免疫応答を誘発する抗原の量を指す。

本明細書で用いる場合、「ベクターセット」または「ワクチンセット」とは、初回免疫ベクターまたは初回免疫ワクチンと、追加免疫ベクターまたは追加免疫ワクチンとを含み、各々は、共有免疫原性決定基、交差反応免疫原性決定基、共有抗原、免疫原性タンパク質もしくはペプチド、またはその断片のうちの少なくとも１つをコードする。

「抗原」とは、体液性抗原特異的応答および／または細胞性抗原特異的反応を生成するために、哺乳類の免疫系などの宿主の免疫系を刺激する、１つまたは複数のエピトープ（直鎖状、立体構造のいずれか、または両方）または免疫原性決定基を含む分子を指す。この用語は、用語「免疫原」と互換的に用いられる。抗原は、総タンパク質、切断型タンパク質、タンパク質の断片またはペプチドであり得る。抗原は、天然起源、遺伝子操作したタンパク質の変異体であってもよく、または特定の哺乳類の被験者もしくは宿主での発現に最適化されてコドンであってもよい。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５個のアミノ酸を含むが、３〜４ほどの小さいアミノ酸であり得る。ＣＴＬエピトープなどのＴ細胞エピトープは、少なくとも約７〜９のアミノ酸を含み、およびヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０のアミノ酸を含むであろう。通常、エピトープは、７と１５との間のアミノ酸、例えば、９、１０、１２または１５のアミノ酸を含む。用語「抗原」とは、両サブユニットの抗原を意味する（すなわち、抗原が本来関連するある生物全体から離れて、分散している抗原）。抗イディオタイプ抗体などの抗体、またはその断片、および合成ペプチドミモトープ（すなわち、抗原もしくは抗原決定基を模倣することができる合成ペプチド）も、本明細書で用いる場合、抗原の定義下に入る。本発明の目的として、抗原は、いくつかの既知の病原性ウイルス、細菌、寄生体および菌類のいずれかに由来することができる。抗原は、癌に由来することもあり得る。さらに、本発明の目的として、「抗原」とは、本明細書に定義するように、タンパク質が免疫応答を誘発する応力を維持する限り、通常、天然起源の配列に対して本来は保存的である、欠失、添加および置換などの修飾を含むタンパク質を指す。部位特異的変異誘発を介する場合、これらの修飾は、計画的であり得、または例えば、抗原を生成する宿主の変異を介してなどと偶発的であり得る。本発明の抗原は、宿主において抗原の発現または免疫原性を改善するために、当技術分野で既知の方法によって最適化されたコドンであってもよい。本明細書で用いる場合、「交差反応」抗原決定基とは、関連するが、同一ではない抗原決定基に対して免疫応答を誘発することができる、決定基、エピトープまたは抗原を指し、例えば、ＨＩＶに対する交差反応決定基は、クレードにわたるＨＩＶ抗原の２メンバーもしくは複数メンバーもしくはすべてのメンバーに対して免疫応答を誘発することができる抗原であろう、

抗原、またはベクターもしくはワクチンもしくは該抗原を含む組成物に対する「免疫学的応答」または「免疫応答」とは、哺乳類被験者において、１つの抗原またはベクターセット中に存在する複数の抗原に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の発現である。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または、これらに限定されないが、ナチュラルキラー細胞とマクロファージを含む他の白血球によって媒介される免疫応答である。本発明のＴリンパ球は、Ｔ細胞を発現するαβ−Ｔ細胞受容体サブユニットまたはγδ−Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞を含み、かつエフェクターＴ細胞またはサプレッサーＴ細胞のいずれかであり得る。「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、免疫系の細胞媒介アームの一部を構成する非抗体産生リンパ球である。Ｔ細胞は骨髄から胸腺に移動する未成熟のリンパ球から生じ、胸腺でＴ細胞は、胸腺ホルモンの働きの下で成熟過程を経る。成熟Ｔ細胞は、特異的抗原を認識して結合するそれらの能力に基づいて、免疫適格になる。免疫適格Ｔ細胞の活性化は、抗原がリンパ球表面受容体と結合すると、引き起こされる。T細胞応答を生成するために、抗原は細胞内で合成される、または細胞に導入され、その後プロテアソーム複合体によって低分子ペプチドにプロセシングされ、次いで主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質との最終的な結合のために、小胞体／ゴルジ複合体分泌経路に移動しなくてはならないことが知られている。機能的に、細胞性免疫は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む。本明細書で用いる場合、抗原特異的Ｔ細胞、ＣＴＬ、または細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって、またはタンパク質がヒトにおいて参照される場合はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）によってコードされるタンパク質に結合して提示されるペプチド抗原に対する特異性を有する細胞を指す。本発明のＣＴＬは、ＭＨＣと関連して特異的抗原によって引き起こされた活性化ＣＴＬ；および抗原への再曝露の結果、再活性化されたＴ細胞を参照するメモリーＣＴＬまたはリコールＣＴＬならびに交差反応ＣＴＬを含む。本発明のＣＴＬは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。本発明の活性化した抗原特異的ＣＴＬは、病原体に感染した被験者の細胞またはとりわけＣＴＬが特異的である癌細胞の破壊および／または溶解、これらに限定されないがマクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ−１ａ）、ＭＩＰ−１ＢおよびＲＡＮＴＥＳを含むケモカインとサイトカインの分泌；および疾患状態を抑制する可溶性因子の分泌を促進する。また、本発明の細胞性免疫は、Ｔ細胞のTヘルパーサブセットによってもたらされる抗原特異的応答を指す。ヘルパーＴ細胞は、その表面でＭＨＣ分子と結合するペプチドを表示する細胞に対して非特異的エフェクター細胞の機能を刺激するのに役立ち、かつ該エフェクター細胞の活性に集中するように作用する。また、細胞性免疫応答は、サイトカイン、ケモカインの産生ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞とＮＫ細胞とに由来するものを含む他の白血球によって産生される他の分子の産生を指す。細胞性免疫応答を誘発する初回免疫用量もしくは追加免疫用量、または初回免疫用量もしくは追加免疫用量を含む組成物もしくはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と結合する抗原を提示することによって哺乳類被験者を感作するのに役立ち得る。細胞性免疫応答は、細胞表面で抗原を提示する細胞で、またはその近に向けられる。加えて、抗原特異的Ｔリンパ球が生成され、免疫された宿主の今後の防御を可能にすることができる。細胞性免疫応答を刺激する特定の抗体の能力は、当技術分野で既知のいくつかのアッセイ、たとえば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作された被験者においてＴリンパ球特異的抗原をアッセイすることによって決定され得る。そのようなアッセイは、周知の技術である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅ，らＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照されたい。細胞性免疫応答を測定する方法は、細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌のＴ細胞集団による測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術によって）を含む（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．， ａｎｄ Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７−１３７１，１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７に概説されている）。本明細書で用いる場合、免疫学的応答または免疫応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞および／もしくは抗体媒介免疫応答の生成もしくは活性化を刺激する応答を包含する。

本明細書で用いる場合、「免疫学的応答」または「免疫応答」は、以下の効果の少なくとも１つまたは複数を包含する：Ｂ細胞による抗体の産生；および／またはサプレッサーＴ細胞および／または関心のベクター、組成物もしくはワクチンに存在する抗体に特に向けられるＴ細胞の活性化。一部の実施形態では、「免疫学的応答」または「免疫応答」は、サプレッサーＴ細胞の不活性化を含む。本明細書で用いる場合、「増強された追加免疫応答」とは、初回免疫用量の単回投与によって誘発される応答と比較して、より大きな測定可能な免疫応答を誘発するワクチンによる追加免疫用量の投与を指す。

「医薬的に許容される」または「薬理学的に許容される」によって、生物学的にまたは他の点では望ましくないものではない物質を意味する。

本明細書で用いる場合、用語「キット」とは、互いに、しかし必ずしも同時ではなく、使用されるようにパッケージされ、および／またはマークを付けられた構成成分を指す。キットは、別々の容器に初回免疫ワクチンおよび追加免疫ワクチンを含んでもよい。キットは、別々の容器に初回免疫ワクチンおよび／または追加免疫ワクチンの構成成分を含むこともある。キットは、哺乳類への投与に好適な免疫原性組成物を処方するために、構成成分を混合するための説明書を含むこともある。

「治療効果」とは、ワクチン（１種または複数種）が投与される疾患に付随する１つまたは複数の症状を緩和することである。「予防効果」とは、ワクチン（１種または複数種）が投与される疾患に付随する１つまたは複数の症状を抑制することである。

本明細書で用いる場合、「哺乳類被験者」または「宿主」とは、脊椎動物亜門のいずれのメンバーを意味し、これらに限定されないが、チンパンジーおよび他の類人猿などの非ヒト霊長類と、サル種とを含むヒトおよび他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家庭内哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物が挙げられる。この用語は、特定の年齢を意味しない。このように、成人個人および新生児個人の両方を包含することを意図する。

本明細書で用いる場合、「放射線治療」または「放射線療法」は、悪性細胞を制御するために、癌治療の一部として電離放射線の医学的用途を指す。放射線療法は、根本的治療、補助薬物療法または緩和療法で用いられ得る。適切な種類の放射線療法としては、従来の外部照射放射線療法、定位放射線治療（例えば、Ａｘｅｓｓｅ、サイバーナイフ、ガンマナイフ、Ｎｏｖａｌｉｓ、Ｐｒｉｍａｔｏｍ、シナジー、Ｘ−ナイフ、ＴｏｍｏＴｈｅｒａｐｙまたはＴｒｉｌｏｇｙ）強度変調放射線療法、粒子線治療（例えば陽子線治療）、密封小線源療法、ラジオアイソトープ送達などが挙げられる。このリストは限定することを意図としない。

標的抗原に対する免疫応答を誘発する方法

本発明は、哺乳類において免疫応答を誘発する方法を包含する。標的抗原は、疾患状態と関連した抗原、例えば癌細胞または病原体上に存在することが特定された抗原であり得る。一次癌治療の後に、標的抗原の免疫学的に活性な部分をコードし、かつ発現させる代謝的に活性な弱毒化リステリアを含むワクチンが投与される。

1. 標的抗原
本発明の治療レジメンで用いられ得る標的抗原の例は、以下の表に記載する。標的抗原は、表に記載した抗原の免疫学的に活性な部分を含む融合ポリペプチドの断片であってもよい。

