JP5960374B2 - 金被覆銀ナノプレートの懸濁液 - Google Patents
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Description
本発明は、金で被覆された銀ナノプレート(以下、金被覆銀ナノプレートともいう)の懸濁液に関する。
銀ナノプレートは、光との相互作用(局在表面プラズモン共鳴:LSPR)により光を吸収するため、その懸濁液はナノプレートの形状に応じて色を示すことが知られている。更に、銀ナノプレートの大きさや形状を制御することにより、吸収する光を変化させること、すなわち色を変化させることができることも知られている。
この性質を利用して、銀ナノプレートは、被験物質の検出試薬の標識(例えば、目的タンパク質の検出に用いられる抗体の標識)として用いられている。
一方、銀ナノプレートは酸化により溶解してその形状が変化する。この酸化による銀ナノプレートの形状変化は、意図していた色の変化を引き起こし得る。
そこで、銀ナノプレートを酸化に対して安定化するため、銀ナノプレートの表面を金で被覆することが行われている(特許文献1及び非特許文献1〜2)。
また、被験物質に対する特異的結合物質を担持した着色ラテックス粒子の懸濁液を用いた診断薬が知られている。ラテックス粒子径0.02〜2μmのポリスチレン粒子などが知られており、有機色素によって赤色や青色に着色されている(特許文献2及び特許文献3)。
この性質を利用して、銀ナノプレートは、被験物質の検出試薬の標識(例えば、目的タンパク質の検出に用いられる抗体の標識)として用いられている。
一方、銀ナノプレートは酸化により溶解してその形状が変化する。この酸化による銀ナノプレートの形状変化は、意図していた色の変化を引き起こし得る。
そこで、銀ナノプレートを酸化に対して安定化するため、銀ナノプレートの表面を金で被覆することが行われている(特許文献1及び非特許文献1〜2)。
また、被験物質に対する特異的結合物質を担持した着色ラテックス粒子の懸濁液を用いた診断薬が知られている。ラテックス粒子径0.02〜2μmのポリスチレン粒子などが知られており、有機色素によって赤色や青色に着色されている(特許文献2及び特許文献3)。
Materials Chemistry and Physics, 90 (2005), p.361-366
Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, p.5629-5633
金被覆銀ナノプレートを標識として用いる検出技術の分野では、被験物質の検出感度を高めることが望まれている。一方、銀ナノプレートの懸濁液は酸化に弱いため、被験物質の検出のために応用できる用途が限られていた。そして、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を安定化するために水溶性高分子を添加することがあるが、これを多量に添加すると、該金被覆銀ナノプレートによる被験物質の検出感度が低下する。したがって、本発明は、金被覆銀ナノプレートの安定な懸濁液であって、種々の被験物質の検出のために応用することができ、種々の検出手段に適合させることができ、かつ被験物質の検出感度の高い懸濁液を提供することを目的としている。
本発明者等は、金被覆銀ナノプレートと検出試薬との複合体の形成条件と得られた複合体を用いて行った被験物質検出の結果について鋭意検討したところ、金被覆銀ナノプレートの懸濁液の物性及び組成を特定のものとすることで、該懸濁液の安定性を保持しつつ、被験物質の検出感度も高めることができることを見出した。また、本発明者等は、金被覆銀ナノプレートが、種々の被験物質に対する特異的結合物質を担持することができること、及び、種々の検出手段に適合し得ることも見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に示す懸濁液、該懸濁液を使用して被験物質を検出する方法、及び、該懸濁液を含み該方法に使用するためのキットを提供するものである。
〔1〕金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
0〜50μMの水溶性高分子を含み、
pHが10以下であることを特徴とする、懸濁液。
〔2〕前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、1.0nm以下である、前記〔1〕に記載の懸濁液。
〔3〕前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、0.1〜0.7nmである、前記〔1〕又は〔2〕に記載の懸濁液。
〔4〕前記水溶性高分子の濃度が、0〜25μMである、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔5〕pHが4〜10である、前記〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔6〕pHが5〜9である、前記〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔7〕前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持していることを特徴とする、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔8〕前記被験物質と前記特異的結合物質の組み合わせが、抗原とそれに結合する抗体、抗体とそれに結合する抗原、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、IgGとプロテインA又はプロテインG、プロテインA又はプロテインGとIgG、及び、第1の核酸とそれに結合する第2の核酸から成る群から選択される、前記〔7〕に記載の懸濁液。
〔9〕前記〔7〕又は〔8〕に記載の懸濁液を使用して、前記被験物質を検出する方法であって、
該懸濁液を該被験物質と混合して、該被験物質と前記特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、
該複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、方法。
〔10〕前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出する、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記複合体の形成を、200〜2500nmの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、前記〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記複合体の形成を、430〜2000nmの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、前記〔9〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の方法。
〔13〕前記複合体の形成を、前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長よりも長波長側の前記複合体の形成に依存して消光度又は吸光度が上昇する波長領域における濁度測定によって検出する、前記〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔14〕前記〔7〕又は〔8〕に記載の懸濁液を含む、前記〔9〕〜〔13〕のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
〔1〕金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
0〜50μMの水溶性高分子を含み、
pHが10以下であることを特徴とする、懸濁液。
〔2〕前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、1.0nm以下である、前記〔1〕に記載の懸濁液。
〔3〕前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、0.1〜0.7nmである、前記〔1〕又は〔2〕に記載の懸濁液。
〔4〕前記水溶性高分子の濃度が、0〜25μMである、前記〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔5〕pHが4〜10である、前記〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔6〕pHが5〜9である、前記〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔7〕前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持していることを特徴とする、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか一項に記載の懸濁液。
〔8〕前記被験物質と前記特異的結合物質の組み合わせが、抗原とそれに結合する抗体、抗体とそれに結合する抗原、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、IgGとプロテインA又はプロテインG、プロテインA又はプロテインGとIgG、及び、第1の核酸とそれに結合する第2の核酸から成る群から選択される、前記〔7〕に記載の懸濁液。
〔9〕前記〔7〕又は〔8〕に記載の懸濁液を使用して、前記被験物質を検出する方法であって、
該懸濁液を該被験物質と混合して、該被験物質と前記特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、
該複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、方法。
〔10〕前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出する、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記複合体の形成を、200〜2500nmの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、前記〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔12〕前記複合体の形成を、430〜2000nmの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、前記〔9〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の方法。
〔13〕前記複合体の形成を、前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長よりも長波長側の前記複合体の形成に依存して消光度又は吸光度が上昇する波長領域における濁度測定によって検出する、前記〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔14〕前記〔7〕又は〔8〕に記載の懸濁液を含む、前記〔9〕〜〔13〕のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、安定な懸濁液として調製され、種々の被験物質を高い感度で検出するために応用することができ、また、種々の検出手段に応用することができる。したがって、本発明の懸濁液を用いることにより、多様な被験物質の検出において正確な判定が可能となる。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の金被覆銀ナノプレート懸濁液は、0〜50μMの水溶性高分子を含み、pHが10以下であることを特徴とする。
本発明の金被覆銀ナノプレート懸濁液は、0〜50μMの水溶性高分子を含み、pHが10以下であることを特徴とする。
本発明の金被覆銀ナノプレートとは、銀ナノプレート(コア)の表面に金の被覆(シェル)を有するものをいう。
本発明では、被験物質の検出技術分野で着色標識として用いられている銀ナノプレートを特に制限なく用いることができるが、以下に好ましい態様を詳述する。
銀ナノプレートとは、銀から製造されたナノプレート(板)をいう。
銀ナノプレートの主面の最大長さとなる粒子径(円形の場合は直径に相当し、三角形の場合は最大辺の長さに相当する)は、通常10〜1000nmであり、10〜150nmが好ましい。更に、銀ナノプレートのアスペクト比(粒子径/厚み)は、通常1.5以上であり、可視光領域にLSPRの吸収波長が発現して多色設計が可能な1.5〜10が好ましい。近赤外光での検出に用いる場合には、LSPRが800〜2000nmで発現するようなアスペクト比(例えば、アスペクト比11で900nm付近にLSPRが発現)のプレート状銀ナノ粒子を用いればよい。
色を定量的に表す体系である表色系の一つであるマンセル・カラー・システムのマンセル値(以下、単にマンセル値ともいう)が5Y 8.5/14で、CIE1931xy色度図の座標(以下、単に色度座標ともいう)がx:0.4498、y:0.4811であるイエロー(イエロー系色、400〜500nm付近にLSPRを発現するプレート状銀ナノ粒子)、マンセル値が5RP 5/14で、色度座標がx:0.4142、y:0.2428であるマゼンタ(マゼンタ系色、500〜600nm付近にLSPRを発現するプレート状銀ナノ粒子)、マンセル値が7.5B 6/10で、色度座標がx:0.1934、y:0.2374であるシアン(シアン系色、600〜750nm付近にLSPRを発現するプレート状銀ナノ粒子)など、プレート状銀ナノ粒子のアスペクト比を調整することで任意のLSPRの吸収波長を選択できる。なお、図1は、CIE1931xy色度図におけるイエロー、マゼンタ及びシアンの色度座標を示す。アスペクト比の異なる2種以上のプレート状銀ナノ粒子を混合して色を設計してもよい。例えば、イエローとマゼンタを混合し赤色(マンセル値:5R 4/14、色度座標 x:0.5734、y:0.3057)、マゼンタとシアンを混合し青色(マンセル値:10B 4/14、色度座標 x:0.1310、y:0.1580)、イエローとシアンを混合し緑色(マンセル値:2.5G 6.5/10、色度座標 x:0.3000、y:0.6000)などが設計できる。なお、図2は、CIE1931xy色度図における赤色、青色及び緑色の色度座標を示す。さらに、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色が発現するアスペクト比の異なる3種以上のプレート状銀ナノ粒子を三原色とした減法混合を適用した多色設計を用いることができる。例えば、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色のプレート状銀ナノ粒子を任意の割合で混合して黒色を設計した場合、イムノクロマト試験時の被験物質検出ラインは背景(白色)とのコントラスト差が大きくなるため視認性(検出感度)が高くなる。
本発明では、被験物質の検出技術分野で着色標識として用いられている銀ナノプレートを特に制限なく用いることができるが、以下に好ましい態様を詳述する。
銀ナノプレートとは、銀から製造されたナノプレート(板)をいう。
銀ナノプレートの主面の最大長さとなる粒子径(円形の場合は直径に相当し、三角形の場合は最大辺の長さに相当する)は、通常10〜1000nmであり、10〜150nmが好ましい。更に、銀ナノプレートのアスペクト比(粒子径/厚み)は、通常1.5以上であり、可視光領域にLSPRの吸収波長が発現して多色設計が可能な1.5〜10が好ましい。近赤外光での検出に用いる場合には、LSPRが800〜2000nmで発現するようなアスペクト比(例えば、アスペクト比11で900nm付近にLSPRが発現)のプレート状銀ナノ粒子を用いればよい。
色を定量的に表す体系である表色系の一つであるマンセル・カラー・システムのマンセル値(以下、単にマンセル値ともいう)が5Y 8.5/14で、CIE1931xy色度図の座標(以下、単に色度座標ともいう)がx:0.4498、y:0.4811であるイエロー(イエロー系色、400〜500nm付近にLSPRを発現するプレート状銀ナノ粒子)、マンセル値が5RP 5/14で、色度座標がx:0.4142、y:0.2428であるマゼンタ(マゼンタ系色、500〜600nm付近にLSPRを発現するプレート状銀ナノ粒子)、マンセル値が7.5B 6/10で、色度座標がx:0.1934、y:0.2374であるシアン(シアン系色、600〜750nm付近にLSPRを発現するプレート状銀ナノ粒子)など、プレート状銀ナノ粒子のアスペクト比を調整することで任意のLSPRの吸収波長を選択できる。なお、図1は、CIE1931xy色度図におけるイエロー、マゼンタ及びシアンの色度座標を示す。アスペクト比の異なる2種以上のプレート状銀ナノ粒子を混合して色を設計してもよい。例えば、イエローとマゼンタを混合し赤色(マンセル値:5R 4/14、色度座標 x:0.5734、y:0.3057)、マゼンタとシアンを混合し青色(マンセル値:10B 4/14、色度座標 x:0.1310、y:0.1580)、イエローとシアンを混合し緑色(マンセル値:2.5G 6.5/10、色度座標 x:0.3000、y:0.6000)などが設計できる。なお、図2は、CIE1931xy色度図における赤色、青色及び緑色の色度座標を示す。さらに、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色が発現するアスペクト比の異なる3種以上のプレート状銀ナノ粒子を三原色とした減法混合を適用した多色設計を用いることができる。例えば、イエロー系色、マゼンタ系色、シアン系色のプレート状銀ナノ粒子を任意の割合で混合して黒色を設計した場合、イムノクロマト試験時の被験物質検出ラインは背景(白色)とのコントラスト差が大きくなるため視認性(検出感度)が高くなる。
銀ナノプレートの厚さは、プラズモン吸収することができるものであれば特に制限されず、一般的には40nm以下であり、好ましくは5〜20nmである。
銀ナノプレートの形状は、プラズモン吸収することができるものであれば特に制限されず、意図する色に応じた形状を採用することができる。具体例としては三角形状、五角形状、六角形状等の多角形状や、角がカーブ状となった円形状等の形状があげられる。
本発明では、単一種類(単一形状)の銀ナノプレートを用いてもよく、形状の異なる複数種類の銀ナノプレートの混合物を用いてもよい。
銀ナノプレートの大きさ(主面の最大長さ)並びに形状は、意図する色又は最大吸収波長に応じて適宜設定することができる。銀ナノプレートの最大吸収波長は、430〜2000nmの範囲で調整してもよく、好ましくは430〜1500nm、特に好ましくは430〜1000nmの範囲で調整してもよい。銀ナノプレートの大きさ及び形状と色との関係は、例えば特表2011−508072号公報に記載されている。例えば、銀ナノプレートを三形状および六角形状(主面の最大長さ:20nm、厚さ:5.1nm)とすると、マゼンタ(極大吸収波長:538nm)を呈することができる。銀ナノプレートの最大吸収波長は、銀ナノプレート形成後の金による被覆、懸濁液のpHの調整、及び/又は、被験物質に対する特異的結合物質の担持後に安定する。
銀ナノプレートは市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。
銀ナノプレートの形状は、プラズモン吸収することができるものであれば特に制限されず、意図する色に応じた形状を採用することができる。具体例としては三角形状、五角形状、六角形状等の多角形状や、角がカーブ状となった円形状等の形状があげられる。
本発明では、単一種類(単一形状)の銀ナノプレートを用いてもよく、形状の異なる複数種類の銀ナノプレートの混合物を用いてもよい。
銀ナノプレートの大きさ(主面の最大長さ)並びに形状は、意図する色又は最大吸収波長に応じて適宜設定することができる。銀ナノプレートの最大吸収波長は、430〜2000nmの範囲で調整してもよく、好ましくは430〜1500nm、特に好ましくは430〜1000nmの範囲で調整してもよい。銀ナノプレートの大きさ及び形状と色との関係は、例えば特表2011−508072号公報に記載されている。例えば、銀ナノプレートを三形状および六角形状(主面の最大長さ:20nm、厚さ:5.1nm)とすると、マゼンタ(極大吸収波長:538nm)を呈することができる。銀ナノプレートの最大吸収波長は、銀ナノプレート形成後の金による被覆、懸濁液のpHの調整、及び/又は、被験物質に対する特異的結合物質の担持後に安定する。
銀ナノプレートは市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。
銀ナノプレートの表面を被覆する金の厚さは、銀ナノプレートの発色性能に影響を与えない限り特に制限されないが、厚みの平均が、好ましくは1.0nm以下、より好ましくは0.7nm以下である。金の被覆の厚さが1.0nm以下であると、銀ナノプレートのプラズモン吸収を維持しつつ、銀ナノプレートの酸化を抑制することができる。
金の厚さの下限は、銀ナノプレート表面の金による被覆という目的を達成できるものであれば特に制限されないが、厚みの平均が、好ましくは0.1nm以上又は0.3nmである。なお、本発明における金の厚みの平均とは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡法(HAADF−STEM)を用いて測定された、銀ナノプレート表面の金の厚みより算出すれば良い。具体的には、HAADF−STEM像から任意の粒子10個について各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を金の厚みの平均とすれば良い。
被覆方法は、銀ナノプレート表面の金による被覆という目的を達成できるものであれば特に制限されない。したがって、公知の被覆方法や後述の実施例に記載の被覆方法を用いることができる。
本発明の金被覆銀ナノプレートは、銀ナノプレートの全ての表面が金で被覆されているものであってもよく、銀ナノプレートの表面の一部が金で被覆されているものであってもよい。銀ナノプレートの表面の全て又は一部が金で被覆されたことは、電子顕微鏡による観察及び物理化学的性質の測定など、通常用いられる種々の方法によって確認することができる。例えば、銀ナノプレートの表面の全て又は一部が金で被覆されると、酸又はナトリウム若しくは塩化物イオンに対する安定性が上昇し、酸化に対して安定なものとなる。そうすると、金被覆処理後に、酸性溶液(例えば、2%過酸化水素水)又は緩衝液(例えば、10mMのリン酸緩衝生理食塩水(二価イオンあり又はなし))中という銀ナノプレートにとって過酷な条件下で銀ナノプレートの懸濁液の分光特性(最大吸収波長)を測定しても、その分光特性が水中で測定したときと比較して僅かしか変化しない場合には、その銀ナノプレートは金で被覆されていると判断できる。
