JP5952000B2 - Protein solution and detergent composition containing the same - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質溶液及びこれを含む洗剤組成物に関する。   The present invention relates to a protein solution and a detergent composition containing the same.

プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素群の総称で、微生物、動物及び植物中に広く存在が知られている。その応用分野としては、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤などがあり、多くの分野で盛んに利用されている。   Protease is a general term for a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds, and is widely known in microorganisms, animals and plants. Its application fields include clothing cleaners, automatic dishwasher cleaners, contact lens cleaners, bath preparations, exfoliating cosmetics, food modifiers (baking, meat softening, marine processing, etc. ), Beer fining agents, leather tanning agents, photographic film gelatin removers, digestion aids and anti-inflammatory agents, etc., and are actively used in many fields.

洗浄剤に添加するプロテアーゼとして、洗浄時の温度で高活性を発揮する低温至適プロテアーゼが近年開発されている。しかしながら、低温至適プロテアーゼは、プロテアーゼの中でも特に耐熱性が低く、一般的なプロテアーゼ（至適温度が５０を超え８０℃以下）と比較して溶液中での自己分解がより起こりやすく、酵素活性が低下しやすいという問題がある。   As a protease to be added to a cleaning agent, a low-temperature optimal protease that exhibits high activity at the temperature at the time of cleaning has been recently developed. However, the low temperature optimal protease is particularly low in heat resistance among proteases, and is more likely to self-decompose in solution as compared with general proteases (optimal temperature is more than 50 and less than 80 ° C.). There is a problem that it tends to decrease.

一方、プロテアーゼの活性を阻害するプロテアーゼ活性阻害剤の研究が行われている。例えば、非特許文献１には、ボロニックアシッドがセリンプロテアーゼやズブチリシンを阻害する旨の記載がある。
しかしながら、上記のプロテアーゼ活性阻害剤は、一般的なプロテアーゼに対しては一定の効果があるものの、低温至適プロテアーゼの酵素活性を長期間安定に維持できるほど十分でない。また、低温至適プロテアーゼの耐熱性の向上については効果がない。 On the other hand, a protease activity inhibitor that inhibits the activity of a protease has been studied. For example, Non-Patent Document 1 describes that boronic acid inhibits serine protease and subtilisin.
However, although the above protease activity inhibitor has a certain effect on general proteases, it is not sufficient to stably maintain the enzyme activity of the low temperature optimal protease for a long period of time. Moreover, there is no effect in improving the heat resistance of the low temperature optimal protease.

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５１，１９８３，ｐ５−３２Molecular & Cellular Biochemistry, 51, 1983, p5-32.

本発明は、低温至適プロテアーゼの酵素活性の低下を抑制し、さらに耐熱性を向上させ、低温至適プロテアーゼの酵素活性を長期間安定に維持できるタンパク質溶液を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a protein solution that can suppress a decrease in enzyme activity of a low-temperature optimal protease, further improve heat resistance, and can stably maintain the enzyme activity of a low-temperature optimal protease for a long period of time.

本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明のタンパク質溶液は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｄ）であって、（Ａ）の酵素反応至適温度が０℃〜５０℃であるタンパク質溶液である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｅ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。 As a result of studies to achieve the above object, the present inventors have completed the present invention.
That is, the protein solution of the present invention is a protein solution (D) containing a low-temperature optimum protease (A), the following protease activity inhibitor (B) and a solvent (C), and is suitable for the enzyme reaction of (A). A protein solution having a temperature of 0 ° C to 50 ° C.
Protease activity inhibitor (B): As the substrate (E), any one of benzyloxycarbonylphenylalanine nitroanilide, benzoylarginine nitroanilide, furylacryloylglycylleucinamide and succinylalanylalanylprolylphenylalanine nitroanilide is used. A protease activity inhibitor having an inhibition constant Ki of 1 pM to 10 μM for (A) determined by Henderson plot under the conditions of the optimum temperature, optimum pH and optimum substrate concentration of the low temperature optimum protease (A).

本発明のタンパク質溶液は、低温至適プロテアーゼの酵素活性の低下を抑制し、さらに耐熱性を向上できるので、低温至適プロテアーゼの酵素活性を長期間安定に維持できる。
また、本発明の洗剤組成物は、洗浄性の持続性が高い。
なお、本発明において、「洗浄性の持続性が高い」とは、一定期間保管した後に測定した洗浄性と、保管する直前に測定した洗浄性との差が小さく、一定の洗浄性を示すことを意味する。 The protein solution of the present invention can suppress a decrease in the enzyme activity of the low temperature optimal protease and can further improve the heat resistance, so that the enzyme activity of the low temperature optimal protease can be stably maintained for a long period of time.
Moreover, the detergent composition of the present invention has a high detergency.
In the present invention, “high cleaning durability” means that the difference between the cleaning performance measured after storage for a certain period of time and the cleaning performance measured immediately before storage is small and exhibits a certain cleaning performance. Means.

カンナーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍを求めるために作成したＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットであり、縦軸をそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数（［Ｓ］／ｖ）、横軸を基質（Ｄ）の濃度［Ｓ］としてプロットしたグラフである。FIG. 2 is a Hanes-Woolf plot prepared for obtaining the Michaelis constant Km of a substrate for cannase, where the vertical axis represents the reciprocal ([S] / v) of each substrate concentration [S] according to the initial enzyme reaction velocity v, and the horizontal axis represents the substrate. It is the graph plotted as density | concentration [S] of (D). カンナーゼの活性の最適ｐＨを求めるために、縦軸をｐＨ４．５〜９．５における傾き係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、カンナーゼの活性のｐＨ依存性を表したグラフである。In order to determine the optimum pH of cannase activity, the vertical axis represents the slope coefficient k at pH 4.5 to 9.5, and the horizontal axis represents pH, which is a graph showing the pH dependence of cannase activity. カンナーゼの活性の至適温度を求めるために、縦軸を２０〜７０℃における傾き係数ｋ、横軸を温度としてプロットし、カンナーゼの活性の温度依存性を表したグラフである。In order to determine the optimum temperature of cannase activity, the vertical axis represents a slope coefficient k at 20 to 70 ° C. and the horizontal axis represents temperature, and is a graph showing the temperature dependence of cannase activity. 製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）のカンナーゼに対する阻害定数を求めるために作成したＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットであり、横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ１）のモル濃度］／（１−α）をプロットしたグラフである。It is a Henderson plot created in order to obtain | require the inhibition constant with respect to cannase of the protease activity inhibitor (B1) obtained in manufacture example 1, 1 / (alpha) is on a horizontal axis, [Molar concentration of (B1)] / ( It is the graph which plotted 1- (alpha).

本発明のタンパク質溶液は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するタンパク質溶液（Ｄ）であって、（Ａ）の酵素反応至適温度が０〜５０℃であるタンパク質溶液である。
プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）：基質（Ｅ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤。 The protein solution of the present invention is a protein solution (D) containing a low temperature optimal protease (A), the following protease activity inhibitor (B) and a solvent (C), and the enzyme reaction optimal temperature of (A) is It is a protein solution which is 0-50 degreeC.
Protease activity inhibitor (B): As the substrate (E), any one of benzyloxycarbonylphenylalanine nitroanilide, benzoylarginine nitroanilide, furylacryloylglycylleucinamide and succinylalanylalanylprolylphenylalanine nitroanilide is used. A protease activity inhibitor having an inhibition constant Ki of 1 pM to 10 μM for (A) determined by Henderson plot under the conditions of the optimum temperature, optimum pH and optimum substrate concentration of the low temperature optimum protease (A).

本発明において低温至適プロテアーゼ（Ａ）は、酵素反応至適温度が０〜５０℃であるプロテアーゼである。
（Ａ）としては、酵素反応至適温度が０〜５０℃である公知のプロテアーゼが含まれ、例えば、アスパラギン酸プロテアーゼに分類されるもの｛活性部位に２個のアスパラギン酸を有するプロテアーゼ｝、システインプロテアーゼに分類されるもの｛活性部位に求核攻撃を行うシステインを有するプロテアーゼ｝、金属プロテアーゼに分類されるもの｛活性部位に金属イオンを有するプロテアーゼ｝並びにセリンプロテアーゼに分類されるもの｛触媒残基として、求核攻撃を行うセリン残基を有するプロテアーゼであり、具体的には、カンナーゼ（ノボザイムズ社）、スブチリシンＳ３９及びスブチリシンＳ４１等｝等が挙げられる。
（Ａ）としては、洗剤用途に広く使用されている観点から、セリンプロテアーゼに分類されるものが好ましい。 In the present invention, the low temperature optimal protease (A) is a protease having an enzyme reaction optimal temperature of 0 to 50 ° C.
(A) includes known proteases having an optimal enzyme reaction temperature of 0 to 50 ° C., for example, those classified as aspartic proteases {proteases having two aspartic acids in the active site}, cysteine Those classified as proteases {proteases having cysteines that perform nucleophilic attack in the active site}, those classified as metal proteases {proteases having metal ions in the active site} and those classified as serine proteases {catalytic residues Are proteases having serine residues that perform nucleophilic attack, and specifically include cannase (Novozymes), subtilisin S39, subtilisin S41, etc.}.
(A) is preferably one classified as a serine protease from the viewpoint of being widely used in detergent applications.

上記の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の酵素反応至適温度は、具体的には、後述する至適温度測定法によって求められる。
また、上記以外のプロテアーゼについて、低温至適プロテアーゼであるかどうかは、一般的なプロテアーゼ活性測定法（例えば、アゾカゼインを用いた活性測定法）によってプロテアーゼの酵素反応の至適温度を求めた際、至適温度が０〜５０℃であるかどうかで判断し、至適温度が０〜５０℃のものを低温至適プロテアーゼとする。
低温至適プロテアーゼは、至適温度が０〜５０℃であるプロテアーゼであるが、この至適温度は使用時（洗浄等）の温度で高活性を発揮する観点から、５〜４５℃が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０℃である。 Specifically, the enzyme reaction optimum temperature of the low temperature optimum protease (A) is determined by the optimum temperature measurement method described later.
In addition, for proteases other than the above, whether or not it is a low-temperature optimal protease is determined by determining the optimal temperature of the enzymatic reaction of the protease by a general protease activity measurement method (for example, an activity measurement method using azocasein) Judgment is made based on whether or not the optimum temperature is 0 to 50 ° C., and an optimum temperature of 0 to 50 ° C. is defined as a low temperature optimum protease.
The low temperature optimal protease is a protease having an optimal temperature of 0 to 50 ° C., and this optimal temperature is preferably 5 to 45 ° C. from the viewpoint of exhibiting high activity at the temperature at the time of use (washing etc.), More preferably, it is 10-40 degreeC.

プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）は、基質（Ｅ）としてベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、ベンゾイルアルギニンニトロアニリド、フリルアクリロイルグリシルロイシンアミド及びサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドのうちいずれか１つを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが１ｐＭ〜１０μＭであるプロテアーゼ活性阻害剤である。（Ｂ）は、（Ａ）と一定のモル比で可逆的に結合し、（Ａ）の活性を阻害するものである。   The protease activity inhibitor (B) comprises any one of benzyloxycarbonylphenylalanine nitroanilide, benzoylarginine nitroanilide, furylacryloylglycylleucinamide and succinylalanylalanylprolylphenylalanine nitroanilide as a substrate (E). A protease activity inhibitor having an inhibition constant Ki of 1 pM to 10 μM with respect to (A) determined by Henderson plot under conditions of optimum temperature, optimum pH and optimum substrate concentration of low temperature optimum protease (A) activity is there. (B) binds reversibly to (A) at a fixed molar ratio and inhibits the activity of (A).

上記ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリドは、フェニルアラニンのアミノ基にオキシカルボキシベンジル基が結合し、カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、ＭＰ−バイオメディカル社（製品名：Ｎ−ｃｂｚ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）から入手可能である。
上記ベンゾイルアルギニンニトロアニリドは、アルギニンのアミノ基にカルボキシベンジル基が結合し、アルギニンのカルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、和光純薬工業（株）（製品名：Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩 ）から入手可能である。
上記フリルアクリロイルグリシルロイシンアミドは、グリシルロイシンアミドのアミノ基にフリルアクリル酸がペプチド結合したものであり、シグマ社（製品名：Ｎ‐（３‐［２‐Ｆｕｒｙｌ］ａｃｒｙｌｏｙｌ）‐Ｇｌｙ‐Ｌｅｕ ａｍｉｄｅ）から入手可能である。
上記サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドは、アラニルアラニルプロリルフェニルアラニンの末端アミノ基に無水コハク酸が結合し、末端カルボキシル基にニトロアニリンがペプチド結合したものであり、Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ社（製品名：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）から入手可能である。 The benzyloxycarbonylphenylalanine nitroanilide is obtained by binding an oxycarboxybenzyl group to the amino group of phenylalanine and a peptide bond of nitroaniline to the carboxyl group. MP-Biomedical Co., Ltd. (product name: N-cbz-L- (Phenylalanine-p-nitronilide).
The above benzoylarginine nitroanilide is a compound in which carboxybenzyl group is bonded to the amino group of arginine, and nitroaniline is peptide-bonded to the carboxyl group of arginine. Wako Pure Chemical Industries, Ltd. -Arginine-p-nitroanilide hydrochloride).
The above-mentioned furylacryloylglycylleucine amide is a peptide in which furylacrylic acid is peptide-bonded to the amino group of glycylleucine amide. Sigma (product name: N- (3- [2-Furyl] acryloyl) -Gly-Leu amide).
The succinylalanylalanylprolylphenylalanine nitroanilide is a succinic anhydride bonded to the terminal amino group of alanylalanylprolylphenylalanine, and nitroaniline is peptide-bonded to the terminal carboxyl group. Product name: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA).

上記基質（Ｅ）のうち、Ｋｉを求める際にどの基質を用いるかは、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が活性を阻害する（Ａ）の分類により適宜選択される。上記アスパラギン酸プロテアーゼ（Ａ−１）であればベンジルオキシカルボニルフェニルアラニンニトロアニリド、システインプロテアーゼ（Ａ−２）であればベンゾイルアルギニンニトロアニリド、金属プロテアーゼ（Ａ−３）であればフリルアクリロイルグリシルロイシンアミド、セリンプロテアーゼ（Ａ−４）であればサクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドを使用する。
上記に（Ａ）として例示されていないプロテアーゼについては、参考文献１（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ， Ａ．Ｊ． （１９９３） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９０， ｐ２０５−２１８）に、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかが記載されている。
また、上記にも、参考文献１にも記載されていないプロテアーゼが、（Ａ−１）〜（Ａ−４）のいずれに分類されるかは、参考文献２（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９８）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に示される方法を用いることで分類できる。 Among the substrates (E), which substrate is used when obtaining Ki is appropriately selected according to the classification of (A) in which the protease activity inhibitor (B) inhibits the activity. Benzyloxycarbonylphenylalanine nitroanilide for the aspartic protease (A-1), benzoylarginine nitroanilide for the cysteine protease (A-2), and furylacryloylglycylleucinamide for the metalloprotease (A-3). In the case of serine protease (A-4), succinylalanylalanylprolylphenylalanine nitroanilide is used.
For proteases not exemplified as (A) above, Reference 1 (Rawlings, ND & Barrett, AJ (1993) Evolutionary families of peptides. Biochem J 290, p205-218), A-1) to (A-4) are classified.
In addition, whether or not a protease not described in Reference 1 is classified as (A-1) to (A-4) is determined in Reference 2 (Woosner & Barrett (1998) Handbook of It can be classified by using a method shown in proteolytic enzymes (Academic Press).

本発明において低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度は、（Ａ）に対する基質（Ｅ）のミカエリス定数Ｋｍの３分の１〜２倍である。ミカエリス定数Ｋｍは酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記のミカエリス定数Ｋｍ測定法によって求めたものである。
＜ミカエリス定数Ｋｍ測定法＞
一定量の基質（Ｅ）、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した酵素反応溶液（Ｉ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｉ）の温度は、０〜５０℃の範囲内で、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（Ｉ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｉ）のｐＨは、ｐＨ３〜１２の範囲内であればいい。後述する最適ｐＨがわかっている場合は、最適ｐＨであることが好ましい。
酵素反応溶液（Ｉ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｉ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｉ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択されるが、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｉ）中の基質（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、経時的な吸光度変化を観測できる最小の基質濃度から最大の基質濃度の間で３点以上選べばよい。測定に使用する（Ａ）と類似のプロテアーゼのミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、類似プロテアーゼのＫｍの１／５０〜１０倍の間で３点以上選べばよい。
酵素反応溶液（Ｉ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｉ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。基質（Ｅ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）から酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００） （１）
さらに、基質（Ｅ）の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｉ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
ミカエリス定数Ｋｍは、算出した酵素反応初速度ｖを用いて、下記ミカエリスメンテン式（数式（２））から派生するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットによって求められる。
ｖ＝Ｖｍａｘ［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］） （２）
上記数式（２）中、ｖは酵素反応初速度（Ｍ／ｓ）、Ｖｍａｘは最大速度（Ｍ／ｓ）、［Ｓ］は酵素反応溶液中での基質濃度（Ｍ）である。
Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質（Ｅ）の濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数（［Ｓ］／ｖ）をプロットしたものであり、プロットの近似直線とｘ軸との交点が−Ｋｍである。 In the present invention, the optimal substrate concentration for the activity of the low temperature optimal protease (A) is 1/3 to 2 times the Michaelis constant Km of the substrate (E) to (A). The Michaelis constant Km is determined by determining the substrate concentration dependency of the initial enzyme reaction rate. Specifically, it is obtained by the following Michaelis constant Km measurement method.
<Michaelis constant Km measurement method>
An enzyme reaction solution (I) prepared to a certain temperature and pH containing a certain amount of substrate (E), low temperature optimum protease (A), pH adjusting agent (M) and water is prepared.
The temperature of the enzyme reaction solution (I) is within the range of 0 to 50 ° C., and the temperature of the enzyme reaction solution (I) is such that the activity of the low temperature optimal protease (A) is not inactivated and the activity can be measured. I) What is necessary is just to be able to keep constant temperature from the time of preparation to the end of measurement.
The pH of enzyme reaction solution (I) should just be in the range of pH 3-12. When the optimum pH described later is known, the optimum pH is preferable.
The pH adjuster (M) used in the enzyme reaction solution (I) is preferably a Good buffer such as a HEPES buffer or MES buffer from the viewpoint of ease of handling and stability. The concentration (molar concentration) of (M) in the enzyme reaction solution (I) is 25 to 500 mM.
The concentration (molar concentration) of the low-temperature optimum protease (A) in the enzyme reaction solution (I) is appropriately selected depending on each protease, and the absorbance change ΔAλ described later is plotted on the vertical axis and the time h is plotted on the horizontal axis. If this is the case, select a concentration that makes the plot a straight line.
The concentration (molar concentration) of the substrate (E) in the enzyme reaction solution (I) may be selected from three or more points between the minimum substrate concentration and the maximum substrate concentration at which the change in absorbance over time can be observed. When the Michaelis constant Km of the similar protease to (A) used for the measurement is known, it is sufficient to select 3 or more points between 1/50 and 10 times the Km of the similar protease.
For the enzyme reaction solution (I), using a spectrophotometer, the absorbance Aλ at a wavelength at which the product of the enzyme reaction has a maximum absorption is measured over time within a wavelength range of 300 to 450 nm. The temperature at the time of measurement is the same temperature as when the enzyme reaction solution (I) was prepared. The measurement time varies depending on the activity of the enzyme, but it is sufficient that the absorbance changes by 0.1 or more within a range not exceeding 0.8. The absorbance immediately after mixing the substrate (E) and the low temperature optimal protease (A) is Aλ ₀ , the absorbance after h hours is Aλ _h, and the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) and measurement of the product The initial rate of enzyme reaction v (M / s) is calculated from the following mathematical formula (1) using the molar extinction constant ε at the wavelength.
v = ΔAλ / (ε × h × 3600) (1)
Further, using the enzyme reaction solution (I) having a different concentration of the substrate (E), the same measurement is performed to calculate the enzyme reaction initial velocity v.
The Michaelis constant Km is obtained by a Hanes-Woolf plot derived from the following Michaelis-Menten equation (Equation (2)) using the calculated initial reaction velocity v.
v = Vmax [S] / (Km + [S]) (2)
In the above formula (2), v is the initial enzyme reaction rate (M / s), Vmax is the maximum velocity (M / s), and [S] is the substrate concentration (M) in the enzyme reaction solution.
The Hanes-Woolf plot shows the concentration [S] of each substrate (E) on the horizontal axis (x-axis) and the reciprocal ([S ] / V) is plotted, and the intersection of the approximate straight line of the plot and the x-axis is −Km.