２．初回・追加免疫アプローチで用いた薬剤
初回・追加免疫アプローチでは、補助療法は哺乳類に初回免疫ワクチンの有効量を投与することを含んでもよい。初回ワクチンは、好ましくは、標的抗原をコードする代謝的に活性ななリステリアを含まない。そのようなワクチンは、標的抗原それ自体、例えば、アジュバントを含むもしくは含まないタンパク質、腫瘍細胞溶解物、照射腫瘍細胞、標的抗原のペプチドで刺激した抗原提示細胞（例えば樹状細胞）のいずれかを含んでもよく、またはワクチンは標的抗原をもたらす薬剤を含んでもよい。標的抗原をもたらす好適な薬剤は、組み換えベクター、例えば細菌、ウイルスおよびネイキッドＤＮＡを含む。組み換えベクターは、当技術分野で既知の標準技術を用いて調製され、かつ標的抗原をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結した好適な調節領域を含む。例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ，ら（編）（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第４版，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ．；Ｓｉｋｏｒａ，ら（編）（１９９６）Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；Ｈａｃｋｅｔｔ ａｎｄ Ｈａｒｎ（編）Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｉｓａａｃｓｏｎ（編）（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，ＮＹ；Ｍｏｒｓｅ，ら（編）（２００４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），Ｌｉａｏ，ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５：９０８９−９０９８；Ｄｅａｎ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２：２２７−２３６；Ａｒｌｅｎ，ら（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：４８３−４９３；Ｄｅｌａ Ｃｒｕｚ，ら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：１３１７−１３２６；Ｊｏｈａｎｓｅｎ，ら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０：４１３−４１７；Ｅｘｃｌｅｒ（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１４３９−１４４３；Ｄｉｓｉｓ，ら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１５１−３１５８）を参照されたい。ペプチドワクチンは記述されている（例えば、ＭｃＣａｂｅ，ら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１７４１−１７４７；Ｍｉｎｅｖ，ら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：４１５５−４１６１；Ｓｎｙｄｅｒ，ら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：７０５２−７０６０を参照されたい。

ウイルス由来ベクターとしては、ウイルス、修飾ウイルスおよびウイルス粒子が挙げられる（例えば、表２を参照されたい）。ウイルス由来ベクターは、哺乳類被験者に直接投与されることができ、またはｅｘ ｖｉｖｏで抗原提示細胞（ＡＰＣ）に導入されることができ、次いでＡＰＣは哺乳類被験者に投与される。

ウイルスベクターは、例えば、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含むトガウイルス；アルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス、シンドビス株ＳＡＡＲ８６、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、西部ウマ脳炎ウイルス、ロスリバーウイルス、Ｓａｇｉｙａｍｉウイルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇウイルス、ハイランドＪウイルスなどに基づき得る。フラビウイルス、例えば黄熱病ウイルス、黄熱病株１７Ｄ、日本脳炎、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳炎、デングウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス（西ナイルウイルスの亜型）など；アルテリウイルス、例えば、ウマ動脈炎ウイルスなど；およびルビウイルス、例えば、風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、修飾ワクチニアアンカラ（ＭＶＡ）など；トリポックスウイルスベクター；鶏痘ベクター；ワクシニアウイルスベクター；インフルエンザウイルスベクター；アデノウイルスベクター；ヒトパピローマウイルスベクター；ウシパピローマウイルスベクターなど。ウイルスベクターは、オルソポックスウイルス、例えば、痘瘡ウイルス（天然痘）、ワクシニアウイルス（天然痘に対するワクチン）、アンカラ（ＭＶＡ）またはコペンハーゲン株、ラクダ痘、サル痘または牛痘などに基づき得る。ウイルスベクターは、鶏痘ウイルスまたはカナリアポックスウイルスなどのトリポックスウイルスのウイルスに基づき得る。

アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が利用可能であり、アデノウイルスベクターとしては、アデノウイルスセロタイプ５（アデノ５；Ａｄ５）、アデノ６、アデノ１１およびアデノ３５が挙げられる。６つの亜群（亜群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ）に分類される、少なくとも５１のヒトアデノウイルスセロタイプが利用可能である。例えば、「空」アデノウイルスベクターに対する免疫応答の評価に有用なアデノウイルスタンパク質としては、ヘキソン３タンパク質、線維タンパク質およびペントンベースタンパク質などのヘキソンタンパク質が挙げられ、およびアデノウイルスタンパク質に対するヒト免疫応答が記載されている（例えば、Ｗｕら，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１２７７５−１２７８２；Ｍａｓｃｏｌａ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ
４４１：１６１−１６２；Ｒｏｂｅｒｔｓら，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：２３９−２４３を参照されたい）。

抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベクター、例えば樹状細胞（ＤＣ）は、抗原を負荷された、腫瘍溶解物を負荷された、または核酸を含む組成物を形質移入された細胞を含み、核酸は例えば、」プラスミド、ｍＲＮＡまたはウイルスであり得る。ＤＣ／腫瘍融合ワクチンも、使用され得る。例えば、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ，ら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５３８１−５３９０；Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：７−１０；Ｐａｒｍｉａｎｉ，ら（２００２）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９４：８０５−８１８；Ｋａｏ，ら（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０１：１５４−１５９；Ｇｅｉｇｅｒ，ら（２００５）Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：２９；Ｏｓａｄａ，ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｎｏｖ．５，１−１０［ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；Ｍａｌｏｗａｎｙ，ら（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：７６６−７７５；Ｍｏｒｓｅ ａｎｄ Ｌｙｅｒｌｙ（２００２）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｕｒｇ．２６：８１９−８２５；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：４５４−４５８；Ｍｏｒｓｅ，ら（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ３ Ｓｕｐｐｌ．４：Ｓ１６４−Ｓ１７２；Ｍｏｒｓｅ，ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ＣｈｅｍｏｔｈｅｒＢｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆ．２０：３８５−３９０；Ａｒｌｅｎ，ら（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：４８３−４９３；Ｍｏｒｓｅ ａｎｄ Ｌｙｅｒｌｙ（１９９８） ｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ７：１６１７−１６２７；Ｈｉｒｓｃｈｏｗｉｔｚ，ら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２８０８−２８１５；Ｖａｓｉｒ，ら（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２９：６８７−７００；Ｋｏｉｄｏ，ら（２００５）Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９９：４６２−４７１を参照されたい。

腫瘍細胞、例えば、自己腫瘍細胞および同種腫瘍細胞は、ワクチンとして利用可能である（Ａｒｌｅｎ，ら（２００５）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２：５４９−５５５）。ワクチンは、修飾腫瘍細胞、例えば、腫瘍細胞溶解物または照射された腫瘍細胞も含み得る。また、腫瘍細胞は、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、など）、ＮＫＧ２Ｄ配位子、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、などの分子をコードする核酸を組み込むことによって修飾され得る（例えば、Ｄｒａｎｏｆｆ （２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８８：１４７−１５４；Ｊａｉｎ，ら（２００３）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０：８１０−８２０；Ｂｏｒｒｅｌｌｏ ａｎｄ Ｐａｒｄｏｌｌ（２００２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３ １８５−１９３ Ｃｈｅｎ，ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２７：１−１１；Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ，ら（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１０３：１５６−１６４；Ｔａｉ，ら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．１１：２２８−２３８；Ｓｃｈｗａａｂ，ら（２００４）Ｊ． Ｕｒｏｌ．１７１ １０３６−１０４２；Ｆｒｉｅｓｅ，ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：８９９６−９００６；Ｂｒｉｏｎｅｓ，ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：３１９５−３１９９；Ｖｉｅｗｅｇ ａｎｄ ＤａｎｎｕＵ（２００３）Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３０：６３３−６４３；Ｍｉｎｃｈｅｆｆ，ら（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：１２５−１３２を参照されたい）。

ワクチンは、ネイキッドＤＮＡベクターおよびネイキッドＲＮＡベクターを含むこともある。核酸を含有するこれらのワクチンは、遺伝子銃、電気穿孔法、細菌ゴースト、マイクロスフェア、微小粒子、リポソーム、ポリカチオンナノ粒子などによって投与され得る（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ら（１９９７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８；Ｍｉｎｃｈｅｆｆ，ら（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９：１２５−１３２；Ｓｏｎｇ，ら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：９８５４−９８６１；Ｅｓｔｃｏｕｒｔ，ら（２００４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１９９：１４４−１５５を参照されたい）。

ネイキッド核酸の投与のための試薬および方法論は、例えば、遺伝子銃法、内皮法、筋肉内法および電気穿孔法によって利用可能である。核酸ワクチンは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよく、ＬＮＡは、官能部分のプラスミドＤＮＡへの付着を可能にし、該官能部分は、アジュバントであり得る（例えば、Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ，ら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４５１０−４５１８；Ｓｔｒｕｇｎｅｌｌ，ら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：３６４−３６９；Ｈｅｒｔｏｕｇｈｓ，ら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：５８１７−５８３０；Ｔｒｉｍｂｌｅ，ら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：４０３６−４０４２；Ｎｉｓｈｉｔａｎｉ，ら（２０００）Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．４：４７−５０；Ｔｕｔｉｎｇ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：２１６−２２５）。核酸ワクチンは、未成熟の樹状細胞がそのワクチンに向かって移動するのを促進する複数の試薬と、成熟ＤＣが、初回免疫が生じることができる流入領域リンパ節へ移動するのを促進するある試薬とを組み合わせで用いられることができ、これらの試薬はＭＩＰ−１αおよびＦｌｔ３Ｌを包含する（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅ（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１２４１−１２４４；Ｓｕｍｉｄａ，ら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１３３４−１３４２を参照されたい）。

細菌ベクターとしては、例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カルメット‐ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。細菌は、腫瘍、癌細胞または感染体に由来する組換え抗原、異種抗原または抗原をコードする核酸を含むために操作され得る。さらに、細菌は、弱毒化されるように修飾され得る。別の態様では、非リステリア細菌ワクチンは、組換え抗原をコードするいずれの核酸も不在であり得る（例えば、Ｘｕ，ら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：６４４−６４８；Ｐａｓｅｔｔｉ，ら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５２０９−５２１９；Ｌｏｅｓｓｎｅｒ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ（２００４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１５７−１６８；Ｇｒａｎｇｅｔｔｅ，ら（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３３０４−３３０９；Ｂｙｒｄ，ら（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：２１９７−２２０５ Ｅｄｅｌｍａｎ，ら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：９０４−９１４；Ｄｏｍｅｎｅｃｈ，ら（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７：８６０−８６６を参照されたい）。