金の厚さの下限は、銀ナノプレート表面の金による被覆という目的を達成できるものであれば特に制限されないが、厚みの平均が、好ましくは0.1nm以上又は0.3nmである。なお、本発明における金の厚みの平均とは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡法(HAADF−STEM)を用いて測定された、銀ナノプレート表面の金の厚みより算出すれば良い。具体的には、HAADF−STEM像から任意の粒子10個について各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を金の厚みの平均とすれば良い。
被覆方法は、銀ナノプレート表面の金による被覆という目的を達成できるものであれば特に制限されない。したがって、公知の被覆方法や後述の実施例に記載の被覆方法を用いることができる。
本発明の金被覆銀ナノプレートは、銀ナノプレートの全ての表面が金で被覆されているものであってもよく、銀ナノプレートの表面の一部が金で被覆されているものであってもよい。銀ナノプレートの表面の全て又は一部が金で被覆されたことは、電子顕微鏡による観察及び物理化学的性質の測定など、通常用いられる種々の方法によって確認することができる。例えば、銀ナノプレートの表面の全て又は一部が金で被覆されると、酸又はナトリウム若しくは塩化物イオンに対する安定性が上昇し、酸化に対して安定なものとなる。そうすると、金被覆処理後に、酸性溶液(例えば、2%過酸化水素水)又は緩衝液(例えば、10mMのリン酸緩衝生理食塩水(二価イオンあり又はなし))中という銀ナノプレートにとって過酷な条件下で銀ナノプレートの懸濁液の分光特性(最大吸収波長)を測定しても、その分光特性が水中で測定したときと比較して僅かしか変化しない場合には、その銀ナノプレートは金で被覆されていると判断できる。
また、銀ナノプレートが金で被覆されていることは、金被覆銀ナノプレート懸濁液中の金及び銀濃度を測定することによっても確認できる。具体的には、以下の手順に示すように、懸濁液を遠心分離後、上澄み液を除去し、得られた沈殿物を、除去した上澄み液と同量の超純水で再度懸濁する。そして、その懸濁液に王水を添加後、煮沸して、得られた溶液を、ICP発光分析装置を用いて分析する。
1.金被覆銀ナノプレート懸濁液を遠心分離(25,000rpm、2
6,000g)後、上澄み液を除去し、得られた沈殿物を、除去し
た上澄み液と同量の超純水で再度懸濁する。
2.上記工程1で得られた懸濁液に王水を添加後、5分間煮沸して、金
及び銀を王水中へ溶解させる。
3.上記工程2で得られた溶液を、ICP発光分析装置を用いて測定す
る。
なお、各金属の濃度は、任意濃度の標準サンプルを上述と同様に測定することで作成した検量線より算出する。
得られた各金属の濃度から、金と銀の比率が明らかとなり、銀ナノプレート表面が金で被覆されていること、そして、その金の厚さを確認することができる。例えば、三角形の銀ナノプレート上の金の厚さは、以下のようにして算出することができる。
1.ICP発光分析結果(例)
金濃度:銀濃度=1:4
2.銀ナノプレートの体積(形状:正三角形、高さ:30nm、厚さ8n
mの場合)
式:(三角形の面積)×(厚さ)
=(30nm×(30×2÷√3)nm÷2)×8nm
=4157nm3(=4157×10-21cm3)
3.銀の比重
10.51g/cm3
4.三角形の銀ナノプレートの質量
式:(三角形の銀ナノプレートの体積)×(銀の比重)
=(4157×10-21cm3)×10.51g/cm3
=4.37×10-17g
5.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の質量(X)
1:4=X:4.37×10-17g
X=1.09×10-17g
6.金の比重
19.32g/cm3
7.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積
式:(金の質量)÷(金の比重)
=1.09×10-17g ÷ 19.32g/cm3
=5.64×10-19cm3(=564nm3)
8.三角形の銀ナノプレートの表面積
式:(三角形の面積)+(粒子側面の面積)
=(30×(60÷√3)÷2)×2+(8×(60÷√3))×3
=1871nm2
9.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の厚さ
式:(三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積)
÷(三角形の銀ナノプレートの表面積)
=564nm3÷1871nm2
=0.30nm(=3.0Å)
このように、ICP発光分析装置を用いた分析の結果、金濃度と銀濃度の比率が1:4であることがわかった場合には、金被覆処理を施した銀ナノプレート(形状:正三角形、高さ:30nm、厚さ8nmの粒子の場合)の表面の金の厚さは、0.30nmであると計算できる。これは、金原子が一層から二層被覆していることを意味している。
1.金被覆銀ナノプレート懸濁液を遠心分離(25,000rpm、2
6,000g)後、上澄み液を除去し、得られた沈殿物を、除去し
た上澄み液と同量の超純水で再度懸濁する。
2.上記工程1で得られた懸濁液に王水を添加後、5分間煮沸して、金
及び銀を王水中へ溶解させる。
3.上記工程2で得られた溶液を、ICP発光分析装置を用いて測定す
る。
なお、各金属の濃度は、任意濃度の標準サンプルを上述と同様に測定することで作成した検量線より算出する。
得られた各金属の濃度から、金と銀の比率が明らかとなり、銀ナノプレート表面が金で被覆されていること、そして、その金の厚さを確認することができる。例えば、三角形の銀ナノプレート上の金の厚さは、以下のようにして算出することができる。
1.ICP発光分析結果(例)
金濃度:銀濃度=1:4
2.銀ナノプレートの体積(形状:正三角形、高さ:30nm、厚さ8n
mの場合)
式:(三角形の面積)×(厚さ)
=(30nm×(30×2÷√3)nm÷2)×8nm
=4157nm3(=4157×10-21cm3)
3.銀の比重
10.51g/cm3
4.三角形の銀ナノプレートの質量
式:(三角形の銀ナノプレートの体積)×(銀の比重)
=(4157×10-21cm3)×10.51g/cm3
=4.37×10-17g
5.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の質量(X)
1:4=X:4.37×10-17g
X=1.09×10-17g
6.金の比重
19.32g/cm3
7.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積
式:(金の質量)÷(金の比重)
=1.09×10-17g ÷ 19.32g/cm3
=5.64×10-19cm3(=564nm3)
8.三角形の銀ナノプレートの表面積
式:(三角形の面積)+(粒子側面の面積)
=(30×(60÷√3)÷2)×2+(8×(60÷√3))×3
=1871nm2
9.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の厚さ
式:(三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積)
÷(三角形の銀ナノプレートの表面積)
=564nm3÷1871nm2
=0.30nm(=3.0Å)
このように、ICP発光分析装置を用いた分析の結果、金濃度と銀濃度の比率が1:4であることがわかった場合には、金被覆処理を施した銀ナノプレート(形状:正三角形、高さ:30nm、厚さ8nmの粒子の場合)の表面の金の厚さは、0.30nmであると計算できる。これは、金原子が一層から二層被覆していることを意味している。
なお、本発明において、「銀ナノプレートの表面を被覆する金」とは、銀ナノプレートの表面に存在している金を指すが、金単体で存在しているものに加えて、銀との合金の状態で存在しているものも含まれる。
金被覆銀ナノプレートは市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。
本発明では、単一種類の金被覆銀ナノプレートを用いてもよく、形状や大きさの異なる複数種類の金被覆銀ナノプレートの混合物を用いてもよい。
金被覆銀ナノプレートは市販品を用いてもよく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の方法に従って製造したものを用いてもよい。
本発明では、単一種類の金被覆銀ナノプレートを用いてもよく、形状や大きさの異なる複数種類の金被覆銀ナノプレートの混合物を用いてもよい。
本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液(以下、本発明の懸濁液ともいう)では、固体の金被覆銀ナノプレートが液体の分散媒中に懸濁している。
分散媒としては、金被覆銀ナノプレートを分散できるものであれば特に制限なく用いることができる。具体例としては、水、水性緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、HEPES緩衝液など)、エタノールやメタノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン等が挙げられる。分散媒は、生化学実験において好適であるため、好ましくは水である。
分散媒は一種類であってもよく、複数種類の混合物であってもよい。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、静置状態で金被覆銀ナノプレートが分散媒中に分散しているものであってもよく、静置状態では金被覆銀ナノプレートは沈降しているが振盪や超音波分散することにより分散媒中に分散するものであってもよい。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、金被覆銀ナノプレートの製造方法を実施した結果生じた懸濁液をそのまま用いたものであってもよく(但し、後述の水溶性高分子濃度及びpHの要件を満たしていることを条件とする)、前記の懸濁液から金被覆銀ナノプレートを分離し、次いで分散媒中に分散させたものであってもよい。
懸濁液の製造方法に特に制限はなく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の製造方法を用いることができる。
分散媒としては、金被覆銀ナノプレートを分散できるものであれば特に制限なく用いることができる。具体例としては、水、水性緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、HEPES緩衝液など)、エタノールやメタノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフラン等が挙げられる。分散媒は、生化学実験において好適であるため、好ましくは水である。
分散媒は一種類であってもよく、複数種類の混合物であってもよい。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、静置状態で金被覆銀ナノプレートが分散媒中に分散しているものであってもよく、静置状態では金被覆銀ナノプレートは沈降しているが振盪や超音波分散することにより分散媒中に分散するものであってもよい。
金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、金被覆銀ナノプレートの製造方法を実施した結果生じた懸濁液をそのまま用いたものであってもよく(但し、後述の水溶性高分子濃度及びpHの要件を満たしていることを条件とする)、前記の懸濁液から金被覆銀ナノプレートを分離し、次いで分散媒中に分散させたものであってもよい。
懸濁液の製造方法に特に制限はなく、公知の製造方法や後述の実施例に記載の製造方法を用いることができる。
本発明の懸濁液の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して、好ましくは50質量%以下、より好ましくは1〜0.000015質量%、特に好ましくは0.1〜0.000015質量%である。懸濁液の銀含有率が50質量%以下であると、分散安定性の向上及び分光特性を利用した生化学試験(例えば、イムノクロマト試験)に用いた時に発色の確認(例えば、イムノクロマト試験の場合、検出ラインの目視確認)が容易なるといった効果が得られる。
本発明の懸濁液には、水溶性高分子が任意に含まれても含まれなくてもよく、その濃度の範囲は0〜50μMである。
本発明における水溶性高分子とは、分子量が500〜1,000,000、好ましくは500〜100,000の水溶性物質をいう。本発明における水溶性とは、常温常圧下で高分子が水に0.001質量%以上溶解することをいう。
具体例としては、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、ビス(p−スルホナトフェニル)フェニルホスフィンやポリスチレンスルホン酸等があげられる。これらの水溶性高分子を含有している、塗料やインクなどに用いられる市販の分散剤を、本発明の水溶性高分子として使用してもよい。また、本発明の懸濁液中の金属微粒子と化学結合する官能基である水酸基、メルカプト基、ジスルフィド基、アミノ基、カルボキシル基などで上記具体例の水溶性高分子が修飾されていてもよい。
本発明の懸濁液に含まれる水溶性高分子の種類は、該懸濁液の用途に応じて選択することができる。例えば、生体実験や細胞実験に使用する場合、生体適合性が良好なポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどを用いてもよい。
本発明の懸濁液が水溶性高分子を含む場合には、その懸濁液中に溶解又は分散している水溶性高分子の濃度(懸濁液1リットルあたりの水溶性高分子のモル数)は、50μM以下、好ましくは25μM以下、特に好ましくは10μM以下である。水溶性高分子の濃度が50μM以下であると、該濃度が50μMを超える場合と比較して、本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液による該被験物質の検出感度を高めることができる。
また、別の好ましい態様では、本発明の懸濁液は水溶性高分子を含まない(すなわち0μM)。本発明の金被覆銀ナノプレートは、水溶性高分子がなくても、被験物質に対する特異的結合物質を担持することで安定な懸濁液を形成することができるので、特に被験物質の検出感度を高めるためには、水溶性高分子を含まなくてもよい。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、水溶性高分子の濃度が50μM以下であると、例えば、後述する被験物質に対する特異的結合物質が金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートが該被験物質と安定した複合体を形成するため、結果として該被験物質の検出感度が高まると考えられる。
本発明における水溶性高分子とは、分子量が500〜1,000,000、好ましくは500〜100,000の水溶性物質をいう。本発明における水溶性とは、常温常圧下で高分子が水に0.001質量%以上溶解することをいう。
具体例としては、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアリルアミン、デキストラン、ポリメタクリルアミド、ポリビニルフェノール、ポリ安息香酸ビニル、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、ビス(p−スルホナトフェニル)フェニルホスフィンやポリスチレンスルホン酸等があげられる。これらの水溶性高分子を含有している、塗料やインクなどに用いられる市販の分散剤を、本発明の水溶性高分子として使用してもよい。また、本発明の懸濁液中の金属微粒子と化学結合する官能基である水酸基、メルカプト基、ジスルフィド基、アミノ基、カルボキシル基などで上記具体例の水溶性高分子が修飾されていてもよい。
本発明の懸濁液に含まれる水溶性高分子の種類は、該懸濁液の用途に応じて選択することができる。例えば、生体実験や細胞実験に使用する場合、生体適合性が良好なポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどを用いてもよい。
本発明の懸濁液が水溶性高分子を含む場合には、その懸濁液中に溶解又は分散している水溶性高分子の濃度(懸濁液1リットルあたりの水溶性高分子のモル数)は、50μM以下、好ましくは25μM以下、特に好ましくは10μM以下である。水溶性高分子の濃度が50μM以下であると、該濃度が50μMを超える場合と比較して、本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液による該被験物質の検出感度を高めることができる。
また、別の好ましい態様では、本発明の懸濁液は水溶性高分子を含まない(すなわち0μM)。本発明の金被覆銀ナノプレートは、水溶性高分子がなくても、被験物質に対する特異的結合物質を担持することで安定な懸濁液を形成することができるので、特に被験物質の検出感度を高めるためには、水溶性高分子を含まなくてもよい。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、水溶性高分子の濃度が50μM以下であると、例えば、後述する被験物質に対する特異的結合物質が金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートが該被験物質と安定した複合体を形成するため、結果として該被験物質の検出感度が高まると考えられる。
水溶性高分子の濃度の測定方法として、核磁気共鳴分光法(NMR)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ゲルろ過クロマトグラフィー(GPC)、示唆熱・熱重量測定(TG−DTA)などが挙げられる。
NMRの場合、金被覆銀ナノプレートの懸濁液を乾燥させ、得られた固形分を重溶媒で溶解(分散)させて測定する。重溶媒には既知濃度の内部標準物質(例えば、マレイン酸)を予め添加し、得られたスペクトル中の水溶性高分子由来のシグナルの積分値と内部標準物質由来のシグナルの積分値を比較することで水溶性高分子の濃度を算出することができる。
また、GPCの場合、初めに複数の既知濃度の水溶性高分子水溶液を分析し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より検量線を作成する。次に、金被覆銀ナノプレートの懸濁液を測定し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より水溶性高分子の濃度を算出することができる。
さらに、TG−DTAの場合、金被覆銀ナノプレート懸濁液の乾燥固形分を測定した際の、重量変化から水溶性高分子量を算出することができる。
NMRの場合、金被覆銀ナノプレートの懸濁液を乾燥させ、得られた固形分を重溶媒で溶解(分散)させて測定する。重溶媒には既知濃度の内部標準物質(例えば、マレイン酸)を予め添加し、得られたスペクトル中の水溶性高分子由来のシグナルの積分値と内部標準物質由来のシグナルの積分値を比較することで水溶性高分子の濃度を算出することができる。
また、GPCの場合、初めに複数の既知濃度の水溶性高分子水溶液を分析し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より検量線を作成する。次に、金被覆銀ナノプレートの懸濁液を測定し、得られたチャート中の水溶性高分子由来のピーク面積より水溶性高分子の濃度を算出することができる。
さらに、TG−DTAの場合、金被覆銀ナノプレート懸濁液の乾燥固形分を測定した際の、重量変化から水溶性高分子量を算出することができる。
本発明の懸濁液のpHは10以下であり、好ましくは4〜10又は5〜10、特に好ましくは5〜9又は6〜9である。pHが10以下であると、後述する被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液による被験物質の検出感度が高くなる。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、懸濁液のpHが10以下であると、例えば、後述する被験物質に対する特異的結合物質が金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートが該被験物質と安定した複合体を形成するため、結果として該被験物質の検出感度が高まると考えられる。
本発明における懸濁液のpHは、本技術分野で用いられている一般的なpH測定法、例えばガラス電極法において測定された室温下(20〜30℃)におけるpHをいう。
懸濁液のpHを調整するために、懸濁液へpH調整剤を添加してもよい。pH調整剤としては公知の物質を使用することができる。具体例としては、PBS緩衝液、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムやクエン酸等をあげることができる。
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、懸濁液のpHが10以下であると、例えば、後述する被験物質に対する特異的結合物質が金被覆銀ナノプレートに良好に担持されるか、又は、被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートが該被験物質と安定した複合体を形成するため、結果として該被験物質の検出感度が高まると考えられる。
本発明における懸濁液のpHは、本技術分野で用いられている一般的なpH測定法、例えばガラス電極法において測定された室温下(20〜30℃)におけるpHをいう。
懸濁液のpHを調整するために、懸濁液へpH調整剤を添加してもよい。pH調整剤としては公知の物質を使用することができる。具体例としては、PBS緩衝液、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムやクエン酸等をあげることができる。
本発明の懸濁液は、被験物質に対する特異的結合物質、すなわち検出試薬を標識するために用いることができる。換言すると、本発明の金被覆銀ナノプレートは、被験物質に対する特異的結合物質を担持することができる。用語「担持」は、共有結合若しくは非共有結合又は直接的若しくは間接的な結合などの様式にかかわらず、金被覆銀ナノプレートと被験物質に対する特異的結合物質とが結合して複合体を形成していることを意味している。担持の方法としては、通常の担持方法を特に制限なく用いることができ、物理吸着、化学吸着(表面への共有結合)、化学結合(共有結合、配位結合、イオン結合又は金属結合)等を利用して、金被覆銀ナノプレートと被験物質に対する特異的結合物質とを直接的に結合させる方法や、金被覆銀ナノプレートの表面に前述の水溶性高分子の一部を結合させて、該水溶性高分子の末端又は主鎖若しくは側鎖に、直接的又は間接的に被験物質に対する特異的結合物質を結合させる方法を採用することができる。例えば、被験物質に対する特異的結合物質が抗体である場合には、本発明の懸濁液と抗体の溶液とを混合し、振盪し、遠心分離することで、抗体を担持した金被覆銀ナノプレート(標識された検出試薬)を沈殿物として得ることができる。
本発明の被験物質に対する特異的結合物質としては、検出の対象である被験物質を、該被験物質との複合体形成により検出できるものであって、金被覆銀ナノプレートを標識として利用することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせの具体例としては、抗原とそれに結合する抗体、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、IgGとプロテインA又はプロテインG、プロテインA又はプロテインGとIgG、あるいは、第1の核酸とそれに結合する(ハイブリダイズする)第2の核酸等があげられる。前記第2の核酸は、前記第1の核酸と相補的な配列を含む核酸であってもよい。
