JP5972793B2 - タンパク質ディスプレイ - Google Patents
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Description
a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、
b)細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドおよびポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは透過化された細菌細胞の内部に保持され、
c)透過化された細菌細胞を標的分子と接触させて、該標的分子を透過化された細菌細胞中に拡散させ、そして
d)ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、細菌細胞壁に付着させ、
b)細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞内部に保持される、
c)透過化された細菌細胞を標的分子と接触させ、そして
d)ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
i)ポリペプチドが標的分子に結合するかどうか、および/もしくは標的分子に結合する程度を決定すること、ならびに/または
ii)ポリペプチドが標的分子を酵素的に修飾するかどうか、および/もしくは標的分子の酵素修飾率を決定する
ことを含む。
したがって、本発明は、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって:
a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、
b)細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドおよびポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは透過化された細菌細胞の内部に保持され、
c)透過化された細菌細胞を標的分子と接触させて、該標的分子を透過化された細菌細胞中に拡散させ、そして
d)ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
本発明はさらに、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって:
a)ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、細菌細胞壁に付着させ、
b)細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞内部に保持される、
c)透過化された細菌細胞を標的分子と接触させ、そして
d)ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
i)タンパク質複合体が透過化された細菌細胞壁の内部に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド;
ii)DNA結合タンパク質;および/または
iii)細菌細胞壁結合タンパク質
から選択することができる。
i)LB中約0.5%のn−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド(8TGP)、および
ii)LB中約0.5%のデカノイル−N−メチルグルカミド(Mega10)および約0.5%のジメチルオクチルホスフィンオキシド(Apo8)
から選択される溶液中で実施される。
所望の活性を有するポリペプチドを同定するための方法であって:
a)本発明の方法を用いてポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすること;および
b)所望の活性を有する1以上のポリペプチドを選択すること
を含む方法を提供する。
本発明はさらに、透過化された細胞膜を含むグラム陰性菌細胞を提供し、細菌細胞が、第2ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する外因性ポリペプチドを含む。
本発明はさらに、透過化された細胞膜を含むグラム陰性菌細胞を提供し、細菌細胞が、細菌細胞壁に付着した外因性ポリペプチドを含む。
a)i)第1ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入するための部位、および
ii)第1ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する、第2ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレーム
を含むベクター、ならびに
b)細菌細胞を透過化することができる薬剤
を含むキットを提供する。
a)i)第1ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入するための部位、および
ii)第1ポリペプチドと結合して、細菌細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第2ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレーム
を含むベクター、ならびに
b)細菌細胞を透過化することができる薬剤
を含むキットを提供する。
本発明はさらに、
a)i)ベクターに第1ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを挿入するための部位と、
ii)第1ポリペプチドと結合して、透過化された細胞壁を含むグラム陰性菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する第2ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームと
を含むベクターと、
b)グラム陰性菌細胞を透過化することができる薬剤と
を含むキットを提供する。
本発明はさらに、
a)i)ベクターに第1ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを挿入するための部位と、
ii)第1ポリペプチドと結合して、グラム陰性菌細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第2ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームであって、グラム陰性菌細胞が、透過化された細胞膜を含むオープンリーディングフレームと
を含むベクターと、
b)グラム陰性菌細胞を透過化することができる薬剤
を含むキットを提供する。
配列番号1 pAra3::His6::SNAPアラビノースベクターのヌクレオチド配列
配列番号2 pAra3::His6::KzPG::SNAP::DBPベクターのヌクレオチド配列
配列番号3 pAra3::OmpF::SNAP::LPPベクターのヌクレオチド配列
配列番号4 pAra3::αGFP(R35)::HALO::FLAG::RhnAベクターのヌクレオチド配列
配列番号5 ランダム化ペプチドスペーサードメイン
配列番号6〜12 ペプチドリンカースペーサー
配列番号13 I27::RL6::KzPG::SNAP::DBP
配列番号14 I27::RL6::KzPG::SNAP::DBPコーディング配列
配列番号15 ライブラリスカフォールドベクター
配列番号16 I27スペーサー
別段の明確な規定がない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、(たとえば、タンパク質化学、生化学,細胞培養、分子遺伝学、微生物学、および免疫学の)当業者により通常理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