死滅しているが代謝的に活性な（「ＫＢＭＡ」）細菌および特に、ＫＢＭＡリステリアは、ＤＮＡ架橋剤（例えばソラレン）で処理することによっておよび／またはＤＮＡ修復、例えば、組み換え修復遺伝子（例えば、ｒｅｃＡ）もしくは紫外線損傷修復遺伝子（例えば、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＡＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、ｐｈｒＡ、ｐｈｒＢ）を媒介する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって生細菌から調製されることができる（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙらの米国特許公開番号２００４／０２２８８７７号および同２００４／０１９７３４３号を参照されたい。それぞれその全体を参照によって本明細書に組み入れる）。

ＫＢＭＡリステリアの１種類は、異種抗原を発現させるように操作されたリステリアｕｖｒＡＢであり、該操作された細菌は、核酸架橋剤、ソラレン化合物、マスタード化合物、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン、またはβ‐アラニン，Ｎ−（アクリジン−９−イル），２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルで処理される。また、例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，らの米国特許出願番号２００４／０１９７３４３号、「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＦＲＥＥ−ＬＩＶＩＮＧ ＭＩＣＲＯＢＥＳ， ＶＡＣＣＩＮＥ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」；Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：８５３−８６０を参照されたい。

一部の実施形態では、初回免疫ワクチンは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）ベクター、樹状細胞（ＤＣ）ベクター、アデノウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡベクターおよびＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）からなる群から選択される媒介物を含む。

３．補助療法で用いられるリステリア
特定の実施形態では、本発明はリステリア細菌の使用を含み、該リステリアは弱毒化されている。弱毒化は、病原性因子、例えば、ａｃｔＡ、インターナリンＢ（Ｂ）、ｐ６０（自己溶菌酵素）、リステイオリジンＯ（ＬＬＯ；
ｈｌｙ遺伝子）、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ；ｐｌｃＡ遺伝子）、リポ酸タンパク質リガーゼならびにＣｅｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに付与された米国特許番号１１／３９５，１９７号「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＬＩＳＴＥＲＩＡ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」（出願日２００６年３月３０日）に開示される遺伝子などをコードする１つまたは複数の遺伝子を変異させることからもたらされ得る。本発明の方法は、１種類または複数種類のリステリア種およびその中で特定された株の使用を含むが、これに限定されるものではない。例えば、本発明は、リステリア属細菌、すなわちリステリア・モノサイトゲネス、またはリステリア・モノサイトゲネスに由来する細菌の使用を包含する。また、リステリオリジン（ｈｌｙ遺伝子；ＬＬＯ）、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢ、または病原性遺伝子もしくは宿主細胞内への侵入を媒介する遺伝子などの他の遺伝子のうちの１つまたは複数を発現するように操作されたＬ．イノキュアなどの他のリステリア種も有用である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ら（２００４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：４２５６−４２６６；Ｓｌａｇｈｕｉｓ，ら（２００４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８９：３９３−４０１；Ｍｉｌｏｈａｎｉｃ，ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：１６１３−１６２５を参照されたい）。追加免疫ワクチンでの使用に適したリステリアの弱毒化された株は、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００３４２９号およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４４０８０号に記述されるように調製され得る。上記の出願のすべては、それら全体を参照によって本明細書に組み込まれる。

弱毒化されたリステリアの非限定的な例は、例えば、以下の特許公報に記述されており、各々は、その全体を参照によって本明細書に組み込まれる：米国特許公開番号２００４／０２２８８７７号；米国特許公開番号２００４／０１９７３４３号；および米国特許公開番号２００５／０２４９７４８号。非限定的な例は、例えば、２００６年３月３０日に出願された米国特許出願番号１１／３９５，１９７号に提供されており、その全体を参照によって本明細書に組み込まれる。

４．ワクチン組成物
上記の媒介物に加えて、本発明のワクチン組成物は、さまざまな賦形剤、アジュバント、担体、補助物質、調節剤などをさらに含み得る。随意に存在する担体は、分子であり、それ自体は、ワクチン組成物を投与される個人に有害な抗体の産生を誘発しない。好適な担体は、典型的に大きな、ゆっくり新陳代謝する巨大分子であり、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子である。微粒子担体の例は、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するもの、ならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＣとして知られているポリ（ラクチド−ｃｏ−グルコリド）由来の微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ Ｊ Ｐ，ら，Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｄ Ｔ，ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照されたい。そのような担体は、当業者にとって周知である。さらに、これらの担体は、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリア、破傷風コレラなどに由来するトキソイドなどの細菌トキソイド、ならびに大腸菌由来の毒素にコンジュゲートされ得る。そのようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：（１）アルミニウム塩類（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油型乳剤製剤（他の特異的免疫刺激剤を含む、もしくは含まない、例えば、ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分）、例えば、（ａ）Ｍｏｄｅｌ ＨＯＹマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に製剤化された、スクアレンを５％、Ｔｗｅｅｎ８０を０．５％およびＳｐａｎ８５を０．５％（随意に、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下参照）を含むが必要ではない）を含むＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）スクアレンを１０％、Ｔｗｅｅｎ８０を０．４％、プルロニックブロックポリマーＬ１２１を５％含むＳＡＦ、および大きな粒子径の乳濁液を生成するためにサブミクロン乳濁液にマイクロフルイダイズした、もしくはボルテックスしたＭＤＰ、および（ｃ）スクアレンを２％、Ｔｗｅｅｎ８０を０．２％、モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘｕ）を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）などのサポニンアジュバントを用いてもよく、またはそれ由来のＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などの生成された粒子；（４）
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）などのサイトカイン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、βケモカイン（ＭＩＰ、１-αランテス、１−βランテスなど）；（６）例えばコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）または大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ）などの細菌ＡＤＰリボシル化毒素の解毒化変異体、特にＬＴ−Ｋ６３（リシンが６３位で野生型アミノ酸と置き換わる）、ＬＴ−Ｒ７２（アルギニンが７２位で野生型アミノ酸と置き換わる）、ＣＴ−Ｓ１０９（セリンが１０９位で野生型アミノ酸と置き換わる）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（リジンが９位で野生型アミノ酸と置き換わり、グリシンが１２９位で置き換わる）（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２号および同ＷＯ９２／１９２６５号を参照されたい）；および（７）組成物の効果を増強するために、免疫刺激剤として作用する他の物質。

５．ワクチン組成物の調製
ワクチンは、当業者に既知の方法で調製される。通常、上述の薬剤（初回免疫ワクチンまたは追加免疫ワクチンで使用する）のうちの１つまたは複数を、所望の量の薬剤と、医薬的に許容される賦形剤とを混合することで調製する。医薬的に許容される賦形剤としては、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸塩緩衝液、アミノ酸ベースの緩衝液または重炭酸塩緩衝液が挙げられるがこれらに限定されるものではない。

６．ワクチン投与
単一用量または複数用量のワクチンで供給されるべき初回免疫ベクターまたは追加免疫ベクターの有効量は、当業者によって決定されることができる。そのような量は、ルーチンの試験を通して決定され得る範囲に収まるであろう。

初回免疫ワクチンおよび追加免疫ワクチンは、以下の経路のいずれか１つでまたは組み合わせによって投与され得る。一態様では、初回免疫ワクチンおよび追加免疫ワクチンは、同じ経路で投与される。別の態様では、初回免疫ワクチンおよび追加免疫ワクチンは、異なる経路で投与される。用語「異なる経路」とは、体の異なる部位、例えば、口腔、非口腔、腸内、非経口、直腸、節間（リンパ節）、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腫瘍周辺、腫瘍内、点滴、粘膜、鼻腔、脳脊髄腔または脳脊髄液など、ならびに異なる様式によって、例えば、経口、静脈内および筋肉内が挙げられるがこれらに限定されるものではない。

初回免疫ワクチンまたは追加免疫ワクチンの有効量は、一用量で与えられてもよいが、一用量に限定されない。したがって、投与は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のワクチン投与であり得る。ワクチンを複数回投与する場合、該投与は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分またはそれ以上の時間間隔を空けて、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間などの間隔を空けることができる。時間の関連で、用語「約」とは、任意の時間間隔±３０分以内を意味する。複数回投与の場合、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日およびその組み合わせの日数間隔で空けることも可能である。本発明は、時間を均等に空ける投与間隔に限定されるものではなく、非限定例だけを示すと、１日目、４日目、７日目および２５日目での投与からなる初回免疫スケジュールなどの非等間隔での投与を包含する。

初回免疫ワクチンおよび追加免疫ワクチンのの相対的タイミングを決定する際に以下を考慮に入れてもよい。抗原または抗原をコードする核酸を投与すると、抗原特異的免疫細胞の増殖を刺激し、結果として抗原特異的免疫細胞数のピーク、それに続いて収縮が生じることが判明している（例えば、Ｂａｄｏｖｉｎａｃ，ら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：６１９−６２６を参照されたい）。ピークに達する前に、ピークと同時に、またはピーク後に追加免疫ワクチン接種を開始することができる。

抗原特異性免疫細胞の集団が、最終的には達成される抗原特異的免疫細胞の最高数の少なくとも２０％まで；少なくとも３０%まで；少なくとも４０%まで；少なくとも５０%まで；少なくとも６０%まで；少なくとも７０%まで；少なくとも８０%まで；少なくとも９０%まで；少なくとも９５%まで；最終的には達成される抗原特異的免疫細胞の最高数の少なくとも９５％まで増殖した（数が増加する）ときに、追加免疫ワクチン接種の投与を開始することができる。初回・追加免疫ワクチンの追加スケジュールは、例えば、抗原特異的細胞の集団が抗原特異的細胞の最高数の９０％未満まで；８０%未満まで；７０%未満まで；６０%未満まで：５０%未満まで；４０%未満まで；３０%未満まで；２０%未満まで；１０%未満まで；５%未満まで；１．０%未満まで；０．５%未満まで；０．１%未満まで；０．０５％%未満まで；または抗原特異的細胞の最高数の０．０１％未満まで収縮したときに、追加免疫ワクチン接種を開始することができる。抗原特異的細胞は、ベクター特異的抗原（空のベクターに特異的である）に特異的である、または該ベクターに含まれる核酸によって発現される異種抗原に特異的であると特定されることができる。