被験物質が抗原である場合には、該抗原に対する特異的結合物質は抗体であってもよい。前記抗体は、前記抗原に対して特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体又はそれらの断片であってもよく、該断片は、F(ab)フラグメント、F(ab’)フラグメント、F(ab’)2フラグメント又はF(v)フラグメントであってもよい。被験物質としての抗原は、コンカナバリンA(ConA)、麦芽アグルチニン及びリシンなどのレクチンであってもよく、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びB型肝炎ウイルスなどのウイルス又はそれらが有する物質(例えば、B型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン)であってもよく、アスペルギルス・フラバス、クラミジア、梅毒トレポネーマ、溶連菌、炭疽菌、黄色ブドウ球菌、赤痢菌、大腸菌、サルモネラ菌、ネズミチフス菌、パラチフス菌、緑膿菌及び腸炎ビブリオ菌などの病原性微生物又はそれらが有する物質(例えば、アスペルギルス・フラバスのアフラトキシン(B1、B2、G1、G2又はM1など)、腸管出血性大腸菌のベロ毒素又は溶連菌のストレプトリジンO)であってもよく、免疫グロブリンG(IgG)、リウマチ因子及びC反応性タンパク質(CRP)などの血中タンパク質であってもよく、ムチンなどの糖タンパク質であってもよく、インスリン、下垂体ホルモン(例えば、成長ホルモン(GH)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、プロラクチン、又はメラニン細胞刺激ホルモン(MSH))、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)、甲状腺ホルモン(例えば、ジヨードサイロニン又はトリヨードサイロニン)、絨毛性ゴナドトロピン、カルシウム代謝調節ホルモン(例えば、カルシトニン又はパラトルモン)、膵ホルモン、消化管ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、卵胞ホルモン(例えば、エストロン)、天然又は合成黄体ホルモン(例えば、プロゲステロン)、男性ホルモン(例えば、テストステロン)、及び副腎皮質ホルモン(例えば、コルチゾール)などのホルモンであってもよく、セロトニン、ウロキナーゼ、フェリチン、サブスタンP、プロスタグランジン及びコレステロールなどのその他生体内物質であってもよく、前立腺性酸性フォスファターゼ(PAP)、前立腺特異抗原(PSA)、アルカリ性フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、トリプシン、ペプシノーゲン、α−フェトプロテイン(AFP)及び癌胎児性抗原(CEA)などの腫瘍マーカーであってもよく、血液型抗原などの糖鎖抗原であってもよく、ヘモグロビン及びトランスフェリンなどの便潜血の検出に用いられるマーカーであってもよい。そして、被験物質である抗原がホルモン又はサイトカインなどの生体内物質である場合には、該生体内物質に対する特異的結合物質は、抗体だけでなく受容体であってもよく、被験物質である抗原が糖鎖又は糖鎖を有する複合糖質である場合には、該糖鎖又は糖鎖を有する複合糖質に対する特異的結合物質は、抗体だけでなくレクチンであってもよい。また、被験物質としての抗原は、ペニシリン及びカドミウムなどのハプテンであってもよい。
被験物質が抗体である場合には、該抗体に対する特異的結合物質は抗原であってもよい。前記抗原は、前記抗体に対して特異的に結合する抗原全体又はその断片であってもよく、それらを他の担体と結合した融合物質であってもよい。被験物質としての抗体は、抗環状シトルリン化ペプチド(CCP)抗体又は抗リン脂質抗体などの自己抗体であってもよく、抗クラミジア抗体、抗HIV抗体又は抗HCV抗体などの外来抗原に対する抗体であってもよい。
被験物質が糖鎖である場合には、該糖鎖に対する特異的結合物質はレクチンであってもよい。前記レクチンは、前記糖鎖に特異的に結合するガレクチン、C型レクチン、マメ科レクチン又はそれらの断片であってもよい。被験物質としての糖鎖は、単糖又は多糖であってもよく、それらがタンパク質又は脂質に結合した複合糖質であってもよい。例えば、被験物質がマンノースを含む糖鎖である場合には、該糖鎖に対する特異的結合物質としてマメ科レクチンのコンカナバリンA(ConA)を使用することができる。
被験物質がレクチンである場合には、該レクチンに対する特異的結合物質は糖鎖であってもよい。前記糖鎖は、前記レクチンに特異的に結合する単糖、多糖、複合糖質又はそれらが他の担体と結合した融合物質であってもよい。被験物質としてのレクチンは、ガレクチン、C型レクチン又はマメ科レクチンであってもよい。例えば、被験物質がマメ科レクチンのコンカナバリンA(ConA)である場合には、該レクチンに対する特異的結合物質としてマンノースを含む糖鎖を使用することができる。
被験物質と被験物質に対する特異的結合物質との組み合わせが、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマーである場合には、核酸アプタマーは、例えば、炭疽菌(Bacillus anthracis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、D群赤痢菌・ソンネ赤痢菌(Shigella sonnei)、大腸菌(Escherichia coli)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、溶連菌(Streptococcus hemolyticus)、パラチフス(Salmonella paratyphi A)、ブドウ球菌エンテロトキシンB(Staphylococcal enterotoxin B)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)等の細菌、ムチン1等の上皮の細胞表面に表れる腫瘍マーカー、若しくはβ−ガラクトシダーゼやトロンビン等の酵素等と結合するDNAアプタマー、又は、ヒト免疫不全ウイルスのTatタンパク質やRevタンパク質と結合するRNAアプタマーであってもよく、ペプチドアプタマーは、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)の腫瘍性タンパク質HPV16 E6と結合するペプチドアプタマーであってもよい。
被験物質がビタミン類である場合には、該ビタミン類に対する特異的結合物質は、ビタミンDと結合するトランスカルシフェリン及びビタミンB12と結合するトランスコバラミンなどのビタミン結合タンパク質であってもよい。被験物質が抗生物質である場合には、該抗生物質に対する特異的結合物質は、ペニシリンに結合するPBP1及びPBP2などのペニシリン結合タンパクであってもよい。
被験物質又は被験物質に結合する物質としての核酸は、例えば、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は、それらの増幅物であってもよい。
被験物質又は被験物質に結合する物質としての核酸は、例えば、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は、それらの増幅物であってもよい。
本発明の懸濁液は、金被覆銀ナノプレートへ悪影響を与えない限り任意の成分を含んでいてもよい。任意成分としては、金被覆銀ナノプレートの製造方法を実施する際に用いた試薬(例えば、水素化ホウ素ナトリウムやアスコルビン酸)や、分散剤(例えば、クエン酸三ナトリウム)等があげられる。
本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートは、対応する被験物質の検出に使用することができる。本発明の被験物質を検出する方法は、本発明の懸濁液を該被験物質と混合して、該被験物質と該被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、該複合体を検出する工程を含む。
前記複合体は、被験物質の検出の分野で通常用いられる手段又は凝集物若しくは沈殿物を検出するのに通常用いられる手段を、特に制限なく利用することによって検出することができる。例えば、前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー法、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出してもよい。
前記複合体は、被験物質の検出の分野で通常用いられる手段又は凝集物若しくは沈殿物を検出するのに通常用いられる手段を、特に制限なく利用することによって検出することができる。例えば、前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー法、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出してもよい。
イムノクロマトグラフィー法では、検出部位(ライン状)に金被覆銀ナノプレートが集合する。このとき、金被覆銀ナノプレートが可視域の光を吸収する場合、前記複合体の形成を色として認識することができる。本試験の結果は目視判定と、輝度差解析によって数値化できる。目視判定はイムノクロマト試験後の検出ライン有無を目視によって確認し、検出ラインが確認可能な最低被験物質濃度を検出感度とすることができる。輝度解析では、以下の輝度差1から輝度差2を引いた値の絶対値が2(検出限界輝度差)以上である時の最低被験物質濃度を検出感度とすることができる。
1.被験物質を含まない展開液を使用したイムノクロマト試験時の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
2.被験物質を含む展開液を使用したイムノクロマト試験時のイムノクロマト担体上の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
また、近赤外域の光を吸収する金被覆銀ナノプレートを使用したイムノクロマト試験においては、試験後に近赤外光を検出部に照射し、そのときの吸光を測定することで検出を確認することができる
1.被験物質を含まない展開液を使用したイムノクロマト試験時の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
2.被験物質を含む展開液を使用したイムノクロマト試験時のイムノクロマト担体上の検出ラインと検出ライン以外の部分の輝度差
また、近赤外域の光を吸収する金被覆銀ナノプレートを使用したイムノクロマト試験においては、試験後に近赤外光を検出部に照射し、そのときの吸光を測定することで検出を確認することができる
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例1
(1)銀ナノプレートの種粒子の作製
2.5mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLに、0.5g/Lの分子量70,000ポリスチレンスルホン酸水溶液1mLと、10mMの水素化ホウ素ナトリウム水溶液1.2mLとを添加し、次いで、20mL/minで攪拌しながら、0.5mMの硝酸銀水溶液50mLを添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中で60分間静置し、銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液を作製した。作製した水懸濁液(原液)の光学特性を図3に示す。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。最大吸収を示す波長は球状銀ナノ粒子のLSPRである396nm(消光度3.3)であった。なお、本発明の消光度とは懸濁液を分光光度計で測定した際の吸光度の値である。また、SEM観察写真を図4に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。粒子径は主に3nm以上、10nm未満のプレート状粒子であった。
(1)銀ナノプレートの種粒子の作製
2.5mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLに、0.5g/Lの分子量70,000ポリスチレンスルホン酸水溶液1mLと、10mMの水素化ホウ素ナトリウム水溶液1.2mLとを添加し、次いで、20mL/minで攪拌しながら、0.5mMの硝酸銀水溶液50mLを添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中で60分間静置し、銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液を作製した。作製した水懸濁液(原液)の光学特性を図3に示す。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。最大吸収を示す波長は球状銀ナノ粒子のLSPRである396nm(消光度3.3)であった。なお、本発明の消光度とは懸濁液を分光光度計で測定した際の吸光度の値である。また、SEM観察写真を図4に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。粒子径は主に3nm以上、10nm未満のプレート状粒子であった。
(2)銀ナノプレートの作製(マゼンタ)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液4mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液aを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は526nm(消光度1.1)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液a中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は31nmであり、平均厚さは8nmでアスペクト比は3.8であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液4mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液aを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は526nm(消光度1.1)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液a中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は31nmであり、平均厚さは8nmでアスペクト比は3.8であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
(3)金被覆銀ナノプレートの作製
(2)で作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液A1)を作製した。
懸濁液A1の主要分散媒は水であった。
懸濁液A1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液A1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液A1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液A1におけるPVP(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は8.1μMであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた(後述の懸濁液B1及びD1も同様)。
懸濁液A1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液A1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
(2)で作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液A1)を作製した。
懸濁液A1の主要分散媒は水であった。
懸濁液A1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液A1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液A1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液A1におけるPVP(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は8.1μMであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた(後述の懸濁液B1及びD1も同様)。
懸濁液A1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液A1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
(4)懸濁液A1のpH調整
(3)で得られた懸濁液A1の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液B1)を作製した。
懸濁液B1の主要分散媒は水であった。
懸濁液B1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液B1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。SEM観察写真を図6に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液B1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液B1の色度座標はx=0.4276、y=0.1751であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図1に示す。
色度座標の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア(株式会社島津製作所製)」にて照明:D65、視野:2°と設定した条件下で行われた。
懸濁液B1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液B1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液B1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液B1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
(3)で得られた懸濁液A1の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液B1)を作製した。
懸濁液B1の主要分散媒は水であった。
懸濁液B1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液B1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。SEM観察写真を図6に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液B1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液B1の色度座標はx=0.4276、y=0.1751であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図1に示す。
色度座標の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び分光光度計操作用ソフトウェア「カラー測定ソフトウェア(株式会社島津製作所製)」にて照明:D65、視野:2°と設定した条件下で行われた。
懸濁液B1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液B1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液B1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液B1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例2
実施例1の(4)と同様にして、実施例1の(3)で作製した懸濁液A1(pH4.0)を190mM 炭酸ナトリウム水溶液でpH5.2に調整し、懸濁液F1を作製した。懸濁液F1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであり、懸濁液F1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
実施例3
実施例1の(4)と同様にして、実施例1の(3)で作製した懸濁液A1(pH4.0)を190mM 炭酸ナトリウム水溶液でpH9.8に調整し、懸濁液G1を作製した。懸濁液G1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであり、懸濁液G1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
実施例1の(4)と同様にして、実施例1の(3)で作製した懸濁液A1(pH4.0)を190mM 炭酸ナトリウム水溶液でpH5.2に調整し、懸濁液F1を作製した。懸濁液F1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであり、懸濁液F1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
実施例3
実施例1の(4)と同様にして、実施例1の(3)で作製した懸濁液A1(pH4.0)を190mM 炭酸ナトリウム水溶液でpH9.8に調整し、懸濁液G1を作製した。懸濁液G1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであり、懸濁液G1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
実施例4
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、超純水9.1mL、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.99mLに200mMのPBS緩衝液0.01mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液I1)を作製した。