低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適ｐＨは、様々なｐＨで酵素反応溶液の吸光度を測定することによって決定できる。具体的には、下記の最適ｐＨ測定法によって求めたｐＨである。
＜最適ｐＨ測定法＞
一定量の基質（Ｅ）、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含むｐＨを３〜１２に調製した酵素反応溶液（ＩＩ）を作成する。それぞれの溶液（ＩＩ）のｐＨ間隔は１程度とする（例えば、ｐＨ３．０、４．０及び５．０等）。
酵素反応溶液（ＩＩ）の温度は、０〜５０℃の範囲内で、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、酵素反応溶液（ＩＩ）作成時から測定終了までの間、一定温度に保つことができればいい。
酵素反応溶液（ＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩ）中のｐＨ調整剤（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の基質（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、上記低温至適プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｅ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩ）において、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｅ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き（係数ｋ）を求める。さらに、それぞれのｐＨ（３〜１２）の酵素反応溶液（ＩＩ）を用いて測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし、係数ｋが極大値となるｐＨが最適ｐＨである。
ｐＨを調整する際に、バッファーの種類を変更する場合は、バッファーによってプロテアーゼ活性が異なるため、適宜これを補正する必要がある。補正する方法としては、バッファーの種類を変える境目のｐＨにおいて、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正する方法が挙げられる。 The optimum pH for the activity of the low temperature optimum protease (A) can be determined by measuring the absorbance of the enzyme reaction solution at various pHs. Specifically, it is the pH determined by the following optimum pH measurement method.
<Optimum pH measurement method>
An enzyme reaction solution (II) having a pH adjusted to 3 to 12 containing a certain amount of substrate (E), low temperature optimal protease (A), pH adjusting agent (M) and water is prepared. The pH interval of each solution (II) is about 1 (for example, pH 3.0, 4.0, 5.0, etc.).
The temperature of the enzyme reaction solution (II) is within a range of 0 to 50 ° C., and the temperature of the enzyme reaction solution ( II) It should be possible to maintain a constant temperature from the time of creation to the end of measurement.
The pH adjuster (M) used in the enzyme reaction solution (II) is preferably a Good buffer such as a HEPES buffer or a MES buffer from the viewpoint of ease of handling and stability. The concentration (molar concentration) of the pH adjuster (M) in the enzyme reaction solution (II) is 25 to 500 mM.
The concentration (molar concentration) of the substrate (E) in the enzyme reaction solution (II) is 4 to 6 times the Michaelis constant Km with respect to the substrate (E) of the low temperature optimum protease (A).
The concentration (molar concentration) of the low temperature optimal protease (A) in the enzyme reaction solution (II) is appropriately selected depending on each protease, and the absorbance change ΔAλ described later is plotted on the vertical axis and the time h is plotted on the horizontal axis. Select the concentration at which the plot is a straight line.
In the enzyme reaction solution (II), using a spectrophotometer, the absorbance Aλ at a wavelength at which the product of the enzyme reaction has a maximum absorption is measured over time within a wavelength range of 300 to 450 nm. The temperature at the time of measurement is the same temperature as when the enzyme reaction solution (II) was prepared. Although the measurement time h varies depending on the activity of the enzyme, it may be changed by 0.1 or more as long as the absorbance does not exceed 0.8. The absorbance immediately after mixing the substrate (E) and the low temperature optimal protease (A) is Aλ ₀ , the absorbance after h hours is Aλ _h, and the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) is plotted on the vertical axis, The time h is plotted on the horizontal axis, and the slope of the straight line (coefficient k) is obtained. Furthermore, using the coefficient k measured using the enzyme reaction solution (II) of each pH (3 to 12), the vertical axis represents the coefficient k, the horizontal axis represents the pH, and the pH at which the coefficient k becomes the maximum value is plotted. Is the optimum pH.
When adjusting the pH, when the buffer type is changed, the protease activity differs depending on the buffer, and thus it is necessary to correct this appropriately. Examples of the correction method include a method in which the activity is measured with both buffers at the pH of the boundary at which the buffer type is changed, and the activity is corrected based on the value measured with one buffer.

低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度は、０〜５０℃の範囲で酵素反応溶液の吸光度を測定することによって求められる。具体的には、下記の至適温度測定法によって求めた温度である。
＜至適温度測定法＞
一定量の基質（Ｅ）、低温至適プロテアーゼ（Ａ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む最適ｐＨに調整した酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）の温度は、０℃、５℃、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び８０℃でそれぞれ作成する。０℃で測定する際は、塩化ナトリウムを１Ｍとなるように溶解して作成する。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の基質（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、後述する低温至適プロテアーゼ（Ａ）の基質（Ｅ）に対するミカエリス定数Ｋｍの４〜６倍である。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、各プロテアーゼによって適宜選択され、後述する吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットした場合、プロットが直線となる濃度を選ぶ。
酵素反応溶液（ＩＩＩ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（ＩＩＩ）を作成したときの温度と同温度である。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で、０．１以上変化すれば良い。基質（Ｅ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）を混合した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ）を求める。０〜５０℃の各温度で作成した酵素反応溶液（ＩＩＩ）において測定した係数ｋを用いて、縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットする。係数ｋが極大値となる温度がプロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度である。 The optimum temperature for the activity of the low temperature optimum protease (A) is determined by measuring the absorbance of the enzyme reaction solution in the range of 0 to 50 ° C. Specifically, it is the temperature obtained by the following optimum temperature measurement method.
<Optimum temperature measurement method>
An enzyme reaction solution (III) adjusted to an optimum pH containing a certain amount of substrate (E), low temperature optimum protease (A), pH adjusting agent (M) and water is prepared.
The enzyme reaction solution (III) is prepared at temperatures of 0 ° C, 5 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 70 ° C and 80 ° C, respectively. When measuring at 0 ° C., it is prepared by dissolving sodium chloride to 1M.
The pH adjuster (M) used in the enzyme reaction solution (III) is preferably a Good buffer such as a HEPES buffer or a MES buffer from the viewpoint of ease of handling and stability. The concentration (molar concentration) of (M) in the enzyme reaction solution (III) is 25 to 500 mM.
The concentration (molar concentration) of the substrate (E) in the enzyme reaction solution (III) is 4 to 6 times the Michaelis constant Km with respect to the substrate (E) of the low-temperature optimal protease (A) described later.
The concentration (molar concentration) of the low temperature optimal protease (A) in the enzyme reaction solution (III) is appropriately selected depending on each protease, and the absorbance change ΔAλ described later is plotted on the vertical axis and the time h is plotted on the horizontal axis. Select the concentration at which the plot is a straight line.
For the enzyme reaction solution (III), using a spectrophotometer, the absorbance Aλ at a wavelength at which the product of the enzyme reaction has a maximum absorption is measured over time within a wavelength range of 300 to 450 nm. The temperature at the time of measurement is the same temperature as when the enzyme reaction solution (III) was prepared. Although the measurement time h varies depending on the activity of the enzyme, it may be changed by 0.1 or more as long as the absorbance does not exceed 0.8. The absorbance immediately after mixing the substrate (E) and the low temperature optimal protease (A) is Aλ ₀ , the absorbance after h hours is Aλ _h, and the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) is plotted on the vertical axis, The time h is plotted on the horizontal axis to determine the slope of the straight line (coefficient k). Using the coefficient k measured in the enzyme reaction solution (III) prepared at each temperature of 0 to 50 ° C., the vertical axis represents the coefficient k and the horizontal axis represents the temperature. The temperature at which the coefficient k reaches the maximum value is the optimum temperature for the activity of the protease (A).

＜阻害定数Ｋｉの測定方法＞
至適温度、最適ｐＨに調製した、一定量の低温至適プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）及び水を含む低温至適プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成する。また、（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を数種類作成する。作成した（ｉ）は、数十分〜数時間静置する。静置後のそれぞれの（ｉ）に、基質（Ｅ）を添加して酵素反応溶液（ＩＶ）を作成する。
（ｉ）及び（ＩＶ）に用いるｐＨ調整剤（Ｍ）は、扱いやすさ及び安定性の観点から、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファーなどのＧｏｏｄバッファーが好ましい。（ｉ）及び（ＩＶ）中の（Ｍ）の濃度（モル濃度）は、２５〜５００ｍＭであり、最適ｐＨに調整できればいい。
（ｉ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）は、前述のＫｍを求めた際の（Ａ）の濃度付近であり、且つ、後に（ｉ）に添加する基質（Ｄ）のモル濃度の１０００分の１〜１０分の１の濃度である。（ＩＶ）中の（Ａ）のモル濃度は、（ＩＶ）中の基質（Ｅ）のモル濃度の１０００分の１〜１０分の１の濃度である。
（ｉ）及び（ＩＶ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度（モル濃度）は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の濃度（モル濃度）の１０分の１〜１０００倍で４種類以上と（Ｂ）を含まないものを作成する。
酵素反応溶液（ＩＶ）中の基質（Ｅ）のモル濃度は、最適基質濃度（上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１〜２倍）である。
（ｉ）の静置時間は、（Ａ）と（Ｂ）が十分に結合し、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間であり、あらかじめ実験して求めておく。
低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が一定になるまでの時間は、後述する吸光度を利用した活性測定法により求めることができる。具体的には、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ）を作成してから、一定時間おきに、後述する吸光度を利用した活性測定法により、直線の傾き（係数ｋ）を求める。係数ｋが一定になるまでの時間が（Ａ）の活性が一定になるまでの時間である。
プロテアーゼ活性の至適温度及び最適ｐＨの条件下、酵素反応溶液（ＩＶ）を作成後、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時間ｈは酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化すれば良い。単位時間あたりの吸光度変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と生成物の測定波長におけるモル吸光定数εから上記数式（１）を用いて酵素反応初速度ｖを算出する。また、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の濃度が異なる（ｉ）を用いて作成した酵素反応溶液（ＩＶ）についても同様に測定し、酵素反応初速度ｖｉを算出する。（Ｂ）を含まない時の酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ）濃度での相対活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出する。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成する。このプロットに近似直線を描いたときの傾きＫｉ（ａｐｐ）、測定時の基質濃度［Ｓ］及びミカエリス定数Ｋｍを式Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）に当てはめてＫｉを算出する。 <Measurement method of inhibition constant Ki>
Low temperature optimal protease / protease activity inhibitor mixed solution containing a certain amount of low temperature optimal protease (A), protease activity inhibitor (B), pH adjuster (M) and water adjusted to the optimal temperature and optimal pH Create (i). Also, several types of (i) having different concentrations of (B) are created. The prepared (i) is allowed to stand for several tens of minutes to several hours. Substrate (E) is added to each (i) after standing to prepare an enzyme reaction solution (IV).
The pH adjuster (M) used in (i) and (IV) is preferably a Good buffer such as a HEPES buffer or MES buffer from the viewpoint of ease of handling and stability. The concentration (molar concentration) of (M) in (i) and (IV) is 25 to 500 mM, as long as it can be adjusted to the optimum pH.
The concentration (molar concentration) of the low temperature optimal protease (A) in (i) is close to the concentration of (A) when the above-mentioned Km was determined, and the substrate (D) to be added to (i) later The molar concentration is 1/1000 to 1/10. The molar concentration of (A) in (IV) is 1/1000 to 1/10 of the molar concentration of substrate (E) in (IV).
The concentration (molar concentration) of the protease activity inhibitor (B) in (i) and (IV) is 1 to 1000 times the concentration (molar concentration) of the low-temperature optimal protease (A), and four or more types. Create one that does not include (B).
The molar concentration of the substrate (E) in the enzyme reaction solution (IV) is the optimum substrate concentration (1 to 2 times the third of the Michaelis constant Km).
The standing time of (i) is the time until (A) and (B) are sufficiently combined and the activity of the low-temperature optimal protease (A) becomes constant, and is determined in advance through experiments.
The time until the activity of the low temperature optimal protease (A) becomes constant can be determined by an activity measurement method using absorbance described later. Specifically, after preparing the protease / protease activity inhibitor mixed solution (i), the slope of the straight line (coefficient k) is determined at regular intervals by an activity measurement method using absorbance described later. The time until the coefficient k becomes constant is the time until the activity of (A) becomes constant.
After preparing the enzyme reaction solution (IV) under the conditions of optimal temperature and optimal pH for protease activity, using a spectrophotometer, the absorbance at a wavelength where the product has a maximum absorption within a wavelength range of 300 to 450 nm Aλ is measured over time. Although the measurement time h varies depending on the activity of the enzyme, it may be changed by 0.1 or more within a range where the absorbance does not exceed 0.8. The initial enzyme reaction rate v is calculated from the absorbance change ΔAλ per unit time (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) and the molar absorption constant ε at the measurement wavelength of the product using the above equation (1). Further, the enzyme reaction solution (IV) prepared using (i) having different concentrations of the protease activity inhibitor (B) is also measured in the same manner, and the initial reaction rate vi is calculated. The initial enzyme reaction rate when (B) is not included is vo, and the relative activity α (x = vi / vo) at each concentration (B) is calculated.
Plot 1 / α on the horizontal axis and [Molar concentration of (B)] / (1-α) on the vertical axis to create a Henderson plot. The slope Ki (app) when drawing an approximate straight line on this plot, the substrate concentration [S] at the time of measurement, and the Michaelis constant Km are applied to the equation Ki = Ki (app) / (1+ [S] / Km) to obtain Ki. calculate.

上記Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットは、具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１２７，１９７２，ｐ２１−３３３に記載されている方法を用いる。   The Henderson plot is specifically described in Biochem. J. et al. 127, 1972, p21-333.

本発明において、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の阻害定数Ｋｉは、１ｐＭ〜１０μＭであり、適度な低温至適プロテアーゼ濃度範囲で低温至適プロテアーゼ活性を抑制及び回復並びに低温至適プロテアーゼの耐熱性を向上できるとの観点から、１ｎＭ〜１μＭが好ましい。   In the present invention, the inhibitory constant Ki of the protease activity inhibitor (B) is 1 pM to 10 μM, and suppresses and recovers the low temperature optimal protease activity within the appropriate low temperature optimal protease concentration range, and the heat resistance of the low temperature optimal protease. From the viewpoint that it can be improved, 1 nM to 1 μM is preferable.

上記阻害定数Ｋｉが１ｐＭ未満では、低温至適プロテアーゼ（Ａ）とプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の結合が強いため、（Ａ）の活性を回復させるには大量に希釈しなければならない。例えば、Ｋｉが０．１ｐＭの（Ｂ）を、（Ａ）と等モル量用いて（Ａ）の活性を２０％以下にした場合、タンパク質溶液中の（Ａ）が約１．０×１０^-10重量％の濃度になるように大希釈しなければ（Ａ）の活性を５０％以上に回復することができない。しかしながら、（Ａ）の濃度が１．０×１０^-10重量％以下では、低温至適プロテアーゼを衣料用洗浄剤等として使用する場合、添加することによる有用な効果が得られない。
一方、（Ｂ）の阻害定数Ｋｉが１０μＭより大きくなると、（Ａ）の活性を抑制するのに、大量の（Ｂ）が必要となる。また、（Ｂ）を大量に添加すると、大量に希釈しなければ（Ａ）の活性を回復させることができない。 When the inhibition constant Ki is less than 1 pM, the low-temperature optimum protease (A) and the protease activity inhibitor (B) are strongly bound. Therefore, in order to recover the activity of (A), it must be diluted in a large amount. For example, when (B) having a Ki of 0.1 pM is used in an equimolar amount with (A) and the activity of (A) is 20% or less, (A) in the protein solution is about 1.0 × 10 ⁻ The activity of (A) cannot be recovered to 50% or more unless it is diluted to a concentration of ¹⁰ % by weight. However, when the concentration of (A) is 1.0 × 10 ⁻¹⁰ wt% or less, when a low-temperature optimum protease is used as a cleaning agent for clothing, a useful effect due to addition cannot be obtained.
On the other hand, when the inhibition constant Ki of (B) is larger than 10 μM, a large amount of (B) is required to suppress the activity of (A). Moreover, when (B) is added in a large amount, the activity of (A) cannot be recovered unless it is diluted in a large amount.