別の態様では、追加免疫ワクチン接種の投与を、初回免疫ワクチン接種から約５日後に開始することができる；初回免疫ワクチン接種から約１０日後に開始する；約１５日後に；約２０日後に；約２５日後に；約３０日後に；約３５日後に；約４０日後に；約４５日後に；約５０日後に；約５５日後に；約６０日後に；約６５日後に；約７０日後に；約７５日後に；約８０日後に；約６カ月後に、および初回免疫ワクチン接種から約１年後に開始する。

追加免疫ワクチン接種を、初回免疫ワクチン接種から５〜１０日後に；初回免疫ワクチン接種から１０〜１５日後に；初回免疫ワクチン接種から１５〜２０日後に；初回免疫ワクチン接種から２０〜２５日後に；初回免疫ワクチン接種から２５〜３０日後に；初回免疫ワクチン接種から３０〜４０日後に；初回免疫ワクチン接種から４０〜５０日後に；初回免疫ワクチン接種から５０〜６０日後に；初回免疫ワクチン接種から６０〜７０日後などに投与することができる。

初回免疫ワクチン接種の開始と、追加免疫ワクチン接種を開始するまでの期間は、当業者が決定することができる。例えば、期間は、初回免疫化が生じた後に測定されるは生理的パラメータに反応するアルゴリズムに基づき得る。

投与量およびレジメンが決定されることになり、少なくとも部分的には、様式の効力、使用されるワクチン送達法、被験者の必要性により決定され、かつ実行者の判断に依存するであろう。

例えば、本発明で用いられるワクチン中のリステリアは、用量または投与量で投与されることができ、各用量は、体重７０ｋｇあたり１０^７〜１０^８の間のリステリア；体重７０ｋｇあたり２×１０^７〜２×１０^８の間のリステリア；体重７０ｋｇあたり５×１０^７〜５×１０^８の間のリステリア；体重７０ｋｇあたり１０^８〜１０^９の間のリステリア；７０ｋｇあたり２．０×１０^８〜２．０×１０^９の間のリステリア；７０ｋｇあたり５．０×１０^８〜５．０×１０^９の間のリステリア；７０ｋｇあたり１０^９〜１０^１０の間のリステリア；７０ｋｇあたり２×１０^９〜２×１０^１０の間のリステリア；７０ｋｇあたり５×１０^９〜５×１０^１０の間のリステリア；７０ｋｇあたり１０^１１〜１０^１２の間のリステリア；７０ｋｇあたり２×１０１１〜２×１０^１２の間のリステリア；７０ｋｇあたり５×１０^１１〜５×１０^１２の間のリステリア；７０ｋｇあたり１０^１２〜１０^１３の間のリステリア；７０ｋｇあたり２×１０^１２〜２×１０^１３の間のリステリア；７０ｋｇあたり５×１０^１２〜５×１０^１３の間のリステリア；などを湿重量あたりで含む。また、上記の各用量は、表面積１，７平方メートルあたりの基準または肝臓重量１．５ｋｇの基準に基づき提供される。本発明のリステリア投与時のマウス肝臓は約１．５グラムの重さであることに留意するべきである。ヒト肝臓は、約１．５キログラムの重さである。

本発明の一部の実施形態では、リステリアの追加免疫投与は、初回免疫投与による免疫応答を少なくとも２倍、時には約３〜５倍の間、もしくは５〜１０倍、または１０〜１００倍もしくはそれ以上増強するであろう。本発明の一部の実施形態では、初回免疫投与および追加免疫投与は、免疫応答に対して相乗効果を及ぼすであろう。本発明の一部の実施形態では、増強された免疫応答はＴ細胞応答を含み、一部の実施形態では、そのＴ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答であろう。本発明の一部の実施形態では、初回免疫投与および追加免疫投与は、標的抗原に対する哺乳類の免疫寛容誘発状態を壊すことになろう。これらの実施形態のすべの例を以下に示す。

７． 免疫応答を測定する方法
当技術分野では、 体液性免疫応答および細胞性免疫応答を測定することを含む、免疫応答を測定するための種々のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイが、知られており、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡアッセイなどの標準イムノアッセイ；細胞内染色アッセイ；例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイを含むＴ細胞アッセイ、または感作された被験者においてＴリンパ球特異的抗原をアッセイすることによるアッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなアッセイは、周知の技術である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照されたい。細胞性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌のＴ細胞集団による測定、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術によって）を含む（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．， ａｎｄ Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）１３６７−１３７１，１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１，１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．，ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５，１９９７に概説されている）。本明細書に開示される例示的な実施形態では、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌する個々の細胞を検出して分析する。ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮ−γアッセイおよび試薬は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３５０ Ｑｕｍｅ Ｄｒｉｖｅ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，９５１３１から入手可能である。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、活性化ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の集団からサイトカイン生成細胞を検出することが可能であり、かつ高親和性の捕捉抗体と検出抗体および酵素増幅を用いることでその特異性と感受性を引き出す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いることに関するさらなる情報は、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１，２５４（ｌ−２）：５９に記載されている。動物モデル、例えば非ヒト霊長類は、当技術分野で知られている。例えば、マウスは、ヒト免疫応答の認められているモデルである。腫瘍に対するマウスＮＫ細胞応答は、腫瘍に対するヒトＮＫ細胞応答の認められているモデルである。さらに、マウスＴ細胞は、ヒトＴ細胞のモデルであり、マウス樹状細胞（ＤＣ）は、ヒトＤＣのモデルであり、マウスＮＫＴ細胞は、ヒトＮＫＴ細胞のモデルであり、マウス生得的反応は、ヒト生得的反応の認められているモデルなどがある。モデル研究は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞（例えば、Ｗａｌｚｅｒ，ら（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２７０４−２７１１を参照されたい）；ＮＫ細胞の２つのサブセット（例えば、Ｃｈａｋｉｒ，ら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４９８５−４９９３；Ｓｍｉｔｈ，ら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１３４１−１３５４；Ｅｈｒｌｉｃｈ，ら（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１９２２−１９３１；Ｐｅｒｉｔｔ，ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：５８２１−５８２４を参照されたい）；ＮＫＴ細胞（例えば、Ｃｏｕｅｄｅｌ，ら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３９１−４３９７ Ｓａｋａｍｏｔｏ，ら（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：Ｓ４４５−Ｓ４５１； Ｓａｉｋｈ，ら（２００３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：１５６２−１５７０；Ｅｍｏｔｏ，ら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：５００３−５００９；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，ら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４８３−５１３；Ｓｉｄｏｂｒｅ，ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：１２２５４−１２２５９を参照されたい）；単球／マクロファージ（Ｓｕｎｄｅｒｋｏｔｔｅｒ，ら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：４４１０−４４１７）；ＤＣの２系統（Ｂｏｏｎｓｔｒａ，ら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１０１−１０９；Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，ら（２００１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７２：１９４６−１９５１；Ｂｅｃｋｅ（２００３）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２６：１１９−１３０；Ｃａｒｉｎｅ，ら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６４６６−６４７７ Ｐｅｎｎａ，ら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９：６６７３−６６７６；Ａｌｆｅｒｉｎｋ，ら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：５８５−５９９）に関して開示されている。開示されるように、トール様受容体（ＴＬＲ）を含むマウス生得的反応は、ヒト生得的免疫応答のモデルである（例えば、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ａｎｄ Ｂｅｙａｅｒｔ（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｒｅｖｓ．１６：６３７−６４６を参照されたい）。マウス好中球は、ヒト好中球の認められているモデルである（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ら（２００３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１０９４８−１０９５３；Ｔｏｒｒｅｓ，ら（２００４）７２：２１３１−２１３９；Ｓｉｂｅｌｉｕｓ，ら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７：１１２５−１１３０ Ｔｖｉｎｎｅｒｅｉｍ，ら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：１９９４−２００２を参照されたい）。リステリアに対するマウス免疫応答は、リステリアに対するヒト応答の認められているモデルである（例えば、Ｋｏｌｂ−Ｍａｕｒｅｒ，ら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６８：３６８０−３６８８；Ｂｒｚｏｚａ，ら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２６４１−２６５１を参照されたい）。

８．初回・追加免疫レジメンの使用
癌および感染症は、免疫系を調節する試薬を投与することによって治療および／または阻害され得る。本発明の範囲内に包含される初回・追加免疫法は、アップレギュレートされる免疫応答を引き起こし、かつ自己抗原に対する耐性を壊すことを含む。このように、これらの初回・追加免疫法は、癌の増殖を阻害するのに、および／または癌に随伴する１つまたは複数の症状を寛解させるのに有用であることが予想される。また、初回・追加免疫法は、病原体に起因する疾患の予防および／または治療に有用であろことが予想される。

上記に加えて、これらのレジメンを用いて、哺乳類が治療に反応するかどうか決定することができる。
例えば、特異性抗原に対する初回・追加免疫レジメンを用いる場合、追加免疫後に有意な免疫応答を得られないと、その哺乳類が標的抗原に対して非反応性であることが示唆され、かつ代替治療様式を追求すべきである。本実施例は、癌または病原体の遺伝的背景が、標的抗原が不在であり、または標的抗体と交差反応しない方法で修飾されるような場合であり得る。

実施例
本発明は本明細書に開示される特定の実施例に限定されず、または変わり得ると理解されるべきである。本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によって説明されるので、これらの実施例は限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

［実施例で使用した方法についての一般事項］
ワクチンに対する免疫応答は、Ｔ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む免疫系の細胞を提供する源である脾細胞を採取することによって評価した。抗原特異的免疫応答は、脾細胞を１つまたは複数のペプチドともにインキュベートし、次いで免疫細胞の活性を測定することで測定し、活性は細胞内染色アッセイ（ＩＣＳ）とエリスポットアッセイで決定した。一部のアッセイでは、わずかに単一のペプチドを添加し、該ペプチドは、腫瘍抗原の１つのエピトープだけを含んでいた。他のアッセイでは、該抗原の全長を含むペプチドの全ライブラリーを添加した。

ＩＣＳアッセイは、脾細胞を透過処理することと、免疫細胞の内部に蓄積したサイトカインに結合する抗体によって処理することとを含み、該抗体は蛍光タグ付けをすることが可能である。ブレフェルジンは、タンパク質輸送を妨害し、かつ免疫細胞内でサイトカインの蓄積を誘発する。