懸濁液I1の主要分散媒は水であった。
懸濁液I1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液I1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液I1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液I1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液I1のpHは、室温下(20℃)で7.8であった。
懸濁液I1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、超純水9.1mL、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.99mLに200mMのPBS緩衝液0.01mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液I1)を作製した。
懸濁液I1の主要分散媒は水であった。
懸濁液I1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液I1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液I1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液I1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液I1のpHは、室温下(20℃)で7.8であった。
懸濁液I1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
実施例5
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、0.780mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液J1)を作製した。
懸濁液J1の主要分散媒は水であった。
懸濁液J1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液J1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液J1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液J1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液J1におけるPVPの濃度は49μMであった。
懸濁液J1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液J1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、0.780mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液J1)を作製した。
懸濁液J1の主要分散媒は水であった。
懸濁液J1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液J1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液J1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液J1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液J1におけるPVPの濃度は49μMであった。
懸濁液J1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液J1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例6
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、0.025mMの末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるSUNBRIGHT ME−020SH(分子量:2,000、NOF CORPORATION製)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液K1)を作製した。
懸濁液K1の主要分散媒は水であった。
懸濁液K1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液K1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液K1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液K1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液K1におけるSUNBRIGHT ME−020SHの濃度は1.6μMであった。
懸濁液K1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液K1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、0.025mMの末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるSUNBRIGHT ME−020SH(分子量:2,000、NOF CORPORATION製)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液K1)を作製した。
懸濁液K1の主要分散媒は水であった。
懸濁液K1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液K1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液K1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液K1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液K1におけるSUNBRIGHT ME−020SHの濃度は1.6μMであった。
懸濁液K1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液K1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例7
銀ナノプレートの作製(色調:イエロー)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に実施例1の(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液12mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液bを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は454nm(消光度1.1)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液b中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は18nmであり、平均厚さは8nmでアスペクト比は2.2であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
銀ナノプレートの作製(色調:イエロー)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に実施例1の(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液12mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液bを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は454nm(消光度1.1)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液b中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は18nmであり、平均厚さは8nmでアスペクト比は2.2であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
金被覆銀ナノプレートの作製
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液M1)を作製した。
懸濁液M1の主要分散媒は水であった。
懸濁液M1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液M1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液M1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液M1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液M1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液M1)を作製した。
懸濁液M1の主要分散媒は水であった。
懸濁液M1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液M1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液M1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液M1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液M1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
懸濁液M1のpH調整
懸濁液M1 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液N1)を作製した。
懸濁液N1の主要分散媒は水であった。
懸濁液N1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液N1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
SEM観察写真を図7に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液N1の3倍希釈溶液の色調はイエローであった。
懸濁液N1の色度座標はx=0.5070、y=0.4774であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図1に示す。
また、懸濁液B1とN1を混合した混合液(B1+N1)の色調は赤色であった。混合液(B1+N1)の色度座標はx=0.6057、y=0.3317であった。
CIE1931xy色度図における色度座標を図0520−2に示す。
懸濁液N1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液N1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液N1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液N1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液N1を実施例7とした。
懸濁液M1 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液N1)を作製した。
懸濁液N1の主要分散媒は水であった。
懸濁液N1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液N1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
SEM観察写真を図7に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液N1の3倍希釈溶液の色調はイエローであった。
懸濁液N1の色度座標はx=0.5070、y=0.4774であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図1に示す。
また、懸濁液B1とN1を混合した混合液(B1+N1)の色調は赤色であった。混合液(B1+N1)の色度座標はx=0.6057、y=0.3317であった。
CIE1931xy色度図における色度座標を図0520−2に示す。
懸濁液N1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液N1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液N1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液N1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液N1を実施例7とした。
実施例8
(1)銀ナノプレートの作製(色調:シアン)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に実施例1の(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液2mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液cを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は626nm(消光度1.1)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液c中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は50nmであり、平均厚さは10nmでアスペクト比は5.0であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
(1)銀ナノプレートの作製(色調:シアン)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に実施例1の(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液2mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液cを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は626nm(消光度1.1)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液c中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は50nmであり、平均厚さは10nmでアスペクト比は5.0であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
(2)金被覆銀ナノプレートの作製
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液O1)を作製した。
懸濁液O1の主要分散媒は水であった。
懸濁液O1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。また、懸濁液O1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液O1の3倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液O1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液O1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液O1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液O1)を作製した。
懸濁液O1の主要分散媒は水であった。
懸濁液O1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。また、懸濁液O1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液O1の3倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液O1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液O1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液O1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
(3)懸濁液O1のpH調整
懸濁液O1 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液P1)を作製した。
懸濁液P1の主要分散媒は水であった。
懸濁液P1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。また、懸濁液P1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
SEM観察写真を図8に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液P1の3倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液P1の色度座標はx=0.1467、y=0.2090であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図1に示す。
また、懸濁液B1とP1を混合した混合液(B1+P1)の色調は青色、懸濁液N1とP1を混合した混合液(N1+P1)の色調は緑色であった。
混合液(B1+P1)の色度座標はx=0.1731、y=0.0675、混合液(N1+P1)の色度座標はx=0.2549、y=0.5712であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図2に示す。
懸濁液P1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液P1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液P1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液P1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液O1 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液P1)を作製した。
懸濁液P1の主要分散媒は水であった。
懸濁液P1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。また、懸濁液P1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
SEM観察写真を図8に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液P1の3倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液P1の色度座標はx=0.1467、y=0.2090であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図1に示す。
また、懸濁液B1とP1を混合した混合液(B1+P1)の色調は青色、懸濁液N1とP1を混合した混合液(N1+P1)の色調は緑色であった。
混合液(B1+P1)の色度座標はx=0.1731、y=0.0675、混合液(N1+P1)の色度座標はx=0.2549、y=0.5712であった。CIE1931xy色度図における色度座標を図2に示す。
懸濁液P1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液P1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液P1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液P1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例9
(1)銀ナノプレートの作製(色調:薄いシアン)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に実施例1の(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液1mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液dを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は704nm(消光度1.0)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液d中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は74nmであり、平均厚さは8nmでアスペクト比は9.2であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
(1)銀ナノプレートの作製(色調:薄いシアン)
超純水200mLに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、更に実施例1の(1)で作製した銀ナノプレート種粒子水懸濁液1mLを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中で100時間静置し、銀ナノプレートの水懸濁液dを作製した。調製した懸濁液を超純水で4倍容に希釈した水懸濁液の光学特性を図5に示す。最大吸収を示す波長は704nm(消光度1.0)であった。光学特性の測定は、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:190−1300nmの条件下で行われた。水懸濁液d中の銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、銀ナノプレートの平均粒子径は74nmであり、平均厚さは8nmでアスペクト比は9.2であった。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
