JP5959522B2 - ヒト血液がん細胞のアポトーシスを誘導するヘプタマー型スモールガイド核酸 - Google Patents
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Description
(1)2種以上のヒト血液がん細胞のアポトーシスを誘導する、配列番号1から12のいずれかの7塩基配列からなるヘプタマー型スモールガイド核酸。
(2)ヒト血液がん細胞がヒト白血病細胞およびヒト骨髄腫細胞である前記(1)のヘプタマー型スモールガイド核酸。
(3)ヒト血液がん細胞のアポトーシスが、3日間で80%以上の細胞死である前記(1)のヘプタマー型スモールガイド核酸。
(4)前記(1)に記載のヘプタマー型スモールガイド核酸の1種または2種以上を有効成分として含有するがん治療薬。
(5)ヒト白血病およびヒト骨髄腫の治療薬である前記(1)の癌治療薬。
ことにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid:LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid:ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、およびペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等をあげることができる。
(1-1)ヘプタマー型sgRNAの合成
表1に示した12種のヘプタマー型sgRNA(配列番号1-12)を化学合成機にて合成した。
各sgRNAは、5′末端および3′末端がリン酸化され、かつ2′-O-メチル化されている。合成後、各sgRNAはHPLCにて精製した。精製時には、hexylammonium acetate (HAA)とacetonitrileの混合溶液を用いて、合成sgRNAをカラムから溶出した。その後、溶出体積の1000倍量の蒸留水で溶出溶液を10時間透析し、透析した溶液を凍結乾燥した後、使用時まで冷凍保存した。使用時に蒸留水で最終濃度が100 μMになるように溶解し、残りの溶液は冷凍保存した。
ヒトがん細胞株(1000個/100 μl培地)の入った96ウエル培養プレートに、細胞内導入試薬なしで各sgRNA(最終濃度1 μM)を加え、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。72時間後MTT試薬(テトラカラーワン6 μl、生化学バイオビジネス(株))を加え、3時間後と6時間後に分光光度計で450 nmの吸光度を測定することにより生細胞数の定量(triplicateの平均値として表示)を行なった。ヒトがん細胞株は、白血病細胞HL60、骨髄腫細胞KMM1およびRPMI-8226を使用し、生細胞数量をsgRNA非投与群と比較した。また対照として正常細胞HEK293に対して各sgRNAを導入し、同様のMTTアッセイを行なった。
ヒトがん細胞株(1000個/100 μl培地)の入った96ウエル培養プレートに、細胞内導入試薬なしでsgRNA(最終濃度1 μM)を加え、37℃のCO2インキュベーターにて培養した。72時間後、細胞を室温にて15分間phycoerythrin-conjugated Annexin V(BD Pharmingen)および7-AAD(Sigma)により染色し、フローサイトメター(FACSCalibur)を用いて解析した。
免疫不全マウスであるヌードマウスの皮下に、2 X 106個のヒト白血病細胞HL60を細胞外マトリクスと共に移植した。この移植部位に、各ヘプタマー型sgRNA(100 μM)を10 μl毎日1回(連続5日間)投与し、腫瘍の体積を毎日測定した。腫瘍体積が1500 mm3に達した時点で安楽死させた。グループあたり6から8匹のマウスを用いて実験を行い、各sgRNA投与グループの生存日数の中央値と非投与(あるいは効果のないヘプタマー型sgRNA投与)グループの生存日数の中央値の差をヘプタマー型sgRNAによる余命の延長日数とした。
(2-1)MTTアッセイ
結果は表2に示したとおりである。配列番号1−6のヘプタマー型sgRNAは、3種のがん細胞の80%以上を3日間で死滅させた。また、配列番号7−12のヘプタマー型sgRNAは、3種のがん細胞のうち、2種の癌細胞の80%以上を死滅させた。一方、正常細胞HEK293の死滅率は0%であった。
結果は図1−4(骨髄細胞腫RPMI-8226)および図5−9(白血病細胞HL60)に示したとおりである。試験したヘプタマー型sgRNAは、効果のないヘプタマー型sgRNA(mock)に較べ、遙かに多くの細胞のアポトーシスを誘導することが確認された。
(2-3)マウスゼノグラフト実験
結果は表2に示したとおりである。試験したヘプタマー型sgRNAは少なくとも3日、最大で26日間もHL60細胞移植マウスを延命させた。
Claims (5)
- 2種以上のヒト血液がん細胞のアポトーシスを誘導する、配列番号1から12のいずれかの7塩基配列からなるヘプタマー型スモールガイド核酸。
- ヒト血液がん細胞がヒト白血病細胞およびヒト骨髄腫細胞である請求項1のヘプタマー型スモールガイド核酸。
- ヒト血液がん細胞のアポトーシスが、3日間で80%以上の細胞死である請求項1のヘプタマー型スモールガイド核酸。
- 請求項1に記載のヘプタマー型スモールガイド核酸の1種または2種以上を有効成分として含有するがん治療薬。
- ヒト白血病およびヒト多発性骨髄腫の治療薬である請求項4のがん治療薬。
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