エリスポット（酵素結合免疫スポット）アッセイは、分泌されたタンパク質に感受性があり、該タンパク質はウェル中に置かれた免疫細胞からある期間にわたり分泌される。捕捉抗体は、分泌されたサイトカインを固定化したウェルに結合している。分泌期間の後、免疫細胞を取り出して、検出抗体を用いて、固定化したサイトカインを検出する。捕捉抗体および検出抗体は、サイトカインの異なる領域に結合する。ＩＣＳアッセイおよびエリスポットアッセイの方法論的な詳細は、開示されている（例えば、２００５年１１月１０日に公開されたＤｕｂｅｎｓｋｙらの米国特許出願公開番号２００５／０２４９７４８号を参照されたい）。

投与されたベクターが、オボアルブミンをコードする核酸を含んでいる場合、ＩＣＳアッセイまたはエリスポットアッセイの方法によるいずれの誘発された免疫応答の分析は、オボアルブミン、ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＮＬ（配列番号１））由来の標準ペプチドを使用した。該ペプチドは、調製された脾細胞に添加して脾細胞とともにインキュベートした。

以下の構築物で用いたヒトメソテリンの核酸配列は、２００６年３月３０日に出願され、Ｃｅｒｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに付与された米国特許番号１１／３９５，１９７号、「ENGINEERED LISTERIA AND METHODS OF USE THEREOF」に特定されたものであった。ヒトメソテリンの全長にわたったメソテリンペプチドライブラリーは、１５３個のペプチド（各１５塩基長）からなり、各１５塩基長は次の１５塩基長と１１個のアミノ酸が重複していた。

以下の実施例で用いたリステリア・モノサイトゲネスの構築物であるＬｍ−ｈＭｅｓｏ３８を表１に特定する。また、２００６年３月３０日に出願された米国特許番号１１／３９５，１９７号、「ENGINEERED LISTERIA AND METHODS OF USE THEREOF」を参照されたい。Ｌｍ−ｍＭｅｓｏは、完全長のヒトメソテリン配列が完全長のマウスメソテリン配列と置換されていることを除いて、Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８と同じ構築物である。完全長マウス配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１８８５７から利用可能である。

ＯＶＡ（「Ｌｍ−ＯＶＡ」）をコードするリステリア・モノサイトゲネスの調製は、米国特許出願番号２００４／０１９７３４３号（米国特許番号１０／７７３，６１８号）に記述された通りであった。

完全長のオボアルブミンをコードする核酸を含む、ワクシニアウイルス由来のベクター（ＶＶ−ＯＶＡ）は、記述されたようにＮ．Ｐ．Ｒｅｓｔｉｆｏによって調製されて提供された（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，ら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２７７−２８６）。

アデノウイルスに基づくベクターは、完全長ヒトメソテリンまたは完全長のマウスメソテリンをコードする核酸を含んだ（Ａｄ−ｈＭｅｓｏまたはＡｄ−ｍＭｅｓｏ）。異種抗原をコードしない対照Ａｄベクター（別名「空のＡｄベクター」としても知られている）も用いた。すべての対照および抗原をコードするＡｄベクターは、Ｅ１とＥ３の領域を欠失したアデノウイルスセロタイプ５に基づいており、かつＳｔｒａｔａｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した「ＡｄＥａｓｙ」系を利用して引き出し、供給者によって記述された方法によって引き出した。抗原は、Ｅｌ座位でクローン化した。異種抗原をコードする核酸は、ＣＭＶプロモーターと機能可能な連結で、ＡｄＥａｓｙのシャトルベクターに組み込んだ。

ＧＶＡＸ（登録商標）は、マウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする核酸を含む不活性化腫瘍細胞を指し、該腫瘍細胞系は、ｇｐ７０を発現する細胞系、ＣＴ２６細胞であった。ＡＨ１は、ＣＴ２６細胞の免疫優性抗原であるｇｐ７０のエピトープである。ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）を開示されているように調製して投与した（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，ら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：１０９６−１１０４；Ｊａｉｎ，ら（２００３）Ａｎｎａｌｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．１０：８１０−８２０；Ｚｈｏｕ，ら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：０７９−１０８８ Ｃｈａｎｇ，ら（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８６：７２５−７３０；Ｂｏｒｒｅｌｌｏ ａｎｄ Ｐａｒｄｏｌｌ（２００２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３：１８５−１９３；Ｔｈｏｍａｓ，ら（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：８３５−８４３を参照されたい）。

死滅しているが代謝的に活性なＬｍ（「ＫＢＭＡ−Ｌｍ」）は、ｕｖｒＣ遺伝子産物との組み合わせでのその発現がヌクレオチド除去修復に必要とされるエキソヌクレアーゼを形成するｕｖｒＡＢ遺伝子の欠失した生Ｌｍをソラレンおよび紫外線で処理して、少量のゲノムの架橋結合をもたらすことによって調製した（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙらの米国特許番号１０／７７３，６１８号、同公開番号２００４／０１９７３４３号「MODIFIED FREE-LIVING MICROBES, VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF
USE THEREOF」；Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：８５３−８６０を参照されたい）。

［実施例１］
試験当日、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたり３匹）に、ＯＶＡをコードするワクシニアウイルス（「ＶＶ」）１×１０^６ｐｆｕ（プラーク形成単位）、またはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ病原性決定基を欠失し、ＯＶＡをコードする組み換えリステリア・モノサイトゲネス（「Ｌｍ」）５×１０^６ｃｆｕ（コロニー形成単位）のいずれかで免疫した。２１日目に、マウスにＶＶまたはＬｍのいずれかの追加免疫投与を、いずれの場合にも、初回免疫用量と同じ用量で投与した。２７日目に、該マウスを犠牲にして、脾細胞を採取した。単回免疫化の後のワクチン誘発ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きさを評価するために、２０日目に対照マウスにＶＶまたはＬｍによる単回免疫だけを投与し、２７日目にマウスを犠牲にして脾細胞を採取した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を、ＩＳＣアッセイでＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを用いて決定した。

初回・追加免疫レジメンでもたらされたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を図１Ａに示す。図に示すように、ＶＶ初回免疫／Ｌｍ追加免疫を使用する初回・追加免疫レジメンは、Ｌｍ初回免疫／ＶＶ追加免疫と比較して、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージでほぼ２倍をもたらした。加えて、ＶＶ初回免疫／Ｌｍ追加免疫では、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが、同種のＬｍ初回免疫／Ｌｍ追加免疫よりも約３倍高く、同種のＶＶ初回免疫／ＶＶ追加免疫よりも約９倍高かった。このデータは、Ｌｍ追加免疫を用いる系で得た優れた結果によって、異種初回・追加免疫レジメンでの方向性のエビデンスを提供する。

［実施例２］
試験当日に、１群あたり３匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、ヒトメソテリンをコードするアデノウイルス（「ＡＶ］または「アデノ−ｈＭｅｓｏ」）３×１０^７ｐｆｕまたはヒトメソテリンをコードするＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ（「Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８」）５×１０^６ｃｆｕのいずれかを注射した。２１日目に、マウスにＡＶまたはＬｍ−ｈＭｅｓｏ３８のいずれかの追加免疫投与を、いずれの場合にも、初回免疫用量と同じ用量で投与した。２７日目にマウスを犠牲にして、脾細胞を採取した。単回免疫化の後のワクチン誘発ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きさを評価するために、２０日目に対照マウスにＡＶおよびＬｍ−ｈＭｅｓｏ３８だけを投与し、２７日目にマウスを犠牲して脾細胞を採取した。

初回・追加免疫レジメンでもたらされたワクチン誘発ヒトメソテリン特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を図１Ｂに示す。ＡＶ初回免疫／Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８追加免疫は、Ｌｍ初回免疫／ＡＶ追加免疫レジメンを与えたマウスのコホートと比較すると、ヒトメソテリン（「ｈＭｅｓｏ」）に特異的な脾臓ＣＤ８＋細胞のパーセンテージが約１０倍高い大きさをもたらし、異種追加免疫レジメンにおける方向性が、コードされた抗原に特異的なワクチン誘発細胞性免疫の大きさに影響することと、その優れた結果はＬｍ追加免疫を用いる系から得られることとの両方を示した。

［実施例３］
Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたり３匹）に、初回免疫投与および追加免疫投与を投与して、ヒトメソテリンに対する免疫応答を誘発した。図２に示すように、初回および追加免疫レジメンは、すべてヒトメソテリンをコードした、表示したベクターを用いたものであった。ＩＣＳアッセイの結果が示すように、ＡＶ初回免疫／Ｌｍ追加免疫のレジメンは、Ｌｍ初回免疫／ＡＶ追加免疫がもたらしたよりも３〜４倍高いパーセンテージのヒトメソテリン（「ｈＭｅｓｏ」）特異的ＣＤ８＋細胞をもたらした。加えて、図２の結果は、ＡＶ初回免疫／Ｌｍ追加免疫が、試験した他の異種初回・追加免疫レジメンのいずれよりも有意に高かったことも示している。

［実施例４］
異種ＡＶ初回・追加免疫において、一定のＬｍ追加免疫に対する異なるＡＶ初回免疫投与の、ワクチンに誘発された脾臓ｈＭｅｓｏ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫の大きさへの影響を試験した。すべてのベクターは、ヒトメソテリンをコードした。ＨＢＳＳを対照として用いた。利用した初回免疫および追加免疫のレジメンは、図３Ａに示すように、各実験コホートが３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスからなっていた。これらの研究では、ＩＣＳアッセイの前に、完全長メソテリンに相当する、４アミノ酸をオフセットした１５アミノ酸長のペプチドからなるメソテリンペプチドのプールライブラリー（「１５×１１ライブラリー」）を用いて免疫したマウスから採取した脾細胞を５時間刺激した。初回・追加免疫レジメンにおいてＡＶの滴定からもたらされたヒトメソテリン特異的細胞性免疫応答を図３Ａに示す。この図に示すように、著しく増強した特異的Ｔ細胞応答は、より多い量のＡＶで得られ、かつＣＤ８＋Ｔ細胞の応答がＣＤ４＋の応答よりも大きかった。

［実施例５］
実施例４で用いたものに類似する免疫化プロトコルをＢａｌｂ／ｃマウスで用いた（図３Ｂを参照）が、ただし、初回免疫と追加免疫との間隔は３８日であり、対照マウスにはｈＭｅｓｏ３８で免疫したが、初回免疫はＡＶではなかった。図３Ｂに示すように、著しく増強した特異的Ｔ細胞応答は、ＡＶのより多い量の範囲にわたっていた。ここでも、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＣＤ４＋のそれよりも大きかった。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、１×１０^４ｐｆｕまでの低いＡＶ初回免疫投与で、５×１０^６ｃｆｕのＬｍ ｈＭｅｓｏ３８での追加免疫の後に、かなりのレベルのｈＭｅｓｏ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘発された。