本発明の方法では、細菌細胞を透過化し、かくして可溶性細胞成分の少なくとも一部を、細胞壁を通して拡散させる。所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは、細菌細胞壁内に保持されるか、または細菌細胞壁に付着する。本明細書中で用いられる場合、「透過化された細菌細胞」とは、1以上細胞膜中に孔を生成させるか、または細胞膜を可溶化し、一方、ペプチドグリカン間の結合を加水分解せず、それにより細胞壁をインタクトのままで保持する透過化剤の使用を指す。細菌細胞を透過化する薬剤の非限定的例としては、界面活性剤および有機溶媒が挙げられる。透過化は、有利には、小〜中程度のサイズのタンパク質、たとえば120kDaまで、または同等以下のサイズの他の分子がインタクトなままの細胞カプセル中に侵入させる。さらに、細菌細胞壁の完全性を維持することにより、透過化された細菌細胞は、従来法で、たとえば細菌細胞をTris−EDTA−リゾチームで処理することにより産生されるスフェロプラストほど脆弱ではなく、スフェロプラストでは、細菌細胞壁が少なくとも部分的に加水分解されている。本発明の方法で産生される透過化された細菌細胞は、蛍光活性化細胞分類(FACS)などの技術によく適しており、一方、スフェロプラストは高剪断フローサイトメトリー環境により損なわれ、制御された浸透圧条件を必要とし、したがってそれらの潜在的使用が限定される。
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを、細菌細胞における発現の好適なベクター中にクローンすることができる。「ベクター」は本明細書中で用いられる場合、細菌細胞を形質転換するために好適であることが当該技術分野で知られている任意のベクターを指す。好ましくは、ベクターはまた、宿主のゲノムから独立して、細菌細胞内で複製することができる。ベクターとしては、プラスミド、ウイルスおよびコスミドならびに線状DNAエレメント、例えば大腸菌の線状ファージN15、および/または細菌細胞ゲノムから独立して複製する染色体外DNAが挙げられる。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを少なくとも第2ポリペプチドと結合させて、タンパク質複合体が透過化された細菌細胞の内部に保持されるような分子サイズを有するタンパク質複合体を形成することができる。ポリペプチドをたとえば、ジスルフィド架橋などの共有結合によるか、または非共有結合により、第2ポリペプチドと結合させることができる。「非共有結合」とは、原子間結合が関与しない分子相互作用を指す。たとえば、非共有相互作用は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、およびファンデルワールス力が関与する。非共有結合力を用いて、別個のポリペプチド鎖をタンパク質またはタンパク質複合体中に一緒に保持することができる。したがって、ポリペプチドおよび第2ポリペプチドを同じかもしくは異なるベクターのいずれかから別のポリペプチドとして発現することができるか、またはポリペプチドの一方もしくは両方を、細菌細胞ゲノム中に組み入れられたポリペプチドをコード化するDNAから発現することができる。
第2ポリペプチドは、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドで形成された複合体の少なくともいくつかが、透過化された細菌細胞から拡散することができないような十分な分子サイズ、すなわち十分な分子量または分子半径を有する任意のポリペプチドであり得る。したがって、タンパク質複合体は、細胞の透過化後に細菌細胞内に保持される。当業者は、その分子量および球状または桿状(糸状)タンパク質であるかどうかをはじめとする第2ポリペプチドの性質が、細菌細胞壁を通るタンパク質複合体の拡散を防止または阻害するその能力を決定することを理解するであろう。1つの実施形態において、第2ポリペプチドの分子量は、少なくとも約30kDa、または少なくとも約40、50、60、70、80、90、100、120、130、140、150kDaもしくはそれ以上である。1つの実施形態において、第2ポリペプチドは少なくとも約120kDaである。
本発明者は、透過化後の細菌細胞内にDNAが保持されることを見出した。したがって、1つの実施形態において、ポリペプチドをDNA結合タンパク質と結合させて、タンパク質複合体を形成し、これはDNAと結合し、細菌細胞の内部に保持される。本明細書中で用いられる場合、「DNA結合タンパク質」とは、2本鎖または1本鎖DNAを認識する少なくとも1つのモチーフを含むDNA結合ドメインを含む任意のタンパク質を指す。当業者には知られているように、DNA結合ドメインは、ヘリックス・ターン・ヘリックス、亜鉛フィンガー、ロイシンジッパー、翼状ヘリックス、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、DNAを認識する免疫グロブリンフォールド、またはB3ドメインを含む。ポリペプチドをDNA結合タンパク質と結合することによって、有利には、本発明のスクリーニング法においてポリペプチドをコード化するプラスミドなどのDNAの回収が増大する。
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを、細菌細胞壁結合タンパク質と結合させることができる。当業者は、細胞壁結合タンパク質の選択が宿主細胞種に依存することを理解するであろう。なぜなら、異なる細菌は異なる細胞壁組成を有するからである。細菌はペプチドグリカン(PG)から構成される細胞壁を有するが、種間の化学修飾は、異種間結合に影響を及ぼし得る。当業者は、特定の細菌種における使用に好適な細胞壁結合タンパク質を容易に決定することができるであろう。
1つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを、1以上スペーサーを含む融合ポリペプチドとして発現することができる。「スペーサー」は、本明細書中で用いられる場合、融合ポリペプチド中に含まれて、細菌細胞におけるポリペプチドの発現を増強するか、または立体障害を減少させて、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドがその所望の三次構造をとることができ、および/またはその標的分子と適切に相互作用することができるペプチドまたはポリペプチドを指す。したがって、融合タンパク質は、融合ポリペプチド中の1以上のポリペプチドドメインの前、後、または間に1以上スペーサーを含み得る。スペーサーおよび所望のスペーサーの同定方法については、たとえば、George, et al. (2003)を参照のこと。
本発明は、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。本明細書中で用いられる場合、「所望の活性」という用語は、ポリペプチドの任意の潜在的に有用な活性を指し、これらに限定されるものではないが、結合、酵素修飾、フォールディング安定性および/または熱安定性を包含する。
1つの実施形態において、本発明の方法を、たとえば抗体などの結合タンパク質の発生に適用することができる。したがって、1つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは結合タンパク質であり、標的分子は、結合タンパク質が結合することができる任意の分子であり、所望の活性は、標的分子に対する結合、および/または結合の程度である。本発明の方法は、たとえば、結合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、細胞においてタンパク質を産生することを含み得る。細胞を続いて透過化し、透過化された細胞を標的分子と接触させる。当該技術分野における任意の好適な方法を、ポリペプチドが標的分子と結合するかどうか、および/または標的分子と結合する程度を決定するために用いることができる。