本発明において、（Ｂ）としては、上記の条件を満たす公知のプロテアーゼ活性阻害剤が含まれる。（Ｂ）としては、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）及び非タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）が含まれる。   In the present invention, (B) includes known protease activity inhibitors that satisfy the above conditions. (B) includes proteinaceous protease activity inhibitors (B1) and non-protein protease activity inhibitors (B2).

タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）は、天然物から抽出された又は宿主細胞に遺伝子を組み込むことで発現されたタンパク質であり、低温至適プロテアーゼの活性を阻害する性質をもつタンパク質である。（Ｂ１）として、例えば、ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）及びタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−２）等が挙げられる。   The proteinaceous protease activity inhibitor (B1) is a protein extracted from a natural product or expressed by incorporating a gene into a host cell, and has a property of inhibiting the activity of a low-temperature optimal protease. Examples of (B1) include proteinaceous protease activity inhibitors (B1-1) and proteinaceous protease activity inhibitors (B1-2) belonging to the potato inhibitor 1 family.

ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）としては、配列番号１のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸配列を置換した配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−１）、（Ｂ１−１−１）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−３）及びその他のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−４）が含まれる。   As a proteinaceous protease activity inhibitor (B1-1) belonging to the potato inhibitor 1 family, a proteinaceous protease activity inhibitor having a sequence (Y) in which 1 to 8 amino acid sequences of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted ( B1-1-1), a proteinaceous protease activity inhibitor (B1-1-2) having 90% or more homology with the amino acid sequence of (B1-1-1), having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 to 28 Proteinaceous protease activity inhibitors (B1-1-3) and other proteinaceous protease activity inhibitors (B1-1-4) are included.

プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−１）は、 配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換した配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であって、下記（１）〜（８）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤である。
（１）（Ｙ）の１２位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ１）である
（２）（Ｙ）の３８位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ２）である
（３）（Ｙ）の４８位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ３）である
（４）（Ｙ）の５０位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ４）である
（５）（Ｙ）の５１位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ５）である
（６）（Ｙ）の５２位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ６）である
（７）（Ｙ）の５３位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ７）である
（８）（Ｙ）の７０位のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ８）である
（Ｘ１）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸
（Ｘ２）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ以外のアミノ酸
（Ｘ３）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸
（Ｘ４）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸
（Ｘ５）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ６）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸
（Ｘ７）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸
（Ｘ８）：アミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸
（Ｘ０）：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ A protease activity inhibitor (B1-1-1) is a protein having a sequence (Y) in which 1 to 8 amino acids of the amino acid sequence in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are replaced with an amino acid different from the amino acid before the change It is a protein protease activity inhibitor, Comprising: It is a protein protease activity inhibitor which satisfy | fills at least 1 condition among following (1)-(8).
(1) The amino acid at position 12 of (Y) is the following amino acid (X1) (2) The amino acid at position 38 of (Y) is the following amino acid (X2) (3) The amino acid at position 48 of (Y) is The following amino acid (X3) (4) The amino acid at position 50 of (Y) is the following amino acid (X4) (5) The amino acid at position 51 of (Y) is the following amino acid (X5) (6) (Y The amino acid at position 52 in () is the following amino acid (X6) (7) The amino acid at position 53 in (Y) is the following amino acid (X7) (8) The amino acid at position 70 in (Y) is the following amino acid (X8) (X1): amino acid other than Glu among amino acids (X0): amino acid other than Val among amino acids (X0) (X3): amino acids other than Met among amino acids (X0) (X4): amino acids ( X0) except for Tyr Noic acid (X5): Amino acid other than Arg among amino acids (X0) (X6): Amino acid other than Ile among amino acids (X0) (X7): Amino acid other than Asp among amino acids (X0) (X8): Amino acids ( Amino acid other than Arg (X0): Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val

上記（１）の条件において、（Ｘ１）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＧｌｕ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、Ａｓｎ及びＧｌｎであり、特に好ましくはＡｌａ及びＡｓｐである。
上記（２）の条件において、（Ｘ２）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＶａｌ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｒｐが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｅｕ及びＩｌｅであり、特に好ましくはＡｌａ及びＩｌｅである。
上記（３）の条件において、（Ｘ３）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＭｅｔ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ及びＶａｌであり、特に好ましくはＡｌａ及びＧｌｙである。
上記（４）の条件において、（Ｘ４）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＴｙｒ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｐｈｅ及びＬｅｕであり、特に好ましくはＡｌａ、Ｐｈｅ及びＬｅｕである。
上記（５）の条件において、（Ｘ５）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｌｙｓ，Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ及びＨｉｓである。
上記（６）の条件において、（Ｘ６）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＩｌｅ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ及びＧｌｎである。
上記（７）の条件において、（Ｘ７）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｓｐ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＧｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｎ及びＧｌｎである。
上記（８）の条件において、（Ｘ８）はアミノ酸（Ｘ０）のうちＡｒｇ以外のアミノ酸であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、Ａｌａ、Ｌｙｓ，Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＶａｌが好ましく、さらに好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ及びＬｅｕであり、特に好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ及びＬｙｓである。 In the condition (1) above, (X1) is an amino acid other than Glu among the amino acids (X0), but moderate suppression of low-temperature optimal protease activity, improvement in heat resistance of low-temperature optimal protease, and low-temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Asp, Ala, Asn, Gln, Leu, Ser, Thr and Val are preferable, more preferably Asp, Ala, Asn and Gln, and particularly preferably Ala and Asp. is there.
In the above condition (2), (X2) is an amino acid other than Val among the amino acids (X0), but moderate suppression of low-temperature optimal protease activity, improvement in heat resistance of low-temperature optimal protease, and low-temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Ala, Gly, Ile, Leu, Phe, Ser, Thr and Trp are preferred, Ala, Leu and Ile are more preferred, and Ala and Ile are particularly preferred.
In the condition (3) above, (X3) is an amino acid other than Met among the amino acids (X0), but moderate suppression of low-temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low-temperature optimal protease, and low-temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Ala, Gly, Ile, Leu, Ser, Thr and Val are preferred, more preferably Ala, Gly, Leu, Ser and Val, particularly preferably Ala and Gly. is there.
In the above condition (4), (X4) is an amino acid other than Tyr among the amino acids (X0), but moderate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease, and low temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Ser, Thr and Val are preferable, more preferably Ala, Phe and Leu, and particularly preferably Ala, Phe and Leu. is there.
In the condition (5) above, (X5) is an amino acid other than Arg among the amino acids (X0), but moderate suppression of low-temperature optimal protease activity, improvement in heat resistance of low-temperature optimal protease, and low-temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Ala, Lys, His, Ile, Leu, Ser, Thr and Val are preferable, and Ala, Lys and His are more preferable.
In the condition (6) above, (X6) is an amino acid other than Ile among the amino acids (X0), but moderate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease, and low temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Glu, Ala, Asn, Gln, Leu, Ser, Thr and Val are preferable, and Ala, Val and Gln are more preferable.
In the condition (7) above, (X7) is an amino acid other than Asp among the amino acids (X0), but moderate suppression of low-temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low-temperature optimal protease, and low-temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Glu, Ala, Asn, Gln, Ile, Leu, Ser, Thr and Val are preferable, and Glu, Ala, Asn and Gln are more preferable.
In the above condition (8), (X8) is an amino acid other than Arg among the amino acids (X0), but moderate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease, and low temperature optimality during dilution. From the viewpoint of easy recovery of suitable protease activity, Ala, Lys, His, Ile, Gly, Leu, Ser, Thr and Val are preferred, more preferably Ala, Lys, Gly, Ile and Leu, particularly preferably. Ala, Gly and Lys.

（Ｂ１−１−１）は、配列番号１のアミノ酸配列の１〜８個のアミノ酸を変更前のアミノ酸とは別のアミノ酸と置換した配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであるが、配列（Ｙ）中におけるアミノ酸の置換数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜５個が好ましく、さらに好ましくは１〜３個である。   (B1-1-1) is a proteinaceous protease inhibitor having a sequence (Y) in which 1 to 8 amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with amino acids different from the amino acids before change, The number of amino acid substitutions in (Y) is 1 to 5 from the viewpoints of moderate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease, and ease of recovery of low temperature optimal protease activity upon dilution. The number is preferable, and more preferably 1 to 3.

（Ｂ１−１−１）は、配列（Ｙ）を少なくとも１つ有すればよく、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から１〜４個が好ましい。   (B1-1-1) only needs to have at least one sequence (Y), which is suitable for moderate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease, and low temperature optimal protease activity during dilution. From the viewpoint of easy recovery, 1 to 4 is preferable.

本発明において、（Ｂ１−１−１）は配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであり、配列（Ｙ）のみからなるものでもよく、配列（Ｙ）のＣ末端及び／又はＮ末端に配列（Ｚ）を１個又は複数個有しているものでもよく、これらが繰り返された配列でもよい。
配列（Ｚ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。
配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個である。
（Ｂ１−１−１）が配列（Ｚ）を有する場合、配列（Ｚ）の個数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましい。 In the present invention, (B1-1-1) is a proteinaceous protease inhibitor having the sequence (Y), which may consist of only the sequence (Y), and is arranged at the C-terminus and / or N-terminus of the sequence (Y). It may have one or a plurality of (Z), and may be an arrangement in which these are repeated.
The sequence (Z) is a peptide sequence in which one amino acid or two or more amino acids are bound.
The number of amino acids constituting the sequence (Z) is from the viewpoint of appropriate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease, and ease of recovery of low temperature optimal protease activity upon dilution. 100 is preferable, and more preferably 1 to 50.
In the case where (B1-1-1) has the sequence (Z), the number of the sequences (Z) is appropriate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of the low temperature optimal protease, and low temperature optimal protease during dilution. From the viewpoint of easy recovery of activity, 1 to 100 is preferable.

また、（Ｂ１−１−１）を構成するアミノ酸配列中の配列（Ｙ）以外のアミノ酸の数は、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個である。   In addition, the number of amino acids other than the sequence (Y) in the amino acid sequence constituting (B1-1-1) includes moderate suppression of low-temperature optimal protease activity, improvement in heat resistance of low-temperature optimal protease, and low temperature during dilution. From the viewpoint of easy recovery of optimal protease activity, 1 to 100 is preferable, and 1 to 50 is more preferable.

（Ｂ１−１−１）は配列（Ｙ）を有するタンパク質性プロテアーゼインヒビターであり、具体的には、配列番号２〜２５のタンパク質性プロテアーゼインヒビターが挙げられる。
（Ｂ１−１−１）として、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、配列番号２〜２５が好ましい。また、プロテアーゼの持続性の観点から、４、１２、１８、１９、２２、２３、２４及び２５が好ましい。 (B1-1-1) is a proteinaceous protease inhibitor having the sequence (Y), and specific examples include proteinaceous protease inhibitors of SEQ ID NOs: 2 to 25.
As (B1-1-1), from the viewpoints of moderate suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance of low temperature optimal protease and ease of recovery of low temperature optimal protease activity upon dilution, SEQ ID NOs: 2 to 25 Is preferred. Moreover, 4, 12, 18, 19, 22, 23, 24 and 25 are preferable from the viewpoint of the persistence of the protease.

プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）は、上記（Ｂ１−１−１）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であって、下記（９）〜（１６）のうち少なくとも１つの条件を満たすタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）であるタンパク質性プロテアー活性阻害剤である。
（９）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の１２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ１）である
（１０）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の３８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ２）である
（１１）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の４８位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ３）である
（１２）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ４）である
（１３）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５１位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ５）である
（１４）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５２位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ６）である
（１５）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の５３位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ７）である
（１６）（Ｂ１−１−１）において、配列（Ｙ）の７０位に相当する位置のアミノ酸が下記アミノ酸（Ｘ８）である The protease activity inhibitor (B1-1-2) is a proteinaceous protease activity inhibitor having 90% or more homology with the amino acid sequence of (B1-1-1), and includes the following (9) to (16): ) Is a proteinaceous protease activity inhibitor (B1-1-2) that satisfies at least one of the conditions.
(9) In (B1-1-1), the amino acid at the position corresponding to position 12 of the sequence (Y) is the following amino acid (X1) (10) In (B1-1-1), In (11) (B1-1-1), the amino acid at the position corresponding to position 38 is the following amino acid (X2), and the amino acid at the position corresponding to position 48 in the sequence (Y) is the following amino acid (X3) ( 12) In (B1-1-1), the amino acid at the position corresponding to position 50 of the sequence (Y) is the following amino acid (X4): (13) In (B1-1-1), 51 of the sequence (Y) In (14) (B1-1-1), the amino acid at the position corresponding to the position is the following amino acid (X5), and the amino acid at the position corresponding to position 52 in the sequence (Y) is the following amino acid (X6) (15 ) (B1-1-1), the sequence (Y) In amino acid position corresponding to position 53-position is the following amino acids (X7) (16) (B1-1-1), amino acid at the position corresponding to position 70 of SEQ (Y) is the following amino acid (X8)

本発明において、（Ｂ１−１−２）のアミノ酸配列は、（Ｂ１−１−１）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤であるが、低温至適プロテアーゼ活性の適度な抑制、低温至適プロテアーゼの耐熱性向上及び希釈時の低温至適プロテアーゼ活性の回復しやすさの観点から、９５％以上の相同性を有することが好ましく、さらに好ましくは９７％以上の相同性を有することである。
アミノ酸配列の相同性は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供する相同性解析プログラム「ＢＬＡＳＴ」の、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いて解析する（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。 In the present invention, the amino acid sequence of (B1-1-2) is a proteinaceous protease activity inhibitor having 90% or more homology with the amino acid sequence of (B1-1-1). From the viewpoints of moderate suppression of heat resistance, improvement in heat resistance of low temperature optimal protease and ease of recovery of low temperature optimal protease activity upon dilution, it is preferable to have 95% or more homology, more preferably 97% or more It is to have homology.
The homology of amino acid sequences is analyzed using the blastp algorithm of the homology analysis program “BLAST” provided by National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). .

配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−３）としては、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列を有するものであればよく、具体的には、配列番号２６〜２８のアミノ酸配列であるものが含まれる。   The proteinaceous protease activity inhibitor (B1-1-3) having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 26 to 28 may be any one having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 26 to 28, and specifically, SEQ ID NO: 26 Those having an amino acid sequence of ˜28 are included.

その他のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−４）としては、Ｅｇｌｉｎ Ｃ及びＷｈｅａｔ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等が挙げられる。   Examples of other proteinaceous protease activity inhibitors (B1-1-4) include Eglin C and Wheat Subtilisin / Chymotrypsin inhibitor.

タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−２）には、ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）以外の上記の条件を満たす公知のタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤が含まれ、具体的には、Ｆｕｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＨｕｍａｎ ＬＥＫＴＩ等が挙げられる。   The proteinaceous protease activity inhibitor (B1-2) includes known proteinase protease activity inhibitors that satisfy the above conditions other than the proteinaceous protease activity inhibitor (B1-1) belonging to the potato inhibitor 1 family, Specific examples include Fungal Protease Inhibitor F, Streptomyces Subtilisin Inhibitor, and Human LEKTI.

非タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）としては、上記（Ｂ１）以外の分子量５０〜１０００の化合物であり、低温至適プロテアーゼ（Ａ）と可逆的な結合を形成し、低温至適プロテアーゼの活性を阻害するものである。（Ｂ２）として、具体的には、２，４−ジクロロフェニルボロン酸等が挙げられる。   The non-protein protease activity inhibitor (B2) is a compound having a molecular weight of 50 to 1000 other than the above (B1), forms a reversible bond with the low temperature optimal protease (A), and the activity of the low temperature optimal protease It inhibits. Specific examples of (B2) include 2,4-dichlorophenylboronic acid.

上記（Ｂ）のうち、入手しやすさ、低温至適プロテアーゼ活性の抑制及び耐熱性向上の観点から、タンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）が好ましく、さらに好ましくはポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）であり、特に好ましくはＥｇｌｉｎ Ｃ及びＷｈｅａｔ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒである。
また、上記（Ｂ）のうち、低温至適プロテアーゼ活性の抑制、耐熱性向上及び他のタンパク質の安定性の観点から、ポテトインヒビター１ファミリーに属するタンパク質性プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１）が好ましく、さらに好ましくはプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−１）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１−１−２）である。 Among the above (B), from the viewpoints of availability, suppression of low-temperature optimal protease activity and improvement of heat resistance, proteinaceous protease activity inhibitor (B1) is preferred, and protein properties belonging to the potato inhibitor 1 family are more preferred. Protease activity inhibitor (B1-1), particularly preferably Eglin C and Wheat Subtilisin / Chymotrypsin inhibitor.
Of the above (B), a protein protease activity inhibitor (B1-1) belonging to the potato inhibitor 1 family is preferable from the viewpoints of suppression of low temperature optimal protease activity, improvement of heat resistance and stability of other proteins. More preferred are a protease activity inhibitor (B1-1-1) and a protease activity inhibitor (B1-1-2).

本発明において、溶剤（Ｃ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が挙げられる。   In the present invention, examples of the solvent (C) include water, organic solvents, and mixtures thereof.

水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。   The water is not particularly limited, and examples thereof include tap water, ion exchange water, distilled water, and reverse osmosis water. Moreover, the buffer aqueous solution etc. which contain the pH adjuster (M) mentioned later in water are mentioned.

有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質の安定性の観点からアルコールが好ましい。   Examples of the organic solvent include alcohols (alcohols having 1 to 18 carbon atoms, specifically methanol, ethanol, butanol, ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, etc.), ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), ethers (tetrahydrofuran). , Diethyl ether, ethylene glycol monoalkyl ether, propylene glycol monoalkyl ether, cyclic ether, etc.), sulfoxide (dimethyl sulfoxide, etc.), aliphatic or alicyclic hydrocarbons (n-hexane, n-heptane, mineral spirit, cyclohexane, etc.) ) And fluorine-containing compounds (tetrafluoroethylene, etc.). Of these organic solvents, alcohol is preferred from the viewpoint of protein stability.