［実施例６］
ＡＶに対する既存の免疫の存在下でのＡＶ初回免疫／Ｌｍ追加免疫の効果を試験した。第１の研究では、既存のアデノウイルス特異的免疫の存在下でのＡＶ免疫化への応答性を、図４Ａに示すプロトコルを用いて試験した。ヒトメソテリンをコードするＡＶでの免疫化の２８日前に、図に示すように種々のレベルの「空Ａｄベクター」でマウスを免疫することによって、既存のアデノウイルス特異的免疫を誘発した。本研究では、１群あたりＢａｌｂ／Ｃマウスを５匹用いた。マウスに、空のＡｄ粒子を試験当日に、その後の２８日目にヒトメソテリンをコードするＡＶ（「Ａｄ−ｈＭｅｓｏ」）のいずれかを注射した。３５日目に、脾細胞を採取して、ＩＣＳアッセイで用いた。Ａｄ空ベクターおよびＡｄ−ｈＭｅｓｏベクターは、両方ともセロタイプ５であった。メソテリン特異的免疫応答を、ヒトメソテリンペプチドプールで脾細胞を刺激することによって測定し、ＡＶ特異的免疫応答は、クラスＩのＨｅｘ３エピトープを用いて測定した。図４Ａに示す結果は、既存のＡｄ５特異的細胞性免疫の存在下では、マウスにヒトメソテリンをコードする同じＡｄ５ベクターで免疫した場合、わずかに低いｈＭｅｓｏ特異的応答が誘発され得ることを示している。

第２の研究は、ＡＶ免疫が既存する（図４ＢのＸ軸上に投与したＡＶプラーク形成単位の量で示した）マウスにＡＶ初回／Ｌｍ追加免疫レジメン後のｈＭｅｓｏ特異的細胞性免疫応答を試験した。使用したプロトコル（図４Ｂに示す）は、ＡＶでの初回免疫から２０日後、マウスにＬｍ−ｈＭｅｓｏ３８で追加免疫を与え、かつＡＶ特異的Ｔ細胞免疫応答を測定する代わりにプラーク減少アッセイでＡＶ特異的中和抗体を決定したことを除いて、初回免疫を試験するためのプロトコルと同じであった。図４Ａと比較して、図４Ｂの結果は、ＡＶセロタイプ５に対する既存の中和免疫が存在するにも関わらず、ＡＶ初回免疫に続いてＬｍ−ｈＭｅｓｏ３８の追加免疫を組み合わせると、ｈＭｅｓｏ特異的細胞性免疫に著しい増加を誘発する結果をもたらしたことを示している。

［実施例７］
腫瘍細胞初回免疫／Ｌｍ追加免疫を用いる異種初回免疫−追加免疫を、以下のように行った。該レジメンは、ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）初回免疫／Ｌｍ−ＡＨ１−Ａ５追加免疫を用いた。「ＧＶＡＸ」は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする核酸を含む不活性腫瘍細胞をいう。投与したリステリア・モノサイトゲネスは、Ｌｍ−ΔａｃｔＡ−ＯＶＡ−ＡＨｉ−Ａ５であった。Ｌｍ−ΔａｃｔＡ−ＯＶＡ−ＡＨ１−Ａ５は、ａｃｔＡ遺伝子において１つの欠失によって弱毒化され、かつリステリアゲノム中に抗原発現カセットの単一コピーを含み、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込まれた組換えリステリア・モノサイトゲネスであり、該発現カセットは、オボアルブミン内のオンフレームに挿入されたＡＨ１−Ａ５を含む（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１３８３２−１３８３７）。ＡＨ１−Ａ５は、ＣＴ２６腺癌細胞系によって発現されるｇｐ７０内在性拒絶抗原のＡＨｌ Ｌｄ免疫優性エピトープの変化したＴ細胞リガンドであり、かつ腫瘍抗原、ｇｐ７０に対する免疫応答の研究で従来から用いられている（Ｓｌａｎｓｋｙ，ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：５２９−５３８ Ｊａｉｎ，ら（２００３）Ａｎｎａｌｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．１０：８１０−８２０）。

異種初回免疫／追加免疫のために、１群あたり３匹のマウスに、初回免疫としてＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）（１×１０^６細胞）（皮下注射）を、および追加免疫としてＬｍ−ＯＶＡ−ＡＨｌ−Ａ５（５×１０^６細胞）（静脈内）を投与した。ＧＶＡＸによる同種初回免疫／追加免疫ワクチンのために、マウスに、初回と追加の両免疫に対して、ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）初回免疫（１×１０^６細胞）（皮下）を投与した。Ｌｍだけによる同種初回免疫／追加免疫のワクチンのために、初回と追加の両免疫に対して、Ｌｍ−ＯＶＡ−ＡＨｌ−Ａ６（５×１０^６ｃｆｕ）（静脈内）を投与した。別々の同種初回免疫／追加免疫の試験を行い、Ｌｍだけを皮下、筋肉内または静脈内に投与した。すべての場合において、初回免疫をｔ＝試験当日に投与し、追加免疫をｔ＝２１日目に投与し、ｔ＝２９日目に脾細胞を採取した。また、図に示すように、マウスを単回投与単一ワクチン（ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）のみ；Ｌｍ−ＯＶＡ−ＡＨｌ−Ａ５のみ）で処置した。

結果は、ＧＶＡＸ（登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）初回免疫とそれに続くＬｍ−ΔａｃｔＡ−ＯＶＡ−ＡＨｌ−Ａ５追加免疫が、いずれの投与経路によるいずれの同種初回・追加免疫レジメンよりも大きなＡＨｌ特異的免疫応答を誘発したことを示している。

［実施例８］
ＡＶ初回免疫／Ｌｍ追加免疫と樹状細胞（「ＤＣ」）初回免疫／Ｌｍ追加免疫との比較を以下のように行った。１群あたり５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。樹状細胞を２×１０^６樹状細胞の量で投与した（静脈内）。ヒトメソテリンをコードする核酸を含むアデノウイルス由来のベクターを１×１０^８ｃｆｕの用量で投与した（筋肉内）。Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８を５×１０^６ｃｆｕの量で投与した（静脈内）。ペプチド刺激ＤＣを２×１０^６ＤＣの用量で投与した（静脈内）。ＤＣとＬｍの初回免疫および追加免疫を８日あけて、ＡＶとＬｍの初回免疫および追加免疫を１４日あけた。すべてのマウスにおいて、脾臓メソテリン１３１−１３９特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８による追加免疫の翌日までに測定した。図６Ａおよび図６Ｂに対照を示した。

ペプチド刺激ＤＣを以下のように調製した。ＤＣをｈＭｅｓｏ１３１−１３９（ＳＧＰＱＡＣＴＲＦ）で刺激した。ＤＣは、高濃度のＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスの全骨髄から調製した。最初のプレーティングおよびＧＭ−ＣＳＦ集積培養から８日目に、浮遊細胞を収集して、骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃｈｉ）であるかを表現型的に確認した。ＤＣを、リポ多糖体（ＬＰＳ）で（２４時間）処理して、１．０マイクロモルペプチド（ｈＭｅｓｏ１３１−１３９）（０．００１ｍＭ）で１時間刺激した。ペプチドを負荷したＤＣを２回洗浄してから、１×１０^６ＤＣをレシピエントのＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。

図６Ａに示したＩＣＳアッセイの結果は、ＤＣ−ｈＭｅｓｏ１３１−１３９初回免疫／Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８追加免疫による異種初回免疫／追加免疫および異種アデノ−ｈＭｅｓｏ初回免疫／Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８追加免疫が、それぞれメソテリン特異的細胞性免疫応答を誘発したことを示し、免疫応答のレベルは、両初回免疫／追加免疫レジメンの場合、ほぼ同じであった。

図６Ｂに示すエリスポットアッセイの結果は、ＤＣ−ｈＭｅｓｏ１３１−１３９初回免疫／Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８追加免疫による異種初回免疫／追加免疫および異種アデノ−ｈＭｅｓｏ初回免疫／Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８追加免疫が、それぞれメソテリン特異的細胞性免疫応答を誘発したことを示し、免疫応答のレベルは、両初回免疫／追加免疫レジメンの場合、ほぼ同じであった。

［実施例９］
ＤＣ初回免疫後の追加免疫としてのＬｍ、ＡＶおよびＶＶの比較を以下のように行った。試験当日に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群あたり５匹）に、１×１０^６骨髄由来樹状細胞を静脈内にワクチン接種した（初回免疫）。実施例８で記述したように、ＤＣを調製した。２１日目に、マウスに追加免疫を与え、該追加免疫は以下のうちの１つであった：Ｌｍ−ｈＭｅｓｏ３８（５×１０^６ｃｆｕ、静脈内）、ＡｄｈＭｅｓｏ（１×１０^７ｐｆｕ、筋肉内）またはワクシニアウイルス−ｈＭｅｓｏ（「ＶＶ−ｈＭｅｓｏ」）（１×１０^６ｐｆｕ、腹腔内）。別のマウスの群に、追加免疫ワクチンの代わりにＨＢＳＳを投与した。追加免疫ワクチン接種から５日後にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）で決定した。

図６Ｃに示す結果は、ＡＶ−ｈＭｅｓｏが、ｈＭｅｓｏ細胞特異的応答に対して著しい追加免疫を与えたのだが、追加免疫剤としてＬｍを用いることによって約５倍も高い結果が達成されたことを示している。

［実施例１０］
追加免疫としてＬｍを用いた異種初回・追加免疫レジメンにおいて初回免疫としてのＡＶおよびネイキッドＤＮＡの比較を行った。加えて、マウスメソテリンは、異種初回・追加免疫レジメンで耐性を弱めることが可能だったかどうか決定するためにヒトメソテリンと置き換わった。この研究では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いた。全メソテリンペプチドライブラリーを用いて、異種ＤＮＡ初回免疫／Ｌｍ追加免疫および異種Ａｄ初回免疫／Ｌｍ追加免疫ワクチンを投与して、メソテリン特異的免疫応答を評価した。ＤＮＡ初回免疫／Ｌｍ追加免疫は、ＤＮＡ−ｍＭｅｓｏ（０．１ｍｇ）（筋肉内）初回免疫／Ｌｍ−ｍＭｅｓｏ３８（５×１０^６ｃｆｕ）（静脈内）追加免疫であった（図７Ａ）。Ａｄ初回免疫／Ｌｍ追加免疫は、Ａｄ−ｍＭｅｓｏ（１×１０^８ｐｆｕ）（筋肉内）初回免疫／Ｌｍ−ｍＭｅｓｏ３８（５×１０^６ｃｆｕ）（静脈内）追加免疫であった（図７Ｂ）。ネイキッドＤＮＡベクター（ＤＮＡ−ｍＭｅｓｏ）を以下のように調製した。完全長マウスメソテリンをコードする核酸を、真核細胞発現ベクターのｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｐｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。