(2)金被覆銀ナノプレートの作製
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液Q1)を作製した。
懸濁液Q1の主要分散媒は水であった。
懸濁液Q1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が74nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液Q1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
SEM観察写真を図9に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液Q1の3倍希釈溶液の色調は薄いシアンであった。
懸濁液Q1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液Q1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液Q1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
上述のように作製した銀ナノプレート水懸濁液120mLに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液Q1)を作製した。
懸濁液Q1の主要分散媒は水であった。
懸濁液Q1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が74nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液Q1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
SEM観察写真を図9に示す。SEM観察写真の解析には株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70を用いた。
懸濁液Q1の3倍希釈溶液の色調は薄いシアンであった。
懸濁液Q1におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液Q1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液Q1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
(3)懸濁液Q1のpH調整
懸濁液Q1 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液R1)を作製した。
懸濁液R1の主要分散媒は水であった。
懸濁液R1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が74nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液R1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液R1の3倍希釈溶液の色調は薄いシアンであった。
懸濁液R1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液R1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液R1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液R1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液Q1 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液R1)を作製した。
懸濁液R1の主要分散媒は水であった。
懸濁液R1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が74nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液R1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液R1の3倍希釈溶液の色調は薄いシアンであった。
懸濁液R1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液R1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液R1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液R1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
実施例10
(1)金被覆銀ナノプレートの作製
上述の実施例1の(3)金被覆銀ナノプレートの作製、における塩化金酸水溶液の濃度を0.14mMから0.42mMに変更した以外は、懸濁液A1の作製と同様にして金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液S1)を作製した。
懸濁液S1の主要分散媒は水であった。
懸濁液S1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液S1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.85nmであった。
懸濁液S1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
懸濁液S1におけるPVPの濃度は8.1μMであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた。
懸濁液S1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた。
懸濁液S1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
(1)金被覆銀ナノプレートの作製
上述の実施例1の(3)金被覆銀ナノプレートの作製、における塩化金酸水溶液の濃度を0.14mMから0.42mMに変更した以外は、懸濁液A1の作製と同様にして金被覆銀ナノプレートの水懸濁液(以下、懸濁液S1)を作製した。
懸濁液S1の主要分散媒は水であった。
懸濁液S1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液S1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.85nmであった。
懸濁液S1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
懸濁液S1におけるPVPの濃度は8.1μMであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた。
懸濁液S1のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた。
懸濁液S1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
(2)懸濁液S1のpH調整
(1)で得られた懸濁液S1の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液T1)を作製した。
懸濁液T1の主要分散媒は水であった。
懸濁液T1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液T1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.90nmであった。
懸濁液T1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液T1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液T1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液T1のpHは、室温下(20℃)で7.4であった。
懸濁液T1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
(1)で得られた懸濁液S1の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液T1)を作製した。
懸濁液T1の主要分散媒は水であった。
懸濁液T1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液T1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.90nmであった。
懸濁液T1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液T1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液T1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液T1のpHは、室温下(20℃)で7.4であった。
懸濁液T1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
比較例
(1)水溶性高分子の濃度が高い例(その1)
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、1.25mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液D1)を作製した。
懸濁液D1の主要分散媒は水であった。
懸濁液D1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液D1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液D1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液D1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液D1におけるPVPの濃度は78μMであった。
懸濁液D1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液D1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
(1)水溶性高分子の濃度が高い例(その1)
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、1.25mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液D1)を作製した。
懸濁液D1の主要分散媒は水であった。
懸濁液D1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液D1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液D1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液D1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液D1におけるPVPの濃度は78μMであった。
懸濁液D1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液D1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
(2)pHが高い例
実施例1の(4)と同様にして、実施例1の(3)で作製した懸濁液A1(pH4.0)を200mM 水酸化ナトリウム水溶液でpH11.5に調整し、懸濁液H1を作製した。懸濁液H1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであり、懸濁液H1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
実施例1の(4)と同様にして、実施例1の(3)で作製した懸濁液A1(pH4.0)を200mM 水酸化ナトリウム水溶液でpH11.5に調整し、懸濁液H1を作製した。懸濁液H1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであり、懸濁液H1におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
(3)水溶性高分子の濃度が高い例(その2)
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、1.25mMの末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるSUNBRIGHT ME−020SH(分子量:2,000、NOF CORPORATION製)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液L1)を作製した。
懸濁液L1の主要分散媒は水であった。
懸濁液L1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液L1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液L1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液L1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液L1におけるSUNBRIGHT ME−020SHの濃度は78μMであった。
懸濁液L1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液L1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
上述のように、本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液及び比較例としての懸濁液を調製することができた。懸濁液A1、B1、F1、G1、I1,J1、K1、N1、P1、D1、H1、L1、又はT1中の水溶性高分子(ポリスチレンスルホン酸(PSS)、ポリビニルピロリドン(PVP)又はチオール修飾ポリエチレングリコール(PEG−SH))の濃度、pH及び色調(マゼンタ(M)、イエロー(Y)、シアン(C)又は薄いシアン(PC))を、後掲の表2にまとめた。
実施例1の(2)で作製した銀ナノプレートの水懸濁液120mLに、1.25mMの末端がチオール基で修飾されたポリエチレングリコールであるSUNBRIGHT ME−020SH(分子量:2,000、NOF CORPORATION製)の水溶液9.1mLを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mLを添加した後、0.14mMの塩化金酸水溶液9.6mLを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液L1)を作製した。
懸濁液L1の主要分散媒は水であった。
懸濁液L1に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液L1に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液L1の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液L1におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液L1におけるSUNBRIGHT ME−020SHの濃度は78μMであった。
懸濁液L1のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液L1の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
上述のように、本発明の金被覆銀ナノプレートの懸濁液及び比較例としての懸濁液を調製することができた。懸濁液A1、B1、F1、G1、I1,J1、K1、N1、P1、D1、H1、L1、又はT1中の水溶性高分子(ポリスチレンスルホン酸(PSS)、ポリビニルピロリドン(PVP)又はチオール修飾ポリエチレングリコール(PEG−SH))の濃度、pH及び色調(マゼンタ(M)、イエロー(Y)、シアン(C)又は薄いシアン(PC))を、後掲の表2にまとめた。
試験例1
実施例及び比較例の各懸濁液を下記手順のイムノクロマト試験に用いて、試験結果を評価した。
(1)イムノクロマト試験に使用する展開液の作製(金被覆銀ナノプレートへの特異的結合物質の担持(検出試薬の標識))
5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度50μg/mLのB型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)に対する抗体(品名:Goat anti HBsAg、製造元:Arista Biologicals,Inc.)(イムノクロマト法における検出抗体)の溶液0.2mLと、金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液A1、B1、F1、G1、I1,J1、K1、N1、P1、D1、H1、L1、又はT1)1.8mLを混合し、得られた混合物を室温下で30分間振とうした。次いで、遠心分離(25000rpm、4℃、10分間)を行い、抗体−金被覆銀ナノプレート複合体を沈殿させ、上澄み液1.85mLを除去した。その後、抗体−金被覆銀ナノプレート複合体を、4.9μMのBSAを含有する1.85mLの5mM PBS(−)緩衝液を添加して再分散させ、紫外可視分光光度計 Agilent 8453(アジレント・テクノロジー株式会社製)を使用して消光度(Extinction)2.0になるように調整し、展開液を作製した。
実施例及び比較例の各懸濁液を下記手順のイムノクロマト試験に用いて、試験結果を評価した。
(1)イムノクロマト試験に使用する展開液の作製(金被覆銀ナノプレートへの特異的結合物質の担持(検出試薬の標識))
5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度50μg/mLのB型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)に対する抗体(品名:Goat anti HBsAg、製造元:Arista Biologicals,Inc.)(イムノクロマト法における検出抗体)の溶液0.2mLと、金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液A1、B1、F1、G1、I1,J1、K1、N1、P1、D1、H1、L1、又はT1)1.8mLを混合し、得られた混合物を室温下で30分間振とうした。次いで、遠心分離(25000rpm、4℃、10分間)を行い、抗体−金被覆銀ナノプレート複合体を沈殿させ、上澄み液1.85mLを除去した。その後、抗体−金被覆銀ナノプレート複合体を、4.9μMのBSAを含有する1.85mLの5mM PBS(−)緩衝液を添加して再分散させ、紫外可視分光光度計 Agilent 8453(アジレント・テクノロジー株式会社製)を使用して消光度(Extinction)2.0になるように調整し、展開液を作製した。
使用した金被覆銀ナノプレート懸濁液と作製された展開液との関係を、以下の表1に示す。
(2)イムノクロマト試験
図10に示す手順により、B型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)を被験物質としたイムノクロマト試験を、抗HBs抗原抗体(捕獲抗体)を直線状(図10の検出ライン)に固定化したイムノクロマト試験紙を用いて行った。
イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社(有限会社バイオデバイステクノロジー)より購入したものを使用した。捕獲抗体を直線状に固定する際、捕獲抗体を5mM PBS(−)緩衝液で濃度1g/mLに調整したものを使用した。
第1展開液(図10(a)で用いる展開液)は、5mMのPBS(−)緩衝液中におけるHBs抗原(品名:HBsAg Protein(Subtype adr)、製造元:Fitzgerald Industries International Inc.)の溶液であった。第1展開液として、HBs抗原の濃度が0.60μM、0.06μM、0.006μM、0.0006μM又は0M(ブランク)の溶液を用意した。
第2展開液は5mMのPBS(−)緩衝液であった。
第3展開液(図10(c)で用いた展開液)は、上述の展開液A1、B1、F1、G1、I1,J1、K1、N1、P1、D1、H1、L1又はT1であった。
図10に示す手順により、B型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)を被験物質としたイムノクロマト試験を、抗HBs抗原抗体(捕獲抗体)を直線状(図10の検出ライン)に固定化したイムノクロマト試験紙を用いて行った。
イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社(有限会社バイオデバイステクノロジー)より購入したものを使用した。捕獲抗体を直線状に固定する際、捕獲抗体を5mM PBS(−)緩衝液で濃度1g/mLに調整したものを使用した。
第1展開液(図10(a)で用いる展開液)は、5mMのPBS(−)緩衝液中におけるHBs抗原(品名:HBsAg Protein(Subtype adr)、製造元:Fitzgerald Industries International Inc.)の溶液であった。第1展開液として、HBs抗原の濃度が0.60μM、0.06μM、0.006μM、0.0006μM又は0M(ブランク)の溶液を用意した。
第2展開液は5mMのPBS(−)緩衝液であった。
第3展開液(図10(c)で用いた展開液)は、上述の展開液A1、B1、F1、G1、I1,J1、K1、N1、P1、D1、H1、L1又はT1であった。
具体的な試験手順は以下の通りであった。
イムノクロマト試験紙に、第1展開液15μLを展開させた(図10(a))。第1展開液の展開により、HBs抗原が試験紙の検出ライン上に固定化された捕獲抗体によって捕獲される(図10(b))。
次いで、第2展開液30μLを展開させて、イムノクロマト試験紙上の余剰抗原の洗浄を行った。
最後に、第3展開液60μLを展開させた(図10(c))。第3展開液の展開により、試験紙の検出ライン上で捕獲されたHBs抗原へ検出抗体(抗体−金被覆銀ナノプレート複合体)が結合する(図10(d))。
同一の手順をHBs濃度の異なる各第1展開液を用いて繰り返した。