本発明の方法は、酵素および酵素ライブラリーのディスプレイのため、そして酵素特性の発生のために用いることができる。したがって、1つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは酵素であり、標的分子は酵素の基質であり、所望の活性は標的分子に対する結合および/または標的分子の酵素修飾である。当業者は、他の表面ディスプレイ技術を用いる酵素活性に関してのアッセイを開発するための方法を、本発明の方法に対するアッセイと同等に適用することができることを理解するであろう。
本発明の細胞ディスプレイ技術は、関心対象のポリペプチドの数千もの分子を一度に提示することができ、リボソーム/mRNAディスプレイまたはファージディスプレイなどの分子ディスプレイ技術と異なり、フローサイトメトリー技術を用いて、たとえば蛍光活性化細胞分類(FACS)機械を用いてスクリーニングすることができる。ライブラリーにおける陽性事象をとらえることができるだけでなく、酵素活性または親和性などのパラメーターを各陽性メンバーについて同時に定義することができ、これによりスクリーンのアウトプットを改善することができる。フローサイトメトリーを実施するための機器は当該技術分野で公知であり、FACS Star Plus、FACScanおよびFACSort(Becton Dickinson)、Epics C、ならびにMoFloが挙げられる。フローサイトメトリー技術は、一般的に、液体試料中の細胞の分離を含む。典型的には、FACSの目的は、1以上の特性、たとえば、標的分子の存在について細胞を分析することである。フローサイトメトリー分析を実施するための方法は、当該技術分野で周知である。たとえば、酵素活性を分析するためのFACSの使用法の概説は、Farinas(2006)により記載されている。
本発明の方法の実施に必要な成分は、キットの形態で都合良く提供することができる。当業者には理解されるように、キット中の種々の成分は、個々の容器中もしくはアリコートで供給することができるか、または溶液成分を異なる組み合わせ、異なる濃度で組み合わせて、本発明の方法の最適な実施を達成することができる。使用するまで成分が安定な形態で維持されるように、キットのどの成分を組み合わせることができるかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。
大腸菌細胞を透過性にするであろう、界面活性剤を同定するため、イオン性(n−ドデシル−β−イミノジプロピオン酸;デシルトリメチルアンモニウムクロライド;ドデカノイルサルコシンナトリウム;アンゼルゲント3−10)、および非イオン性(ジメチルオクチルホスフィンオキシド[Apo8];ジメチルデシルホスフィンオキシド;n−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド[8TGP];スクロースモノドデカノアート;メガ(Mega)10;トウィーン(Tween)80;トリトン(Triton)X100;トリトン(Triton)X114)の両方の多くの界面活性剤を、膜−不透過性色素、ゲルレッド(Gel Red)(Biotium社、カタログ番号41002)の取り込み、およびGFPの遊離の両方によってスクリーニングした。透過処理のテストを行った界面活性剤は、Anatraceから購入した。
ここに述べる実験に用いた大腸菌宿主株は、全てK12由来のArgentum細胞株(ΔmcrAΔ(mrr−hsdRMS−mcrBC)ΔendA lacZΔM15)(Alchemy Biosciences社)であった。しかしながら、本発明の方法は、B株由来のBL21(F−dcm ompT hsdS(rB−mB−)gal)、およびK12クローン株DH5α(F−endA1 glnV44 thi−1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA−argF)U169,hsdR17(rK −mK +),λ−)を用いてもテストを行い、同様な結果を得た。
GFPを、アラビノース誘導性の高コピー数ベクター(pAra1::GFP5)にクローン化した。発現は、新たに画線したコロニーを含むシャーレから重度に播種した培養液より行った。培養液は、37°Cで、アラビノースを最終濃度0.2%になるまで添加して発現を誘導するときに、OD600が約0.3となるまで培養した。誘導された培養液は、収穫まで25°Cで2時間振盪した。
1mLの誘導培養液を遠心分離して細胞を沈殿させ、300μLの0.5%界面活性剤含有LB中に懸濁して透過性にした後、25°Cで10分間培養した。透過性にした細胞は、沈澱させ、再懸濁し1xゲルレッド(Gel Red)を含む水に再懸濁し2分間置き、その後沈澱させ300μLのTBSで1度洗浄した。細胞は、300μLのTBSに懸濁し、蛍光顕微鏡検査のために、DABCO/グリセリン(0.0325gのDABCOを900μLのグリセリン+100μLのPBS中に溶解)を加えて処理した。
サンプルは、スライド式カメラ(SPOT RT 2.3.0ソフトウェアv4.6)を用いたオリンパスProvis AX70光学顕微鏡、またはLeica TCS SP2共焦点レーザ走査顕微鏡/Leica DM IRE2倒立顕微鏡(Leica共焦点ソフトウェアv2.0)のいずれかにより可視化した。
図1は、界面活性剤によるGFP発現大腸菌の透過処理の結果を示す。未処理細胞は緑色(GFP)であるが、透過性にされた細胞は、内部のGFPを失い、DNA結合性ゲルレッド(Gel Red)色素を取り込み赤色に染色される。また、ノニデット−40もいくらか透過性化を示すが、Apo8とMega10は、より高い割合の透過化された細胞を示す。これら2種の界面活性剤の0.5%ずつの混合物は、剤86と呼ばれ、別の界面活性剤n-オクチル−β−D-チオグルコピラノシド(8TGP)と同様に、ほとんど完全に透過処理することを示した。Mega10、Apo8および8TGPは、すべて非イオン性界面活性剤で、イオン性界面活性剤と比べ、タンパク質の折りたたみや機能に対して、破壊の程度が低い。
細胞壁は、透過処理によっても無傷であったので、上述した界面活性剤での透過処理による上澄みの可溶性タンパク質の抽出物をSDS−PAGEにより分析した。透過処理した細胞に、ニワトリ卵白リゾチーム(Boehringer Mannheim社;837 059)を最終濃度2mg/mLまで、透過処理している細胞のサンプルに加え、細胞壁を除去し、全細胞タンパク質を遊離させた。β−メルカプトエタノールを含むSDS−PAGEローディング色素を、95°Cで2分間変性したサンプルに加えた。20μLのサンプルを9%SDS−PAGEにロードし、クーマシー・ブリリアント・ブルー/メタノール/酢酸で染色/固定した。
図2は、可溶性タンパク質の遊離は、顕微鏡検査で見られたGFPの遊離およびGel Redの取り込みと直接的に関連していることを示す。無傷な細胞壁を有する細胞からのタンパク質の遊離と、リゾチームを用いて細胞壁を除去した細胞からのそれとの間には、明白に差があったが、細胞壁に被包された細胞が遊離する可溶性タンパク質は、大きさが約120kDまでであった。これは、球状タンパク質が、グラム陰性真正細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカン格子の細孔を通って、細胞から出ることができなくなる限界寸法であると思われる。
本発明の方法を、改良された特性のタンパク質変異体を求めて遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに使用するなら、発現されるタンパク質と、それをコードする核酸との間に関連がなければならない。膜の透過処理工程で、DNAが、細胞壁を通って失われるのを防ぐ障壁が除去されるので、宿主DNAの損失を減少し、あるいは防止しうる、透過処理の条件を調べた。
細胞の透過処理を、0.5%8TGPを用い異なる培地中で行い、DNAの損失を、DNA結合色素、Gel Redを用い、蛍光顕微鏡検査法により調べた。
LB培地(10gトリプトン、5g酵母抽出物、10g/LのNaCl)
LB(塩)培地(10gトリプトン、5g/Lの酵母抽出物)
50mM−Tris、pH7.5
50mM−HEPES、pH7.0
170mM−NaCl
250mM−NaCl