試験当日に初回免疫を投与し、１３日目に追加免疫を投与し、１８日目に脾細胞を採取した。採取した脾細胞を、マウスメソテリン（「ｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」）ペプチドライブラリー由来のペプチドで処理し、脾細胞を含有する各ウェルにユニークなペプチドを添加し、および免疫応答をエリスポットアッセイで評価した。完全長のマウスメソテリンタンパク質を網羅するユニークなペプチド類（４アミノ酸をオフセットした１５アミノ酸長）を用いることができ、Ｔ細胞反応性マウスメソテリンペプチドを特定することを可能にするように、免疫化マウス由来の脾細胞を含む十分なウェルを利用した。

図７Ａの結果は、ｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎペプチドライブラリーの各ペプチドについて免疫応答を別々に評価したとき、ＤＮＡ−ｍＭｅｓｏ初回免疫／Ｌｍ−ｍＭｅｓｏ３８追加免疫が、比較的少ない免疫応答を誘発したことを示している。対照的に、図７Ｂの結果は、Ａｄ−ｍＭｅｓｏ初回免疫／Ｌｍ−ｍＭｅｓｏ３８追加免疫が、マウスメソテリンペプチドライブラリー由来のマウスメソテリンペプチド番号２７８、２７９および２８０に対して比較的高い免疫応答を誘発したことを示している。マウスメソテリンペプチドライブラリー由来の他のペプチドを用いた場合、免疫応答が比較的少ないことが判明した。図７Ｃは、脾細胞をメソテリンペプチド番号２７８、２７９または２８０にさらしたウェルの写真である。この写真はエリスポットアッセイからのスポットを示している。このように、図７Ｂおよび図７Ｃに示す結果は、ＡＶ初回／Ｌｍ追加免疫レジメンがｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎに対して特異的な細胞性免疫応答をもたらしたことを示している。さらに、これらの結果は、ＡＶベクターおよびＬｍベクターからなり、両ベクターがマウスメソテリンをコードする、初回免疫および追加免疫レジメンを与えたマウスにおいて、マウスメソテリン内在性抗原に対する耐性を壊すことも示している。

［実施例１１］
初回免疫剤としておよび／または追加免疫剤としてＫＢＭＡ Ｌｍの有効性を評価した。試験当日に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたり３匹）に、初回免疫としてＫＢＭＡ−Ｌｍを投与した。以下のうちの１つの追加免疫を１４日目に投与した：「生」Ｌｍ、ＫＢＭＡ−ＬｍまたはＶＶ。１４日目に対照のＫＢＭＡーＬｍおよび生Ｌｍも投与した。１９日目にマウスを犠牲にして、脾細胞を採取した。

リステリア構築物は、ＢａＰＡ分泌配列に機能可能に連結されたｈｌｙプロモーターとオボアルブミンとを有し、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座にゲノムが組み込まれている。

注射したＫＢＭＡリステリア・モノサイトゲネスΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ（ＫＢＭＳＡ Ｌｍ）の数は、３×１０^８細菌粒子であった。ＫＢＭＡ Ｌｍは、ソラレンおよび紫外線であらかじめ処理しておいた。投与した「生」リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ−ΔａｃｔＡΔｕｖｒＡＢ−ＯＶＡ）の量は、１×１０^６ｃｆｕであった。投与したワクシニアウイルス由来ベクター（ＶＶ−ＯＶＡ）の数は、１×１０^６ｐｆｕであった。

免疫反応は、オボアルブミン（ＯＶＡ２５７−２６４）由来の標準オクタペプチドのペプチドで脾細胞をペプチド刺激することによって、およびオボアルブミン特異的免疫応答をＩＦＮ−γに対する細胞内染色（ＩＣＳ）アッセイ法で測定することによって決定した。

図８に示す結果が示すように、ＫＢＭＡ−Ｌｍは初回免疫剤として活性であった。ＫＢＭＡ−Ｌｍ初回免疫／生Ｌｍ追加免疫は、最も高いレベルの免疫応答を誘発し、より少ないレベルの免疫応答は、異種ＫＢＭＡ−Ｌｍ初回免疫／ＶＶ追加免疫ワクチンで生じた。

［実施例１２］
１群あたり１５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、１ｅ８ｐｆｕの空のアデノウイルス（すなわち、ＡＨ１、ＡＨ１／Ａ５、もしくはｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎを発現しないアデノウイルス）またはＡＨ１／Ａ５もしくはマウスメソテリン（ｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を発現するアデノウイルスを筋肉内にワクチン接種した。２１日後に、マウスに、異種抗原をコードしないＬｍまたはＡＨ１／Ａ５もしくはｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎを発現するＬｍを５ｅ６cｆｕ筋肉内に追加免疫した。ＡＨ１／Ａ５は記述されている（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：１３８３２−１３８３７を参照されたい）。５日後に、１群あたり５匹のマウスに由来する脾臓を採取してＡＨ１／Ａ５(図９Ａ）およびｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（図９Ｂ）の免疫応答を評価した。追加ワクチン接種から１週間後に、残りのマウスに４ｅ５のＣＴ２６細胞を静脈内に投与した。マウスの生存をモニターした（図９Ｃ）。図９Ａ〜９Ｃにおいて、「Ａｄ」は、空のアデノウイルスを意味し、「Ｌｍ」は、異種抗原をコードしないリステリア・モノサイトゲネスを意味し、「Ａｄ−ＡＨ１／Ａ５」は、ＡＨ１／Ａ５を発現するアデノウイルスを意味し、「Ａｄ−ｍＭｅｓｏ」は、マウスメソテリンを発現するアデノウイルスを意味し、「Ｌｍ−ｍＭｅｓｏ」は、マウスメソテリンをコードするリステリア・モノサイトゲネスを意味する。

図９Ａに示すように、ＩＣＳアッセイによる、Ａｄ−ＡＨ１／Ａ５初回免疫およびＡＨ１／Ａ５追加免疫による初回免疫／追加免疫は、かなりの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答をもたらした。ＡＨ１ペプチドおよびＡＨ１／Ａ５ペプチドは、ＣＴ２６腫瘍細胞の内在性タンパク質であるｇｐ７０に由来する。示したように、脾細胞インキュベーション混合物に、ＡＨ１ペプチドまたはＡＨ１／Ａ５ペプチドを追加した。ｇｐ７０は、ＣＴ２６の内因性タンパク質である。添加したＡＨ１／Ａ５ペプチドとともに脾細胞をインキュベートした場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答はより多く、添加したＡＨ１ペプチドとともに脾細胞をインキュベートした場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答はより少なかった。

以下のような免疫応答の特異性が示された。空のアデノウイルスおよび異種抗原をコードしないＬｍによる初回免疫／追加免疫は、検出可能なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答をもたらさなかった。また、マウスメソテリンを発現するベクターによる初回免疫／追加免疫は、検出可能なＡＨ１またはＡＨ１／Ａ５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答をもたらさなかった。ここでも免疫応答の特異性を示した（図９Ａ）。

図９Ｂに示すデータは、別の異種抗原、すなわちメソテリンに対する免疫応答の初回免疫／追加免疫の刺激を示し、かつその免疫応答がこの抗原に特異的であったことを示す。空のＡｄ初回免疫／Ｌｍ（異種抗原をコードしない）追加免疫、またはＡｄ ＡＨ１／Ａ５初回免疫／Ｌｍ ＡＨ１／Ａ５追加免疫が、ｍＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を刺激できなかったことによって特異性を示した。

図９Ｃに示したデータは、Ａｄ−ＡＨ１／Ａ５初回免疫／Ｌｍ−ＡＨ１／Ａ５追加免疫が、ＣＴ２６腫瘍細胞の投与に対する生存を増加させたことを示している。また、この図は、Ａｄ−ｍＭｅｓｏ初回免疫／Ｌｍ−ｍＭｅｓｏ追加免疫がＣＴ２６腫瘍細胞の投与に対して生存時間を増加させたことを示している。空のベクター（空のＡｄ；異種抗原をコードしないＬｍ）による初回免疫／追加免疫の処理は、ＨＢＳＳによる処理と比較して、生存時間に変化がなかった(図９Ｃ）．

［実施例１３］
治験薬（ＣＲＳ−２０７）は、腫瘍抗原メソテリンをコードする細胞内細菌リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）の生の弱毒化株からなる（ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ／ｈＭｅｓｏ）。ＣＲＳ−２０７の投与は、悪性中皮腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および脾臓と卵巣の癌腫などの癌の細胞表面に発現されるメソテリンに対して作られる細胞媒介免疫（ＣＭＩ）を誘発することによって抗腫瘍応答を誘発することを目的とする。ＣＲＳ−２０７は、野生型Ｌｍのゲノムに由来する２つの病原性決定基遺伝子の全コード配列を取り除くことによって得られた。２つの病原性決定基遺伝子、ｉｎｌＢとａｃｔＡの産物は、非食細胞のＬｍ侵襲および細胞間拡散をそれぞれ促進する。これらの２つのコード配列を組み合わせて取り除くことで、マウスにおいて病理性を評価すると、１，０００倍以上の弱毒化をもたらす。しかしながら、マクロファージおよび他の食細胞によるＣＲＳ−２０７の肝臓および脾臓への取り込みは、保持されて、局所炎症反応と活性化をもたらし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を肝臓に動員させる。食細胞（ＤＣおよびマクロファージを含む）によるＣＲＳ−２０７の取り込みの後、メソテリンが発現し、サイトゾルコンパートメントに放出され、続いて内因性ＭＨＣクラスＩの提示経路を介してプロセシングされ、抗メソテリン細胞性免疫（ＣＭＩ）か活性化される。メソテリン特異的ＣＭＩを活性化する他の機序としては、ＣＲＳ−２０７による感染またはアポトーシスの後、マクロファージおよび／または他の細胞型からのＡＰＣによる抗原の取り込みまたは交差提示が挙げられる。