イムノクロマト試験紙に、第1展開液15μLを展開させた(図10(a))。第1展開液の展開により、HBs抗原が試験紙の検出ライン上に固定化された捕獲抗体によって捕獲される(図10(b))。
次いで、第2展開液30μLを展開させて、イムノクロマト試験紙上の余剰抗原の洗浄を行った。
最後に、第3展開液60μLを展開させた(図10(c))。第3展開液の展開により、試験紙の検出ライン上で捕獲されたHBs抗原へ検出抗体(抗体−金被覆銀ナノプレート複合体)が結合する(図10(d))。
同一の手順をHBs濃度の異なる各第1展開液を用いて繰り返した。
(3)イムノクロマト試験の目視判定による評価
第3展開液展開後の検出ラインにおける金被覆銀ナノプレートの着色(懸濁液の色調、すなわち、展開液B1を使用した際はマゼンタ、展開液N1を使用した際はイエロー、展開液P1を使用した際はシアン)を目視で確認することにより、HBs抗原の有無を判定した。結果を後掲の表2に示す。
第3展開液展開後の検出ラインにおける金被覆銀ナノプレートの着色(懸濁液の色調、すなわち、展開液B1を使用した際はマゼンタ、展開液N1を使用した際はイエロー、展開液P1を使用した際はシアン)を目視で確認することにより、HBs抗原の有無を判定した。結果を後掲の表2に示す。
(4)イムノクロマト試験の輝度解析による評価
第3展開液展開後のイムノクロマト試験紙をスキャニング(装置名:Cano Scan LiDE500F、製造元:キヤノン株式会社)し、検出ライン(捕獲抗体の固定化部分)の最低輝度と、検出ライン以外の部分の最低輝度とを画像解析ソフト(Image−J:アメリカ国立衛生研究所でWayne Rasbandが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/))を用いて数値化した。最低輝度は、対象領域(検出ライン又は検出ライン以外の部分)における異なる箇所の輝度を5回測定し、得られた数値の中央値を採用した。輝度差(検出ラインの最低輝度−検出ライン以外の部分の最低輝度)を計算し、結果を次の表2及び図11〜23に示す。
第3展開液展開後のイムノクロマト試験紙をスキャニング(装置名:Cano Scan LiDE500F、製造元:キヤノン株式会社)し、検出ライン(捕獲抗体の固定化部分)の最低輝度と、検出ライン以外の部分の最低輝度とを画像解析ソフト(Image−J:アメリカ国立衛生研究所でWayne Rasbandが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/))を用いて数値化した。最低輝度は、対象領域(検出ライン又は検出ライン以外の部分)における異なる箇所の輝度を5回測定し、得られた数値の中央値を採用した。輝度差(検出ラインの最低輝度−検出ライン以外の部分の最低輝度)を計算し、結果を次の表2及び図11〜23に示す。
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液B1を第3展開液として使用しても、検出ラインの色は変化せず、輝度差も生じなかった。結果を次の表3に示す。
それに対して、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第3展開液として用いると、検出ラインが着色(懸濁液の色調に着色、すなわち、展開液B1を使用した際はマゼンタ、展開液N1を使用した際はイエロー、展開液P1を使用した際はシアン)され、顕著な輝度差も測定された。これは、上記抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートが、検出ラインの捕捉抗体に捕捉されたHBs抗原と複合体を形成したことによるものである。
また、pHが10以下の懸濁液A1、B1、F1、G1、I1、J1、K1、N1、P1、D1、L1、又はT1から調製した展開液は、pHが11.5の懸濁液H1から調製した展開液よりも高い輝度差が生じたので、これよりも検出感度が高いことがわかった。
そして、水溶性高分子(PVP又はPEG−SH)の濃度が50μM以下である懸濁液B1、F1、G1、I1、J1、K1、N1、P1、又はT1から調製した展開液は、水溶性高分子の濃度が78μMである懸濁液D1又はL1から調製した展開液よりも高い輝度差が生じたので、これらよりも検出感度が高いことがわかった。特に、懸濁液I1から調製した展開液I1は、0.0006μMのHBs抗原を使用した場合にも輝度差が生じた。
また、pHが10以下の懸濁液A1、B1、F1、G1、I1、J1、K1、N1、P1、D1、L1、又はT1から調製した展開液は、pHが11.5の懸濁液H1から調製した展開液よりも高い輝度差が生じたので、これよりも検出感度が高いことがわかった。
そして、水溶性高分子(PVP又はPEG−SH)の濃度が50μM以下である懸濁液B1、F1、G1、I1、J1、K1、N1、P1、又はT1から調製した展開液は、水溶性高分子の濃度が78μMである懸濁液D1又はL1から調製した展開液よりも高い輝度差が生じたので、これらよりも検出感度が高いことがわかった。特に、懸濁液I1から調製した展開液I1は、0.0006μMのHBs抗原を使用した場合にも輝度差が生じた。
実施例11
1.金属微粒子懸濁液の作製
1−1.銀ナノプレートの作製
1−1−1.銀ナノプレートの種粒子の作製
2.5mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLに、0.5g/Lの分子量70,000ポリスチレンスルホン酸水溶液1mLと、10mMの水素化ホウ素ナトリウム水溶液1.2mLとを添加し、次いで、20mL/minで攪拌しながら、0.5mMの硝酸銀水溶液50mLを添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に60分間静置し、銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液を作製した。
1.金属微粒子懸濁液の作製
1−1.銀ナノプレートの作製
1−1−1.銀ナノプレートの種粒子の作製
2.5mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mLに、0.5g/Lの分子量70,000ポリスチレンスルホン酸水溶液1mLと、10mMの水素化ホウ素ナトリウム水溶液1.2mLとを添加し、次いで、20mL/minで攪拌しながら、0.5mMの硝酸銀水溶液50mLを添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に60分間静置し、銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液を作製した。
1−1−2.銀ナノプレート懸濁液A2の作製
超純水200mlに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、上述の銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液12mlを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mlを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中に100時間静置し、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液A2を調製した。
超純水200mlに、10mMのアスコルビン酸水溶液4.5mLを添加し、上述の銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液12mlを添加した。得られた溶液に、0.5mMの硝酸銀水溶液120mLを30mL/minで攪拌しながら添加した。硝酸銀水溶液の添加が終了した4分後に攪拌を停止し、25mMのクエン酸ナトリウム水溶液20mlを添加し、得られた溶液を大気雰囲気下のインキュベーター(30℃)中に100時間静置し、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液A2を調製した。
1−1−3.銀ナノプレート懸濁液B2の作製
上記銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液の添加量を12mlから4mlに変更した以外は、銀ナノプレート懸濁液A2と同様にして、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液B2を調製した。
上記銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液の添加量を12mlから4mlに変更した以外は、銀ナノプレート懸濁液A2と同様にして、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液B2を調製した。
1−1−4.銀ナノプレート懸濁液C2の作製
上記銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液の添加量を12mlから2mlに変更した以外は、銀ナノプレート懸濁液A2の調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液C2を調製した。
上記銀ナノプレートの種粒子の水懸濁液の添加量を12mlから2mlに変更した以外は、銀ナノプレート懸濁液A2の調製と同様にして、プレート状銀ナノ粒子の水懸濁液である銀ナノプレート懸濁液C2を調製した。
1−2.金被覆銀ナノプレートの作製
1−2−1.金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の作製
上記銀ナノプレート懸濁液A2の120mlに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液A2を調製した。
1−2−1.金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の作製
上記銀ナノプレート懸濁液A2の120mlに、0.125mMのポリビニルピロリドン(PVP)(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液A2を調製した。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の主要分散媒は水であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2に含まれる金被覆銀ナノプレートを走査型電子顕微鏡(SEM)により観察したところ、主面の最大長(粒子径)の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。なお、金被覆銀ナノプレートの主面の最大長(粒子径)の平均は、SEM画像(株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70で撮影)中の任意の金被覆銀ナノプレート100個の最大長(粒子径)を測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた(後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液B2及びCも同様)。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液A2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡法(HAADF−STEM)によれば、平均0.25nmであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆銀ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた(後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液B2及びCも同様)。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液A2における金の濃度は0.056mg/L、銀の濃度は0.226mg/Lであり、以下の計算方法により算出された金の厚さは0.21nmであった。
1.ICP発光分析結果
金濃度:銀濃度=0.056(mg/L):0.226(mg/L)
=1:4.04
2.銀ナノプレートの体積(形状:正三角形、粒子径:18nm、厚さ8
nm)
式:(三角形の面積)×(厚さ)
=(18nm×(18√3/2)nm÷2)×8nm
=1122nm3(=1122×10-21cm3)
3.銀の比重
10.51g/cm3
4.三角形の銀ナノプレートの質量
式:(正三角形の銀ナノプレートの体積)×(銀の比重)
=(1122×10-21cm3)×10.51g/cm3
=1.18×10-17g
5.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の質量(X)
1:4.04=X:1.18×10-17g
X=0.29×10-17g
6.金の比重
19.32g/cm3
7.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積
式:(金の質量) ÷(金の比重)
=0.29×10-17g ÷ 19.32g/cm3
=1.51×10-19cm3(=151nm3)
8.三角形の銀ナノプレートの表面積
式:(三角面の面積)+(粒子側面の面積)
=(18nm×(18√3/2)nm ÷2)×2)
+(8nm×18nm×3)
=713nm2
9.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の厚さ
式:(正三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積)
÷(正三角形の銀ナノプレートの表面積)
=151nm3÷713nm2
=0.21nm
なお、金の濃度および銀の濃度は、以下の手順で分析した(後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液B2及びCも同様)。
1.0.5mLの金被覆銀ナノプレート懸濁液A2を遠心分離(25,
000rpm、26,000g)後、上澄み液を除去し、得られた
沈殿物を、除去した上澄み液と同量の超純水で再度懸濁した。
2.上記工程1で得られた懸濁液に王水15mLを添加後、5分間煮沸
して、金及び銀を王水中へ溶解させた。
3.上記工程2で得られた溶液を、ICP発光分析装置(株式会社島津
製作所製、ICPS−7510)を用いて測定した。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2に含まれる金被覆銀ナノプレートを走査型電子顕微鏡(SEM)により観察したところ、主面の最大長(粒子径)の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。なお、金被覆銀ナノプレートの主面の最大長(粒子径)の平均は、SEM画像(株式会社日立製作所製の走査電子顕微鏡SU−70で撮影)中の任意の金被覆銀ナノプレート100個の最大長(粒子径)を測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた(後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液B2及びCも同様)。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液A2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さは、高角散乱環状暗視野走査透過顕微鏡法(HAADF−STEM)によれば、平均0.25nmであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆銀ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた(後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液B2及びCも同様)。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液A2における金の濃度は0.056mg/L、銀の濃度は0.226mg/Lであり、以下の計算方法により算出された金の厚さは0.21nmであった。
1.ICP発光分析結果
金濃度:銀濃度=0.056(mg/L):0.226(mg/L)
=1:4.04
2.銀ナノプレートの体積(形状:正三角形、粒子径:18nm、厚さ8
nm)
式:(三角形の面積)×(厚さ)
=(18nm×(18√3/2)nm÷2)×8nm
=1122nm3(=1122×10-21cm3)
3.銀の比重
10.51g/cm3
4.三角形の銀ナノプレートの質量
式:(正三角形の銀ナノプレートの体積)×(銀の比重)
=(1122×10-21cm3)×10.51g/cm3
=1.18×10-17g
5.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の質量(X)
1:4.04=X:1.18×10-17g
X=0.29×10-17g
6.金の比重
19.32g/cm3
7.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積
式:(金の質量) ÷(金の比重)
=0.29×10-17g ÷ 19.32g/cm3
=1.51×10-19cm3(=151nm3)
8.三角形の銀ナノプレートの表面積
式:(三角面の面積)+(粒子側面の面積)
=(18nm×(18√3/2)nm ÷2)×2)
+(8nm×18nm×3)
=713nm2
9.三角形の銀ナノプレートに被覆している金の厚さ
式:(正三角形の銀ナノプレートに被覆している金の体積)
÷(正三角形の銀ナノプレートの表面積)
=151nm3÷713nm2
=0.21nm
なお、金の濃度および銀の濃度は、以下の手順で分析した(後述の金被覆銀ナノプレート懸濁液B2及びCも同様)。
1.0.5mLの金被覆銀ナノプレート懸濁液A2を遠心分離(25,
000rpm、26,000g)後、上澄み液を除去し、得られた
沈殿物を、除去した上澄み液と同量の超純水で再度懸濁した。
2.上記工程1で得られた懸濁液に王水15mLを添加後、5分間煮沸
して、金及び銀を王水中へ溶解させた。
3.上記工程2で得られた溶液を、ICP発光分析装置(株式会社島津
製作所製、ICPS−7510)を用いて測定した。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
1−2−2.金被覆銀ナノプレート懸濁液B2の作製
上記銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2を調製した。
上記銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2を調製した。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2の主要分散媒は水であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2に含まれる金被覆銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.30nmであった。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2における金の濃度は0.045mg/L、銀の濃度は0.185mg/Lであり、上述のICP発光分析結果に基づいた計算方法により算出された金の厚さは0.28nmであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2に含まれる金被覆銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.30nmであった。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2における金の濃度は0.045mg/L、銀の濃度は0.185mg/Lであり、上述のICP発光分析結果に基づいた計算方法により算出された金の厚さは0.28nmであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液B2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
1−2−3.金被覆銀ナノプレート懸濁液C2の作製
上記銀ナノプレート懸濁液C2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液C2を調製した。
上記銀ナノプレート懸濁液C2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液C2を調製した。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2の主要分散媒は水であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2に含まれる金被覆銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、主面の最大長(粒子径)の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.45nmであった。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液C2における金の濃度は0.047mg/L、銀の濃度は0.186mg/Lであり、上述のICP発光分析結果に基づいた計算方法により算出された金の厚さは0.41nmであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2に含まれる金被覆銀ナノプレートをSEMにより観察したところ、主面の最大長(粒子径)の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。そして、金被覆銀ナノプレート懸濁液B2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.45nmであった。
また、金被覆銀ナノプレート懸濁液C2における金の濃度は0.047mg/L、銀の濃度は0.186mg/Lであり、上述のICP発光分析結果に基づいた計算方法により算出された金の厚さは0.41nmであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.98nMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。
金被覆銀ナノプレート懸濁液C2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
1−3.金被覆銀ナノプレート懸濁液のpH調整
1−3−1.pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液D2)の調製