溶剤（Ｃ）としては、低温至適プロテアーゼの安定性の観点からアルコール及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｍ）を含むバッファー水溶液である。   As the solvent (C), alcohol and water are preferable from the viewpoint of stability of the low temperature optimal protease, more preferably water, and particularly preferably a buffer aqueous solution containing a pH adjuster (M).

本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）は、上記低温至適プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有するものである。
タンパク質溶液（Ｄ）中の（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質分解効果を発揮する観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜４０重量％であり、特に好ましくは０．０００１〜３０重量％である。
タンパク質溶液（Ｄ）中の（Ｂ）の含有量（重量％）は、低温至適プロテアーゼの活性阻害効果の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００１〜５０重量％であり、特に好ましくは０．０００１〜５０重量％である。
タンパク質溶液（Ｄ）中の（Ｃ）の含有量（重量％）は、低温至適プロテアーゼの安定性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、０．０００００００１〜９９．９９９９９８重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜９９．９９９９８重量％であり、特に好ましくは２０〜９９．９９９８％である。 The protein solution (D) in the present invention contains the aforementioned low-temperature optimal protease (A), protease activity inhibitor (B) and solvent (C).
The content (% by weight) of (A) in the protein solution (D) is 0.000001 to 50 based on the total weight of (A), (B), and (C) from the viewpoint of exerting a proteolytic effect. % By weight is preferable, more preferably 0.00001 to 40% by weight, and particularly preferably 0.0001 to 30% by weight.
The content (% by weight) of (B) in the protein solution (D) is 0 on the basis of the total weight of (A), (B) and (C) from the viewpoint of the activity-inhibiting effect of the low-temperature optimal protease. 0.000001 to 50% by weight is preferable, 0.00001 to 50% by weight is more preferable, and 0.0001 to 50% by weight is particularly preferable.
The content (% by weight) of (C) in the protein solution (D) is 0. 0% based on the total weight of (A), (B) and (C) from the viewpoint of the stability of the low temperature optimal protease. It is preferably from 00000001 to 99.999999% by weight, more preferably from 10 to 99.99998% by weight, and particularly preferably from 20 to 99.99998%.

タンパク質溶液（Ｄ）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）と低温至適プロテアーゼ（Ａ）のモル比（（Ｂ）のモル数／（Ａ）のモル数）は、低温至適プロテアーゼの効果的な阻害の観点から１〜１０００００が好ましく、さらに好ましくは１〜１０００であり、特に好ましくは１〜５００である。   The molar ratio of the protease activity inhibitor (B) and the low temperature optimal protease (A) in the protein solution (D) (number of moles of (B) / number of moles of (A)) is effective for the low temperature optimal protease. From the viewpoint of inhibition, 1 to 100,000 is preferable, more preferably 1 to 1000, and particularly preferably 1 to 500.

本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）には、上記の低温至適プロテアーゼ（Ａ）、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）以外に、無機塩（Ｇ）、糖（Ｈ）、アミノ酸（Ｉ）、低分子有機化合物（Ｊ）、脂肪酸（Ｋ）、油脂（Ｌ）、ｐＨ調整剤（Ｍ）、（Ａ）と（Ｂ）以外のタンパク質（Ｎ）及び界面活性剤（Ｏ）を含有することができる。   In the protein solution (D) in the present invention, in addition to the above-mentioned low temperature optimal protease (A), protease activity inhibitor (B) and solvent (C), inorganic salt (G), sugar (H), amino acid (I ), Low molecular organic compound (J), fatty acid (K), fat (L), pH adjuster (M), protein (N) other than (A) and (B), and surfactant (O) be able to.

無機塩（Ｇ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。   Examples of the inorganic salt (G) include sodium chloride, sodium borate, calcium chloride, magnesium chloride, sodium formate, magnesium sulfate, and ammonium sulfate.

糖（Ｈ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。   Examples of the sugar (H) include trehalose, sucrose, dextrin, cyclodextrin, maltose, fructose, hyaluronic acid and chondroitin sulfate.

アミノ酸（Ｉ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン及びそれらの塩等が挙げられる。   As amino acid (I), glycine, alanine, aspartic acid, asparagine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, leucine, lysine, histidine, cysteine, glutamine, glutamic acid, isoleucine, methionine, proline, serine, threonine, valine and their salts Can be mentioned.

脂肪酸（Ｋ）として、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸等が挙げられる。   Examples of the fatty acid (K) include oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, docosahexaenoic acid, and eicosapentaenoic acid.

油脂（Ｌ）としては、上記脂肪酸（Ｋ）のモノ、ジ、トリグリセリドが挙げられる。   Examples of the fat (L) include mono-, di-, and triglycerides of the above fatty acid (K).

ｐＨ調整剤（Ｍ）としては、従来のｐＨ調整剤が使用でき、例えば、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー及びクエン酸等が挙げられる。   As the pH adjuster (M), a conventional pH adjuster can be used, and examples thereof include borate buffer, phosphate buffer, acetate buffer, Tris buffer, HEPES buffer, and citric acid.

（Ａ）と（Ｂ）以外のタンパク質（Ｎ）としては、特に限定するものではないが、低温至適プロテアーゼ以外の酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられ、具体的には、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチド等が挙げられる。   The protein (N) other than (A) and (B) is not particularly limited, but examples include enzymes other than low-temperature optimal proteases, recombinant proteins, antibodies, peptides, and the like. Specifically, serum albumin , Collagen, casein, gelatin, silk peptide and the like.

界面活性剤（Ｏ）としては、後述する界面活性剤（Ｏ）が含まれ、好ましいものも同様である。   As the surfactant (O), a surfactant (O) described later is included, and preferable ones are also the same.

低分子有機化合物（Ｊ）としては、上記以外の分子量１０００以下の低分子有機化合物が含まれ、具体的には、酢酸ベンジル、メチルサリチル酸、ベンジルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、けい皮酸、カフェ酸、カテキン類、アスコルビン酸及びカロテノイド等が挙げられる。   Examples of the low molecular weight organic compound (J) include low molecular weight organic compounds having a molecular weight of 1000 or less other than those described above, specifically, benzyl acetate, methyl salicylic acid, benzyl salicylic acid, hydroxybenzoic acid, cinnamic acid, caffeic acid, Examples include catechins, ascorbic acid, and carotenoids.

本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる無機塩（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜１０％が好ましく、さらに好ましくは０〜５％、特に好ましくは０〜３％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる糖（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれるアミノ酸（Ｉ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる低分子有機化合物（Ｊ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる脂肪酸（Ｋ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる油脂（Ｌ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれるｐＨ調整剤（Ｍ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる低温至適プロテアーゼ以外のタンパク質（Ｎ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜３０％、特に好ましくは０〜１５％である。
本発明のタンパク質溶液（Ｄ）に含まれる界面活性剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、タンパク質の安定性の観点からタンパク質溶液（Ｄ）の重量に対し０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは０〜２５％、特に好ましくは０〜１０％である。 The content (% by weight) of the inorganic salt (G) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 10%, more preferably from the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. Is 0 to 5%, particularly preferably 0 to 3%.
The content (% by weight) of the saccharide (H) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 50%, more preferably from the weight of the protein solution (D), from the viewpoint of protein stability. 0 to 30%, particularly preferably 0 to 15%.
The content (% by weight) of amino acid (I) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably from 0 to 50%, more preferably from the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. 0 to 30%, particularly preferably 0 to 15%.
The content (% by weight) of the low molecular weight organic compound (J) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 50% with respect to the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. More preferably, it is 0 to 30%, and particularly preferably 0 to 15%.
The content (% by weight) of the fatty acid (K) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 50%, more preferably the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. 0 to 30%, particularly preferably 0 to 15%.
The content (% by weight) of the fat (L) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 50%, more preferably from the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. 0 to 30%, particularly preferably 0 to 15%.
The content (% by weight) of the pH adjusting agent (M) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 50% with respect to the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. Preferably it is 0 to 30%, particularly preferably 0 to 15%.
The content (% by weight) of the protein (N) other than the low-temperature optimal protease contained in the protein solution (D) of the present invention is 0 to 50% based on the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. Is more preferable, 0 to 30% is more preferable, and 0 to 15% is particularly preferable.
The content (% by weight) of the surfactant (O) contained in the protein solution (D) of the present invention is preferably 0 to 50% based on the weight of the protein solution (D) from the viewpoint of protein stability. Preferably it is 0 to 25%, particularly preferably 0 to 10%.

本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）溶剤（Ｃ）にｐＨ調整剤（Ｍ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）を添加し、２０℃〜４０℃で均一になるまで撹拌する。
（２）低温至適プロテアーゼ（Ａ）を添加し、２０℃〜４０℃℃で均一になるまで撹拌する（低温至適プロテアーゼ（Ａ）とプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）との結合速度の観点から、３０分以上であることが好ましい）。
（３）最後に（Ｇ）〜（Ｏ）を添加し、２５℃で均一になるまで撹拌し、タンパク質溶液（Ｄ）を製造する。 The protein solution (D) in this invention is obtained by mixing each component, and a manufacturing method is not specifically limited. An example is shown below.
(1) A pH adjuster (M) and a protease activity inhibitor (B) are added to the solvent (C), and the mixture is stirred at 20 to 40 ° C. until uniform.
(2) Add low temperature optimal protease (A) and stir until uniform at 20 ° C. to 40 ° C. (from the viewpoint of the binding rate between low temperature optimal protease (A) and protease activity inhibitor (B) 30 minutes or more).
(3) Finally, (G) to (O) are added and stirred at 25 ° C. until uniform to produce a protein solution (D).

本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）のｐＨは、タンパク質の安定性の観点から、ｐＨ３〜１０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５〜９である。
（Ｄ）のｐＨは、ｐＨ調整剤（Ｍ）によって適宜調整できる。 The pH of the protein solution (D) in the present invention is preferably pH 3 to 10, more preferably pH 5 to 9, from the viewpoint of protein stability.
The pH of (D) can be appropriately adjusted with a pH adjuster (M).

本発明におけるタンパク質溶液（Ｄ）は、吸光度を利用した活性測定法によるプロテアーゼ活性Ｘｉが、プロテアーゼ活性の残存によるプロテアーゼ自身及び／又は他のタンパク質の分解を防止するとの観点から、タンパク質溶液（Ｓ）の活性を基準として２０％以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜１０％であり、特に好ましくは０．０００１〜３％である。   The protein solution (D) in the present invention is a protein solution (S) from the viewpoint that the protease activity Xi by the activity measurement method using absorbance prevents degradation of the protease itself and / or other proteins due to the remaining protease activity. Is preferably 20% or less, more preferably 0.0001 to 10%, and particularly preferably 0.0001 to 3%.

タンパク質溶液（Ｓ）は、タンパク質溶液（Ｄ）において、（Ｂ）を（Ｂ）と同重量の（Ｃ）で置きかえたタンパク質溶液である。例えば、（Ｄ）中の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の含有量（重量％）が（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の合計重量を基準として、（Ａ）が２重量％、（Ｂ）が１８重量％、（Ｃ）が８０重量％である場合、（Ｓ）中の（Ａ）は２重量％、（Ｃ）は９８重量％である。   The protein solution (S) is a protein solution obtained by replacing (B) with (C) having the same weight as (B) in the protein solution (D). For example, the content (% by weight) of (A), (B) and (C) in (D) is 2% by weight based on the total weight of (A), (B) and (C). %, (B) is 18 wt%, and (C) is 80 wt%, (A) in (S) is 2 wt% and (C) is 98 wt%.

本発明において、吸光度を利用した活性測定法とは、基質（Ｄ）を用いて、一定温度、一定ｐＨ、上述の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の最適基質濃度の条件下で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する方法である。
基質（Ｅ）として、どの基質を用いるかは、上記Ｋｉを求める際に使用する基質と同様、タンパク質溶液（Ｄ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の分類により適宜選択される。
吸光度を利用した活性測定法として、具体的には、下記の測定によって求められる。 In the present invention, the activity measurement method using absorbance is an enzyme reaction using a substrate (D) under conditions of a constant temperature, a constant pH, and an optimal substrate concentration for the activity of the above-mentioned low temperature optimal protease (A). Is a method of measuring the absorbance Aλ at a wavelength at which the product has a maximum absorption over time.
Which substrate is used as the substrate (E) is appropriately selected according to the classification of the low-temperature optimum protease (A) in the protein solution (D), as with the substrate used when obtaining Ki.
Specifically, the activity measurement method using absorbance is determined by the following measurement.

＜吸光度を利用した活性測定法＞
○プロテアーゼ活性Ｘｉ
一定量のタンパク質溶液（Ｄ）及び一定量の基質（Ｅ）を添加して酵素反応溶液（Ｖ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｖ）の温度は、０〜５０℃の範囲内で、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性が失活せず、活性があり、吸光度の測定ができる温度で、測定の間一定に保つことができればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）中の基質（Ｅ）のモル濃度は、最適基質濃度で上記ミカエリス定数Ｋｍの３分の１〜２倍であり、且つ、（Ｖ）中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）のモル濃度の５〜１０００００倍の濃度であればいい。
酵素反応溶液（Ｖ）について、分光光度計を用いて、波長３００〜４５０ｎｍの範囲内で、酵素反応の生成物が極大吸収をもつ波長での吸光度Ａλを経時的に測定する。測定時の温度は、酵素反応溶液（Ｖ）を作成したときの温度と同温度である。酵素反応溶液（Ｖ）を作成直後の吸光度Ａλ₀及び酵素反応溶液（Ｖ）を作成からｈ時間後の吸光度Ａλ_hを測定し、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を求める。測定時間は酵素の活性によって異なるが、吸光度が０．８を超えない範囲で０．１以上変化するのが見られれば良い。吸光度の変化ΔＡλを縦軸に、時間ｈを横軸にプロットして、直線の傾き（係数ｋ_X）を求める。 <Activity measurement method using absorbance>
○ Protease activity Xi
An enzyme reaction solution (V) is prepared by adding a certain amount of protein solution (D) and a certain amount of substrate (E).
The temperature of the enzyme reaction solution (V) is within the range of 0 to 50 ° C., the temperature of the low temperature optimal protease (A) is not inactivated, the activity is active, and the absorbance can be measured. I hope I can keep it up.
The molar concentration of the substrate (E) in the enzyme reaction solution (V) is 1 to 2 times the above Michaelis constant Km at the optimal substrate concentration, and the low temperature optimal protease (A) in (V) The concentration may be 5 to 100,000 times the molar concentration.
For the enzyme reaction solution (V), using a spectrophotometer, the absorbance Aλ at a wavelength at which the product of the enzyme reaction has a maximum absorption is measured over time within a wavelength range of 300 to 450 nm. The temperature at the time of measurement is the same temperature as when the enzyme reaction solution (V) was prepared. The absorbance Aλ ₀ immediately after preparation of the enzyme reaction solution (V) and the absorbance Aλ _h after the preparation of the enzyme reaction solution (V) are measured to determine the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ). The measurement time varies depending on the activity of the enzyme, but it is sufficient that the absorbance changes by 0.1 or more within a range not exceeding 0.8. The absorbance change ΔAλ is plotted on the vertical axis and the time h is plotted on the horizontal axis to determine the slope of the straight line (coefficient k _x ).

タンパク質溶液（Ｄ）に変えてタンパク質溶液（Ｓ）を使用する以外は同様にして吸光度を測定し、直線の傾き（係数ｋ_S）を求める。 The absorbance is measured in the same manner except that the protein solution (S) is used instead of the protein solution (D), and the slope of the straight line (coefficient k _S ) is obtained.

上記タンパク質溶液（Ｄ）及び（Ｓ）は、作成してから３０分以上６時間以内のものを使用する。   The protein solutions (D) and (S) are used from 30 minutes to 6 hours after preparation.

（Ｄ）のプロテアーゼ活性Ｘｉは、タンパク質溶液（Ｄ）及びタンパク質溶液（Ｓ）を用いた上記の直線の傾き係数ｋ_X及びｋ_Sから、下記数式（３）によって求められる。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋ_X／ｋ_S｝×１００ （３） The protease activity Xi of (D) is determined by the following mathematical formula (3) from the slope coefficients k _X and k _S of the straight line using the protein solution (D) and the protein solution (S).
Protease activity Xi (%) = {k _X / k _S } × 100 (3)

本発明のタンパク質溶液（Ｄ）の使用方法は、従来の   The method of using the protein solution (D) of the present invention is a conventional method.

本発明の洗剤組成物は、上記タンパク質溶液（Ｄ）及び界面活性剤（Ｏ）を含有する洗剤組成物である。   The detergent composition of the present invention is a detergent composition containing the protein solution (D) and the surfactant (O).

本発明において、界面活性剤（Ｏ）は、ノニオン性界面活性剤（Ｏ−１）、アニオン性界面活性剤（Ｏ−２）、カチオン性界面活性剤（Ｏ−３）及び両性界面活性剤（Ｏ−４）が挙げられる。   In the present invention, the surfactant (O) is a nonionic surfactant (O-1), an anionic surfactant (O-2), a cationic surfactant (O-3), or an amphoteric surfactant ( O-4).