25mM−Tris、pH7.5+1.5%PEG6000(w/v)
50mM−Tris、pH7.5+3%PEG6000(w/v)
50mM−Tris、pH7.5+170mM−NaCl
50mM−Tris、pH7.5+250mM−NaCl
好適な透過処理培地は、LB細菌培地と確認された。したがって、以降、透過処理は、0.5%8TGPを含むLBまたは剤86を含むLB(0.5%Mega10および0.5%Apo8を含むLB)のいずれかを用いて行った。
例1に記述した実験で見られたとおり、大きさが約120kDより大きいタンパク質は、細胞壁により、透過性にした大腸菌細胞の内部に保持された。したがって、120kDより小さい目的タンパク質も、タンパク質パ−トナーと融合することで合計寸法が120kDを超えるようにできれば、細胞壁カプセル中に保持されるだろうと考えられた。
このため、融合パートナーとして用いるため、大腸菌から6種の異なる四量体タンパク質をクローン化した。すなわち、β−gal、BetB、G5K、GshB、RhnA、およびYdcWで、それぞれのモノマー寸法は116kD、52kD、39kD、35kD、47kDおよび50kDであった。
アラビノース誘導性高コピー数ベクターを、四量体発現のために構築した。蛍光性基質と共有結合で結合する20kD領域であるSNAPタグ(NEB社/Covalys)が、テトラマー遺伝子の上流にクローン化され、発現レポーターとして使用された。精製と検知を容易にするため、6xHisエピトープも、融合タンパク質のN末端に挿入された。
前記アラビノースベクターpAra3::His6::SNAPの配列が、SEQ ID NO:1(配列番号)として示される。
融合タンパク質の発現は、0.2%アラビノースを加えて誘導し、培養液を25°Cで2時間培養した。
本発明の方法により、蛋白質ディスプレイのために細胞を透過性にするプロトコルは、以下のとおりであった:
1. 遠心分離により細胞1mLを沈澱させる。
2. 300μLの0.5%8TGP/LBに細胞を再懸濁する。
3. 25°Cで10分間培養する。
4. 遠心分離により細胞を沈澱させる。
5. 200μLのTBSまたはLBに細胞を再懸濁する。
1. 20nmolのBG−488(緑色色素)またはBG−547(赤色色素)を、300μLのDMSOに200x原液として溶解する。
2. 1μLの200x原液を200μLの透過性にした細胞を懸濁したTBSまたはLBに加える。
3. 25°Cで15分間培養する。
4. 遠心分離により沈澱させ、また300μLのTBSに再懸濁させて、細胞を2度洗浄する。
1. 20μLの細胞懸濁液を顕微鏡用スライドガラス上に滴下し、カバーガラスで覆い、端部をマニキュア液でシールする(湿式プレパラート);あるいは細胞の液滴をほぼ乾燥させて、その上に20μLのDABCO/グリセリンを滴下し、カバーガラスで覆い、端部をマニキュア液でシールする(乾式プレパラート)。
2. オリンパスまたはLeica蛍光顕微鏡のいずれかを用いて可視化する。
大腸菌内で発現した四量体融合タンパク質の蛍光顕微鏡検査によれば、β−galおよびG5Kは、顕著な封入体を含み、恐らく前記融合タンパク質の折りたたみが困難であるために、蛍光レベルが低いことが分かった。しかしながら、図4によれば、SNAP蛍光により判定されるとおり、前記融合タンパク質の発現は、GshBでは良好、RhnA、BetBおよびYdcWでは、極めて良好であった。透過性にした宿主細胞中の融合タンパク質の分布は、明視野顕微鏡検査および蛍光の両方から明らかなように複数のフォーカスを有し、均一でないことが注目された。しかし、蛍光性SNAP基質は、ミスフォールドされた領域には結合されていないであろうから、かつ信号が非常に強いことから、これらの物体は恐らく折り畳まれたタンパク質の凝集体であって、大腸菌中で過剰発現しているタンパク質においてしばしばみられる、折り畳まれていないタンパク質の封入体ではないと考えられる。
SNAP::テトラマー融合体は、His6-N末端エピトープをまた有していた。抗体といった大きな分子が、大腸菌細胞壁の格子構造を通り抜けられるかを調べるため、透過性にした細胞にSNAP::テトラマー融合体を検出するαHis抗体をプローブとして設けた。
1. 前記His6::SNAP::BetB骨格融合体の発現および透過処理を上述のように実施した。
2. BG−547 SNAPリガンドによる標識化を上述のように実施した。
3. 200μLの透過性にしたSNAP−標識化細胞をLB中で3回洗浄し、ポリエチレンイミン(PEI)コートしたカバーガラス上に沈降させた。過剰な細胞培地を、吸引して除去し、前記スライドガラスを風乾させた。
4. 細胞を、ブロッキング緩衝液(1%BSA、1%冷水魚ゼラチン(Sigma社、G7765)、アジドの0.02%PBS−Tween20溶液)中で、1時間ブロックした。
5. 細胞を、ブロッキング緩衝液で1:10に希釈したαHis一次抗体(Abcam社、AB9136−100)中で、一晩25°Cで培養した。
6. 細胞を3回PBS−Tween20中で洗浄した(各回10分間)。
7. 細胞を、ブロッキング緩衝液で1:2,000に希釈した二次抗体(Molecular Probes、A11015)中、室温1時間培養した。
8. 細胞を3回PBS−Tween20中で洗浄した。
9. DABCO/グリセリンを封入剤に用い、共焦点オリンパス顕微鏡で観察した。
細胞下物体の生成が変化するか否かを見るためにSNAP融合パートナーおよび発現レポーターをHALOタンパク質(Promega社)と比較した。前記HALOタンパク質は、SNAPと同様に膜不透過性蛍光性基質(Alexa fluor 488;G1001、Promega社)と共有結合で結合する。HALOレポーター遺伝子は、四量体発現コンストラクト中のSNAP遺伝子の位置にインフレームに直接クローン化した。HALO::四量体骨格タンパク質の発現を、SNAP変異体と比較した。透過性にしたHALO細胞の標識付けは、実質的にSNAPに対して記述したように、またメーカーの説明書に従い実施した。図6は、HALO::テトラマーおよびSNAP::テトラマーの発現パターンは、同様であったが、例外的にHALO::RhnA融合タンパク質は、部分的にSNAP::RhnA融合体より溶解性で、複数の蛍光フォーカスを有する細胞がより少数であったことを示す。
したがって、タンパク質を四量体骨格(ここでは、SNAPまたはHALO)への融合体として発現させ、つづいて大腸菌宿主細胞を適当な界面活性剤で透過性にすると、目的のタンパク質が、細胞壁の内側に保持できる。
表現型を遺伝子型に結合するには、宿主細胞は、透過処理の後、また機能スクリーニングを通して、少なくともいくらかのエピソームDNAを保持しなければならない。宿主ゲノムのDNAならびにプラスミドDNAを保持する透過処理条件を見出したことで、発現した目的のタンパク質の保持骨格としてDNAが使用できると結論付けた。
このため、小型(80aa)の高親和性らせん−ヘアピン−らせんDNA結合タンパク質(DBP)を、Neisseria gonorrhoeae ComE遺伝子(ChenおよびGotschlich、2001)からクローン化し、これをアラビノース誘導性コンストラクト(pAra3::GFP::DBP;seq2)中で、GFPのC末端に融合した。
アラビノース誘導による発現を例1に記述したように実施した。細胞を透過性にし、例1および3に記述したように蛍光顕微鏡検査のために調製した。
図7は、GFP::DBP融合体(緑色)が透過性にした細胞中に保持され、DNA結合色素、Gel Red(赤色)と共存したことを示す。
したがって、タンパク質を、高親和性、非特異的DNA結合タンパク質への融合体として発現させ、つづいて大腸菌宿主細胞を適当な界面活性剤で透過性にすると、目的のタンパク質が、細胞カプセルの内側に保持できる。
DNA、ゲノムおよびエピソーム両方のプラスミドの、透過性にした細胞カプセル中への保持を実証するため、蛍光顕微鏡検査およびプラスミドDNA抽出のためにGFP5::DBPおよびHis6::eGFPを発現する細胞を調製した。