1−2−1で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液D2)を作製した。
1−3−1.pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液D2)の調製
1−2−1で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液A2の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液D2)を作製した。
懸濁液D2の主要分散媒は水であった。
懸濁液D2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。そして、懸濁液D2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.25nmであった。
懸濁液D2の3倍希釈溶液の色調はイエローであった。
懸濁液D2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液D2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液D2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液D2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液D2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が18nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。そして、懸濁液D2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.25nmであった。
懸濁液D2の3倍希釈溶液の色調はイエローであった。
懸濁液D2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液D2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液D2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液D2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
1−3−2.pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液E2)の調製
1−2−2で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液B2の1.95mLに200mMのPBS緩衝液(+又は−)0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液E2)を作製した。ここで、200mMのPBS緩衝液(+)とは、二価イオンを含むPBS緩衝液(1.0mMのMg2+及び1.8mMのCa2+)のことをいい、200mMのPBS緩衝液(−)とは、二価イオンを含まないPBS緩衝液のことをいう。
1−2−2で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液B2の1.95mLに200mMのPBS緩衝液(+又は−)0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液E2)を作製した。ここで、200mMのPBS緩衝液(+)とは、二価イオンを含むPBS緩衝液(1.0mMのMg2+及び1.8mMのCa2+)のことをいい、200mMのPBS緩衝液(−)とは、二価イオンを含まないPBS緩衝液のことをいう。
懸濁液E2の主要分散媒は水であった。
懸濁液E2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。そして、懸濁液E2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.30nmであった。
懸濁液E2の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液E2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液E2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液E2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液E2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液E2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。そして、懸濁液E2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.30nmであった。
懸濁液E2の3倍希釈溶液の色調はマゼンタであった。
懸濁液E2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液E2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液E2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液E2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
1−3−3.pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液F2)
1−2−3で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液C2の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液F2)を作製した。
1−2−3で得られた金被覆銀ナノプレート懸濁液C2の1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整された金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液F2)を作製した。
懸濁液F2の主要分散媒は水であった。
懸濁液F2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。そして、懸濁液F2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.45nmであった。
懸濁液F2の3倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液F2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液F2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液F2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液F2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液F2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が50nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は10nmであった。そして、懸濁液F2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は、HAADF−STEMによれば、0.45nmであった。
懸濁液F2の3倍希釈溶液の色調はシアンであった。
懸濁液F2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液F2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液F2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液F2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
2.金被覆銀ナノプレートへの特異的結合物質の担持
2−1.金被覆銀ナノプレートへの糖鎖の担持
2−1−1.金被覆銀ナノプレート(懸濁液E2)へのメルカプトエチルマンノースの担持 上記懸濁液E2(PBS緩衝液(+)で調製したもの)4mLの入った9mL容バイヤル瓶に1−メルカプトエチルマンノース(Mw:270.274)10mgを添加、30℃下で12時間、マグネチックスターラーを使用し500rpmで撹拌し、マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2を調製した。
なお、1−メルカプトエチルマンノースは有機化学的手法にて合成した。具体的にはマンノース(関東化学株式会社製)を原料とし、1位のアセチル化、ブロモエチル化、チオアセチル化、脱アセチル化を経て合成した。1−メルカプトエチルマンノースの化学式を以下に示す。
2−1.金被覆銀ナノプレートへの糖鎖の担持
2−1−1.金被覆銀ナノプレート(懸濁液E2)へのメルカプトエチルマンノースの担持 上記懸濁液E2(PBS緩衝液(+)で調製したもの)4mLの入った9mL容バイヤル瓶に1−メルカプトエチルマンノース(Mw:270.274)10mgを添加、30℃下で12時間、マグネチックスターラーを使用し500rpmで撹拌し、マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2を調製した。
なお、1−メルカプトエチルマンノースは有機化学的手法にて合成した。具体的にはマンノース(関東化学株式会社製)を原料とし、1位のアセチル化、ブロモエチル化、チオアセチル化、脱アセチル化を経て合成した。1−メルカプトエチルマンノースの化学式を以下に示す。
2−2.金被覆銀ナノプレートへの抗体の担持
2−2−1.金被覆銀ナノプレートへの抗B型肝炎ウイルス抗原抗体の担持
5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度50μg/mLのB型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)に対する抗体(品名:Goat anti HBsAg、製造元:Arista Biologicals,Inc.)(以下、抗HBs抗原抗体ともいう)の溶液2mLと、上記懸濁液D2の18mLを混合し、得られた混合物を室温下で30分間振とうした。次いで、遠心分離(25000rpm、4℃、10分間)を行い、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを沈殿させ、上澄み液18.5mLを除去した。その後、上記抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを5mMのPBS(−)緩衝液18.5mLで再分散させ、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液H2を調製した。
上記懸濁液E2(PBS緩衝液(−)で調製したもの)及び懸濁液F2についても同様に抗体を担持させ、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液I2及びJ2をそれぞれ調製した。
懸濁液H2、I2及びJ2中の抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長は、それぞれ458nm、532nm及び630nmだった。
調製した懸濁液H2、I2及びJ2は、緩衝液中で安定に分散しており、分光特性もほとんど変化しないかったことから、これらはいずれも酸化に対して安定性が高いことがわかった。
2−2−1.金被覆銀ナノプレートへの抗B型肝炎ウイルス抗原抗体の担持
5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度50μg/mLのB型肝炎ウイルス抗原(HBs抗原)に対する抗体(品名:Goat anti HBsAg、製造元:Arista Biologicals,Inc.)(以下、抗HBs抗原抗体ともいう)の溶液2mLと、上記懸濁液D2の18mLを混合し、得られた混合物を室温下で30分間振とうした。次いで、遠心分離(25000rpm、4℃、10分間)を行い、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを沈殿させ、上澄み液18.5mLを除去した。その後、上記抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを5mMのPBS(−)緩衝液18.5mLで再分散させ、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液H2を調製した。
上記懸濁液E2(PBS緩衝液(−)で調製したもの)及び懸濁液F2についても同様に抗体を担持させ、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液I2及びJ2をそれぞれ調製した。
懸濁液H2、I2及びJ2中の抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長は、それぞれ458nm、532nm及び630nmだった。
調製した懸濁液H2、I2及びJ2は、緩衝液中で安定に分散しており、分光特性もほとんど変化しないかったことから、これらはいずれも酸化に対して安定性が高いことがわかった。
3.被験物質との相互作用
3−1.糖鎖を担持した金被覆銀ナノプレートとレクチンとの相互作用
上記マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2(PBS(+))を5本のエッペンチューブへ500μLずつ分注、5mMのPBS(+)緩衝液中における濃度10μMのコンカナバリンA(略称:ConA、品名:コンカナバリンA、製造元:株式会社オイルミルズ製)溶液5μL(ConA物質量:50pmol、添加後の濃度:0.1μM)、10μL(ConA物質量:100pmol、添加後の濃度:0.2μM)、25μL(ConA物質量:250pmol、添加後の濃度:0.5μM)、50μL(ConA物質量:500pmol、添加後の濃度:1.0μM)を各エッペンチューブへ添加、撹拌後、30℃下で1時間静置した。
3−1.糖鎖を担持した金被覆銀ナノプレートとレクチンとの相互作用
上記マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2(PBS(+))を5本のエッペンチューブへ500μLずつ分注、5mMのPBS(+)緩衝液中における濃度10μMのコンカナバリンA(略称:ConA、品名:コンカナバリンA、製造元:株式会社オイルミルズ製)溶液5μL(ConA物質量:50pmol、添加後の濃度:0.1μM)、10μL(ConA物質量:100pmol、添加後の濃度:0.2μM)、25μL(ConA物質量:250pmol、添加後の濃度:0.5μM)、50μL(ConA物質量:500pmol、添加後の濃度:1.0μM)を各エッペンチューブへ添加、撹拌後、30℃下で1時間静置した。
(1)色調変化及び沈殿形成
マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2にConA(50μL)を添加した後の静置中に、該懸濁液の色調変化及び該懸濁液中の沈殿形成を目視によって観察した。結果を表4に示す。
マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2にConA(50μL)を添加した後の静置中に、該懸濁液の色調変化及び該懸濁液中の沈殿形成を目視によって観察した。結果を表4に示す。
(2)消光度測定
各相互作用溶液の消光度測定を株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:300−1000nmの条件下で実施した。測定結果を図24及び表5に示す。
各相互作用溶液の消光度測定を株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:300−1000nmの条件下で実施した。測定結果を図24及び表5に示す。
糖鎖を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液にConAを添加しても消光度は変化しなかった(データは掲載せず)のに対して、マンノースを担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液G2にConAを添加すると、該ConAの添加量に依存して消光度が減少した。これは、ConAとマンノースを担持した金被覆銀ナノプレートとが複合体を形成したことによる変化である。
3−2.抗体を担持した金被覆銀ナノプレートと抗原との相互作用
上記抗HBs抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液H2(PBS(−))を2本の9mL容バイヤル瓶へ5mLずつ分注し、5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度5μMのB型肝炎ウイルス抗原(略称:HBsAg、品名:HBsAg Protein(Subtype adr)、製造元:Fitzgerald Industries International Inc.)溶液50μL(HBs抗原物質量:250pmol、添加後の濃度:50nM)、および、5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度10μMのB型肝炎ウイルス抗原溶液50μL(HBs抗原物質量:500pmol、添加後の濃度:100nM)をそれぞれバイヤル瓶へ添加、撹拌後、30℃下で1時間静置した。
上記抗HBs抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液H2(PBS(−))を2本の9mL容バイヤル瓶へ5mLずつ分注し、5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度5μMのB型肝炎ウイルス抗原(略称:HBsAg、品名:HBsAg Protein(Subtype adr)、製造元:Fitzgerald Industries International Inc.)溶液50μL(HBs抗原物質量:250pmol、添加後の濃度:50nM)、および、5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度10μMのB型肝炎ウイルス抗原溶液50μL(HBs抗原物質量:500pmol、添加後の濃度:100nM)をそれぞれバイヤル瓶へ添加、撹拌後、30℃下で1時間静置した。
(1)消光度測定
懸濁液H2から調製した各相互作用溶液の消光度測定を、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:300−1000nmの条件下で実施した。測定結果を図25Aに示す。
また、懸濁液I2又は懸濁液J2を使用した際の結果を図25B及び図25Cに示す。
懸濁液H2から調製した各相互作用溶液の消光度測定を、株式会社島津製作所製の紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PCを用い、光路長:1cm及び測定波長:300−1000nmの条件下で実施した。測定結果を図25Aに示す。
また、懸濁液I2又は懸濁液J2を使用した際の結果を図25B及び図25Cに示す。
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液にHBs抗原を添加しても消光度は変化しなかった(データは掲載せず)のに対して、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液H2、I2又はJ2にHBs抗原を添加すると、該HBs抗原の添加量に依存して消光度が減少した。これは、HBs抗原と抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートとが複合体を形成したことによる変化である。
(2)濁度測定
抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液I2にHBs抗原を添加したときの波長700nm付近における消光度を、該懸濁液の濁度としてとして測定した。測定結果を図26に示すが、これは図25Bの一部拡大図である。
抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液I2にHBs抗原を添加したときの波長700nm付近における消光度を、該懸濁液の濁度としてとして測定した。測定結果を図26に示すが、これは図25Bの一部拡大図である。
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液にHBs抗原を添加しても濁度は変化しなかった(データは掲載せず)のに対して、抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液I2にHBs抗原を添加すると、該HBs抗原の添加量に依存して濁度が上昇した。これは、HBs抗原と抗HBs抗原抗体を担持した金被覆銀ナノプレートとが複合体を形成したことによる変化である。
実施例12
1.金被覆銀ナノプレートの作製
1−1.金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液K2)の作製
実施例11の1−1−3で作製した銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液K2を調製した。
1.金被覆銀ナノプレートの作製
1−1.金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液K2)の作製
実施例11の1−1−3で作製した銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、金被覆銀ナノプレート懸濁液K2を調製した。
懸濁液K2の主要分散媒は水であった。
懸濁液K2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液K2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液K2におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液K2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆銀ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた。
懸濁液K2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液K2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