ノニオン性界面活性剤（Ｏ−１）としては、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）アルキレンオキサイド（炭素数２〜８）付加物（重合度＝１〜１００）［オレイルアルコールエチレンオキサイド１１モル付加物等］、（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）グリコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝２０）及びジステアリン酸ポリエチレングリコール（重合度＝３０）等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル［モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸エチレングリコール及びモノラウリン酸ソルビタン等］、多価（２価〜１０価又はそれ以上）アルコール高級脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル（ポリ）アルキレンオキサイド付加物（アルキレン基の炭素数２〜８，重合度＝１〜１００）［ソルビタンモノラウレートエチレンオキサイド（重合度＝１０）付加物及びメチルグルコースジオレエートエチレンオキサイド（重合度＝５０）付加物等］、脂肪酸Ｎ−ヒドロキシアルキルアミド［１：１型ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド及び１：１型ラウリン酸ジエタノールアミド等］、アルキル（炭素数１〜２２）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）フェニルエーテル、アルキル（炭素数８〜２４）（ポリ）オキシアルキレン（炭素数２〜８、重合度＝１〜１００）−アミノアルキル（炭素数８〜２４）−エーテル及びアルキル（炭素数８〜２４）ジアルキル（炭素数１〜６）アミンオキシド［ラウリルジメチルアミンオキシド等］等が挙げられる。   As nonionic surfactant (O-1), aliphatic alcohol (carbon number 8-24) alkylene oxide (carbon number 2-8) adduct (degree of polymerization = 1-100) [oleyl alcohol ethylene oxide 11 mol addition Products], (poly) oxyalkylene (carbon number 2-8, polymerization degree = 1-100) glycol higher fatty acid (carbon number 8-24) ester [polyethylene glycol monostearate (polymerization degree = 20) and polyethylene distearate Glycol (degree of polymerization = 30), etc., polyvalent (divalent to 10-valent or higher) alcohol fatty acid (carbon number 8-24) ester [glyceryl monostearate, ethylene glycol monostearate, sorbitan monolaurate, etc.], Multivalent (divalent to 10-valent or higher) alcohol higher fatty acid (8 to 24 carbon atoms) (Poly) alkylene oxide adduct (alkylene group having 2 to 8 carbon atoms, polymerization degree = 1 to 100) [sorbitan monolaurate ethylene oxide (polymerization degree = 10) adduct and methyl glucose dioleate ethylene oxide (polymerization) Degree = 50) adducts, etc.], fatty acid N-hydroxyalkylamide [1: 1 type coconut oil fatty acid diethanolamide, 1: 1 type lauric acid diethanolamide, etc.], alkyl (C1-22) (poly) oxyalkylene (C2-8, degree of polymerization = 1-100) phenyl ether, alkyl (C8-8) (poly) oxyalkylene (C2-8, degree of polymerization = 1-100) -aminoalkyl (carbon number) 8-24) -ethers and alkyls (8-24 carbon atoms) dialkyl (1-6 carbon atoms) amine oxides [lauryl Methylamine oxide, and the like] and the like.

アニオン性界面活性剤（Ｏ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、アシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］が挙げられる。   Examples of the anionic surfactant (O-2) include an alkyl ether carboxylic acid having 8 to 24 carbon atoms or a salt thereof and an alkyl (poly) oxyethylene ether carboxylic acid having 8 to 24 carbon atoms or a salt thereof [(poly) oxy Ethylene (degree of polymerization = 1 to 100) sodium lauryl ether acetate and (poly) oxyethylene (degree of polymerization = 1 to 100) disodium lauryl sulfosuccinate, etc.], alkyl sulfate salts having 8 to 24 carbon atoms and carbon numbers 8 to 8 24 alkyl (poly) oxyethylene sulfate esters [sodium lauryl sulfate, lauryl (poly) oxyethylene (degree of polymerization = 1-100) sodium sulfate and lauryl (poly) oxyethylene (degree of polymerization = 1-100) sulfate-tri Ethanolamine salts, etc.], palm oil fatty acid monoethanolamide sulfate sulfonate Lithium, alkyl phenyl sulfonates having 8 to 24 carbon atoms [sodium dodecylbenzene sulfonate, etc.], alkyl phosphate salts having 8 to 24 carbon atoms and alkyl (poly) oxyethylene phosphate salts having 8 to 24 carbon atoms [Sodium lauryl phosphate and (poly) oxyethylene (degree of polymerization = 1-100) sodium lauryl ether phosphate, etc.], fatty acid salt [sodium laurate, triethanolamine laurate, etc.], acylated amino acid salt [coconut oil fatty acid Methyl taurine sodium, coconut oil fatty acid sarcosine sodium, coconut oil fatty acid sarcosine triethanolamine, N-coconut oil fatty acid acyl-L-glutamic acid triethanolamine, N-coconut oil fatty acid acyl-L-glutamic acid sodium and lauroylmethyl-β -Alanine Sodium etc.].

カチオン性界面活性剤（Ｏ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。   As the cationic surfactant (O-3), quaternary ammonium salt type [stearyl trimethyl ammonium chloride, behenyl trimethyl ammonium chloride, distearyl dimethyl ammonium chloride, ethyl lanolin sulfate fatty acid aminopropylethyl dimethyl ammonium, etc.] and amine salts Type [diethylaminoethylamide stearate lactate, dilaurylamine hydrochloride, oleylamine lactate, etc.] and the like.

両性界面活性剤（Ｏ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］、アミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］が挙げられる。   As the amphoteric surfactant (O-4), a betaine-type amphoteric surfactant [coconut oil fatty acid amidopropyldimethylaminoacetic acid betaine, lauryldimethylaminoacetic acid betaine, 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoli Nium betaine, laurylhydroxysulfobetaine, lauroylamidoethylhydroxyethylcarboxymethylbetaine hydroxypropyl sodium phosphate, etc.] and amino acid type amphoteric surfactants [sodium β-laurylaminopropionate, etc.].

界面活性剤（Ｏ）としては、１種又は２種以上を使用することができる。２種以上の界面活性剤を使用する場合、その組み合わせとしては、ノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤の組み合わせ等が挙げられる。   As surfactant (O), 1 type (s) or 2 or more types can be used. When two or more kinds of surfactants are used, combinations thereof include nonionic surfactants and anionic surfactants, nonionic surfactants and cationic surfactants, and nonionic surfactants and amphoteric surfactants. Examples include combinations of agents.

界面活性剤（Ｏ）として、洗浄性の観点から、ノニオン性界面活性剤単独での使用、及びノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤との組み合わせでの使用が好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）エチレンオキサイド付加物（重合度＝１〜１００）が好ましく、さらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１８）エチレンオキサイド付加物（重合度４〜２０）、次にさらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１５）エチレンオキサイド付加物（重合度＝８〜１２）、特に好ましくはオレイルアルコールエチレンオキサイド１１モル付加物である。
アニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩、脂肪酸塩、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩が好ましく、さらに好ましくは、炭素数１２〜１６のアルキルフェニルスルホン酸塩及び炭素数８〜１６の脂肪酸塩、次にさらに好ましくは、ドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩及びラウリン酸ナトリウムである。 As the surfactant (O), from the viewpoint of detergency, it is preferable to use a nonionic surfactant alone or a combination of a nonionic surfactant and an anionic surfactant.
The nonionic surfactant is preferably an aliphatic alcohol (8 to 24 carbon atoms) ethylene oxide adduct (degree of polymerization = 1 to 100), more preferably an aliphatic alcohol (12 to 12 carbon atoms) from the viewpoint of detergency. 18) Ethylene oxide adduct (degree of polymerization 4-20), then more preferably aliphatic alcohol (carbon number 12-15) ethylene oxide adduct (degree of polymerization = 8-12), particularly preferably oleyl alcohol ethylene oxide 11 Mole adduct.
As an anionic surfactant, from a viewpoint of detergency, an alkylphenyl sulfonate having 8 to 24 carbon atoms, a fatty acid salt, an alkyl sulfate ester having 8 to 24 carbon atoms, and an alkyl (poly) having 8 to 24 carbon atoms. Preferred are oxyethylene sulfate salts, more preferably alkyl phenyl sulfonates having 12 to 16 carbon atoms and fatty acid salts having 8 to 16 carbon atoms, and more preferably dodecylbenzenesulfonic acid monoethanolamine salts and lauric acid. Sodium.

洗剤組成物中のタンパク質溶液（Ｄ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、（Ｄ）及び（Ｏ）の合計重量に基づいて、０.１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜８０重量％、特に好ましくは１〜７０重量％である。
洗剤組成物中の界面活性剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、（Ｄ）及び（Ｏ）の合計重量に基づいて、１〜９９.９重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜９９．５重量％、特に好ましくは３０〜９９重量％である。 The content (% by weight) of the protein solution (D) in the detergent composition is preferably 0.1 to 99% by weight, based on the total weight of (D) and (O), from the viewpoint of detergency. Preferably it is 0.5 to 80 weight%, Most preferably, it is 1 to 70 weight%.
The content (% by weight) of the surfactant (O) in the detergent composition is preferably 1 to 99.9% by weight based on the total weight of (D) and (O) from the viewpoint of detergency. More preferably, it is 20-99.5 weight%, Most preferably, it is 30-99 weight%.

洗剤組成物中のタンパク質溶液（Ｄ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０.１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜６０重量％、特に好ましくは１〜４５重量％である。
洗剤組成物中の界面活性剤（Ｏ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜９８.９９９９９８重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜８９.９９９８重量％、特に好ましくは３０〜７８．９９８重量％である。
洗剤組成物中の低温至適プロテアーゼ（Ａ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０．０００００１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜４重量％、特に好ましくは０．００１〜３重量％である。
洗剤組成物中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の含有量（重量％）は、洗浄性の持続性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０．０００００１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜４０重量％、特に好ましくは０．００１〜３０重量％である。
洗剤組成物中の溶剤（Ｃ）の含有量（重量％）は、低温至適プロテアーゼ（Ａ）及びプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）の安定性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜９０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜８０重量％、特に好ましくは２０〜７０重量％である。 The content (% by weight) of the protein solution (D) in the detergent composition is preferably 0.1 to 99% by weight, more preferably 0.5 based on the weight of the detergent composition from the viewpoint of detergency. -60% by weight, particularly preferably 1-45% by weight.
From the viewpoint of detergency, the content (% by weight) of the surfactant (O) in the detergent composition is preferably 1 to 99.99999% by weight, more preferably 10 to 10%, based on the weight of the detergent composition. It is 89.998% by weight, particularly preferably 30 to 78.998% by weight.
The content (% by weight) of the low temperature optimal protease (A) in the detergent composition is preferably 0.000001 to 5% by weight, more preferably 0, based on the weight of the detergent composition from the viewpoint of detergency. 0.0001 to 4% by weight, particularly preferably 0.001 to 3% by weight.
The content (% by weight) of the protease activity inhibitor (B) in the detergent composition is preferably 0.000001 to 50% by weight, based on the weight of the detergent composition, from the viewpoint of durability of detergency. Preferably it is 0.0001 to 40 weight%, Most preferably, it is 0.001 to 30 weight%.
The content (% by weight) of the solvent (C) in the detergent composition is 1 based on the weight of the detergent composition from the viewpoint of the stability of the low temperature optimum protease (A) and the protease activity inhibitor (B). It is preferably -90% by weight, more preferably 10-80% by weight, particularly preferably 20-70% by weight.

洗剤組成物のｐＨは、洗浄性の観点から、ｐＨ５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５である。   The pH of the detergent composition is preferably pH 5.0 to 9.0, more preferably pH 6.5 to 8.5, from the viewpoint of detergency.

本発明の洗剤組成物は、タンパク質溶液（Ｄ）及び界面活性剤（Ｏ）以外に、ビルダー（Ｐ）、キレート剤（Ｑ）、色素（Ｒ）、香料（Ｓ）、蛍光増白剤（Ｔ）、消泡剤（Ｕ）及び低温至適プロテアーゼ（Ａ）以外の酵素（Ｗ）等を含有することができる。   In addition to the protein solution (D) and the surfactant (O), the detergent composition of the present invention includes a builder (P), a chelating agent (Q), a dye (R), a fragrance (S), and a fluorescent whitening agent (T ), An antifoaming agent (U), an enzyme (W) other than the low temperature optimal protease (A), and the like.

ビルダー（Ｐ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されているビルダーが使用でき、例えば、ポリカルボン酸塩（アクリル酸塩ホモポリマー及びマレイン酸塩ホモポリマー等）、多価カルボン酸塩（クエン酸及びリンゴ酸等）、及びアルカリビルダー（苛性ソーダ、ソーダ灰、アンモニア、トリエタノールアミン、トリポリリン酸ソーダ及びケイ酸ソーダ等）等が挙げられる。   The builder (P) is not particularly limited, and a builder used in a conventional detergent composition can be used. For example, polycarboxylates (such as acrylate homopolymer and maleate homopolymer), Examples include polyvalent carboxylates (such as citric acid and malic acid), and alkali builders (such as caustic soda, soda ash, ammonia, triethanolamine, sodium tripolyphosphate, and sodium silicate).

キレート剤（Ｑ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されているキレート剤が使用でき、例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸及びジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸及びカルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩並びにアミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）又はこれらのアルカリ金属若しくは低級アミン塩等が挙げられる。   The chelating agent (Q) is not particularly limited, and chelating agents used in conventional detergent compositions can be used. For example, nitrilotriacetic acid, iminodiacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, glycol Aminopolyacetic acid such as etherdiaminetetraacetic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid, triethylenetetraaminehexaacetic acid and diencoric acid or salts thereof, diglycolic acid, oxydisuccinic acid, carboxymethyloxysuccinic acid, citric acid, lactic acid, tartaric acid, sulphate Organic acids such as acids, malic acid, oxydisuccinic acid, gluconic acid, carboxymethyl succinic acid and carboxymethyl tartaric acid or salts thereof, aminotri (methylenephosphonic acid), 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid, ethylenediaminetetra ( Chirenhosuhon acid), diethylenetriamine penta (methylene phosphonic acid) or the like of the alkali metal or lower amine salts.

洗剤組成物中のビルダー（Ｐ）及びキレート剤（Ｑ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜５重量％である。   The content (% by weight) of the builder (P) and the chelating agent (Q) in the detergent composition is preferably 0 to 10% by weight, more preferably based on the weight of the detergent composition, from the viewpoint of detergency. 0.1 to 5% by weight.

色素（Ｒ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている色素が使用でき、例えば、ブロモフェノールブルー等が挙げられる。   The dye (R) is not particularly limited, and dyes used in conventional detergent compositions can be used, and examples thereof include bromophenol blue.

香料（Ｓ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている香料が使用でき、例えば、フェニルエチルアルコール等が挙げられる。   The fragrance (S) is not particularly limited, and fragrances used in conventional detergent compositions can be used, and examples thereof include phenylethyl alcohol.

蛍光増白剤（Ｔ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている蛍光増白剤が使用でき、例えば、ビフェニルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。   The fluorescent brightening agent (T) is not particularly limited, and the fluorescent brightening agent used in conventional detergent compositions can be used, and examples thereof include sodium biphenyl sulfonate.

消泡剤（Ｕ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている消泡剤が使用でき、例えば、シリコーン系消泡剤、ポリオキシアルキレン系消泡剤及び鉱物油系消泡剤等が挙げられる。   The antifoaming agent (U) is not particularly limited, and antifoaming agents used in conventional detergent compositions can be used, such as silicone-based antifoaming agents, polyoxyalkylene-based antifoaming agents and minerals. Examples thereof include oil-based antifoaming agents.

洗剤組成物中の色素（Ｒ）、香料（Ｓ）、蛍光増白剤（Ｔ）及び消泡剤（Ｕ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％である。   The content (% by weight) of the dye (R), fragrance (S), fluorescent whitening agent (T) and antifoaming agent (U) in the detergent composition is the weight of the detergent composition from the viewpoint of detergency. Based on 0 to 10% by weight, more preferably 0 to 5% by weight.

低温至適プロテアーゼ（Ａ）以外の酵素（Ｗ）には、セルラーゼ（Ｗ−１）、アミラーゼ（Ｗ−２）、リパーゼ（Ｗ−３）及びオキシドレダクターゼ（Ｗ−４）が含まれる。   Enzymes (W) other than the low temperature optimal protease (A) include cellulase (W-1), amylase (W-2), lipase (W-3) and oxidoreductase (W-4).

セルラーゼ（Ｗ−１）としては、動物、植物又は微生物起源のものが含まれ、入手しやすさの観点から、微生物起源のものが好ましい。セルラーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。
セルラーゼとして、具体的には、ノボザイムス社のＣｅｌｌｕｚｙｍｅ^TM、Ｃａｒｅｚｙｍｅ^TM等が挙げられる。 Cellulases (W-1) include those of animal, plant or microbial origin, and those of microbial origin are preferred from the viewpoint of availability. Cellulases also include chemically or genetically modified variants.
Specific examples of the cellulase include Cellozyme ^™ and Carezyme ^™ manufactured by Novozymes.

アミラーゼ（Ｗ−２）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。アミラーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼ等が挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ノボザイムス社の Ｄｕｒａｍｙｌ^TM、Ｔｅｒｍａｍｙｌ^TM、Ｆｕｎｇａｍｙｌ^TM及びＢＡＮ^TM並びにＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社のＲａｐｉｄａｓｅ^TM及びＭａｘａｍｙｌ Ｐ^TM等が挙げられる。 Amylase (W-2) includes those of bacterial or fungal origin. Amylases also include chemically or genetically modified variants. Examples of the amylase include B.I. described in detail in British Patent No. 1,296,839. And α-amylase obtained from a special strain of B. licheniformis.
Commercially available amylases, Novozymes of Duramyl ^TM, Termamyl ^TM, etc. Fungamyl ^TM and BAN ^TM and Gist-Brocades Inc., Rapidase ^TM and Maxamyl P ^TM, and the like.

リパーゼ（Ｗ−３）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。リパーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リパーゼの例としては、フミコーラ・ランギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（欧州特許第２５８ ０６８号明細書及び欧州特許第３０５ ２１６号明細書）、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ（欧州特許第２３８ ０２３号明細書）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ及びＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）リパーゼ（欧州特許第２１４７６１号明細書）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ 他（１９９３）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ１１３１，２５３−２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号公報）並びにＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）等が挙げられる。   Lipases (W-3) include those of bacterial or fungal origin. Lipases also include chemically or genetically modified variants. Examples of lipases include Humicola langinosa lipase (EP 258 068 and EP 305 216), Rhizomucor miehei lipase and Candida (Candida) Patent No. 238 023), C.I. C. ntartica lipase A and B, Pseudomonas lipase (European Patent No. 247661), P. P. pseudoalcaligenes and P. p. P. alcaligenes lipase (European Patent No. 218272), P. a. P. cepacia lipase (European Patent No. 331376); P. stutzeri lipase, P. p. P. fluorescens lipase and Bacillus lipase (British Patent No. 1,372,034); B. subtilis lipase (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta 1131, 253-260), B. stearothermophilus lipase (Japanese Patent Publication No. 64-744992) and B. stearothermophilus lipase. And B. pumilus lipase (International Publication No. 91/16422).