誘導後、細胞を透過性にし、つづいて凍結するか、TBS中で37°Cにおいて一晩振盪した。次の日、全サンプルを、蛍光顕微鏡検査でGFP、およびDNA結合色素Gel RedでカプセルDNA含量を見るために、または、プラスミドDNA調製のために処理した。
蛍光顕微鏡検査を例3に対して記述したように実施した。図8は、宿主細胞DNA(赤色)およびGFP5::DBP(緑色)双方とも、細胞カプセル中に、透過処理直後も、一晩37°Cで培養しても目立った減少もなく、保持されたことを示す。His6::GFP タンパク質は、透過処理直後に失われたが、宿主細胞DNA(赤色)は、透過処理直後も、一晩後も、同じく目立った減少もなく、保持された。
宿主ゲノムだけでなくプラスミドDNAも透過性にした細胞内に保持されることを確認するため、同じように調製されたサンプルに対してプラスミド少量調製を行った。
1mLの界面活性剤処理または無処理細胞から、プラスミド少量調製アルカリ溶解プロトコルによりプラスミドDNAを調製した。界面活性剤抽出による上澄み中に遊離されたプラスミドDNAを、Perfectprep Gel Cleanup(Eppendorf社、955152051)コレムおよび溶液を、メーカーのプロトコルに従って用いて、抽出した。
各サンプルの全量を1%アガロースゲルにロードし、富士フィルム社LAS−3000インテリジェントダークボックス(Intelligent Darkbox)でイメージリーダー(Image Reader)LAS−3000ソフトウェアおよびMulti Gauge v3.0ソフトウェアを使用して画像化した。
図9は、両細胞株からのプラスミドDNAをサンプルとした、TAE緩衝液を用いた臭化エチジウム染色1%アガロースゲルを示す。
図9のレーン1は、無処理細胞中の全プラスミドDNAである。レーン2は、透過処理工程の上澄み、レーン3は、透過処理後に細胞カプセル中に保持されたプラスミドである。図8で観察された可溶性His6::GFP タンパク質の完全な消失に拘わらず、透過処理による上澄み中へのプラスミド遊離が殆どないことが観測された。したがって、プラスミドDNAは、ほとんど完全に細胞壁により保持され、本発明の方法において改良されたタンパク質変異体の選別のために、遺伝子型を表現型に結合するために使用できる。
顕微鏡検査のデータを確認するように、TBSに懸濁した透過性にした細胞の37°Cでの一晩の培養後も、この培養でのプラスミドDNAの消失は全く見られなかった(レーン5)。
膜透過処理後も保持されるいま一つの細胞構造は、ペプチドグリカン(PG)の格子状ポリマーでなる細胞壁である。
PGを非共有結合で結合するために、大腸菌内で良好に発現し、細胞壁に高親和性(K=3x107M−1)をもって結合することが既に知られている(Briersら、2009)、シュードモナスφKZファージ(KzPG)からの70aaPG結合領域をクローン化した。親和性タンパク質の選別用に、PGに対するKzPG−結合領域の親和性より、より高い親和性を標的に対して有する変異体を見つけるため、骨格結合タンパク質の親和性を増す必要がある。骨格結合部分の親和性を増すため、ComE DNA結合領域(DBD)およびPG結合領域の両方を同一の融合タンパク質内で結合した。したがって、両骨格(PGまたはDNA)からの融合タンパク質の最終解離定数は、それぞれの速度定数の倍数の近似値となる。
このため、発現ベクターpAra3::His6::KzPG::SNAP::DBP(SEQ ID NO:2(配列番号))を構築した。例1に記述したように発現を誘導し、細胞を例3に記述したように蛍光顕微鏡検査のために調製した。融合タンパク質の発現および分布は、例3に記述したようにSNAP標識化により観察した。
蛍光は、細胞の辺縁で、細胞壁の領域において認められ、より軽度には、カプセルの細胞壁で囲まれる空間内の広汎な領域において認められた。
本発明のさらなる態様では、目的のタンパク質を共有結合で、透過処理前の細胞骨格に付着させる。これを実現するため、周辺質内にコイルドコイル三量体を形成する、大腸菌に豊富なタンパク質LPPへのタンパク質融合体を用いた。その天然型においては、1端が脂質化により外膜と連結し、他端はC末端リジンにより共有結合で細胞壁に結合している。
OmpF周辺質標的シグナル配列をSNAP発現レポーターに融合し、さらにN末端シグナル配列を欠く57aa大腸菌LPP配列、外膜付着に必要なシステインが続く発現コンストラクトを構築した。発現ベクター、pAra3::OmpF::SNAP::LPP(SEQ ID NO:3(配列番号))は、例1に記述されるようにアラビノースで誘導され、細胞を蛍光顕微鏡検査のため、例3に記述されるように、調製した。融合タンパク質の発現および分布は、例3に記述したようにSNAP標識化により観察した。
図10が示すように、LPP融合タンパク質の分布は、細胞壁の表面にわたって不均一で、強い蛍光の場所と、蛍光のない場所があった。しかし、ほとんどのケースで細胞の極が、標識化された。
親和性タンパク質に適用する本発明の方法を実証するため、eGFPに対して免疫したラマから生成した単一領域抗体を細胞骨格ベクター中にクローン化した。ここに、αGFP抗体に対する特許出願に(WO2007/068313)挙げられている2配列の内、R35変異体のみが機能することを指摘したい(αGFP−R35;タンパク質データベースID 3K1K)。したがって、この配列を全実験において使用した。
前記αGFP−R35遺伝子を、pAra3::HALO::FLAG::RhnA四量体骨格のN末端融合体として、pAra3::αGFP(R35)::HALO::FLAG::RhnAベクター(SEQ ID NO:4(配列番号))を製作するためクローン化した。
前記抗体の標的基質としてHis6::eGFP融合タンパク質を製造するため、pAra3::His6::eGFPベクターも、構築した。例1に記述されるように、His6::eGFPタンパク質を誘導した。可溶性タンパク質が、0.5%8TGPを用いて細胞から遊離され、Ni−NTAアガロース樹脂(Qiagen社;30230)を用いてIMACにより精製された。His6::eGFPは、Ni−NTA樹脂からNTTW緩衝液+イミダゾール(500mM NaCl、50mM Tris−HCl、pH7.5、0.1%Tween20+200mMイミダゾール)に溶出された。
抗体::四量体融合タンパク質の発現および宿主細胞の透過処理は、例1および3に記述されるように実施した。
透過性にした細胞カプセル内で、αGFPをeGFPに結合するため、カプセル沈殿物を300μLのeGFP中に懸濁し、25°Cで20分間平衡化させてから、カプセルを遠心分離で沈澱させ、300μLのTBS中で1度洗浄した後、TBS中に再懸濁させた。αGFP/eGFPカプセルに対する蛍光顕微鏡検査を、例3に記述されるように、実施した。
図11は、HALOリガンド標識化した図5で観察されるフォーカスと関係があるかもしれない、より強く染色された複数のフォーカスが生じているが、透過性にしたαGFP::HALO::RhnA融合タンパク質を発現しているカプセルが、細胞の全域でeGFPに結合したのを示している。
したがって、ラマαGFP抗体の機能は細胞質内で発現し、さらに界面活性剤透過処理後も、カプセル内に保持される。
例3で記述され、また図5で観察されたαHis抗体の標識化は、すでに約150kDと大きめなタンパク質が、透過性にした細胞壁を拡散して通り、カプセルの内部に入ることができることを実証した。しかし、未変性の抗体は、柔軟なヒンジ領域で分けられた、3つのほぼ同じ大きさの領域を有する変則的な形状のタンパク質である。したがって、これらのタンパク質の示す有効半径は、はるかに小さな球状タンパク質に相応すると思われる。しかし、βバレル構造と約27kDの分子の大きさを有するGFPは、半径がその大きさに比例する、対称性のタンパク質であり、内部のαGFP抗体と結合するために、透過性にしたカプセルの細胞壁を通過することができた。
したがって、本発明の方法は、大腸菌細胞質中で親和性タンパク質を発現して、少なくとも30kDの対称性の標的に結合する親和性ライブラリーのディスプレイに使用できる。
本発明の方法は、PG−およびDNA結合領域と融合したαGFPラクダ抗体を用いてさらに実証された。