懸濁液K2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長(粒子径)の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液K2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液K2におけるポリスチレンスルホン酸(本発明における水溶性高分子に該当)の濃度は0.98nMであった。
懸濁液K2におけるPVPの濃度は8.1μMであった。なお、金の厚みの平均は、HAADF−STEM像から任意の金被覆銀ナノプレート粒子10個について、各粒子の任意の部位10点について、金の厚みを測定した計100点のデータの内、上下10%を除いた80点の平均値を用いた。
懸濁液K2のpHは、室温下(20℃)で4.0であった。pH測定は株式会社堀場製作所のtwinpHメータ B−212(ガラス電極法)を用いた(以下、同様)。
懸濁液K2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0016質量%であった。
1−2.pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液L2)の調製
上記1−1で作製した懸濁液K2 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mL及び190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液L2)を作製した。
上記1−1で作製した懸濁液K2 1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mL及び190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液L2)を作製した。
懸濁液L2の主要分散媒は水であった。
懸濁液L2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液L2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液L2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液L2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液L2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液L2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液L2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液L2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液L2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液L2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液L2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液L2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
1−3.pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液M2)の調製
実施例11の1−1−3で作製した銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、1.25mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液M2)を作製した。
実施例11の1−1−3で作製した銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、1.25mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび190mMの炭酸ナトリウム水溶液0.025mLを攪拌しながら添加し、pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液M2)を作製した。
懸濁液M2の主要分散媒は水であった。
懸濁液M2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液M2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液M2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液M2におけるPVPの濃度は78μMであった。
懸濁液M2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液M2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液M2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液M2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液M2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液M2におけるPVPの濃度は78μMであった。
懸濁液M2のpHは、室温下(20℃)で7.3であった。
懸濁液M2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
1−4.pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液N2)の調製
実施例11の1−1−3で作製した銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび200mMの水酸化ナトリウム水溶液を攪拌しながら添加し、pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液N2)を作製した。
実施例11の1−1−3で作製した銀ナノプレート懸濁液B2の120mlに、0.125mMのPVP(分子量:40,000)の水溶液9.1mlを添加し、0.5Mのアスコルビン酸水溶液1.6mlを添加した後、0.42mMの塩化金酸水溶液9.6mlを0.5mL/minで攪拌しながら添加した。得られた溶液をインキュベーター(30℃)中に24時間静置し、銀ナノプレートの表面が金で被覆された金被覆銀ナノプレートの水懸濁液を作製した。
作製した金被覆銀ナノプレートの水懸濁液1.95mLに200mMのPBS緩衝液0.05mLおよび200mMの水酸化ナトリウム水溶液を攪拌しながら添加し、pH調整した金被覆銀ナノプレート懸濁液(以下、懸濁液N2)を作製した。
懸濁液N2の主要分散媒は水であった。
懸濁液N2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液N2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液N2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液N2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液N2のpHは、室温下(20℃)で11.5であった。
懸濁液N2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
懸濁液N2に含まれる金被覆銀ナノプレートは、主面の最大長の平均が31nmの三角形状を含む多角形状、円形状であるプレートの混合物であり、厚さの平均は8nmであった。また、懸濁液N2に含まれる金被覆銀ナノプレートにおける金の厚さの平均は0.30nmであった。
懸濁液N2におけるポリスチレンスルホン酸の濃度は0.94nMであった。
懸濁液N2におけるPVPの濃度は7.8μMであった。
懸濁液N2のpHは、室温下(20℃)で11.5であった。
懸濁液N2の銀含有率は、懸濁液の総質量に対して0.0015質量%であった。
2.金被覆銀ナノプレートへの抗体の担持及びイムノクロマトグラフィーに使用する展開液の作製
5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度50μg/mLのアフラトキシンB1に対する抗体(品名:AFB1(Aflatoxin B1)Antibody、製造元:IMMUNE CHEM)の溶液0.2mLと、金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液K2、L2、M2又はN2)1.8mLを混合し、得られた混合物を室温下で30分間振とうした。次いで、遠心分離(25000rpm、4℃、10分間)を行い、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを沈殿させ、上澄み液1.85mLを除去した。その後、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを4.9μMのBSAを含有する5mM PBS(−)緩衝液で再分散させ、紫外可視近赤外分光光度計(装置名:紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PC、製造元:株式会社島津製作所)を使用して消光度(Extinction)2.0になるように調整し、懸濁液である展開液K2、L2、M2又は、N2を作製した。展開液K2、L2、M2及びN2の最大吸収波長は、532nmだった。作製された展開液と金被覆銀ナノプレート懸濁液との関係を表6に示す。
5mMのPBS(−)緩衝液中における濃度50μg/mLのアフラトキシンB1に対する抗体(品名:AFB1(Aflatoxin B1)Antibody、製造元:IMMUNE CHEM)の溶液0.2mLと、金被覆銀ナノプレート懸濁液(懸濁液K2、L2、M2又はN2)1.8mLを混合し、得られた混合物を室温下で30分間振とうした。次いで、遠心分離(25000rpm、4℃、10分間)を行い、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを沈殿させ、上澄み液1.85mLを除去した。その後、抗体を担持した金被覆銀ナノプレートを4.9μMのBSAを含有する5mM PBS(−)緩衝液で再分散させ、紫外可視近赤外分光光度計(装置名:紫外可視近赤外分光光度計MPC3100UV−3100PC、製造元:株式会社島津製作所)を使用して消光度(Extinction)2.0になるように調整し、懸濁液である展開液K2、L2、M2又は、N2を作製した。展開液K2、L2、M2及びN2の最大吸収波長は、532nmだった。作製された展開液と金被覆銀ナノプレート懸濁液との関係を表6に示す。
3.被験物質との相互作用のイムノクロマトグラフィーによる検出(その1)
実施例1の(2)と同様の手順により、アフラトキシンB1を被験物質としたイムノクロマトグラフィーを、抗アフラトキシンB1抗体(捕獲抗体)を直線状(図10の検出ライン)に固定化したイムノクロマト試験紙を用いて行った。
イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社(有限会社バイオデバイステクノロジー)より購入したものを使用した。捕獲抗体を直線状に固定する際、抗アフラトキシンB1抗体を5mM PBS(−)緩衝液で濃度1g/mLに調整した溶液を使用した。
第1展開液(図10(a)で用いる展開液)は、5mMのPBS(−)緩衝液中におけるアフラトキシンB1(品名:アフラトキシンB1、製造元:Toronto Research Chemicals Inc.)の溶液であった。第1展開液として、アフラトキシンB1の濃度が0.60μM、0.06μM、0.006μM又は0M(ブランク)の溶液を用意した。
第2展開液は5mMのPBS(−)緩衝液であった。
第3展開液(図10(c)で用いる展開液)は、上記2で作製した展開液K2、L2、M2又はN2であった。
実施例1の(2)と同様の手順により、アフラトキシンB1を被験物質としたイムノクロマトグラフィーを、抗アフラトキシンB1抗体(捕獲抗体)を直線状(図10の検出ライン)に固定化したイムノクロマト試験紙を用いて行った。
イムノクロマト試験紙はイムノクロマト試験紙の受託作製会社(有限会社バイオデバイステクノロジー)より購入したものを使用した。捕獲抗体を直線状に固定する際、抗アフラトキシンB1抗体を5mM PBS(−)緩衝液で濃度1g/mLに調整した溶液を使用した。
第1展開液(図10(a)で用いる展開液)は、5mMのPBS(−)緩衝液中におけるアフラトキシンB1(品名:アフラトキシンB1、製造元:Toronto Research Chemicals Inc.)の溶液であった。第1展開液として、アフラトキシンB1の濃度が0.60μM、0.06μM、0.006μM又は0M(ブランク)の溶液を用意した。
第2展開液は5mMのPBS(−)緩衝液であった。
第3展開液(図10(c)で用いる展開液)は、上記2で作製した展開液K2、L2、M2又はN2であった。
具体的な試験手順は以下の通りであった。
イムノクロマト試験紙に、第1展開液15μLを展開させた(図10(a))。第1展開液の展開により、アフラトキシンB1が試験紙の検出ライン上に固定化された捕獲抗体によって捕獲される(図10(b))。
次いで、第2展開液30μLを展開させて、イムノクロマト試験紙上の余剰抗原の洗浄を行った。
最後に、第3展開液60μLを展開させた(図10(c))。第3展開液の展開により、試験紙の検出ライン上で捕獲されたアフラトキシンB1へ検出抗体(抗アフラトキシンB1抗体を担持した金被覆銀ナノプレート)が結合する(図10(d))。
同一の手順をアフラトキシンB1濃度の異なる各第1展開液を用いて繰り返した。
イムノクロマト試験紙に、第1展開液15μLを展開させた(図10(a))。第1展開液の展開により、アフラトキシンB1が試験紙の検出ライン上に固定化された捕獲抗体によって捕獲される(図10(b))。
次いで、第2展開液30μLを展開させて、イムノクロマト試験紙上の余剰抗原の洗浄を行った。
最後に、第3展開液60μLを展開させた(図10(c))。第3展開液の展開により、試験紙の検出ライン上で捕獲されたアフラトキシンB1へ検出抗体(抗アフラトキシンB1抗体を担持した金被覆銀ナノプレート)が結合する(図10(d))。
同一の手順をアフラトキシンB1濃度の異なる各第1展開液を用いて繰り返した。
(1)イムノクロマトグラフィーの目視判定による評価
第3展開液展開後の検出ラインにおける金被覆銀ナノプレートの着色(マゼンタ)を目視で確認することにより、アフラトキシンB1の有無を判定した。結果を表7に示す。
第3展開液展開後の検出ラインにおける金被覆銀ナノプレートの着色(マゼンタ)を目視で確認することにより、アフラトキシンB1の有無を判定した。結果を表7に示す。
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第3展開液として使用しても検出ラインの色は変化しなかった(データは掲載せず)のに対して、抗アフラトキシンB1抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第3展開液として用いると、検出ラインがマゼンタに着色された。これは、上記抗アフラトキシンB1抗体を担持した金被覆銀ナノプレートが、検出ラインの捕捉抗体に捕捉されたアフラトキシンB1と複合体を形成したことによるものである。また、展開液L2を用いた場合にのみ、0.006μMのアフラトキシンB1を検出することができた。
(2)イムノクロマトグラフィーの輝度解析による評価
第3展開液展開後のイムノクロマト試験紙をスキャニング(装置名:Cano Scan LiDE500F、製造元:キヤノン株式会社)し、検出ライン(捕獲抗体の固定化部分)の最低輝度と、検出ライン以外の部分の最低輝度とを画像解析ソフト(Image−J:アメリカ国立衛生研究所でWayne Rasbandが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/))を用いて数値化した。最低輝度は、対象領域(検出ライン又は検出ライン以外の部分)における異なる箇所の輝度を5回測定し、得られた数値の中央値を採用した。輝度差は、次の式:
輝度差=検出ラインの最低輝度−検出ライン以外の部分の最低輝度
により計算した。
第3展開液展開後のイムノクロマト試験紙をスキャニング(装置名:Cano Scan LiDE500F、製造元:キヤノン株式会社)し、検出ライン(捕獲抗体の固定化部分)の最低輝度と、検出ライン以外の部分の最低輝度とを画像解析ソフト(Image−J:アメリカ国立衛生研究所でWayne Rasbandが開発したオープン・ソースで公有の画像処理ソフトウェア(http://imagej.nih.gov/ij/))を用いて数値化した。最低輝度は、対象領域(検出ライン又は検出ライン以外の部分)における異なる箇所の輝度を5回測定し、得られた数値の中央値を採用した。輝度差は、次の式:
輝度差=検出ラインの最低輝度−検出ライン以外の部分の最低輝度
により計算した。
(2−1)pHの影響
展開液K2、L2又はN2を使用した場合の輝度差を表8及び図27に示す。
展開液K2、L2又はN2を使用した場合の輝度差を表8及び図27に示す。
抗体を担持していない金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第3展開液として使用しても輝度差は生じなかった(データは掲載せず)のに対して、抗アフラトキシンB1抗体を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液を第3展開液として用いると、顕著な輝度差が測定された。これは、上記抗アフラトキシンB1抗体を担持した金被覆銀ナノプレートが、検出ラインの捕捉抗体に捕捉されたアフラトキシンB1と複合体を形成したことによるものである。また、pH7.3の懸濁液L2から調製した展開液L2又はpH4.0の懸濁液K2から調製した展開液K2は、pH11.5の懸濁液N2から調製した展開液N2よりも高い輝度差が生じたので、これよりも検出感度が高いことがわかった。展開液L2を使用した場合には、0.006μMのアフラトキシンB1においても輝度差が生じ、特に検出感度が高いことがわかった。
(2−2)水溶性高分子の影響
展開液L2又はM2を使用した場合の輝度差を表9及び図28に示す。
展開液L2又はM2を使用した場合の輝度差を表9及び図28に示す。
水溶性高分子であるPVPの濃度が7.8μMである懸濁液L2から調製した展開液L2は、0.006μMのアフラトキシンB1においても輝度差が生じ、PVPの濃度が78μMである懸濁液M2から調製した展開液M2よりも検出感度が高いことがわかった。
以上より、本発明の被験物質に対する特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートの懸濁液は、安定な懸濁液として調製されること、種々の被験物質の検出のために応用することができること、種々の検出手段に適合し得ること、及び、高い感度で該被験物質を検出することができることがわかった。
本発明は、金被覆銀ナノプレートを標識として用いる検出技術の分野で利用することができる。本発明の懸濁液を用いることにより、多様な被験物質の検出において正確な判定が可能となる。
Claims (14)
- 金被覆銀ナノプレートの懸濁液であって、
0μMより多く50μM以下の水溶性高分子を含み、
pHが10以下であることを特徴とする、懸濁液。 - 前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、1.0nm以下である、請求項1に記載の懸濁液。
- 前記金被覆銀ナノプレート上の金の厚みの平均が、0.1〜0.7nmである、請求項1又は2に記載の懸濁液。
- 前記水溶性高分子の濃度が、0より多く25μM以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の懸濁液。
- pHが4〜10である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の懸濁液。
- pHが5〜9である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の懸濁液。
- 前記金被覆銀ナノプレートが、被験物質に対する特異的結合物質を担持していることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の懸濁液。
- 前記被験物質と前記特異的結合物質の組み合わせが、抗原とそれに結合する抗体、抗体とそれに結合する抗原、糖鎖又は複合糖質とそれに結合するレクチン、レクチンとそれに結合する糖鎖又は複合糖質、ホルモン又はサイトカインとそれに結合する受容体、受容体とそれに結合するホルモン又はサイトカイン、タンパク質とそれに結合する核酸アプタマー若しくはペプチドアプタマー、酵素とそれに結合する基質、基質とそれに結合する酵素、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、IgGとプロテインA又はプロテインG、プロテインA又はプロテインGとIgG、及び、第1の核酸とそれに結合する第2の核酸から成る群から選択される、請求項7に記載の懸濁液。
- 請求項7又は8に記載の懸濁液を使用して、前記被験物質を検出する方法であって、
該被験物質と前記特異的結合物質を担持した金被覆銀ナノプレートとの複合体を形成する工程、及び、
該複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、方法。 - 前記複合体の形成を、消光度測定、吸光度測定、濁度測定、粒度分布測定、粒子径測定、ラマン散乱光測定、色調変化の観察、凝集又は沈殿形成の観察、イムノクロマトグラフィー、電気泳動、及び、フローサイトメトリーから成る群から選択される手段によって検出する、請求項9に記載の方法。
- 前記複合体の形成を、200〜2500nmの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記複合体の形成を、430〜2000nmの範囲の前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長における消光度測定又は吸光度測定によって検出する、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複合体の形成を、前記金被覆銀ナノプレートの最大吸収波長よりも長波長側の前記複合体の形成に依存して消光度又は吸光度が上昇する波長領域における濁度測定によって検出する、請求項9又は10に記載の方法。
- 請求項7又は8に記載の懸濁液を含む、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキット。
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