市販のリパーゼとしては、ジェネンコア社の Ｍ１ Ｌｉｐａｓｅ^TM、Ｌｕｍａ ｆａｓｔ^TM及びＬｉｐｏｍａｘ^TM、ノボザイムス社のＬｉｐｏｌａｓｅ^TM及びＬｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ^TM並びに天野エンザイム社のＬｉｐａｓｅ Ｐ“Ａｍａｎｏ”^TM等が挙げられる。 Commercially available lipases, Genencor M1 Lipase ^TM, Luma fast ^TM and Lipomax ^TM, Novozymes of Lipolase ^TM and Lipolase Ultra ^TM and Amano Enzyme Inc. of Lipase P "Amano" ^TM, and the like.

オキシドレダクターゼ（Ｗ−４）としては、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ（例えばラッカーゼ）が含まれる。
ペルオキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ペルオキシダーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。ペルオキシダーゼとしては、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）（例えばＣ．シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）又はＣ．マクロリザス（Ｃ．ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）の菌株由来のもの）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｂ．ピュミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）の菌株由来のもの）及び国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼが好ましく、特に好ましくは国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼである。
ラッカーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ラッカーゼとしては、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（例えばＴ．ビロサ（Ｔ．ｖｉｌｌｏｓａ）又はＴ．ベルシコロール（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）の菌株由来のもの］、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）［例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）の菌株由来のもの］及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）［例えばＭ．サーモフィラ（Ｍ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌａ）の菌株由来のもの］等が挙げられる。 Oxidoreductase (W-4) includes peroxidase and oxidase (for example, laccase).
Peroxidases include those of plant, bacterial or fungal origin. Peroxidases also include chemically or genetically modified variants. Peroxidases include Coprinus (e.g., derived from C. cinereus or C. macrolithus strains), Bacillus (from B. pumilus strains). And the peroxidase described in WO 91/05858 are preferable, and the peroxidase described in WO 91/05858 is particularly preferable.
Laccases include those of bacterial or fungal origin. Laccases include Trametes (eg, derived from strains of T. villosa or T. versicolol), Coprinus (eg, strains of C. cinereus). Derived from] and Myceliophthora [for example, derived from a strain of M. thermophila] and the like.

洗剤組成物中の（Ａ）以外の酵素（Ｗ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜８重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％である。   From the viewpoint of detergency, the content (% by weight) of the enzyme (W) other than (A) in the detergent composition is preferably 0 to 10% by weight, more preferably 0, based on the weight of the detergent composition. 0.001 to 8% by weight, particularly preferably 0.01 to 5% by weight.

本発明の洗剤組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）界面活性剤（Ｏ）に、タンパク質溶液（Ｄ）を所定量添加し、２５℃均一になるまで撹拌する。
（２）その他成分を所定量添加し、２５℃で均一になるまで攪拌する。 The detergent composition of the present invention is obtained by mixing each component, and the production method is not particularly limited. An example is shown below.
(1) A predetermined amount of the protein solution (D) is added to the surfactant (O) and stirred until it becomes uniform at 25 ° C.
(2) Add a predetermined amount of other components and stir until uniform at 25 ° C.

本発明の洗剤組成物の使用方法は、従来の洗剤組成物の使用方法と同じでよく、特に限定されるものではない。衣料用洗剤としての使用方法の１例を下記に示す。
（１）洗濯物が入った洗濯機に水道水を張り、洗剤組成物を２５℃で添加し、軽く撹拌して溶解させる。
（２）洗濯機で洗濯物を洗浄する。
（３）洗濯機から液を抜き、水道水で１〜２回すすぐ。
（４）適宜脱水をかける。 The method of using the detergent composition of the present invention may be the same as the method of using the conventional detergent composition, and is not particularly limited. An example of usage as a laundry detergent is shown below.
(1) The washing machine containing the laundry is filled with tap water, the detergent composition is added at 25 ° C., and lightly stirred to dissolve.
(2) Wash the laundry with a washing machine.
(3) Drain the liquid from the washing machine and rinse with tap water once or twice.
(4) Appropriate dehydration.

以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。   The present invention will be further described with reference to the following examples and comparative examples, but the present invention is not limited thereto.

＜製造例１＞
配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（５‘末端側に制限酵素ＮｃｏＩ，３’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加し、北海道システムサイエンス社に人工合成を依頼したもの）を制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合し、配列番号１のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ１）を作成した。このプラスミドと１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー配列番号２９、３０を用い、以下の条件でプラスミド（Ｐ１）に変異導入を行った。即ち、プラスミド（Ｐ１）を０．５μＬ（１０ｎｇ）、１０μＭの変異導入用プライマー各０．７５μＬ（７．５ｐｇ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液２．５μＬ（タカラバイオ製）、２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）混液２μＬ（タカラバイオ製）、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ０．２５μＬ（タカラバイオ製）及び脱イオン水１７μＬを混合した後、ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（タカラバイオ製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９８℃１０秒間、５０℃１０秒間、６８℃６．５分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で精製後（５０μＬ）、６μＬの１０倍濃度のＤｐｎＩ用緩衝液及び３μＬの制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ製）を加え、３７℃で１時間、テンプレートを分解した。得られた制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを大腸菌ＤＨ５αへの形質転換に供した。即ち、制限酵素処理ＰＣＲ産物５μＬを１００μＬのＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５α コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）に添加し、氷上で３０分間保存した後、４２℃で９０秒間過熱した。ここＳＯＣ培地（ＴＯＹＯＢＯ製）９００μＬを添加し、３７℃で１時間静置培養した。培養液のうち１００μＬをＬＢ／アンピシリンプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。現れたコロニーをＬＢ培地１ｍＬで１２時間培養したのち、Ｑｕａｎｔｕｍｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供し、配列番号２のタンパク質を発現するプラスミド（Ｐ２）を精製した（１００μＬ）。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス解析サービス（マクロジェンジャパン社）に解析を依頼し、変異が導入されたことを確認した。
得られたプラスミド（Ｐ２）を大腸菌Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に同様の方法で形質転換した。得られたプロテアーゼ活性阻害剤発現株をＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）１ｍＬに植菌して３０℃で１２時間培養を行い、終夜培養液を作成し、０．５ｍｌをＬＢ培養液（アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い７種類の前培養液を作成した。７種類の前培養液をそれぞれ５０ｍＬの培養液｛水５０ｍＬ中のそれぞれの成分の含有量は、酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（ＩＩＩ）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン｝に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を行った。培養開始後１Ｍ ＩＰＴＧ溶液を０．１５ｍＬを加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０％ グリセリン、５０ｇ／Ｌ ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ 消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン）の滴下を開始した。培養開始後、４８時間目に培養液（Ｋ−１）を回収した。
得られた培養液（Ｋ−１）をＨｉｓ-ｔａｇ精製用担体（ＧＥヘルスケア社製 Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）で分離し、配列番号１の１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した配列番号２のアミノ酸配列のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）溶液（Ｌ−１）を得た。（Ｌ−１）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。 <Production Example 1>
The gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (restriction enzyme NcoI added to the 5 ′ end, restriction enzyme BamHI recognition sequence added to the 3 ′ end, and artificial synthesis was requested from Hokkaido System Science) restriction enzyme NcoI Then, the plasmid was treated with BamHI to bind to the NcoI restriction enzyme site and the BamHI restriction enzyme site of the pET-22b plasmid (Novagen) to prepare a plasmid (P1) that expresses the protein of SEQ ID NO: 1. Using this plasmid and mutation introduction primer SEQ ID NOs: 29 and 30 for replacing glutamic acid at position 12 with aspartic acid, mutation was introduced into the plasmid (P1) under the following conditions. Specifically, 0.5 μL (10 ng) of plasmid (P1), 0.75 μL (7.5 pg) of each 10 μM primer for mutagenesis, 2.5 μL of 10 times concentration buffer for PCR (manufactured by Takara Bio Inc.), 2 mM deoxynucleotide After mixing 2 μL of 3-phosphate (dNTP) mixture (Takara Bio), DNA polymerase ExTaq 0.25 μL (Takara Bio) and 17 μL of deionized water, PCR was performed using TaKaRa Thermal Cycler Dice (Takara Bio). The reaction conditions were heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 10 seconds, and 68 ° C. for 6.5 minutes. After purifying the obtained PCR product with QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) (50 μL), 6 μL of 10 times concentrated DpnI buffer solution and 3 μL of restriction enzyme DpnI (manufactured by Takara Bio) were added for 1 hour at 37 ° C. The template was disassembled. The obtained restriction enzyme-treated PCR product (5 μL) was subjected to transformation into E. coli DH5α. That is, 5 μL of restriction enzyme-treated PCR product was converted to 100 μL of E. coli. It was added to Coli DH5α competent cell (manufactured by TOYOBO), stored on ice for 30 minutes, and then heated at 42 ° C. for 90 seconds. Here, 900 μL of SOC medium (manufactured by TOYOBO) was added, followed by static culture at 37 ° C. for 1 hour. 100 μL of the culture solution was applied to an LB / ampicillin plate and cultured at 37 ° C. overnight. The appearing colonies were cultured in 1 mL of LB medium for 12 hours and then subjected to Quantumprep Miniprep Kit (manufactured by Bio-Rad) to purify the plasmid (P2) expressing the protein of SEQ ID NO: 2 (100 μL). The obtained plasmid was analyzed by a DNA sequence analysis service (Macrogen Japan), and it was confirmed that the mutation was introduced.
The resulting plasmid (P2) was transformed into E. coli E. coli. Coli BL21 (DE3) was transformed in the same manner. The obtained protease activity inhibitor-expressing strain was inoculated into 1 mL of LB culture solution (containing 100 mg / L of ampicillin) and cultured at 30 ° C. for 12 hours to prepare an overnight culture solution. 0.5 ml of LB culture solution ( Inoculated into 5 ml of ampicillin (containing 100 mg / L), and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 hours to prepare 7 types of precultures. Each of the seven types of pre-culture solution is 50 mL of culture solution {the content of each component in 50 mL of water is 1.2 g of yeast extract (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.6 g of polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), phosphoric acid 0.47 g of dipotassium, 0.11 g of monopotassium phosphate, 0.35 g of ammonium sulfate, 0.66 g of disodium phosphate dodecahydrate, 0.02 g of sodium citrate dihydrate, 0.2 g of glycerol, hydrolyzed lactalbumin 1.5 g, antifoam (made by Shin-Etsu Silicone, “KM-70”) 0.3 g, 1 mM magnesium sulfate, trace metal solution (calcium chloride 18.9 μg, iron (III) chloride 500 μg, zinc sulfate heptahydrate 9.0 μg, copper sulfate 5.1 μg, manganese chloride tetrahydrate 6.7 μg, cobalt chloride 4.9 μg, ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium 200 μg), 00mg / L ampicillin} inoculated microorganisms culture apparatus in the culture was performed while maintaining the pH6.8,30 ℃ by using the (Able Co., Ltd., product name "BioJr.8"). After the start of culture, 0.15 mL of 1M IPTG solution was added. From 14 hours after the start of the culture, glycerol / protein solution (50% glycerol, 50 g / L lactalbumin hydrolyzate, 33 g / L antifoam (manufactured by Shin-Etsu Silicone, “KM-70”), 100 mg / L ampicillin) was added dropwise. Started. The culture solution (K-1) was collected 48 hours after the start of the culture.
The obtained culture solution (K-1) was separated with a carrier for purification of His-tag (Ni Sepharose 6 Fast Flow manufactured by GE Healthcare), and the glutamic acid at position 12 in SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid. A protease activity inhibitor (B1) solution (L-1) having the amino acid sequence was obtained. When the amount of the protease activity inhibitor (B1) in (L-1) was measured by SDS-PAGE, it was 1 g / L.

＜製造例２＞
製造例１において、「１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号２９、３０）」に変えて、「５０位のチロシンをロイシンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号３１、３２）」を用いる以外は同様にして、配列番号１の５０位のチロシンをロイシンに置換した配列番号１０のアミノ酸配列のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）溶液（Ｌ−２）を得た。（Ｌ−２）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。 <Production Example 2>
Instead of “Primer for mutagenesis for substituting glutamic acid at position 12 for aspartic acid (SEQ ID NOs: 29, 30)” in Production Example 1, “Primer for mutagenesis for substituting tyrosine at position 50 for leucine” (SEQ ID NO: 31, 32) ”was used in the same manner except that the protease activity inhibitor (B2) solution (L-2) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in which tyrosine at position 50 of SEQ ID NO: 1 was substituted with leucine was used. Obtained. When the amount of the protease activity inhibitor (B2) in (L-2) was measured by SDS-PAGE, it was 1 g / L.

＜製造例３＞
製造例１において、「１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号２９、３０）」に変えて、「配列番号１の３８位のバリンをアラニンに置換する変異導入用プライマー（配列番号３１、３２）を用いて、３８位のバリンがアラニンに置換したプラスミド（Ｐ３）を得た。
また、製造例１において、「１２位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換するための変異導入用プライマー（配列番号２９、３０）」に変えて５１位のアルギニンと５２位のイソロイシンとをそれぞれアラニンに置換するための変異導入用プライマー（配列番号３３、３４）」を用い、プラスミドＰ１に変えてプラスミドＰ３を用いる以外は同様にして、配列番号１の３８位のバリンをアラニンに置換し、５１位のアルギニンと５２位のイソロイシンとをそれぞれアラニンに置換した配列番号２２のアミノ酸配列のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）溶液（Ｌ−３）を得た。（Ｌ−３）中のプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ３）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したところ、１ｇ／Ｌであった。 <Production Example 3>
Instead of “Primer for mutagenesis for substituting glutamic acid at position 12 for aspartic acid (SEQ ID NO: 29, 30)” in Production Example 1, “Mutation for substituting valine at position 38 of SEQ ID NO: 1 for alanine” Plasmid (P3) in which valine at position 38 was substituted with alanine was obtained using the primers (SEQ ID NOs: 31 and 32).
Also, in Production Example 1, the arginine at position 51 and the isoleucine at position 52 were each replaced with alanine instead of “primer for mutagenesis to replace glutamic acid at position 12 with aspartic acid (SEQ ID NOs: 29, 30)”. The valine at position 38 in SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine in the same manner except that the plasmid P3 was used instead of the plasmid P1 using the mutation-introducing primers (SEQ ID NOs: 33 and 34) ”. A protease activity inhibitor (B3) solution (L-3) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 in which arginine and isoleucine at position 52 were each substituted with alanine was obtained. When the amount of the protease activity inhibitor (B3) in (L-3) was measured by SDS-PAGE, it was 1 g / L.

＜カンナーゼのプロテアーゼ活性の最適ｐＨの測定＞
カンナーゼ（ノボザイムズ社）１０ｍｇを１Ｌのバッファー１［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させ、カンナーゼ液（Ａ１）（０．３７μＭ）とした。
（Ａ１）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２５℃に保ち、セルを試料室内で５分静置し、温調した。ここに、２５℃に温調した基質溶液（１）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー１溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩ−１）とした。（ＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
同様に、バッファー１に変えてバッファー２［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ５．５、２５℃）水溶液］、バッファー３［５０ｍＭ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー４［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ６．５、２５℃）水溶液］、バッファー５［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．５、２５℃）水溶液］、バッファー７［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］及びバッファー８［５０ｍＭ ＴＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９．５、２５℃）水溶液］をそれぞれ用いてカンナーゼ溶液（Ａ２）〜（Ａ８）及び基質溶液（２）〜（８）を作成した。
（Ａ１）に変えて（Ａ２）〜（Ａ８）を、基質溶液（１）に変えて基質溶液（２）〜（８）用いる以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成し、（ＩＩ−２）〜（ＩＩ−８）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）について、それぞれ（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−８）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、２分後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸をｐＨとしてプロットし（図２）、係数ｋが極大値となるｐＨを求めたところ、最適ｐＨはｐＨ７．５であった。
なお、バッファーの種類を変える境目のｐＨ（ｐＨ６.５及び８.５）において、両方のバッファーで活性を測定しておき、片方のバッファーで測定した値を基準として活性を補正した。ｐＨ６.５（バッファー３及び４）では、バッファー４を使用して求めた値をｐＨ６.５での結果とし、バッファー２を用いて求めた係数ｋにはバッファー３と４の比（バッファー４での係数ｋ／バッファー３での係数ｋ）をかけて補正した。同様に、ｐＨ８.５（バッファー１及び７）ではバッファー１での値をｐＨ８.５の結果とし、バッファー８を用いて求めた係数ｋにはバッファー１と７の比（バッファー１での係数ｋ／バッファー７での係数ｋ）をかけて補正した。カンナーゼの活性の最適ｐＨは８．５であった。 <Measurement of optimum pH of cannase protease activity>
10 mg of cannase (Novozymes) was dissolved in 1 L of buffer 1 [50 mM Na phosphate aqueous solution (pH 8.5, 25 ° C.) aqueous solution] to obtain a cannase solution (A1) (0.37 μM).
1570 μL of (A1) was placed in a spectrophotometer cell (bottom area 1 cm × 1 cm). The sample chamber of the spectrophotometer was kept at 25 ° C., and the cell was allowed to stand in the sample chamber for 5 minutes to control the temperature. 400 μL of a substrate solution (1) adjusted to 25 ° C. (Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-nitronelide dissolved in buffer 1 to a concentration of 5 mg / mL (0.119 mM)) was added thereto. An enzyme reaction solution (II-1) was obtained. Absorbance at 405 nm was measured immediately after preparation of (II-1) and every 5 seconds for 2 minutes.
Similarly, instead of buffer 1, buffer 2 [50 mM Na acetate buffer (pH 5.5, 25 ° C. aqueous solution)], buffer 3 [50 mM Na acetate buffer (pH 6.5, 25 ° C. aqueous solution)], buffer 4 [50 mM phosphoric acid Na buffer (pH 6.5, 25 ° C. aqueous solution)], buffer 5 [50 mM aqueous sodium phosphate buffer (pH 7.5, 25 ° C.) aqueous solution], buffer 7 [50 mM TAPS-NaOH buffer (pH 8.5, 25 ° C. aqueous solution)] And cannase solutions (A2) to (A8) and substrate solutions (2) to (8) were prepared using Buffer 8 [50 mM TAPS-NaOH buffer (pH 9.5, 25 ° C. aqueous solution)], respectively.
In the same manner except that (A2) to (A8) are changed to (A1) and the substrate solutions (2) to (8) are used instead of the substrate solution (1), the enzyme reaction solutions (II-2) to (II) are used. -8) was prepared, and the absorbance at 405 nm was measured immediately after the preparation of (II-2) to (II-8) and every 5 seconds for 2 minutes.
For the enzyme reaction solutions (II-1) to (II-8), the absorbance immediately after preparing (II-1) to (II-8) was Aλ ₀ , the absorbance after 2 minutes was Aλ _h , and the absorbance The change ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) is plotted on the vertical axis and the time h is plotted on the horizontal axis to obtain the slope coefficient k of the straight line. Plotting with the vertical axis representing the coefficient k and the horizontal axis representing the pH (FIG. 2), the pH at which the coefficient k is a maximum was determined, and the optimum pH was 7.5.
The activity was measured with both buffers at the boundary pH (pH 6.5 and 8.5) at which the buffer type was changed, and the activity was corrected based on the value measured with one buffer. At pH 6.5 (buffers 3 and 4), the value obtained using buffer 4 is the result at pH 6.5, and the coefficient k obtained using buffer 2 is the ratio of buffers 3 and 4 (with buffer 4). The coefficient k / the coefficient k in buffer 3 was corrected. Similarly, at pH 8.5 (buffers 1 and 7), the value in buffer 1 is the result of pH 8.5, and the coefficient k obtained using buffer 8 is the ratio of buffers 1 and 7 (coefficient k in buffer 1). / Correction by multiplying by coefficient k) in buffer 7. The optimum pH for cannase activity was 8.5.