抗体::KzPG::SNAP::DBP融合タンパク質の発現、宿主細胞の透過処理、およびHis6::eGFPによる標識付けは、例6に記述されるように実施した。
αGFP融合タンパク質によるeGFPの結合の画像化には、湿式および乾式プレパラートの両方が用いられた。図12は、GFP蛍光において、両方の画像化法で有意な差があったことを示している。乾式プレーパラート(DABCO/グリセリン)にされた細胞は、ほとんどが内部蛍光で、明視野とeGFP標識の間の混合があり、細胞壁の周囲の領域は内部空間より光が強くない(図12B)。しかしながら、TBS中で直接プレパラートにされた細胞は、細胞壁に結合したeGFPと思われる強い蛍光の外部境界のはっきりした形状と、より弱い内部信号を有していた(図12A)。理論に縛られることなく、推測するならば、DABCO/グリセリン溶媒環境は、粘度が高くまた水性でないので、KzPG領域とペプチドグリカン細胞壁の間の相互作用を抑止したが、αGFPのeGFPとの、あるいはDBPのDNAとの結合は抑止しなかった。
しかしながら、親和性タンパク質または酵素のスクリーニング操作は、通常は水系環境で行われるので、親和性融合タンパク質の分布は、図12Aに観測された細胞壁結合湿式プレパラートに近いであろう。
本発明の方法は、αGFP抗体の共有結合による細胞壁への結合によりさらに実証された。
αGFP抗体は、アラビノース誘導性融合体として、OmpFシグナル配列の下流、かつSNAPおよびLPP配列の上流にクローン化された。
アラビノースで発現を誘導した後、OmpFシグナル配列は、新生タンパク質を、内部細胞膜を通して周辺質に送り、これが膜細孔を通るときに***される。
周辺質において、LPP領域は、2つの別のパートナー、野生型LPPまたは他のαGFP融合タンパク質とともに、三量体コイルドコイルを形成すると思われる。LPP領域のC末端の残基はリジンで、共有結合により、εアミン基を介して、恐らくはYbiS L,D−トランスペプチダーゼにより(Magnetら、2007)、大腸菌細胞壁に結合する。
OmpF::αGFP::SNAP::LPP融合タンパク質の発現、細胞透過処理、およびeGFP標識付けは、例8に記述のように実施した。
図13は、eGFPは、細胞壁の周りに不均一に、しかし強力に結合したことを示す(図13B)。eGFPは、OmpF::SNAP::LPP融合体をαGFP領域無しに発現している細胞に結合されなかった(図13A)。
OmpF::SNAP::LPP融合体の細胞壁への共有結合性付着は、最初に、前記融合タンパク質を発現している透過性にした細胞をSNAPリガンドで標識化し、その後標識化細胞カプセルのサンプルを95°Cで5分間加熱して実証した。図14は、細胞壁を標識化するSNAPリガンドからの蛍光は、加熱処理されたサンプルと、加熱されていないコントロールとの間で差が生じなかったことを示す。Gel Red染色でも、加熱処理されたサンプルにおいても、ゲノムDNAは、細胞中に保持され続けることを実証した。
本発明のさらなる態様においては、外膜は、リガンド標的、例えば酵素基質、あるいはポリペプチド等に対して選択的に透過性にしてもよいが、このとき、スクリーンされた前記ポリペプチドは、細胞壁の内部に、あるいはこれに付着して保持される。
外膜を選択的に透過性にする条件を見出すため、一連の界面活性剤および緩衝液を選別した。大型リガンド(eGFP)および小型リガンド(Gel Red)の両方を用いて、外/内膜の透過処理で大きな、または小さな膜細孔が生成したかを調べた。
アラビノース誘導性OmpF::αGFP::SNAP::LPP(細胞壁に付着)またはαGFP::HALO::FLAG::RhnA(細胞質内性)を発現する大腸菌株を培養し、例1に記述されるように誘導した。
誘導された培養液1mLを、50mMのTris(pH8)で1回洗浄し、25mM Tris+1mM EDTA(pH8)または25mM Tris+2mM Ca2+(pH8)のいずれかの中に0.2〜0.4%の界面活性剤をいれた透過処理緩衝液変種中に懸濁し、25℃で10分間培養した。
透過性にした細胞は、適当な緩衝液で1回洗浄してから、Gel Red(1x水中)で染色し、TBSで洗浄した。これを、精製したHis6::eGFPとともに25℃で1時間培養し、遠心分離で沈殿させ、TBS中に再懸濁させ、湿式プレパラートとして蛍光顕微鏡検査法により観察した。
図15及び16は、Tris/Ca2+またはTris/EDTA緩衝液中の0.2%のApo8(A)またはTween20(B)が、外膜を選択的に透過性にし、大きなリガンド(eGFP)に、外膜を通させるが、内膜は通させないことを実証している。より小さな、膜不透過性のDNA結合リガンドGel Redは、大部分のサンプルで、細胞質まで部分的に透過性であって、いくつかの細胞において内膜にある程度の細孔形成が起きたことを示している。しかしながら、0.5%の8TGPまたは剤86である界面活性剤で処理され、外膜、内膜ともにeGFPに対して完全に透過性であるサンプルに比べて、Gel Red結合の程度は著しく減少した。
細胞ディスプレイプラットフォームとして、リガンド結合クローンを識別するのに、本発明の方法は、蛍光標示式細胞選別(FACS)に非常に向いている。透過性にした大腸菌細胞のFACSによる選別での安定性を試験するため、3集団:i)eGFP、ii)αGFP::KzPG::SNAP::DBP、およびiii)His6::SNAP::BetBを誘導して発現させた。
eGFP発現細胞は、透過性にせず、無傷の大腸菌細胞での蛍光のポジティブコントロールとした。αGFP::KzPG::SNAP::DBP発現細胞は、本発明の方法により透過性にし、SNAP BG−488リガンド(緑色)で標識付けした。His6::SNAP::BetB発現細胞は、本発明の方法により透過性にし、SNAP BG−547リガンド(赤色)で標識付けした。
細胞はPBS中に懸濁し、混合集団の選別のために、ほぼ同数を混合し、あるいは信号の較正のため、別々に選別した。細胞選別は、Becton Dickson Influx FACSにより実施した。データ解析は、FlowJoソフトウェアにより実施した。大腸菌選別のためのパラメーターは、操作者が決定した。
図17は、蛍光により3集団が識別できたことを示している。選別された集団の再分析は、前記選別がそれぞれの比較的純粋な集団をもたらすことを示した。グラフの低蛍光領域にある信号は、信号の内部雑音であることが後で判明したので、後に操作者により装置の修正により除去した。
αGFP::KzPG::SNAP::DBP融合タンパク質を発現している細胞を、8TGP培地を用いて透過性にし、中間体His6−タグ化eGFPを経由してHisPur Co2+セファロース・ビーズ(Thermo Scientific社)に結合した。細胞またはビーズは、最初に過剰のHis6−eGFPとともに培養し、TBS中で洗浄し、一緒に25℃で30分間培養した。結合しなかった細胞は、ビーズから洗い流し、つぎに蛍光顕微鏡検査法でビーズの結合の程度を評価した。
最初は、αGFP::KzPG::SNAP::DBP融合タンパク質のセファロース・ビーズへの結合は検知されなかった。αGFP結合領域が、細胞壁に近すぎて、セファロース樹脂上のコバルト錯化eGFPに到達できないためと理論を立てた。このため、ランダムコドンによる12残基ペプチド・スペーサー領域を、αGFP結合領域およびkzPGペプチドグリカン結合領域の間にクローン化した(GGT ACC gcy gcy gkk wtb gck wtb gkk gkk gck gkk gcy gcy GGT CTG(SEQ ID NO:5(配列番号)))。
スペーサー変異体の小型ライブラリー(約2,000要素)を発現し、上述のようにCo2+セファロースに結合した。前記ライブラリーの一部は、ビーズに結合することが観測された。これらのクローンはPCRで増幅し、再クローン化し、十余のクローンの個別の結合性を試験し、配列を調べた。種々のペプチド・スペーサーが、タンパク分解に耐性があり(αGFPを高度に融合タンパク質中に保持する)、また、図18に示されているように、界面活性剤処理細胞をセファロース・ビーズに結合できることが判明した。サポート結合に機能することが判明したスペーサー配列を表1に挙げる。