ＣＲＳ−２０７を、高用量および低用量の２種類の濃度で製剤化した。臨床試験で予想される用量範囲の調製を容易にするために、２種類の濃度を選択した。ＣＲＳ−２０７治験薬の製剤については、表１ａおよび１ｂを参照されたい。

−７５℃またはそれ以下で冷凍保存されるＣＲＳ−２０７。ＣＲＳ−２０７は、１．５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）および９％ｖ／ｖのグリセロール中に懸濁した弱毒化Ｌｍからなる。各高用量バイアルは、５×１０^１０ｃｆｕ／ｍＬの濃度であり、および各低用量バイアルは、１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの濃度である。

標準的治療が効を奏さなかった、または標準的治療の志願者ではなかった、卵巣もしくは膵臓の進行癌、非肺小細胞癌または悪性中皮腫癌のヒト被験者（１８歳以上）にＣＲＳ−２０７を送達した。被験者は、本研究の登録のため以下の試験対象患者基準のすべてを満たしていた：
組織学的に、または細胞学的に実証された悪性中皮腫、膵臓の腺癌、またはメソテリン発現非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）または標準治療が効を奏さないもしくは標準的治療の志願者ではない卵巣癌
ＥＣＯＧパフォーマンススコアがが０〜１またはカルノフスキーパフォーマンスステータス（ＫＰＳ）が８０％〜１００％
予想される平均余命が本研究の持続期間よりも大きい
妊娠の可能性のある女性被験者およびすべての男性被験者は、本研究の全期間にわたり、およびＣＲＳ２０７の投与から２８日間、極めて有効な医学的に許容される方法（経口ホルモン避妊薬、コンドーム＋殺***薬またはホルモンインプラント）を用いることに同意しなければならない。他の方法に関わらず、避妊のバリアー法は含まれなければならない。
被験者はインフォームドコンセントを提出して、すべての検査処置に自発的に応じ、および該検査処置に応じることができる。
適切な臓器機能は、以下の通りに定義される：
血液系
血小板≧１００×１０^９／Ｌ
ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ
総ＷＢＣ数≧３．５×１０^９／Ｌ
ANC ≧１．５×１０^９／Ｌ
総リンパ球数＞０．８×１０^９／Ｌ
ＰＴ／ＩＮＲおよびＰＴＴ≦１．３×臨床検査ＵＬＮ
肝臓
ビリルビン≦１．５×臨床検査ＵＬＮ
ＡＳＴおよびＡＬＴ≦２．５×臨床検査ＵＬＮ（≦３．５×臨床検査ＵＬＮは、膵臓腺癌患者に受け入れられる）
ＧＧＴ≦５×臨床検査ＵＬＮ
アルカリホスファターゼ≦２．５×臨床検査ＵＬＮ
腎臓
血清クレアチニン＜１．５×臨床検査ＵＬＮ

加えて、被験者は以下の除外基準のいずれも有してはならない：
中枢神経系にへの既知の転移。
リステリア症の病歴またはリステリアベースのワクチンによるワクチン接種。
ペニシリンに対する既知のアレルギー。
臨床的に重大な心臓疾患（抑制されないアンギナ、３ヵ月以内の心筋梗塞、ニューヨーク心臓協会ＩＩＩまたはＩＶのうっ血性心不全）。
ＡＨＡガイドラインに一致する、心内膜炎の予防のために抗生物質の予防的投与を必要とする心臓弁膜症の個人（ＤａｊａｎｉらＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９９）。
パルスオキシメータで測定する場合、室内空気のＯ２飽和＜９２％。
病歴および健康診断に基づいて、肺機能不全を有すると疑われたことがあるまたは疑われている研究被験者は、ＶＣ、ＤＬＣＯおよびＦＥＶ１が予想される値の＞６０％を実証しない限り研究の参加に適格でない。
全身治療を必要とする活性な、臨床的に重大な自己免疫疾患または自己免疫疾患の病歴。
ＣＴＣＡＥ臨床代謝／検査異常値グレード３または４に相当する臨床検査結果。
肝硬変または臨床的に関連のある腹水または閉塞性黄疸のかなりのリスクがある個人（例えば、肝門部腫瘤の圧迫によって）。
容易に摘出することができない人工（補綴）関節または他の人工移植物または装置。
移植物の感染症の病歴および移植物と関連した臨床的に重大な有害事象がない場合、歯科インプラントおよび豊胸術は許される。
既知の凝固障害または抗凝固薬の投与。
ひと月に２回以上頻繁に定期的な輸血を必要とする患者。
白血球減少および放射線療法を受けている場合を除き、研究参加から１４日以内の輸血。
いずれの免疫不全症または免疫不全の状態（例えば、免疫抑制剤の使用；
ＣＲＳ１０７の投与前の２８日以内、またはＣＲＳ２０７の投与後２８日以内の予定された化学療法または放射線療法）。
２日間以上の、ＣＲＳ２０７の投与前の２８日以内の、またはＣＲＳ２０７投与から研究期間内に予定した、全身的に活性なステロイドの使用。
ＣＲＳ２０７の投与から１４日以内のいずれの全身的なステロイドの使用。
妊娠している、または授乳中である女性被験者。
妊娠の可能性のある女性被験者は、陰性β−ｈＣＧテスト（血清または尿）を受けなければならない。
アルコール依存症の病歴または研究方法または要件の順守を潜在的に妨げる違法薬物の使用（例えば、オピオイド、コカイン、アンフェタミン、幻覚剤など）。

被験者に、ＣＲＳ２０７を２時間にわたり静脈内に投与することで処置した。用量は、以下の表に示すように、各連続的な用量群ごとに増やした：
用量コホート 用量（ｃｆｕ）
１ １×１０^８
２ １×１０^９
３ １×１０^１０
４ ３×１０^１０
本研究の一部である用量の増加期間中、ＣＲＳ−２０７は、２１日の投与間隔で投与される。

被験者は、ＣＲＳ２０７による最初の投薬から＞１５ヵ月の生存期間を有する被験者と、ＣＲＳ２０７による最初の投薬から＜１５ヵ月の生存期間を有する被験者とにグループ化した。以下の表は、これらの２つの群における人口統計学を表す：

［0160］生存期間は、ＣＲＳ２０７が補助薬物療法であった被験者において改善された：

第ＩＩ相臨床試験で、以前にＧＶＡＸ(登録商標）（ＣＥＬＬ ＧＥＮＥＳＹＳ，ＩＮＣ．）を投与された被験者において、生存は、後にＣＲＳ２０７を送達することによって改善した。

当業者が容易に認識することは、本発明は、目的を実施して、記載される目標および利点、ならびに本発明に特有のものを得るために本発明が十分に適応していることである。本明細書に示した実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本発明は、当業者がそれを作製して使用するために十分に詳細に記述され、かつ例示されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更、修飾および改良が明白であろう。本明細書に示した実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例中の修飾および他の用途を当業者は思いつくであろう。これらの修飾は、本発明の精神の範囲内に含まれ、かつ特許請求の範囲によって定義されている。

本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な置換および修飾が本明細書に開示される本発明になされ得ることは、当業者にとって容易に明らかとなろう。

本明細書に記述したすべての特許と刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを表している。あたかも個々の刊行物が参照によって組み込まれることが具体的に、かつ個々に示されているかのように、すべての特許および刊行物は同じ程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書に説明的に記述した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない、いずれのエレメントもしくは複数のエレメント、限定もしくは複数の限定がない場合でも、実施され得る。したがって、例えば、本明細書の各例では、用語「含む」、「実質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。使用した用語および表現は、説明の用語として用いており、限定するものではない。そのような用語および表現の使用において、表示しかつ記述した特徴またはその部分のいかなる当等物も除外することを意図しておらず、種々の修飾は、主張する本発明の範囲内にあり得ることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてはいるが、本明細書に開示する概念の修飾および変形は当業者にとって、または当業者によって頼られ得る、およびそのような修飾および変形は添付した特許請求の範囲に定義されるように、本発明の範囲内と考えられることを理解すべきである。

その他の実施形態は以下の特許請求の範囲に記載する。

Claims (12)

1. 膵臓癌又は非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患っている哺乳類の治療において使用するための、
   （ａ）癌抗原のすべてまたは一部を発現するヒト細胞株由来の細胞の組成物であって、前記細胞が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を産生して分泌するように組み換え修飾されており、かつ前記細胞が***しないように修飾されている、細胞の組成物、および、
   （ｂ）メソテリンの発現可能な免疫学的に活性の部分をコードする、弱毒化された、代謝的に活性なリステリア、
   の組み合わせであって、前記リステリアは前記細胞の組成物の投与の後に投与されることを特徴とする、組み合わせ。
2. 前記リステリアによって発現される癌抗原がメソテリンである、請求項１に記載の組み合わせ。
3. 前記リステリアがΔａｃｔＡΔｉｎｌＢである、請求項１に記載の組み合わせ。
4. 前記リステリアは死滅しているが、代謝的に活性である（「ＫＢＭＡ」）、請求項１に記載の組み合わせ。
5. 膵臓癌又は非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患っている哺乳類の補助薬物療法を用いた癌治療において使用するための、癌抗原の発現可能な免疫学的に活性の部分をコードする弱毒化された、代謝的に活性なリステリアを含有する医薬組成物であって、前記哺乳類は、癌抗原を発現する癌細胞を除去または死滅させるために、前記哺乳類に施される放射線療法の前にもしくは後に補助薬物療法として前記医薬組成物を用いて治療され、ここで前記癌抗原はメソテリンのすべてまたは一部であることを特徴とする、医薬組成物。
6. 前記哺乳類は、前記補助薬物療法の前に放射線療法を既に受けている哺乳類である、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記補助薬物療法は、前記リステリアを複数回の投与で投与することを含む、請求項５〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記リステリアがＡｃｔＡを不活性化する変異を有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記リステリアがＩｎｌＢを不活性化する変異を有する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記リステリアがΔａｃｔＡΔｉｎｌＢである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記リステリアは死滅しているが、代謝的に活性である（「ＫＢＭＡ」）、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記哺乳類が、前記癌抗原のすべてまたは一部を発現するヒト細胞株由来の細胞をあらかじめ投与されており、前記細胞が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を産生して分泌するように組み換え修飾されており、かつ前記細胞が***しないように修飾されている、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
    

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