＜カンナーゼのプロテアーゼ活性の至適温度の測定＞
カンナーゼ（ノボザイムズ社）１０ｍｇを１Ｌのバッファー１［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させたカンナーゼ溶液（Ａ１）（０．３７μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。
次に、セルに、２０℃に温調した基質溶液（１）（０．１１９ｍＭ、ｐＨ８.５）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）とした。（ＩＩＩ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
分光光度計の試料室をそれぞれ０℃、５℃、１０、２０、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃又は８０℃に設定して温調し、基質溶液（７）も試料室と同じ温度で温調してからセルに添加する以外は同様にして、酵素反応溶液（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成した。（ＩＩＩ−２）〜（ＩＩＩ−６）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
酵素反応溶液（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）について、それぞれ（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−６）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、２分後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋを求た。縦軸を係数ｋ、横軸を温度としてプロットし（図３）、係数ｋが極大値となる温度を求めたところ、至適温度は４０℃であった。 <Measurement of optimum temperature for cannase protease activity>
1570 μL of cannase solution (A1) (0.37 μM) obtained by dissolving 10 mg of cannase (Novozymes) in 1 L of buffer 1 [50 mM Na phosphate buffer (pH 8.5, 25 ° C.) aqueous solution], a spectrophotometer cell ( The bottom area was 1 cm × 1 cm. The sample chamber of the spectrophotometer was kept at 20 ° C., and the cell was allowed to stand in the sample chamber for 5 minutes.
Next, 400 μL of the substrate solution (1) (0.119 mM, pH 8.5) adjusted to 20 ° C. was added to the cell to obtain an enzyme reaction solution (III-1). Absorbance at 405 nm was measured immediately after preparation of (III-1) and every 5 seconds for 2 minutes.
Set the spectrophotometer's sample chamber to 0 ° C, 5 ° C, 10, 20, 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C, 70 ° C, or 80 ° C and adjust the temperature, and the substrate solution (7) is also a sample. Enzyme reaction solutions (III-2) to (III-6) were prepared in the same manner except that the temperature was controlled at the same temperature as the chamber and then added to the cell. Absorbance at 405 nm was measured immediately after preparation of (III-2) to (III-6) and every 5 seconds for 2 minutes.
For the enzyme reaction solutions (III-1) to (III-6), the absorbance immediately after preparing (III-1) to (III-6) was Aλ ₀ , the absorbance after 2 minutes was Aλ _h , and the absorbance The change ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) is plotted on the vertical axis and the time h is plotted on the horizontal axis to obtain the slope coefficient k of the straight line. When the vertical axis is plotted with the coefficient k and the horizontal axis is plotted with temperature (FIG. 3), the temperature at which the coefficient k reaches the maximum value was determined, and the optimum temperature was 40 ° C.

＜カンナーゼに対する基質のミカエリス定数Ｋｍの測定＞
カンナーゼ（ノボザイムズ社）１０ｍｇを１Ｌのバッファー１［５０ｍＭ リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ８．５、２５℃）水溶液］に溶解させたカンナーゼ溶液（Ａ１）（０．３７μＭ）を１５７０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れた。分光光度計の試料室を２０℃に保ち、セルを試料室内で５分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー７溶解して５ｍｇ／ｍＬ（０．１１９ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｉ−１）とした。（Ｉ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
基質溶液（７）において、Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅのバッファー１中のモル濃度を０．０２４ｍＭ（基質溶液（８）、１ｍｇ／ｍＬ）、０．２３７ｍＭ（基質溶液（９）、１０ｍｇ／ｍＬ）、０．４７４ｍＭ（基質溶液（１０）、２０ｍｇ／ｍＬ）および１．１９ｍｍＭ（基質溶液（１１）、５０ｍｇ／ｍＬ）とした溶液を作成した。基質溶液（５）に変えて基質溶液（８）〜（１１）を用いる以外は同様にして酵素反応溶液（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成した。（Ｉ−２）〜（Ｉ−５）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）を作成直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
算出した酵素反応初速度ｖを用いて、横軸（ｘ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］、縦軸（ｙ軸）にそれぞれの基質濃度［Ｓ］の酵素反応初速度ｖによる逆数［Ｓ］／ｖをプロットし、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した（図１）。プロットの近似直線とｘ軸との交点（−Ｋｍ）から、ミカエリス定数Ｋｍは０．０４ｍＭであった。 <Measurement of Michaelis constant Km of substrate for cannase>
1570 μL of cannase solution (A1) (0.37 μM) obtained by dissolving 10 mg of cannase (Novozymes) in 1 L of buffer 1 [50 mM Na phosphate buffer (pH 8.5, 25 ° C.) aqueous solution], a spectrophotometer cell ( The bottom area was 1 cm × 1 cm. The sample chamber of the spectrophotometer was kept at 20 ° C., and the cell was allowed to stand in the sample chamber for 5 minutes. 400 μL of a substrate solution (1) adjusted to 40 ° C. (Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-nitronelide dissolved in buffer 7 to a concentration of 5 mg / mL (0.119 mM)) was added thereto. An enzyme reaction solution (I-1) was obtained. Absorbance at 405 nm was measured immediately after preparation of (I-1) and every 5 seconds for 2 minutes.
In the substrate solution (7), the molar concentrations of Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-nitronelide in buffer 1 were 0.024 mM (substrate solution (8), 1 mg / mL), 0.237 mM (substrate solution (9)). 10 mg / mL), 0.474 mM (substrate solution (10), 20 mg / mL) and 1.19 mmM (substrate solution (11), 50 mg / mL) were prepared. Enzyme reaction solutions (I-2) to (I-5) were prepared in the same manner except that the substrate solutions (8) to (11) were used instead of the substrate solution (5). Absorbance at 405 nm was measured immediately after preparation of (I-2) to (I-5) and every 5 seconds for 2 minutes.
The absorbance immediately after preparation of (I-1) to (I-5) is Aλ ₀ , the absorbance after h hours is Aλ _h, and the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) and the molar absorption constant at 405 nm, respectively. The initial enzyme reaction velocity v (M / s) was calculated from the following formula (1) using ε.
v = ΔAλ / (ε × h × 3600) (1)
Using the calculated enzyme reaction initial velocity v, the horizontal axis (x-axis) represents the respective substrate concentration [S], and the vertical axis (y-axis) represents the reciprocal [S of the respective substrate concentration [S] by the enzyme reaction initial velocity v [S ] / V was plotted to create a Hanes-Woolf plot (FIG. 1). From the intersection (−Km) between the approximate straight line of the plot and the x-axis, the Michaelis constant Km was 0.04 mM.

＜プロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）溶液（Ｌ−１）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬを４９ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）で希釈し、プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）（２．７μＭ）とした。（Ｂ１−１）をバッファー１で１／５０、１／３０、１／２０および１／１０倍のモル濃度に希釈したものを（Ｂ１−２）〜（Ｂ１−５）とした。
バッファー１を１５３０μＬ、分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、カンナーゼ溶液（Ａ１）を４０μＬ及び（Ｂ１−１）を４０μＬ添加し、プロテアーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤混合溶液（ｉ−１）を作成した。
分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（１２）｛Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー７に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ（０．２３７ｍＭ）の濃度にしたもの｝を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（ＩＶ−１）を作成した。（ＩＶ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｂ１−１）に変えて（Ｂ１−２）〜（Ｂ１−５）をそれぞれ用いる以外は同様にして、カンナーゼ・プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）混合溶液（ｉ−２）〜（ｉ−６）を作成し、基質溶液（１２）を用いて酵素反応溶液（ＩＶ−２）〜（ＩＶ−６）を作成し、同様に吸光度を記録した。
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−６）を作成直後の吸光度をＡλ₀、ｈ時間後の吸光度をＡλ_hとし、それぞれ吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）と４０５ｎｍにおけるモル吸光定数εを用いて下記数式（１）からそれぞれの酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出した。
ｖ＝ΔＡλ／（ε×ｈ×３６００）（１）
（ＩＶ−１）〜（ＩＶ−５）の酵素反応初速度ｖｉ、（ＩＶ−６）の酵素反応初速度をｖｏとし、各（Ｂ１）濃度での相対活性α（ｘ＝ｖｉ／ｖｏ）を算出した。
横軸に１／αを、縦軸に［（Ｂ１）のモル濃度］／（１−α）をプロットし、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎプロットを作成した（図４）。このプロットの近似直線の傾きＫｉ（ａｐｐ）（図４から３．０６）、測定時の基質濃度［Ｓ］及びミカエリス定数Ｋｍを式Ｋｉ＝Ｋｉ（ａｐｐ）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）に当てはめてＫｉを算出したところ、Ｋｉは１．４ｎＭであった。 <Measurement of Inhibition Constant Ki for Cannase of Protease Activity Inhibitor>
1 mL of protease activity inhibitor (B1) solution (L-1) (1 g / L) obtained in Production Example 1 was diluted with 49 mL of buffer 1 (pH 8.5), and protease activity inhibitor solution (B1-1) ( 2.7 μM). (B1-1)-(B1-5) were prepared by diluting (B1-1) with buffer 1 to 1/50, 1/30, 1/20, and 1/10 times the molar concentration.
Buffer 1 (1530 μL) was placed in a spectrophotometer cell (bottom area 1 cm × 1 cm), 40 μL of cannase solution (A1) and 40 μL of (B1-1) were added, and protease / protease activity inhibitor mixed solution (i-1 )created.
The sample chamber of the spectrophotometer was kept at 40 ° C., and the cell was left in the sample chamber for 30 minutes. 400 μL of the substrate solution (12) adjusted to 40 ° C. {Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-nitronelide dissolved in buffer 7 to a concentration of 10 mg / mL} is added here. Then, an enzyme reaction solution (IV-1) was prepared. The absorbance at 405 nm for 2 minutes was recorded immediately after preparation of (IV-1) and every 5 seconds.
A cannase / protease activity inhibitor (B1) mixed solution (i-2) to (i-6) except that (B1-2) to (B1-5) are used instead of (B1-1). The enzyme reaction solutions (IV-2) to (IV-6) were prepared using the substrate solution (12), and the absorbance was recorded in the same manner.
The absorbance immediately after preparation of (IV-1) to (IV-6) is Aλ ₀ , the absorbance after h hours is Aλ _h, and the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) and the molar absorption constant at 405 nm, respectively. The initial enzyme reaction velocity v (M / s) was calculated from the following formula (1) using ε.
v = ΔAλ / (ε × h × 3600) (1)
The initial reaction rate vi of (IV-1) to (IV-5) is vi, the initial reaction rate of (IV-6) is vo, and the relative activity α (x = vi / vo) at each (B1) concentration is Calculated.
1 / α is plotted on the horizontal axis, and [Molar concentration of (B1)] / (1-α) is plotted on the vertical axis, thereby creating a Henderson plot (FIG. 4). The slope Ki (app) (FIG. 4 to 3.06) of the approximate line of this plot, the substrate concentration [S] at the time of measurement, and the Michaelis constant Km are expressed as Ki = Ki (app) / (1+ [S] / Km). As a result of calculation, Ki was 1.4 nM.

上記において、「製造例１で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ１）溶液（Ｌ−１）（１ｇ／Ｌ）１ｍＬ」に変えて「製造例２及び製造例３で得たプロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ２）及び（Ｂ３）の溶液（Ｌ−２）及び（Ｌ−３）（１ｇ／Ｌ）をそれぞれ１ｍＬ」用いる以外は同様にして（Ｂ２−１）〜（Ｂ２−５）及び（Ｂ３−１）〜（Ｂ３−５）を作成し、阻害定数Ｋｉを測定した。（Ｂ２）のＫｉは３０ｎＭ、（Ｂ３）のＫｉは９０ｎＭであった。   In the above, the protease activity inhibitor (B2 obtained in Production Example 2 and Production Example 3) was changed to “Protease activity inhibitor (B1) solution (L-1) (1 g / L) 1 mL obtained in Production Example 1]”. ) And (B3) (B2-1) to (B2-5) and (B3-1) in the same manner except that 1 mL each of the solutions (L-2) and (L-3) (1 g / L) is used. To (B3-5) were prepared, and the inhibition constant Ki was measured. The Ki of (B2) was 30 nM, and the Ki of (B3) was 90 nM.

＜カルボキシフェニルボロン酸のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定＞
４−カルボキシフェニルボロン酸（東京化成工業株式会社）５０ｍｇを５０ｍＬのバッファー１（ｐＨ８．５）に溶解させ、フェニルボロン酸溶液（Ｂ’１）（８．２ｍＭ）とした。（Ｂ’１）をバッファー１で１／１０、１／４、１／２および３／４のモル濃度に希釈したものを（Ｂ’２）〜（Ｂ’５）とした。
上記「プロテアーゼ活性阻害剤のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉの測定」において、（Ｂ１−１）〜（Ｂ１−５）に変えて（Ｂ’１）〜（Ｂ’５）を使用して、フェニルボロン酸のカンナーゼに対する阻害定数Ｋｉを求めたところ、１９μＭであった。 <Measurement of inhibition constant Ki for carboxyphenylboronic acid cannase>
50 mg of 4-carboxyphenylboronic acid (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was dissolved in 50 mL of buffer 1 (pH 8.5) to obtain a phenylboronic acid solution (B′1) (8.2 mM). Dilutions of (B′1) with buffer 1 to molar concentrations of 1/10, 1/4, 1/2, and 3/4 were designated as (B′2) to (B′5).
In the above “measurement of inhibition constant Ki for protease activity inhibitor against cannase”, (B′1) to (B′5) are used instead of (B1-1) to (B1-5), and phenylboronic acid is used. The inhibition constant Ki for cannase was determined to be 19 μM.

＜実施例１＞
バッファー１が１５３０μＬに、前述のカンナーゼ溶液（Ａ１）４０μＬ及び２０ｍｇ／Ｌのプロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｄ１）を作成した。 <Example 1>
40 μL of the aforementioned cannase solution (A1) and 40 μL of 20 mg / L protease activity inhibitor solution (B1-1) were added to 1530 μL of buffer 1 to prepare a protein solution (D1).

＜実施例２＞
実施例１において、「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）」に変えて、「プロテアーゼ阻害剤溶液（Ｂ２−１）」を用いる以外は同様にしてタンパク質溶液（Ｄ２）を作成した。 <Example 2>
In Example 1, a protein solution (D2) was prepared in the same manner except that “protease inhibitor solution (B2-1)” was used instead of “protease activity inhibitor solution (B1-1)”.

＜実施例３＞
実施例１において、「プロテアーゼ活性阻害剤溶液（Ｂ１−１）」に変えて、「プロテアーゼ阻害剤溶液（Ｂ３−１）」を用いる以外は同様にしてタンパク質溶液（Ｄ３）を作成した。 <Example 3>
In Example 1, a protein solution (D3) was prepared in the same manner except that the “protease inhibitor solution (B3-1)” was used instead of the “protease activity inhibitor solution (B1-1)”.

＜比較例１＞
バッファー１が１５３０μＬに、前述のカンナーゼ溶液（Ａ１）４０μＬおよび前述の４−カルボキシフェニルボロン酸溶液（Ｂ’１）４０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｄ’１）を作成した。 <Comparative Example 1>
40 μL of the aforementioned cannase solution (A1) and 40 μL of the aforementioned 4-carboxyphenylboronic acid solution (B′1) were added to 1530 μL of the buffer 1 to prepare a protein solution (D′ 1).

＜比較例２＞
バッファー１が１５３０μＬに、前述のカンナーゼ溶液（７）８０μＬを添加し、タンパク質溶液（Ｄ’２）を作成した。 <Comparative example 2>
80 μL of the aforementioned cannase solution (7) was added to 1530 μL of buffer 1 to prepare a protein solution (D′ 2).

＜配合直後のプロテアーゼ活性＞
タンパク質溶液（Ｄ１）〜（Ｄ３）及び（Ｄ’１）〜（Ｄ’２）について、配合直後のタンパク質溶液をそれぞれ１６μＬと、バッファー１を１５８４μＬとを、分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ１）〜（Ｙ５）を作成した。下記吸光度を利用した活性測定法により、（Ｙ１）〜（Ｙ５）のプロテアーゼ活性を測定した。結果を表１に示す。 <Protease activity immediately after compounding>
For the protein solutions (D1) to (D3) and (D′ 1) to (D′ 2), 16 μL of the protein solution immediately after compounding and 1584 μL of buffer 1 were mixed in the cell of the spectrophotometer, Protein solutions (Y1) to (Y5) were prepared. The protease activities (Y1) to (Y5) were measured by an activity measurement method using the following absorbance. The results are shown in Table 1.