スペーサー配列の一つRL6を選んで、後の結合の検討に用いた。固体サポート・マトリックスへの強い結合に寄与する他の要素を調べた。細胞のマトリックスとの培養時間、および結合溶液の塩(NaCl)の濃度は、両方とも結合に対してポジティブな効果を有することが分かった。培養時間30分と、NaCl濃度の範囲約200mM〜500mMが、効果的であることが判明したが、300mMが最適と考えられる。結合は、Tris、リン酸塩、MOPSの300mMの塩含有緩衝溶液を含む一連の緩衝液中で効率的である。
αGFP::RL6::KzPG::SNAP::DBP融合タンパク質を発現している細胞を、ビオチン化eGFPを介してストレプトアビジン磁性ナノ粒子(MagneSphere、Roche Diagnostics社)に結合する条件は、図19に明示されるセファロース・ビーズ結合に対して求められた範囲内にあることも判明した。
12残基スペーサーに加えて、タンパク質領域をも、スペーサー領域として用いることが考えられた。ヒトのタイチン遺伝子(I27)からの小型で安定な高度に発現した27番目のイムノグロブリン領域をRL6スペーサーの上流にクローン化した。この領域も、N末端のαGFP領域の高度かつ安定的な発現と、同時に非常に良好な固定マトリックス結合をも可能にすることが分かった(図19)。
一本鎖抗体(scFv)ライブラリーの細胞内ディスプレイ用の最後の領域構造は、scFv::I27::RL6::KzPG::SNAP::DBPであった。scFv領域を除いた、融合タンパク質のタンパク質およびDNAの配列は、SEQ ID NO:13(配列番号)およびSEQ ID NO:14(配列番号)に与えられている。このタンパク質融合体は、N末端にscFv、つづいて2つのスペーサー領域であるI27およびRL6、つぎにペプチドグリカン結合領域のKzPG、SNAPレポーター領域、最後にDNA結合領域(DBP)を有する。
ランダムプライマーを用いたcDNAを、酵素Superscript III(Invitrogen社)を用いて、マウス脾臓全RNAから製造した。このcDNAから、シェーファー(Schaefer)ら(2010)が記述したように、Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社)、およびマウス抗体ファミリー配列用変性オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、scFv軽鎖(VL)および重鎖(VH)可変領域を増幅した。ライブラリー・クローン化に用いたオリゴヌクレオチド・プライマーは、Schaeferらの記述したものと、Bsm BIを介して我々のライブラリー骨格ベクター(SEQ ID NO:15(配列番号))内にクローン化するのに適当な末端を有する点で相違している。VLおよびVH領域は、オーバーラップ伸長PCRを用いて加えられる。最終的scFvバンドは、合計60回のPCR増幅サイクル(1回目30回、2回目30回)にかけられた。
ライブラリー・クローン化のために、ディスプレイ・コンストラクト900ngを、BsmBIで切断し、メーカーの説明書にしたがいSureclean(Bioline社)を用い沈澱させ、T4 DNAリガーゼを用い、同様に処理されたscFv生成物400ngに連結した。リガーゼを65°C、10分間の培養で失活させ、連結体をE. Coli Argentum株(Alchemy Biosciences社)中に電気穿孔で入れた。電気穿孔された細胞は、SOC培地中に回収し、37°Cで1時間培養し、プール後、75μg/mLアンピシリンを含む20x150mmLB寒天シャーレに拡げた。このシャーレを一晩30°Cで培養した。ライブラリーの大きさは4×105独立クローン程度と推定された。20クローンの内、20クローンに予想された大きさの挿入断片が含まれていることが判明した。
ファージディスプレイ・ライブラリーから単離される一本鎖抗体は、多くの場合大腸菌中での発現が困難で、周辺質での発現レベルが低く、あるいはβシートとIg群の間にジスルフィド結合形成を欠くために、細胞質中で完全に不溶性である。大腸菌細胞質中で可溶性のマウスscFv骨格を選別するのに被包性ディスプレイを用いることができるか否かを決定するには、scFvの溶解性が融合タンパク質の性質と相関しているか否かを決定する必要があった。
有用な可溶性scFvは、凝集のレベルが低く、発現レベルが少なくとも中程度であることが予想された。これは、透過性にした細胞中のKzPG領域を、細胞壁に結合させる(したがって、細胞中の封入体に局在しない)、かつSNAPレポーター領域の少なくとも中程度の発現を示すクローンとして、視覚的に判断できた。
これらのパラメーターを選別するため、単一のコロニーを採取し、すでに例1に記述したようにアラビノースを用いて融合タンパク質の発現を誘導した。透過処理後、これらをSNAPリガンドで標識付けし蛍光顕微鏡検査法をもちいて観察した。前記ライブラリー・クローンを、発現、および、図20に例が示されるような、SNAPレポーターの細胞での分布に基づき、4類に分類した。
1. SNAPの発現なし。
2. 凝集した封入体中でのSNAPの中〜高程度の発現(図20、左図)
3. 細胞壁に局在してのSNAPの弱程度の発現(図20、中央図)
4. 細胞壁に局在してのSNAPの高程度の発現(図20、右図)
SNAPレポーターの発現レベルが高く、透過性にした細胞の細胞壁の周りに均一に分布したクローンの配列を調べ、残りの融合タンパク質に対して正しい翻訳枠にあるscFv挿入断片の存在を確認した。分析した21クローンの全てで、scFv挿入断片は、全長で、正しい長さのグリシン/セリン・リンカー領域を有し、全融合タンパク質の翻訳のために正しい読み枠中にあることが判明した。このことは、本発明のスクリーニング方法は、大腸菌細胞の細胞質中で、溶解状態で発現したマウスscFv遺伝子を正しく識別していることを示唆した。前記ライブラリーから単離されたscFvタンパク質が、大腸菌細胞質中で可溶であることを確認するため、これを、ライブラリー・コンストラクトから、介在性のスペーサー領域I27−RL6またはRL6のいずれかを含むC末端のFLAGエピトープを有するアラビノース誘導性発現ベクターにシャトルした。
アラビノースによるタンパク質発現の誘導後、可溶性のscFv::I27::RL6::FLAGまたはscFv::RL6::FLAG融合タンパク質を、0.5%8TGPで抽出した。不溶性の細胞物質は沈澱させ、β-メルカプトエタノールを含むSDS−PAGEローディング緩衝液中に、サンプルに超音波をかけ95℃で5分間加熱して、再懸濁した。各画分の等量ずつを10%SDS−PAGEゲルにかけ、電気泳動した。分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に移し、5%脱脂粉乳でブロックした。組換えタンパク質発現体に、1:1000に希釈したヒツジαFLAG抗体(Sigma社)、つづいて、抗マウスHRP抱合二次抗体でプローブ付けを行った。化学発光を用いて検出した。
図21は、本発明の方法は、ほとんどが溶解した状態で、細菌細胞質内で発現するscFv遺伝子を識別することができることを明らかにしている。ウェスタンブロット法による発現プロフィールは、各サンプルで、scFv::I27::RL6::FLAGコンストラクトについてSNAPリガンドで検知した蛍光顕微鏡検査法と一致している。
本明細書において、議論され、および/または参照された公刊物は、その全体を参照のため本明細書に組み入れる。
本出願は、AU2009906310による優先権を主張するものであり、その開示全体は、参照により本願に組み込まれている。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等々に関するいかなる議論もひとえに本発明の状況を提供することを目的としている。これらの事項のいずれか、または全てが、当出願の各請求項の優先日より以前に存在していたことを理由として、それが先行技術の基盤の一部を形成すること、あるいは本発明に関連する分野において普通の一般的な知識であったことを是認するとして取られるべきでない。
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Claims (35)
- 標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養して、細胞の細胞質でポリペプチドを産生し、
b)細菌細胞の細胞膜を透過化し、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞の細胞質内部に保持され、
c)透過化された細菌細胞を標的分子と接触させて、該標的分子を透過化された細菌細胞の細胞質中に拡散させ、そして
d)ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含み、
細菌細胞は界面活性剤又は有機溶媒で透過化される、方法。 - 標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、細菌細胞壁に共有結合させ、
b)細菌細胞の細胞膜を透過化し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞内部に保持され、
c)透過化された細菌細胞を標的分子と接触させ、そして
d)ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含み、
細菌細胞は界面活性剤又は有機溶媒で透過化される、方法。 - ステップd)が、
i)ポリペプチドが標的分子と結合するかどうか、および/または標的分子と結合する程度を決定すること、および/または
ii)ポリペプチドが標的分子を酵素的に修飾するかどうか、および/または標的分子の酵素修飾率を決定すること
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチドが、少なくとも第2ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持され、および/または細菌細胞壁に結合するタンパク質複合体を形成する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドが第2ポリペプチド、またはそのサブユニットに融合している、請求項5に記載の方法。
- 第2ポリペプチドが:
i)タンパク質複合体が透過化された細菌細胞壁内部に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド;
ii)DNA結合タンパク質;および/または
iii)細菌細胞壁結合タンパク質
から選択される、請求項5または6に記載の方法。 - タンパク質複合体の分子量が少なくとも約120kDaである、請求項7に記載の方法。
- 第2ポリペプチドが、透過化された細菌細胞の内部でマルチマーを形成する、請求項7または8に記載の方法。
- マルチマーがテトラマーである、請求項9に記載の方法。
- 第2ポリペプチドが、RhnA、β−ガラクトシダーゼ、BetB、G5K、GshBおよびYdcWから選択される、請求項10に記載の方法。
- DNA結合タンパク質がComEである、請求項7に記載の方法。
- 細菌細胞壁結合タンパク質が、ペプチドグリカン結合タンパク質、および細胞壁と結合できるリポタンパク質またはそのフラグメントから選択される、請求項7に記載の方法。
- 細菌細胞壁結合タンパク質が、KzPG、PAL、OmpA、YiaD、YfiBおよびMotBから選択されるペプチドグリカン結合タンパク質である、請求項13に記載の方法。
- 細胞壁と結合できるリポタンパク質またはそのフラグメントが、外膜付着に必要な機能的N末端シグナル配列が欠如したリポタンパク質である、請求項14に記載の方法。
- リポタンパク質が大腸菌(E. coli)LPPである、請求項15に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、デカノイル−N−メチルグルカミド(Mega10)、ジメチルオクチルホスフィンオキシド(Apo8)、n−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド(8TGP)、ならびにデカノイル−N−メチルグルカミド(Mega10)およびジメチルオクチルホスフィンオキシド(Apo8)の混合物から選択される、請求項4から16のいずれか1項に記載の方法。
- 細菌細胞の透過化が:
i)Luriaブロス(LB)中約0.5%のn−オクチル−β−D−チオグルコピラノシド(8TGP)、ならびに
ii)Luriaブロス(LB)中約0.5%のデカノイル−N−メチルグルカミド(Mega10)および約0.5%のジメチルオクチルホスフィンオキシド(Apo8)
から選択される溶液中で実施される、請求項17に記載の方法。 - ステップb)が細菌細胞を選択的に透過化することを含み、それにより、細菌細胞の外膜が細菌細胞の内膜よりもさらに透過化される、請求項13から16のいずれか1項に記載の方法。
- 細菌細胞が、ジメチルオクチルホスフィンオキシド(Apo8)および/またはポリソルベート20(Tween20)から選択される界面活性剤で選択的に透過化される、請求項19に記載の方法。
- 細菌細胞の選択的透過化を、EDTAまたはCa2+を含む溶液中で実施する、請求項19または請求項20に記載の方法。
- e)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNAを、透過化された細菌細胞から単離することを更に含む、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。
- DNAがゲノムDNAおよび/またはエピソームDNAである、請求項22に記載の方法。
- エピソームDNAがプラスミドまたはコスミドである、請求項23に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが外因性ポリヌクレオチドである、請求項1から24のいずれか1項に記載の方法。
- 標的分子の分子量が約120kDa未満である、請求項1から25のいずれか1項に記載の方法。
- 所望の活性を有するポリペプチドを同定する方法であって、
a)請求項1から26のいずれか1項に記載の方法を用いてポリペプチドのライブラリーをスクリーニングし、そして
b)所望の活性を有する1以上のポリペプチドを選択することを含む、方法。 - c)細菌細胞からポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNAを単離することを更に含む、請求項27に記載の方法。
- d)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を決定することを更に含む、請求項28に記載の方法。
- ポリペプチドのライブラリーが、細胞、組織、器官または生物から得られるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項27から29のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドのライブラリーが、1以上の親ポリヌクレオチドを突然変異させることによって得られるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項27から29のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドが抗体または酵素である、請求項1から31のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体が単鎖可変フラグメント(scFV)である、請求項32に記載の方法。
- ポリペプチドが酵素であり、標的分子が透過化された細菌細胞に連結される、請求項32に記載の方法。
- 標的分子が細菌細胞壁結合タンパク質に連結される、請求項34に記載の方法。
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