＜３０℃３ヶ月保存したときのプロテアーゼ活性＞
「配合直後のプロテアーゼ活性」において、「配合直後のタンパク質溶液」を用いる代わりに、「３０℃で３ヶ月保管したタンパク質溶液」を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ活性を算出した。 <Protease activity when stored at 30 ° C for 3 months>
In “Protease activity immediately after compounding”, protease activity was calculated in the same manner except that “protein solution stored at 30 ° C. for 3 months” was used instead of “protein solution immediately after compounding”.

＜プロテアーゼ活性の長期持続性＞
配合直後のプロテアーゼ活性と３０℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性との比を、プロテアーゼ活性の長期持続性として、以下の式にて算出した。
プロテアーゼ活性の長期持続性（％）＝（３０℃で３ヶ月保管後のプロテアーゼ活性）／（調製直後のプロテアーゼ活性）×１００ <Long-term persistence of protease activity>
The ratio between the protease activity immediately after compounding and the protease activity after storage at 30 ° C. for 3 months was calculated as the long-term persistence of the protease activity by the following formula.
Long-term persistence of protease activity (%) = (protease activity after 3 months storage at 30 ° C.) / (Protease activity immediately after preparation) × 100

＜３０℃又は４０℃でそれぞれ１週間保存したときのプロテアーゼ活性＞
「配合直後のプロテアーゼ活性」において、「配合直後のタンパク質溶液」を用いる代わりに、「３０℃又は４０℃でそれぞれ１週間保管したタンパク質溶液」を用いる以外は同様にして、プロテアーゼ活性を算出した。 <Protease activity when stored for 1 week at 30 ° C. or 40 ° C.>
In “Protease activity immediately after blending”, protease activity was calculated in the same manner except that “protein solution stored at 30 ° C. or 40 ° C. for 1 week” was used instead of “protein solution immediately after blending”.

＜プロテアーゼの耐熱性＞
３０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性と４０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性との比を、プロテアーゼの耐熱性として、以下の式にて算出した。
プロテアーゼの耐熱性（％）＝（４０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性）／（３０℃で１週間保管後のプロテアーゼ活性）×１００ <Thermal resistance of protease>
The ratio of the protease activity after 1 week storage at 30 ° C. and the protease activity after 1 week storage at 40 ° C. was calculated as the heat resistance of the protease by the following formula.
Heat resistance of protease (%) = (protease activity after 1 week storage at 40 ° C.) / (Protease activity after 1 week storage at 30 ° C.) × 100

＜吸光度を利用した活性測定法＞
タンパク質溶液（Ｙ１）〜（Ｙ４）をそれぞれ１５７０μＬを分光光度計のセル（底面積１ｃｍ×１ｃｍ）に入れ、分光光度計の試料室を４０℃に保ち、セルを試料室内で３０分静置した。ここに、４０℃に温調した基質溶液（２７）（Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅをバッファー１に溶解して０．５ｍｇ／ｍＬ（０．０１２ｍＭ）の濃度にしたもの）を４００μＬ添加し、酵素反応溶液（Ｖ−１）を作成した。（Ｖ−１）を作成直後及び５秒おきに２分間の４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
（Ｖ−１）を作成した直後の吸光度をＡλ₀、ｈ秒後の吸光度をＡλ_hとし、吸光度の変化ΔＡλ（ΔＡλ＝Ａλ_h−Ａλ₀）を縦軸に、時間ｈを横軸にプロットし、直線の傾き係数ｋ_Xを求た。
ブランクとして、バッファー７が１５７０μＬに、カンナーゼ溶液（Ａ７）４０μＬを配合したタンパク質溶液（Ｄ０）を１６μＬと、バッファー１を１５８４μＬとを分光光度計のセル中で混合し、タンパク質溶液（Ｙ０）を作成した。同様にプロテアーゼ活性を測定し、直線の傾き係数ｋ_Sを求た。
係数ｋ_X及び係数ｋ_Sを用いて、下記数式（３）からタンパク質溶液（Ｙ１）及び（Ｙ２）のプロテアーゼ活性Ｘｉを求めた。
プロテアーゼ活性Ｘｉ（％）＝｛ｋ_X／ｋ_S｝×１００ （３） <Activity measurement method using absorbance>
1570 μL of each of the protein solutions (Y1) to (Y4) was placed in a spectrophotometer cell (bottom area 1 cm × 1 cm), the spectrophotometer sample chamber was kept at 40 ° C., and the cell was allowed to stand in the sample chamber for 30 minutes. . Here, a substrate solution (27) whose temperature was adjusted to 40 ° C. (Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-nitronelide dissolved in buffer 1 to a concentration of 0.5 mg / mL (0.012 mM)) 400 μL was added to prepare an enzyme reaction solution (V-1). The absorbance at 405 nm for 2 minutes was recorded immediately after preparation of (V-1) and every 5 seconds.
The absorbance immediately after creating (V-1) is Aλ ₀ , the absorbance after h seconds is Aλ _h , the change in absorbance ΔAλ (ΔAλ = Aλ _h −Aλ ₀ ) is plotted on the vertical axis, and the time h is plotted on the horizontal axis. Then, the slope coefficient k _{X of the} straight line was obtained.
As a blank, 16 μL of protein solution (D0) containing 1570 μL of buffer 7 and 40 μL of cannase solution (A7) and 1584 μL of buffer 1 were mixed in a spectrophotometer cell to prepare a protein solution (Y0). did. Similarly, protease activity was measured, and a linear slope coefficient k _S was obtained.
Using the coefficients k _X and the coefficient k _S, it was calculated protease activity Xi proteins from the following equation (3) solution (Y1) and (Y2).
Protease activity Xi (%) = {k _X / k _S } × 100 (3)

表１の評価結果から、比較例１及び２のタンパク質溶液と比較して、実施例１〜３の本発明のタンパク質溶液は、プロテアーゼ活性の持続性が高く、長期的にプロテアーゼ活性を保つことができることがわかる。また、３０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性と４０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性とが共に高く、プロテアーゼの耐熱性も向上できることが分かる。さらに、カンナーゼの活性の至適温度は４０℃であり、通常、４０℃で保管すると自己分解しやすいが、３０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性と４０℃で１週間保管した後のプロテアーゼ活性の比較から、４０℃で保管しても活性の低下が小さく、自己分解も効率よく抑制できることが分かる。   From the evaluation results in Table 1, compared to the protein solutions of Comparative Examples 1 and 2, the protein solutions of the present invention of Examples 1 to 3 have a high protease activity persistence and can maintain the protease activity in the long term. I understand that I can do it. It can also be seen that the protease activity after storage at 30 ° C. for 1 week and the protease activity after storage at 40 ° C. for 1 week are both high, and the heat resistance of the protease can be improved. Furthermore, the optimum temperature for the activity of cannase is 40 ° C. Usually, it tends to self-decompose when stored at 40 ° C, but the protease activity after storage at 30 ° C for 1 week and protease after storage at 40 ° C for 1 week From the comparison of the activities, it can be seen that even when stored at 40 ° C., the decrease in the activity is small and the self-decomposition can be efficiently suppressed.

＜実施例４〜６＞
表２の割合で４０℃で配合し、本発明の洗剤組成物を得た。 <Examples 4 to 6>
The detergent composition of the present invention was obtained by blending at a rate of Table 2 at 40 ° C.

＜比較例３〜５＞
表２の割合で４０℃で配合し、比較用の洗剤組成物を得た。 <Comparative Examples 3-5>
The ratio of Table 2 was mix | blended at 40 degreeC, and the detergent composition for a comparison was obtained.

なお、表２中、各成分の割合は、重量部で示した。

In Table 2, the ratio of each component is shown in parts by weight.

実施例４〜６及び比較例３〜５で作製した洗剤組成物を用いて下記の洗浄性試験をおこなった。
＜洗浄性試験＞
＜配合直後の洗浄除去率＞
実施例４〜６及び比較例３〜５で得た洗剤組成物について、洗剤組成物の作成後直ちに洗剤組成物０．８ｇを水９９９．２ｇに溶解させ溶液を得た。この溶液に、湿式人工汚染布（４ｃｍ×４ｃｍ）５枚を投入し、ターゴトメーター（大栄化学製）を用いて以下の条件にて洗浄及びすすぎをした後、布を取り出し、ギヤーオーブン（ＴＡＢＡＩ製、ＧＰＳ−２２２）を用いて７０℃で６０分間乾燥し、試験布を得た。ついで、多光源分光測色計（スガ試験機製）を使用して、この試験布の５４０ｎｍの反射率を、試験布１枚ごとに表裏２個所ずつ計４個所（試験布５枚で合計２０個所）測定し、この平均値を求め、以下の式にて洗浄除去率（％）を算出した。結果を表２に記載した。
（洗浄条件）
時間：１０分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（すすぎ条件）
時間：１分、温度：２５℃、回転速度：１２０ｒｐｍ
（洗浄除去率）
洗浄除去率（％）＝｛（Ｒ_W−Ｒ_S）／（Ｒ_I−Ｒ_S）｝×１００
なお、Ｒ_Iは清浄布の反射率、Ｒ_Wは洗浄布の反射率、Ｒ_Sは汚染布の反射率を示す。
また、使用した湿式人工汚染布は、表３の汚垢組成を有する財団法人洗濯科学協会製の湿式人工汚染布（５４０ｎｍにおける反射率が４０±５％）である。 The following detergency tests were conducted using the detergent compositions prepared in Examples 4 to 6 and Comparative Examples 3 to 5.
<Detergency test>
<Washing removal rate immediately after blending>
For the detergent compositions obtained in Examples 4 to 6 and Comparative Examples 3 to 5, 0.8 g of the detergent composition was dissolved in 999.2 g of water immediately after the preparation of the detergent composition to obtain a solution. Five wet artificially contaminated cloths (4 cm × 4 cm) were put into this solution, washed and rinsed under the following conditions using a targotometer (manufactured by Daiei Chemical Co., Ltd.), then the cloths were taken out, and a gear oven (TABAI) The product was dried at 70 ° C. for 60 minutes using GPS-222) to obtain a test cloth. Next, using a multi-light source spectrocolorimeter (manufactured by Suga Test Instruments), the reflectance of the test cloth at 540 nm was adjusted to 4 places, 2 on each side of the test cloth, for a total of 4 places (a total of 20 places with 5 pieces of test cloth). ), The average value was obtained, and the cleaning removal rate (%) was calculated by the following formula. The results are shown in Table 2.
(Cleaning conditions)
Time: 10 minutes, temperature: 25 ° C., rotation speed: 120 rpm
(Rinsing conditions)
Time: 1 minute, temperature: 25 ° C., rotation speed: 120 rpm
(Washing removal rate)
Cleaning removal rate (%) = {(R _W −R _S ) / (R _I −R _S )} × 100
R _I represents the reflectance of the cleaning cloth, R _W represents the reflectance of the cleaning cloth, and R _S represents the reflectance of the contaminated cloth.
Moreover, the used wet artificial contamination cloth is a wet artificial contamination cloth (reflectance at 540 nm of 40 ± 5%) manufactured by the Japan Laundry Science Association having the dirt composition shown in Table 3.

＜３０℃３ヶ月保管後の洗浄除去率＞
実施例４〜６及び比較例３〜５で得た洗剤組成物について、「配合直後の洗浄除去率」において、「洗剤組成物の作成後直ち」に変えて、「洗剤組成物の作成後３０℃で３ヶ月保管した後」の洗剤組成物を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、洗浄除去率を算出した。結果を表２に記載した。 <Washing removal rate after storage at 30 ° C for 3 months>
For the detergent compositions obtained in Examples 4 to 6 and Comparative Examples 3 to 5, in the “cleaning removal rate immediately after compounding”, the “detergent composition was immediately after creation” was changed to “after creation of the detergent composition”. A detergency test was conducted in the same manner except that the detergent composition “after storage at 30 ° C. for 3 months” was used, and the washing removal rate was calculated. The results are shown in Table 2.

＜３０℃および４０℃１週間保管後の洗浄除去率＞
実施例４〜６及び比較例３〜５で得た洗剤組成物について、「配合直後の洗浄除去率」において、「洗剤組成物の作成後直ち」に変えて、「洗剤組成物の作成後３０℃又は４０℃で１週間保管した後」の洗剤組成物を用いる以外は同様に洗浄性試験をおこない、洗浄除去率を算出した。結果を表２に記載した。 <Washing removal rate after storage for 1 week at 30 ° C and 40 ° C>
For the detergent compositions obtained in Examples 4 to 6 and Comparative Examples 3 to 5, in the “cleaning removal rate immediately after compounding”, the “detergent composition was immediately after creation” was changed to “after creation of the detergent composition”. A detergency test was conducted in the same manner except that the detergent composition “after storage at 30 ° C. or 40 ° C. for 1 week” was used, and the cleaning removal rate was calculated. The results are shown in Table 2.

＜洗浄性の持続性＞
配合直後の洗浄除去率と３０℃および４０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率との比を洗浄性の持続性として、以下の式にて算出した。
洗浄性の持続性（％）＝（３０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）／（配合直後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）×１００ <Durability of detergency>
The ratio of the washing removal rate immediately after compounding and the washing removal rate after storage at 30 ° C. and 40 ° C. for 3 months was calculated as the sustainability of the washing property by the following formula.
Persistence of detergency (%) = (washing removal rate after storage at 30 ° C. for 3 months−washing removal rate of Comparative Example 4) / (washing removal rate immediately after blending—washing removal rate of Comparative Example 4) × 100

＜洗浄性の耐熱性＞
３０℃又は４０℃で１週間保管後の洗浄除去率の比を洗浄性の耐熱性として、以下の式にて算出した。
洗浄性の耐熱性（％）＝（４０℃で１週間保管後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）／（３０℃で１週間保管後の洗浄除去率−比較例４の洗浄除去率）×１００ <Cleaning heat resistance>
The ratio of the washing removal rate after storage at 30 ° C. or 40 ° C. for 1 week was calculated as the heat resistance of the washing property by the following formula.
Detergency heat resistance (%) = (Wash removal rate after storage at 40 ° C. for 1 week−Wash removal rate of Comparative Example 4) / (Wash removal rate after storage for 1 week at 30 ° C.−Wash removal of Comparative Example 4) Rate) x 100

表２に示すとおり、比較例３及び４の洗剤組成物は、配合直後の洗浄除去率は高いものの、３０℃で３ヶ月保管後の洗浄除去率は、カンナーゼを含んでいない比較例５の洗剤組成物と同程度まで低下しており、洗浄性の持続性が５〜１１％と低かった。一方、本発明の洗剤組成物は、３０℃で３ヶ月保管後も、カンナーゼを含んでいない比較例５の洗剤組成物よりも洗浄除去率が１０％以上高く、また、洗浄性の持続性が５３〜７９％と非常に高かった。したがって、本発明の洗剤組成物は、洗浄性の持続性が高いことが分かる。さらに、３０℃で１週間保管した後の洗浄性と４０℃で１週間保管した後の洗浄性とが共に高く、洗浄性の耐熱性が６１〜６８％であり、洗剤組成物の耐熱性も向上できることが分かる。   As shown in Table 2, the detergent compositions of Comparative Examples 3 and 4 have a high washing removal rate immediately after compounding, but the washing removal rate after storage at 30 ° C. for 3 months is the detergent of Comparative Example 5 that does not contain cannase. It was lowered to the same level as the composition, and the durability of the cleaning property was as low as 5 to 11%. On the other hand, the detergent composition of the present invention has a cleaning removal rate of 10% or more higher than that of the detergent composition of Comparative Example 5 which does not contain cannase even after storage at 30 ° C. for 3 months, and has a long cleaning performance. It was very high at 53-79%. Therefore, it turns out that the detergent composition of the present invention has a high detergency. Furthermore, both the washability after storage at 30 ° C. for 1 week and the washability after storage at 40 ° C. for 1 week are both high, the heat resistance of the washability is 61-68%, and the heat resistance of the detergent composition is also It can be seen that it can be improved.

本発明のタンパク質溶液は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、コンタクトレンズ用洗浄剤、浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質剤（製パン、肉の軟化、水産加工など）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写真フィルムのゼラチン除去剤、消化助剤及び消炎剤として広範囲に使用できる。   The protein solution of the present invention comprises a detergent for clothing, a detergent for automatic dishwashers, a detergent for contact lenses, a bath preparation, a cosmetic for removing keratin, a food modifier (baking, softening meat, marine processing Etc.), beer fining agent, leather tanning agent, photographic film gelatin remover, digestion aid and flame retardant.

Claims (2)

低温至適プロテアーゼ（Ａ）、下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）及び溶剤（Ｃ）を含有
するタンパク質溶液（Ｄ）であって、（Ａ）の酵素反応至適温度が０℃〜５０℃であるタ
ンパク質溶液であって、
低温至適プロテアーゼ（Ａ）が、カンナーゼであって、
下記プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ）が、配列番号２，１０又は２２のアミノ酸配列を有するタンパク質プロテアーゼ活性阻害剤であるタンパク質溶液。
ただし、プロテアーゼ活性阻害剤（Ｂ） は、（Ｅ）として サクシニルアラニルアラニルプロリルフェニルアラニンニトロアニリドを用いて、低温至適プロテアーゼ（Ａ）の活性の至適温度、最適ｐＨ及び最適基質濃度の条件下でＨｅｎｄｅｒｓｏｎプロットにより求めた（Ａ）に対する阻害定数Ｋｉが、１ｎＭ〜１００ｎＭである 。 A protein solution (D) containing a low temperature optimal protease (A), the following protease activity inhibitor (B) and a solvent (C), wherein the optimal temperature of the enzyme reaction of (A) is 0 ° C. to 50 ° C. A protein solution,
The low temperature optimal protease (A) is cannase,
A protein solution, wherein the protease activity inhibitor (B) below is a protein protease activity inhibitor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 10 or 22.
However, protease activity inhibitor (B) is Inhibition constant Ki for (A) determined by Henderson plot using succinylalanylalanylprolyl phenylalanine nitroanilide under conditions of optimum temperature, optimum pH and optimum substrate concentration of low temperature optimum protease (A). Is from 1 nM to 100 nM . 請求項１に記載のタンパク質溶液（Ｄ）及び界面活性剤（Ｏ）を含む洗剤組成物。
A detergent composition comprising the protein solution (D) according to claim 1 and a surfactant (O).

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